專利名稱：分泌表達(dá)重組人表皮生長因子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及通過基因工程方法制備重組人表皮生長因子(rhEGF)。
背景技術(shù)：
人表皮生長因子(Human epidermal growth factor，簡稱hEGF)，是一種不帶糖基，由53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為6,216道爾頓。hEGF是人體內(nèi)一種重要的多肽生長因子，它具有多種生物學(xué)功能，可與表皮細(xì)胞上特異的受體結(jié)合，將信息傳遞入細(xì)胞，改變細(xì)胞內(nèi)的酸堿度和游離鈣濃度，促進(jìn)糖酵解和蛋白質(zhì)的合成，增加某些專一性基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。EGF可促使多種細(xì)胞分裂，可促進(jìn)表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和器官組織的上皮細(xì)胞生長。在生物體發(fā)育中，EGF還可促進(jìn)新生兒牙齒、骨骼與各器官的生長。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，hEGF可促使外胚層、中胚層細(xì)胞生長，促進(jìn)燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合，加速移植表皮和移植角膜的生長，因此，對(duì)創(chuàng)燒傷救治、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍、角膜潰瘍、胃腸道潰瘍及應(yīng)激性胃粘膜損傷的治療均有重要作用。近年來，國外已將hEGF用于鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌的治療，取得了顯著的療效。
hEGF廣泛存在于人的體液和某些腺體及組織中，但含量極低，不可能以組織提取方式大量制備供研究和臨床用。在先前的研究中，本發(fā)明者們采用基因工程的方法，將人工合成的hEGF基因、大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列克隆至質(zhì)粒pTZ18R中，構(gòu)建成分泌表達(dá)質(zhì)粒pAE-8并得到工程菌株EE-8。該工程菌株成功地分泌表達(dá)rhEGF，最高表達(dá)量為150mg/l(專利申請(qǐng)CN00127953.X)。
大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子是一種中等強(qiáng)度的啟動(dòng)子，利用上述啟動(dòng)子已使rhEGF的表達(dá)量達(dá)到150mg/l，如果改用更強(qiáng)的啟動(dòng)子，比如PL強(qiáng)啟動(dòng)子是否能使rhEGF的分泌表達(dá)量再上一個(gè)臺(tái)階呢？帶著這一想法，本發(fā)明者們開始了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)，考慮到PL啟動(dòng)子一旦啟動(dòng)，可能會(huì)使rhEGF瞬時(shí)大量表達(dá)，造成大腸桿菌胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來不及將rhEGF分泌至胞外，而使rhEGF大量聚集在胞內(nèi)。為了提高rhEGF的透膜分泌效率，本發(fā)明者們從設(shè)計(jì)信號(hào)肽著手，順利完成了表達(dá)質(zhì)粒和工程菌株的構(gòu)建和發(fā)酵條件的優(yōu)化，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一個(gè)全新設(shè)計(jì)的信號(hào)肽(phoAspL10)序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分泌表達(dá)重組人表皮生長因子(rhEGF)的表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供基因工程菌BE-2。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供信號(hào)肽phoAspL10和表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF在制備直接分泌表達(dá)的rhEGF上的應(yīng)用。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供直接分泌表達(dá)rhEGF至培養(yǎng)基的rhEGF制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一個(gè)全新設(shè)計(jì)的信號(hào)肽(phoAspL10)基因(SEQ ID NO1)5’ATG AAA CAA AGC ACT CTG CTG CTG CTG CTG CTT CTG CTG CTGCTG ACC CCT GTG ACA AAA GCG 3’本發(fā)明還提供分泌表達(dá)重組人表皮生長因子的表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF，其包含所述的全新設(shè)計(jì)的phoAspL10基因，及位于所述基因上游的溫敏啟動(dòng)子PL和位于所述基因下游的hEGF基因。所述溫敏啟動(dòng)子PL的來源見Giladi H，Goldenberg D，Koby S，Oppenheim AB.Enhanced activity of the bacteriophage lambda PL promoter at lowtemperature.FEMS Microbiol Rev.1995 Aug；17(1-2)135-40.
本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF中，所含的重組蛋白基因包含目前所有已知人體的多肽和蛋白基因。
本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞是具有氨芐青霉素抗性的、表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。
本發(fā)明還提供分泌表達(dá)rhEGF的工程菌株BE-2，所述的工程菌株是從表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞篩選出的表達(dá)量最高的菌株。
本發(fā)明提供的直接分泌表達(dá)rhEGF至培養(yǎng)基的rhEGF制備方法包括如下步驟(1)化學(xué)合成phoAspL10序列；(2)以pBLGlu2為起始質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF；(3)構(gòu)建和篩選出基因工程菌株BE-2；(4)基因工程菌BE-2的發(fā)酵培養(yǎng)；(5)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。
本發(fā)明者設(shè)計(jì)的信號(hào)肽phoAspL10是一種全新的序列，其長度為21個(gè)氨基酸，其中第6至第15個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)成非極性氨基酸-亮氨酸。信號(hào)肽phoAspL10較大腸桿菌堿性磷酸酯酶信號(hào)肽的疏水性更強(qiáng)，更利于rhEGF的透膜和分泌。
本發(fā)明者們根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，順利地完成了表達(dá)質(zhì)粒和工程菌株的構(gòu)建。在本發(fā)明構(gòu)建的分泌表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF中，將PL強(qiáng)啟動(dòng)子、全新設(shè)計(jì)的phoAspL10序列和hEGF基因進(jìn)行串聯(lián)。這種表達(dá)方式的最大好處是直接高效分泌表達(dá)rhEGF至培養(yǎng)基中，保留了其天然的空間結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物不需要經(jīng)過蛋白復(fù)性，因而表達(dá)產(chǎn)物的生物活性很高，也使得后續(xù)的分離純化步驟得以簡化。而其它采用PL啟動(dòng)子表達(dá)蛋白的方法，要么表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)形成包涵體，產(chǎn)物在純化后還要進(jìn)行蛋白復(fù)性，要么表達(dá)產(chǎn)物被表達(dá)至細(xì)菌的周質(zhì)中，給后續(xù)的分離純化帶來很大的麻煩。
在對(duì)工程菌株的發(fā)酵條件和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行摸索的基礎(chǔ)上，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，在38℃誘導(dǎo)時(shí)，rhEGF的分泌表達(dá)量要較通常采用的42℃誘導(dǎo)時(shí)為高。在此優(yōu)化的發(fā)酵和誘導(dǎo)條件下，工程菌株BE-2表達(dá)rhEGF的最高量達(dá)到384mg/l，經(jīng)過分離純化，得到純度大于95％、比活性大于1.0×106IU/mg蛋白的rhEGF產(chǎn)品，完全達(dá)到了預(yù)期的效果。
以上的研究結(jié)果為今后表達(dá)其它重組多肽或蛋白時(shí)提供了多種選擇采用PL啟動(dòng)子、全新設(shè)計(jì)的phoAspL10序列串聯(lián)的表達(dá)系統(tǒng)或大腸桿菌堿性磷酸酯酶表達(dá)系統(tǒng)。


圖1為表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF構(gòu)建示意圖。
圖2為陽性克隆核酸電泳圖。其中，第1欄為DNA標(biāo)記；第2欄為陰性對(duì)照；第3欄為陽性對(duì)照；第4欄為空白；第5欄為陽性克隆。圖3為工程菌株篩選SDS-PAGE電泳圖。第1欄為陰性對(duì)照(YK537空菌)；第2欄為hEGF對(duì)照；第3欄為BE-1；第4欄為BE-2；第5欄為BE-3；第6欄為BE-4；第7欄為BE-5；第8欄為BE-6。
圖4A為工程菌株BE-2的發(fā)酵曲線圖。圖4B為工程菌株BE-2的誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖。其中，第1欄為hEGF對(duì)照；第2-6欄分別為誘導(dǎo)培養(yǎng)20、22、25、26和27小時(shí)上清。
圖5為疏水層析圖。
圖6為陰離子交換圖。
圖7為凝膠過濾圖。
圖8為SDS-PAGE電泳檢定圖。其中，第1欄為蛋白分子量標(biāo)記(自下而上依次為10K，20K，30K…100K)；第2欄為對(duì)照hEGF；第3欄為rhEGF產(chǎn)品。圖9為反相HPLC檢定圖。
圖10為分子量測(cè)定圖。
圖11為N端氨基酸序列測(cè)定數(shù)據(jù)。
圖12為生物活性測(cè)定圖。
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。這些實(shí)施例僅僅是舉例說明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1 化學(xué)合成信號(hào)肽phoAspL10序列和人表皮生長因子(hEGF)的串聯(lián)基因(SEQ ID NO2)↓起始密碼子5’GAT ACC AAA CAA AGC ACTCTG CTG CTG CTG CTG CTT CTG CTG| ← 全新設(shè)計(jì)的信號(hào)肽序列(下劃線部分為CTG CTGACC CCT GTG ACA AAA GCG AAT TCC GAC TCT GAA TGC CCG連續(xù)十個(gè)亮氨酸) →|←CTG TCT CAC GAC GGT TAC TGC CTA CAC GAT GGT GTT TGC ATG TAT人表皮生長因子(hEGF)基因ATC GAA GCT CTG GAC AAA TAC GCG TGC AAC TGT GTT GTT GGT TACATC GGT GAA CGT TGC CAG TAC CGT GAC CTG AAA TGG TGG GAA CTG
我們?cè)谠O(shè)計(jì)合成上述串聯(lián)基因時(shí)，充分遵循了以下原則即選用大腸桿菌偏愛的密碼子；AT、GC含量接近且分布均勻；片段內(nèi)避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。
在上述串聯(lián)基因的下游末端，我們?cè)O(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶HindIII的酶切位點(diǎn)，便于基因克隆(基因及引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。
實(shí)施例2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(圖1)2.1起始載體pBLGlu2的酶切處理2.1.1 EcoRI酶切配制如下反應(yīng)混合液10μg質(zhì)粒pBLGlu2；20μl 10×H緩沖液(TaKaRa公司)；5μl EcoRI限制性內(nèi)切酶(15U/μl，TaKaRa公司)；滅菌雙蒸水補(bǔ)足200μl。
將上述反應(yīng)混合液于37℃反應(yīng)4小時(shí)。
2.1.2酶切后載體的回收在2.1.1所得的反應(yīng)混合液中加入20μl 3M乙酸鈉和400μl無水乙醇，充分混勻后，于12,000rpm離心5分鐘，棄上清，再加入400μl 70％乙醇，充分混勻，12,000rpm離心2分鐘，棄上清，真空抽干。
2.1.3綠豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)酶切配制如下反應(yīng)混合液2.1.2中回收的載體；10μl 10×綠豆核酸酶緩沖液(TaKaRa公司)；1μl Mung Bean Nuclease(45U/μl，TaKaRa公司)；滅菌雙蒸水補(bǔ)足100μl。
將上述反應(yīng)混合液于30℃反應(yīng)30分鐘。
2.1.4 DNA片段的回收將2.1.3中所得的DNA片段用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)按試劑盒說明書上的操作步驟進(jìn)行回收，用50μl洗脫液洗脫。
2.1.5保溫將2.1.4中所得的洗脫液于65℃保溫10分鐘。
2.1.6 HindIII酶切配制如下反應(yīng)混合液2.1.5中的洗脫液；6μl 10×M緩沖液(TaKaRa公司)；2μl HindIII限制性內(nèi)切酶(15U/μl，TaKaRa公司；)滅菌雙蒸水補(bǔ)足60μl。
將上述反應(yīng)混合液于37℃反應(yīng)過夜。
2.1.7 DNA大片段的回收將2.1.6中酶切過夜的反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下大條帶，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)按試劑盒說明書上的操作步驟回收DNA大片段，用50μl洗脫液洗脫。
2.2 phoAspL10、hEGF串聯(lián)基因的酶切處理取化學(xué)合成的1OD上述串聯(lián)基因用200μl滅菌雙蒸水溶解，取10μl作HindIII酶切處理。
配制如下反應(yīng)混合液10μl phoAspL10、hEGF串聯(lián)基因；4μl 10×M緩沖液(TaKaRa公司)；2μl HindIII限制性內(nèi)切酶(15U/μl，TaKaRa公司)；滅菌雙蒸水補(bǔ)足40μl。
將上述反應(yīng)混合液于37℃反應(yīng)過夜，然后進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，在紫外燈下切下大條帶，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)按試劑盒說明書上的操作步驟回收DNA大片段，用50μl洗脫液洗脫。
2.3連接配制如下反應(yīng)混合液5μl 2.1.7中經(jīng)處理后的載體大片段；12μl 2.2中經(jīng)HindIII酶切的phoAspL10、hEGF串聯(lián)基因；2μl 10×T4DNA連接酶緩沖液(TaKaRa公司；)1μl T4DNA連接酶(350U/μl，TaKaRa公司)。
將上述反應(yīng)混合液于16℃反應(yīng)過夜。
2.4感受態(tài)細(xì)胞的制備將10μl TOP10甘油菌接種至3ml LB培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm培養(yǎng)過夜，取100μl菌液再接入3ml LB培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm培養(yǎng)至A6000.3～0.4，然后4,000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體以預(yù)冷的鈣溶液(0.1mol/l CaCl2)洗滌，4,000rpm離心10分鐘，菌體重懸于200μl的鈣溶液中備用。
2.5轉(zhuǎn)化取2.3中的連接產(chǎn)物，加入2.4中制備的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，然后于42℃熱休克90秒，隨后加入800μl LB培養(yǎng)基，于37℃，100rpm，振搖30分鐘，取100μl涂布含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板(瓊脂含量為1.5％)，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
2.6篩選陽性克隆合成phoAspL10、hEGF串聯(lián)基因的上游引物和下游引物(1OD上述引物分別用400μl滅菌雙蒸水溶解備用)，用于PCR反應(yīng)篩選陽性克隆，引物序列如下上游引物(21bp)5’GAT ACC ATG AAA CAA AGC ACT 3’(SEQ ID NO3)；下游引物(18bp)5’CCC AAG CTT ATT AAC GCA 3’(SEQ ID NO4)。
用無菌牙簽挑取2.5中長出的若干菌落于3ml LB(其中氨芐青霉素的濃度為100μg/ml)中，在37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，以菌落培養(yǎng)液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。每個(gè)菌落培養(yǎng)液試樣按以下組合和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
配制如下反應(yīng)混合液0.25μl Ex Taq(5U/μl，TaKaRa公司)；5μl 10×Ex Taq緩沖液(TaKaRa公司)；4μl dNTP Mixture(TaKaRa公司)；1μl上游引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；1μl下游引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；1μl菌落培養(yǎng)液；滅菌雙蒸水補(bǔ)足50μl。
反應(yīng)條件94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 40秒，共30個(gè)循環(huán)。
PCR反應(yīng)的陰性對(duì)照用1μl滅菌雙蒸水代替菌落培養(yǎng)液，陽性對(duì)照用2.2中溶解的1μl phoAspL10、hEGF串聯(lián)基因代替菌落培養(yǎng)液。取PCR反應(yīng)液20μl進(jìn)行1.5％瓊脂糖電泳，在紫外燈下，菌落培養(yǎng)液試樣的PCR反應(yīng)產(chǎn)物于240bp左右處出現(xiàn)條帶的即為陽性克隆(見圖2)。
2.7質(zhì)粒的小量抽提取陽性克隆的培養(yǎng)液10μl接種至3ml LB培養(yǎng)基(其中氨芐青霉素的濃度為100μg/ml)中，37℃ 200rpm培養(yǎng)過夜，用UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒說明書上的操作步驟抽提陽性克隆的質(zhì)粒。
2.8 DNA序列測(cè)定我們合成了測(cè)序引物(5’AGC ACA TCA GCA GGA CGC A 3’，19bp，SEQID NO5)，對(duì)陽性克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定(委托上海博亞生物技術(shù)有限公司)。測(cè)序結(jié)果表明，在我們構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF中，phoAspL10、hEGF串聯(lián)基因的DNA序列與我們?cè)O(shè)計(jì)的完全一致。
通過上述步驟，我們完成了表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF的構(gòu)建工作。
實(shí)施例3 基因工程菌株的構(gòu)建和篩選
3.1基因工程菌株的構(gòu)建按2.4中的方法制備大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，按2.5中的方法將表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，取100μl涂布含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板(瓊脂含量為1.5％)，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
3.2基因工程菌株的篩選3.2.1基因工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)挑取3.1中獲得的單菌落放入3毫升LB培養(yǎng)基(其中氨芐青霉素的濃度為100μg/ml)中，37℃ 200rpm過夜培養(yǎng)，然后按1∶10的比例轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基中，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后升溫至42℃，培養(yǎng)6小時(shí)后結(jié)束。取1ml培養(yǎng)液上清作為試樣，加入三氯乙酸至終濃度為10％，12,000rpm離心5分鐘，棄上清，加入1ml丙酮于12,000rpm離心5分鐘，棄上清，晾干沉淀備用。
3.2.2 SDS-PAGE凝膠電泳分析SDS-PAGE凝膠的配方如下

將3.2.1中制備的上清液試樣沉淀加入1×載樣緩沖液，在沸水浴中放置5分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析(電壓200伏，45分鐘)，根據(jù)電泳結(jié)果，rhEGF表達(dá)量最高的該菌株即為篩選得到的基因工程菌株，命名為BE-2(見圖3)。
1×載樣緩沖液10％SDS 1.5ml，巰基乙醇250μl，甘油500μl，0.75MTris·HCl(pH6.8)330μl，溴酚蘭適量，用水定容至20ml。
1×電泳緩沖液15.1g Tris，94g甘氨酸，50ml 10％SDS，用濃鹽酸調(diào)pH至8.3后再用水定容至5,000ml。
實(shí)施例4 基因工程菌BE-2的發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下酵母抽提物10g/l，蛋白胨，20g/l，氯化鈉10g/l，葡萄糖5g/l。
取700μl實(shí)施例3中篩選得到的基因工程菌BE-2甘油菌，接入25ml LB培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm培養(yǎng)12小時(shí)，再以2.8％的接種量轉(zhuǎn)接到50ml LB培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)10小時(shí)，然后按6％的接種量接入到裝有2.5升發(fā)酵培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)溫度設(shè)定為30℃，通氣量為4ml/min，pH為7.0，初始攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，溶氧控制在20％。葡萄糖耗完后開始以恒pH方式流加250g/l葡萄糖，控制pH值為7.0。培養(yǎng)12小時(shí)后菌體濃度OD600大約為36，升溫至38℃開始誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)階段流加含葡萄糖(250g/l)和酵母抽提物(200g/l)的混合液，初始流加速率為12.6ml/h，逐漸以階梯方式遞增到25.4ml/h。培養(yǎng)27小時(shí)，培養(yǎng)基中rhEGF的最高表達(dá)量為384mg/l(見圖4)。
實(shí)施例5 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化5.1超濾將實(shí)施例7中獲得的培養(yǎng)基上清液用截留分子量為5,000的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，通過這一步驟除去分子量小于5,000的雜質(zhì)并對(duì)上清液進(jìn)行濃縮，最終濃縮后的體積約為初始體積的1/10。
5.2疏水層析超濾液中加入固體硫酸銨至終濃度為10％(質(zhì)量百分比)，過濾后，上PhenylSepharose 6 Fast Flow柱(Φ35×300mm)，先用10％硫酸銨溶液沖洗，再用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)進(jìn)行洗脫，收集含rhEGF的組份(見圖5)。
5.3陰離子交換用50mM Tris·HCl(pH7.2)緩沖液將5.2中收集的組份稀釋十倍后上QSepharose Fast Flow柱(Φ35×300mm)，先用50mM Tris·HCl(pH7.2)緩沖液沖洗，再用2M NaCl在三個(gè)柱體積內(nèi)從0-100％進(jìn)行梯度洗脫，收集含rhEGF的組份(見圖6)。
5.4凝膠過濾將5.3中rhEGF組份用真空冷凍干燥法濃縮體積后再上Superdex 30 prep grade柱(Φ35×1200mm)，流動(dòng)相為50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，收集含rhEGF的組份(見圖7)。
實(shí)施例6 純化產(chǎn)物的檢定6.1純度檢定6.1.1SDS-PAGE凝膠電泳掃描經(jīng)計(jì)算機(jī)掃描分析，rhEGF產(chǎn)品的純度大于95％，達(dá)到96.8％(見圖8)。
6.1.2反相HPLCHPLC分析條件如下分析柱RP-300 C8柱(Φ2.1×30mm)。
緩沖液A0.1％TFA。
緩沖液B0.1％TFA，90％乙腈。
梯度 0％～100％B，30分鐘內(nèi)。
流速 0.4ml/min。
經(jīng)計(jì)算機(jī)積分分析，rhEGF產(chǎn)品的純度大于95％，達(dá)到98.3％(見圖9)。
6.2分子量測(cè)定委托中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蛋白質(zhì)組研究分析中心測(cè)定，rhEGF產(chǎn)品試樣的分子量為6,216道爾頓(見圖10)。
6.3N端氨基酸序列分析委托中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蛋白質(zhì)組研究分析中心分析，共測(cè)定了rhEGF產(chǎn)品試樣N端的15個(gè)氨基酸，其N端序列為Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu(SEQ IDNO6)，與天然人表皮生長因子序列的N端氨基酸序列一致(見圖11)。
6.4效價(jià)測(cè)定(生物活性測(cè)定)采用Balb/c3T3細(xì)胞MTT法測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長期的Balb/c3T3細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用RPMI1640+10％FBS培養(yǎng)液制成6×104/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板(0.1ml/孔)，置37℃、5％CO2培箱24小時(shí)；吸去原培基，加入RPMI1640+0.4％FBS培基0.1ml/孔，37℃、5％CO2培箱饑餓培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)；吸去原培基，加入用RPMI1640+0.4％FBS培基稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和試樣0.1ml/孔標(biāo)準(zhǔn)品先預(yù)稀釋至50IU/ml，再進(jìn)行一系列的4倍稀釋，試樣同樣預(yù)稀釋至50ng/ml，再進(jìn)行一系列的4倍稀釋，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)，置37℃、5％CO2培箱72小時(shí)；每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl，置37℃、5％CO2培箱4小時(shí)；每孔吸去80μl上清，加入DMSO 100μl，混勻，測(cè)定OD570值。以試樣的濃度為橫坐標(biāo)，OD570值為縱坐標(biāo)作圖，用計(jì)算機(jī)S形曲線回歸計(jì)算法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的ED50。根據(jù)下式計(jì)算出樣品的效價(jià)X1X1＝X0×(D1/D0)×(E0/E1)其中X0為標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)，D1為樣品的預(yù)稀釋倍數(shù)，D0為標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)稀釋倍數(shù)，E1為樣品的ED50，E0為標(biāo)準(zhǔn)品的ED50。
經(jīng)測(cè)定，rhEGF試樣的比活性大于1.0×106IU/毫克蛋白，達(dá)到1.21×106IU/mg蛋白(見圖12)。
以上描述的具體實(shí)施方式
旨在闡述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式而不是以任何形式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的啟示，結(jié)合本領(lǐng)域的常識(shí)所做的各種變更，均落在本發(fā)明專利申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列表<110>甘人寶、錢悅、朱俊、馮寶山、丁紅珍、張倩、葉勤、張海毅<120>分泌表達(dá)重組人表皮生長因子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>63<212>DNA<213>人工合成<400>1atgaaacaaa gcactctgct gctgctgctg cttctgctgc tgctgacccc tgtgacaaaa60gcg 63<210>2<211>241<212>DNA<213>人工合成<400>2gataccatga aacaaagcac tctgctgctg ctgctgcttc tgctgctgct gacccctgtg60acaaaagcga attccgactc tgaatgcccg ctgtctcacg acggttactg cctacacgat120ggtgtttgca tgtatatcga agctctggac aaatacgcgt gcaactgtgt tgttggttac180atcggtgaac gttgccagta ccgtgacctg aaatggtggg aactgcgtta ataagcttgg240g241<210>3<211>21<212>DNA<213>人工合成
<400>3gataccatga aacaaagcac t 21<210>4<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>4cccaagctta ttaacgca 18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5agcacatcag caggacgca 19<210>6<211>15<212>PRT<213>人工合成<400>6Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu15 10 1權(quán)利要求
1.信號(hào)肽基因phoAspL10，它具有序列表中SEQ ID NO1所示序列。
2.分泌表達(dá)rhEGF的表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF，其包含權(quán)利要求1所述的phoAspL10基因，及位于所述基因上游的溫敏的啟動(dòng)子PL和位于所述基因下游的hEGF基因。
3.權(quán)利要求2所述表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)宿主細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其特征在于具有氨芐青霉素抗性。
5.工程菌株BE-2，所述工程菌株是從表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞篩選出的rhEGF分泌表達(dá)量最高的菌株。
6.信號(hào)肽基因phoAspL10和表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF在制備直接分泌表達(dá)的rhEGF上的應(yīng)用。
7.rhEGF的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)化學(xué)合成phoAspL10序列；(2)以pBLGlu2為起始質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF；(3)構(gòu)建和篩選出基因工程菌株BE-2；(4)基因工程菌BE-2的發(fā)酵培養(yǎng)；(5)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)是先在30℃對(duì)工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)，然后再升溫至38℃誘導(dǎo)rhEGF分泌表達(dá)的方法。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其中所述的分離純化是采用超濾、疏水層析、陰離子交換和凝膠過濾的組合方式。
全文摘要
本發(fā)明提供信號(hào)肽基因phoAspL10、表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF、用表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)宿主細(xì)胞及從中篩選出的工程菌株BE－2。進(jìn)一步提供制備rhEGF的方法，即化學(xué)合成全新設(shè)計(jì)的phoAspL10基因及其與hEGF的串聯(lián)基因，并以pBLGlu2為起始質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBL10EGF，進(jìn)而構(gòu)建工程菌株BE－2，該菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，直接分泌表達(dá)rhEGF至培養(yǎng)基中，分泌表達(dá)量達(dá)到384mg/l，分離純化后，產(chǎn)品純度大于95％，比活性大于1.0×10
文檔編號(hào)C07K1/00GK1854294SQ200510025289
公開日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者甘人寶, 錢悅, 朱俊, 馮寶山, 丁紅珍, 張倩, 葉勤, 張海毅 申請(qǐng)人:甘人寶, 錢悅, 朱俊, 馮寶山, 丁紅珍, 張倩, 葉勤, 張海毅