專利名稱：一種分泌具有纖溶活性蛋白酶的泛溫鏈霉菌c－3662的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從土壤中篩選得到的一種具有產(chǎn)生纖溶活性蛋白酶CGW-3的泛溫鏈霉菌菌株C-3662。
雖然鏈霉菌種類繁多存在廣泛，但是絕大多數(shù)鏈霉菌對人體無害，而且，由于鏈霉菌是迄今為止發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)抗生素的產(chǎn)生菌并廣泛地應(yīng)用于抗生素制藥工業(yè)，所以鏈霉菌為提高人類的生活健康水平作出了巨大的貢獻(xiàn)。
心腦血管血栓栓塞性疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率在人群中仍有逐步上升的趨勢。當(dāng)前，治療這類疾病的一個有效療法為溶栓療法，即對該病患者施用具有溶栓活性的藥物，例如尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑等等。這類藥物在臨床使用中，產(chǎn)生一定的甚至較好的療效，但同時也存在一些的問題，諸如藥物的溶栓特異性還有待提高；這類藥物尤其是組織型纖溶酶原激活劑或其衍生物的價格還比較高，有時甚至是難以接受。此外，使用這類藥物溶栓，從發(fā)生栓塞到給藥時的間隔越短，預(yù)期療效也就越好，但是這類藥物的給藥途徑主要為靜脈注射，所以帶來一定的不方便性。還有一類溶栓藥物，它們來源于動物或微生物，具有激活人體中的纖溶酶原活性或直接降解纖維蛋白活性，如鏈激酶、蛇毒抗栓酶、蚓激酶等，這類藥物中有的療效尚不確切，有的副作用較大，有的在生產(chǎn)原材料的來源上受到一定的限制等。
當(dāng)前研究開發(fā)溶栓藥物的一個方向是從不同來源的生物尤其是微生物中，篩選提取纖溶酶及纖溶酶原激活劑，以期發(fā)現(xiàn)新型溶栓藥物。
鏈霉菌既為非致病菌，又產(chǎn)生、分泌多種化合物和/或蛋白質(zhì)，況且鏈霉菌具有良好的工業(yè)生產(chǎn)基礎(chǔ)，所以從鏈霉菌中篩選并生產(chǎn)人們所需要物質(zhì)的努力一直持續(xù)不斷。然而，這種努力的方向似乎主要集中在諸如抗生素、纖維素酶、淀粉酶以及某些種類的蛋白酶的篩選上，對具有纖溶活性的蛋白酶的篩選很少見到報道。
顯然，從鏈霉菌中篩選具有產(chǎn)生纖溶活性蛋白酶能力的菌株，是一項值得進(jìn)行的研究開發(fā)工作。法國科學(xué)家于1996年報道從一株未定名的鏈霉菌菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)并分離純化了具有纖溶活性的蛋白酶。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所于同年利用自行設(shè)計的纖溶物質(zhì)篩選模型，從云南土壤中篩選得到了產(chǎn)生纖溶活性物質(zhì)的鏈霉菌菌株，并從其中的Y405號菌株的發(fā)酵液中分離得到了纖溶酶SW-1。后經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)，SW-1雖然具有良好的溶栓活性，但是同時具有比較明顯的出血傾向副作用。
本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括以下步驟將待篩選的鏈霉菌菌株在瓊脂平板上培養(yǎng)好后，挖塊并分別置于纖維蛋白平板和酪素平板，經(jīng)37℃保溫過夜后，篩選出僅具有纖溶活性的挖塊；將對應(yīng)挖塊的鏈霉菌菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；在得到發(fā)酵上清液后，經(jīng)硫酸銨沉淀、離子交換層析、疏水層析等分離純化方法處理后，獲得纖溶活性蛋白酶CGW-3的純品。
本發(fā)明的內(nèi)容與要點一、鏈霉菌C-3662菌株的篩選將從土壤中分離得到的多種鏈霉菌菌株分別接種到Bennett等瓊脂斜面(葡萄糖1.0％、酵母提取物0.1％、牛肉膏、乳清蛋白水解物0.2％、瓊脂1.2％)上，在28℃培養(yǎng)7-10天，然后挖塊置于酪素平板(含瓊脂糖0.6％，酪素1.5％，于50mM的pH7.5磷酸鈉緩沖液中)和纖維蛋白平板(含瓊脂糖0.6％，纖維蛋白原0.6mg/ml和凝血酶0.28u/ml)上，于37℃放置過夜。如果菌株分泌產(chǎn)生對纖維蛋白特異性較高的具纖溶活性蛋白酶，則在纖維蛋白平板上有透明圈，而在酪素平板上沒有透明圈。第二天觀察平板上透明圈的產(chǎn)生情況，從中篩選在纖維蛋白平板上產(chǎn)生明顯的透明圈而在酪素平板上沒有或幾乎沒有透明圈的菌株C-3662。
二.鏈霉菌菌株C-3662的分類1、形態(tài)特征于高氏1號瓊脂和葡萄糖天冬素瓊脂上28℃培養(yǎng)7天后，菌株C-3662的基內(nèi)菌絲無橫隔、不斷裂，孢于絲波曲至螺旋形，孢子橢圓形，表面光滑(圖1、2)。
2、培養(yǎng)特征選擇鏈霉菌的八種常用的不同營養(yǎng)培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)7-15天。菌株C-3662的菌絲體在各種不同培養(yǎng)基中的表觀特征見表1。
3、生理生化特征本發(fā)明的菌株C-3662是一種需氧菌，在25-30℃，優(yōu)選地在28℃顯示出最佳生長能力。參照“伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊第四卷”(Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology，Vol.IV)，對菌株C-3662進(jìn)行了生理生化特征鑒定，結(jié)果見表2。
表1菌株C-3662的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基氣生菌絲基內(nèi)菌絲 可溶色素高氏合成一號瓊脂 瓦灰色 桂皮淡棕 無葡萄糖天門冬素瓊脂中灰色 無色 無甘油硝酸鹽瓊脂褐灰色 芥褐 無淀粉銨瓊脂淺灰色 微褐 無蘋果酸鈣瓊脂 灰白色 淺黃褐 無營養(yǎng)瓊脂 褐灰色 污褐 淺褐燕麥粉瓊脂燼灰色 淺黃褐 無土豆浸汁瓊脂 褐灰色 淺褐 淺褐表2菌株C-3662的生理生化特征
1、化學(xué)分類(1)細(xì)胞壁化學(xué)組分分析按照Hasegawa，T.等的快速薄板層析法(TLC)對菌株C-3662進(jìn)行全細(xì)胞水解液的氨基酸及糖型分析。結(jié)果表明菌株C-3662含LL-二氨基庚二酸及甘氨酸，無特征性糖(糖型C)。細(xì)胞壁化學(xué)組分屬于I型。(2)按照Lechevalier等的實驗方法進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)菌株C-3662含磷脂酰乙醇胺，磷酸類脂屬于II型。
2、16S rDNA分析按常規(guī)方法提取菌株C-3662的總DNA，采用通用引物進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接用TaqDyeDeoxy Terminator Cycle Sequenc ing Kit測序，電泳及數(shù)據(jù)分析由Applied Biosystems DNA Sequencer(model 377)自動進(jìn)行。將所測得的16S rDNA序列(圖3)與GeneBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種、屬的序列進(jìn)行比較，表明菌株C-3662與泛溫鏈霉菌的16S rDNA序列同源性非常高，為98.19％(圖4)。
根據(jù)多相分類定種的原則，綜合考慮菌株C-3662的培養(yǎng)特征、生理生化及16S rDNA序列分析比較結(jié)果，認(rèn)為菌株C-3662與泛溫鏈霉菌(Streptomyces eurythermus)非常接近，所以將鏈霉菌C-3662菌株定名為泛溫鏈霉菌(Streptomyces eurythermus)C-3662。該菌種已于2001年9月11日送交北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No.0629。
泛溫鏈霉菌C-3662發(fā)酵纖溶酶CGW-3培養(yǎng)基的優(yōu)化泛溫鏈霉菌C-3662的斜面種子培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域公知的合成5號培養(yǎng)基(其組成為可溶性淀粉2.0％，KNO30.1％，NaCl 0.05％，K2HPO4·3H2O0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001％)。泛溫鏈霉菌C-3662于25-30℃，優(yōu)選地28℃，在合成5號培養(yǎng)基斜面中培養(yǎng)7-10天，產(chǎn)生豐富的灰色孢子。
將斜面種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃和pH接近中性的條件下振蕩培養(yǎng)3-5天。
發(fā)酵上清液中的纖溶活性，采用纖維蛋白平板法測定平板含瓊脂糖0.6％，纖維蛋白原0.6mg/ml和凝血酶0.28u/ml；加樣后于37℃保溫16h。
首先選擇了以下6種培養(yǎng)基，進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基組成的初步探索。6種培養(yǎng)基的組成分別為1號葡萄糖1.0％、淀粉3.0％、黃豆餅粉2.0％、NaCl 0.4％、CaCO30.5％。
2號葡萄糖2.5％、淀粉1.0％、黃豆餅粉2.0％、玉米漿0.5％、KH2PO40.05％、MgSO4·7H2O 0.05％、CaCO30.3％。
3號葡萄糖2.0％、淀粉2.0％、黃豆餅粉2.0％、(NH)4SO40.05％、KH2PO40.05％、MgSO40.05％、CaCO30.15％。
4號(Bennett)葡萄糖1.0％、酵母提取物0.1％牛肉膏、乳清蛋白水解物0.2％。
5號(ISP2)葡萄糖1.0％、麥芽提取物0.3％、酵母提取物0.3％、蛋白胨0.5％。
6號(GGCY)葡萄糖10％、甘氨酸0.1％、Difco酪蛋白水解氨基酸0.4％、酵母提取物0.05％、MgSO40.1％、CaCl2·2H2O 0.01％、微量元素溶液0.4％、KH2PO40.2％、Na2HPO4·12H2O 0.8％。其中的微量元素溶液為ZnCl2·2H2O 0.004％、FeCl3·6H2O 0.02％、CuCl2·2H2O 0.001％、MnCl2·4H2O0.001％、Na2B4O7·10H2O 0.001％、(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.001％。
經(jīng)過發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)2號培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液纖溶活性最高，其次為3號培養(yǎng)基。以2號和3號培養(yǎng)基中的共同組分黃豆餅粉-淀粉-葡萄糖-磷酸二氫鉀-硫酸鎂-碳酸鈣為基礎(chǔ)，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。以黃豆餅粉2.0％(氮源)、淀粉1.0％和葡萄糖2.5％(碳源)、磷酸二氫鉀0.05％和硫酸鎂0.05％以及碳酸鈣0.3％(無機(jī)鹽)為基礎(chǔ)，將其發(fā)酵上清液中的纖溶活性定為100％，分別固定氮源變換碳源及固定碳源變換氮源，并研究無機(jī)鹽對發(fā)酵產(chǎn)生纖溶活性的影響，結(jié)果見表3和表4。
綜合表3和表4可以看出，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為黃豆餅粉2.0％、淀粉1.0％、葡萄糖2.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂0.05％、碳酸鈣0.3％。
本發(fā)明所得到的泛溫鏈霉菌C-3662，培養(yǎng)條件簡單、保藏方便，在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中可分泌產(chǎn)生大量的纖溶活性蛋白酶CGW-3于培養(yǎng)液中，而且CGW-3的分離純化也比較簡單。此外，由于泛溫鏈霉菌C-3662系自然分離菌株，所以經(jīng)過多次傳代后，其大量地分泌產(chǎn)生纖溶活性蛋白酶CGW-3的特性沒有退化。由于CGW-3經(jīng)動物試驗后，發(fā)現(xiàn)其溶栓效果良好、副作用小，有望開發(fā)為一類新的溶栓藥物，所以泛溫鏈霉菌C-3662具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價值。
表3不同氮、碳源培養(yǎng)基對泛溫鏈霉菌C-3662發(fā)酵產(chǎn)生纖溶活性的影響
表4不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基對泛溫鏈霉菌C-3662發(fā)酵產(chǎn)生纖溶活性的影響


圖1泛溫鏈霉菌C-3662的菌絲體及孢子絲形態(tài)(×750)。
圖2泛溫鏈霉菌C-3662的孢子表面特征(×6000)圖3泛溫鏈霉菌C-3662的16S rDNA全序列圖4泛溫鏈霉菌C-3662的16S rDNA全序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的泛溫鏈霉菌16S rDNA全序列的比較，二者的同源性為98.19％；圖中的Query為鏈霉菌C-3662的16S rDNA序列，Sbjct為泛溫鏈霉菌的16S rDNA序列。
實施例1待篩選的鏈霉菌菌株接種到Bennett等瓊脂斜面(葡萄糖1.0％、酵母提取物0.1％、牛肉膏、乳清蛋白水解物0.2％、瓊脂1.2％)上，28℃培養(yǎng)10天。然后，從斜面上挖塊，分別置于酪素平板(含瓊脂糖0.6％，酪素1.5％，于50mM的pH7.5磷酸鈉緩沖液中)和纖維蛋白平板(含瓊脂糖0.6％，纖維蛋白原0.6mg/ml和凝血酶0.28u/m1)上，在每塊內(nèi)徑為8.5cm的平板上均勻分開放置25個瓊脂挖塊。37℃保溫16小時。選出在纖維蛋白平板上產(chǎn)生透明圈，而在酪素平板上不產(chǎn)生透明圈的菌株C-3662。
實施例2將在合成5號斜面培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7天的泛溫鏈霉菌C-3662，挖塊接種于裝有100毫升培養(yǎng)基(葡萄糖2.5％，淀粉1.0％，黃豆餅粉2.0％，KH2PO40.05％，MgSO40.05％，CaCO30.3％，pH7.0)的500毫升三角瓶中，28℃振蕩培養(yǎng)48小時，200轉(zhuǎn)/分鐘；然后以5％的接種量轉(zhuǎn)種至裝有1000毫升相同培養(yǎng)基的5000毫升三角瓶中，28℃往返振蕩培養(yǎng)96小時左右；將發(fā)酵液離心或者過濾除去菌絲體，得到上清液，供進(jìn)一步分離純化CGW-3使用。
實施例3將1升發(fā)酵上清液加硫酸銨至80％飽和度，4℃放置過夜，然后8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清。將沉淀溶于水50毫升中，對50mM磷酸鈉(pH8.0)緩沖液透析。將透析后溶液離心以除去不溶物，此時將透析液過DEAE Sepharose柱(25毫米×200毫米)脫色，接著上CMSepharose柱(25毫米×200毫米)，用0.0-1.0M NaCl鹽濃度線性梯度洗脫?；旌匣钚韵疵撘海?M NH4(SO4)2至終濃度為1M，然后上PhenylSepharose柱(15毫米×200毫米)，用1.0-0.0M NH4(SO4)2鹽濃度線性梯度洗脫?；旌匣钚韵疵撘?，用水4℃透析過夜去鹽，然后冷凍干燥，得CGW-3純品。每升發(fā)酵上清液得8毫克左右CGW-3純品，經(jīng)檢測其N-端的15個氨基酸序列為VVGGTRAAQGEFPFM。
權(quán)利要求
1.一種泛溫鏈霉菌(Streptomyces eurythermus)菌株C-3662(保藏號CCMCC No.0629)，其特征是所說的菌株從土壤中分離、篩選并經(jīng)發(fā)酵可產(chǎn)生具有纖溶活性的蛋白酶CGW-3。
2.一種泛溫鏈霉菌菌株C-3662的篩選方法，其特征是在Bennett等瓊脂斜面上得到的培養(yǎng)物，僅在纖維蛋白平板上特異性地產(chǎn)生呈纖溶活性的透明圈，而在酪素平板上不或幾乎不產(chǎn)生透明圈。
3.按照權(quán)利要求1所述的菌株C-3662，其特征是葡萄糖-淀粉-黃豆餅粉-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中發(fā)酵可產(chǎn)生具纖溶活性的蛋白酶CGW-3。的N-端的15個氨基酸為VVGGTRAAQGEFPFM。
4.按照權(quán)利要求1或3所述的菌株C-3662，其特征是經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶活性蛋白酶CGW-3的N-端15個氨基酸序列為VVGGTRAAQGEFPFM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鏈霉菌菌株C－3662，它是從土壤中分離得到、經(jīng)分類鑒定屬于泛溫鏈霉菌的鏈霉菌菌株，其斜面培養(yǎng)物僅在纖維蛋白平板上產(chǎn)生纖溶活性的透明圈，在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中能產(chǎn)生并分泌纖溶活性的蛋白酶CGW－3。
文檔編號C12N1/20GK1408847SQ0113600
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者王以光, 武臨專, 陳昉 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所