專(zhuān)利名稱：利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法屬于快速分離并裂解生物粒子的細(xì)胞以獲取核酸的技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明的特征在于，它依次含有以下步驟(1)在生物樣品中加入可物理吸附含有核酸的細(xì)胞的固相吸附介質(zhì)，它是一種懸浮狀的粒徑范圍為5～10000nm且經(jīng)有機(jī)包覆的納米磁性微球，使它們旋轉(zhuǎn)混勻后靜置；(2)分離出上述固相吸附介質(zhì)，棄去上清液，用緩沖液洗滌；(3)加入細(xì)胞裂解液使其和固相吸附介質(zhì)旋轉(zhuǎn)混勻并靜置后結(jié)合緩沖液使細(xì)胞裂解；(4)用洗脫緩沖液洗滌上述固相吸附介質(zhì)，獲得上述固相吸附介質(zhì)--核酸的復(fù)合物；(5)回收含有核酸的洗脫緩沖液并分離出核酸。
所述的第(4)步獲得的復(fù)合物是一種“微珠—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)”技術(shù)中的目標(biāo)基因擴(kuò)增用的模板。
對(duì)于小分子核酸(RNA或質(zhì)粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在棄去的上清液中再加入固相吸附介質(zhì)，根據(jù)需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步驟(4)、(5)依次進(jìn)行。
所述的固相吸附材料是在室溫下用0.3mol/l NaOH液浸泡過(guò)夜，然后再用0.5mol/lBCl3·2H2O浸泡8小時(shí)經(jīng)去離子水洗至PH值為中性的玻璃纖維膜。
所述的分離固相吸附介質(zhì)和液體的方法是磁場(chǎng)分離法。
所述的細(xì)胞裂解液含有2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100(三硝基甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸鈉)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羥甲基氨基甲烷)(pH6.5)。
所述的細(xì)胞裂解液組成為15～20g GuSCN(異硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE(10mmol/lEDTA，25mmol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
所述的洗脫緩沖液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
使用證明它達(dá)到了預(yù)期目的。
圖2從人全血中用磁球提取的基因組DNA進(jìn)行HLA-A等位基因PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)圖。O陰性對(duì)照，P陽(yáng)性對(duì)照。
圖3用磁性微球從全血中分離DNA的流程示意圖。
實(shí)施例2用納米磁性微球分離大腸桿菌的基因組的(genomic)DNA。
樣品為培養(yǎng)過(guò)夜的不含質(zhì)粒的E.Coli大腸桿菌菌株。取收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液300μl，再加入50μl納米磁性微球懸浮液。振蕩混合后采用磁性分離架分離磁球，棄去上清液。向磁球加入300μl細(xì)胞裂解液(3mol/l NaI，4mol/l尿素，30g/l Triton-100(三硝基甲苯)，10mmol/l EDTA(pH6.5)，25mmol/l Tris·HCl(pH6.5))(下同)，搖勻，室溫靜置5min。加入300μl異丙醇。在旋渦振蕩器上輕微振蕩15s，室溫靜置5min。用磁性分離架把磁球固定，棄上清后，再用70％乙醇洗磁性微球2次。然后加上述100μlTE溶液(pH＝6.0)，室溫靜置10min。再用磁性分離架把磁球固定，收集洗脫液，進(jìn)行紫外分析和瓊脂糖凝膠電泳。DNA產(chǎn)量約為30μg/ml，與傳統(tǒng)的十二烷基硫酸鈉(SDS)加蛋白酶K破胞，酚-氯仿抽提法相比，產(chǎn)量及純度相當(dāng)。
實(shí)施例3用納米磁性微球吸附分離全血中白細(xì)胞并提取其中DNA。
本試驗(yàn)所用全血由健康供血者提供，用血液1/6體積的ACD(23mmol/l檸檬酸，80mmol/l葡萄糖，45mmol/l檸檬酸鈉)抗凝。取適量的血液300μl，加入50μl上述磁性微球溶液(用上述pH＝6.0的TE溶液懸浮)，在旋渦振蕩器上輕微振蕩15s，室溫靜置3min后，用磁性分離架把磁球固定。棄其他部分。加入300μl細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，室溫靜置2min。再加入300μl異丙醇振蕩混勻，室溫靜置5min。用磁性分離架把磁球固定，棄上清液。用70％乙醇洗滌2次磁球后，加入上述pH6.0的TE溶液，10min后用磁性分離架把磁球固定，收集洗脫液，進(jìn)行凝膠電泳分析，紫外分光分析。提取的基因組DNA用瓊脂糖凝膠(0.9％)電泳檢測(cè)，電泳圖譜見(jiàn)附

圖1。該方法建立了一種快速高效的從全血中制備基因組DNA的方法，它不用有毒試劑，操作安全。分別用在上述操作中所獲的含人類(lèi)基因組DNA的洗脫液或所獲的吸附有基因組DNA的磁珠直接作模板進(jìn)行公知的HLA-A(人類(lèi)白細(xì)胞抗原)等位基因的PCR試驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳圖譜見(jiàn)附圖2。本試驗(yàn)建立了一種快速高效的HLA等位基因擴(kuò)增的磁珠-PCR法(microsphere based PCR)，與傳統(tǒng)制樣方法相比更為簡(jiǎn)單，快速，模板制備僅需10min，并且排除了PCR抑制劑，且無(wú)非特異性擴(kuò)增。圖3是本發(fā)明的磁性分離法的流程示意圖。1是白細(xì)胞，2是紅細(xì)胞，3是磁球，4是DNA，5是磁鐵。先使磁球3和生物樣品人全血輕微振蕩再靜置，磁球3吸附白細(xì)胞1后被磁鐵5吸附在管壁，棄去其余溶液。加入細(xì)胞裂解液后進(jìn)入裂解白細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過(guò)程，破胞后，DNA4被磁球3吸附后，在磁鐵5作用下吸附在管壁上，棄去其余溶液，用TE洗脫緩沖液把DNA從磁球上洗下后，將磁球通過(guò)磁鐵5固定，將含DNA的TE溶液移至新管中。對(duì)300μl人全血，采用100μl磁球溶液(15μg/μl)可得到結(jié)果。
實(shí)施例4用納米磁性微球分離大腸桿菌的質(zhì)粒DNA。
樣品為培育過(guò)夜的含質(zhì)粒的E.coli菌株，試驗(yàn)步驟為取收獲的細(xì)胞培育液300μl，然后加入50μl納米磁性微球懸浮液(15μg/μl)，振蕩混合后采用磁性分離架分離磁球，棄溶液，向磁球加入300μl細(xì)胞裂解液，搖勻，室溫靜置5min，再加入300μl異丙醇振蕩混勻，室溫靜置5min。用磁性分離架把磁球固定，轉(zhuǎn)移上清液至另一新管中，重新加入50μl納米磁性微球懸浮液及300μl異丙醇，搖勻，室溫靜置5min，用磁性分離架把磁球固定，棄上清，再用70％乙醇洗滌磁球2次。然后加入上述pH6.0的TE溶液100μl，和適量RNA酶溶液，在適宜溫度下降解RNA。再用磁性分離架將磁球固定，收集洗脫液，進(jìn)行紫外分析和瓊脂糖電泳檢測(cè)。質(zhì)粒DNA產(chǎn)量約為5μg/ml，與傳統(tǒng)的方法相比，產(chǎn)量及純度相當(dāng)。如果要用納米磁性微球分離大腸桿菌的RNA，則可用DNA酶來(lái)代替上述的RNA酶，其余步驟相同。
實(shí)施例5用經(jīng)過(guò)處理的纖維膜吸附DNA片斷。
在高溫消毒的eppendorf管中加入剪成直徑0.5厘米圓形膜片的處理后的玻璃纖維膜，再在纖維膜上加入0.4mg/μl的雙鏈λ-DNAmarker(Hand III酶切)15μl，又加入5mol·L-1NaI溶液80μl，輕微振蕩15s，然后靜置1min。再加入助吸劑異丙醇100μl，輕微振蕩5s，靜置2min。用離心法除去上清液。用100μl、70％的乙醇洗滌吸附DNA的膜片2次。加入50μlTE溶液(pH＝8.0，10mmol·L-1Tris.Cl，1mmol.L-1EDTA)。在水溶中用62℃恒溫12min，把DNA從膜片洗脫下來(lái)。然后用離心法把膜片與TE溶液分離，把得到的TE溶液用瓊脂糖水平凝膠電泳檢測(cè)分離的DNA片斷。整個(gè)操作只需15min。
實(shí)施例6用經(jīng)過(guò)處理的纖維膜分離大腸桿菌的基因組DNA。
樣品為培養(yǎng)過(guò)夜的不含質(zhì)粒的E.Coli菌株。取收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液300μl，然后加入剪成寬0.3厘米的處理過(guò)的條狀纖維膜膜片。振蕩混勻后用吸管吸取再棄去上清液。加入300μl細(xì)胞裂解液(20gGuSCN，100ml TE(pH6.0)(10mmol·L-1Tris.Cl，25mmol.L-1EDTA)，20gPEG8000)，搖勻，室溫靜置5min。加入300μl 70％乙醇，在旋渦振蕩器上輕微振蕩15s，室溫靜置5min。用吸管吸取后再棄去上清液，再用70％乙醇洗膜片2次。然后加pH＝6.0的上述100μl TE溶液，室溫靜置10min。收集洗脫液，進(jìn)行紫外分析和瓊脂糖凝膠電泳。DNA產(chǎn)量約為40μg/ml，與傳統(tǒng)的SDS加蛋白酶K破胞，酚—氯仿抽提法相比，產(chǎn)量及純度相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.一種利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，依次包含分離并裂解生物粒子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)并從中分離出核酸的步驟，其特征在于，它依次含有以下步驟(1)在生物樣品中加入可物理吸附含有核酸的細(xì)胞的固相吸附介質(zhì)，它是一種懸浮狀的粒徑范圍為5～10000nm且經(jīng)有機(jī)包覆的納米磁性微球，使它們旋轉(zhuǎn)混勻后靜置；(2)分離出上述固相吸附介質(zhì)，棄去上清液，用緩沖液洗滌；(3)加入細(xì)胞裂解液使其和固相吸附介質(zhì)旋轉(zhuǎn)混勻并靜置后結(jié)合緩沖液使細(xì)胞裂解；(4)用洗脫緩沖液洗滌上述固相吸附介質(zhì)，獲得上述固相吸附介質(zhì)——核酸的復(fù)合物；(5)回收含有核酸的洗脫緩沖液并分離出核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，其特征在于所述的第(4)步獲得的復(fù)合物是一種“微珠—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)”技術(shù)中的目標(biāo)基因擴(kuò)增用的模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，其特征在于對(duì)于小分子核酸(RNA或質(zhì)粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在棄去的上清液中再加入固相吸附介質(zhì)，根據(jù)需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步驟(4)、(5)依次進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，其特征在于所述的固相吸附材料是在室溫下用0.3mol/l NaOH液浸泡過(guò)夜，然后再用0.5mol/lBCl3·2H2O浸泡8小時(shí)經(jīng)去離子水洗至PH值為中性的玻璃纖維膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，其特征在于所述的分離固相吸附介質(zhì)和液體的方法是磁場(chǎng)分離法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，其特征在于所述的細(xì)胞裂解液含有2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100(三硝基甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸鈉)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羥甲基氨基甲烷)(pH6.5)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，其特征在于所述的細(xì)胞裂解液組成為15～20g GuSCN(異硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE(10mmol/lEDTA，25mmol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法，其特征在于所述的洗脫緩沖液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
全文摘要
利用固相載體從生物粒子中分離核酸的方法屬于生物粒子快速分離技術(shù)領(lǐng)域,其特征在于:它用納米磁性微球懸浮液或經(jīng)特別處理的纖維膜作固相吸附介質(zhì)來(lái)分離生物粒子中的細(xì)胞,再用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu),通過(guò)固相吸附和解吸附以便直接從全血、血漿、唾液、尿液、細(xì)胞和組織培養(yǎng)液等生物樣品中富集含有核酸的白細(xì)胞、病毒粒子、上皮細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等的生物粒子,并獲取核酸。這種方法簡(jiǎn)便快速,可用于各種不同規(guī)模和品種的樣品制備,而且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、微型化裝置的構(gòu)建。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1355319SQ0114044
公開(kāi)日2002年6月26日 申請(qǐng)日期2001年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月7日
發(fā)明者張旭, 謝欣, 陳繼明, 陳德樸, 費(fèi)維揚(yáng), 程京 申請(qǐng)人:清華大學(xué), 北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司