用于治療核酸相關(guān)眼病的組合物及方法
【專利摘要】本文提供一種用于治療核酸相關(guān)眼病的組合物及方法。
【專利說明】用于治療核酸相關(guān)眼病的組合物及方法
[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 本申請(qǐng)案主張2012年2月17日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案第61/600,377號(hào)及 2011年12月12日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案第61/569, 604號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其各自以全文引 用的方式并入本文中。
[0003] 序列表的簡要說明
[0004] 本申請(qǐng)包括根據(jù)美國37C. F. R § § 1. 821-1. 825之序列表。所述序列表系包含于 文件名稱" 11738468_l.txt"中（790字節(jié)，建立于8月14日，2012年），該序列表以引用的 方式并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明關(guān)于一種用于治療核酸相關(guān)眼病的組合物及方法。

【背景技術(shù)】
[0006] 眼表上皮經(jīng)歷連續(xù)動(dòng)態(tài)更新（turnover)，此是正常脫落過程的一部分。此更新在 摧患各種形式核酸相關(guān)眼?。ɡ绺裳鄄。╠ry eye disease, DED))的個(gè)體中增加。淺層 角膜細(xì)胞脫落至角膜前淚膜中。角膜上皮細(xì)胞脫落過程或脫屑是由凋亡機(jī)制來調(diào)節(jié)。死亡 細(xì)胞與垂死細(xì)胞釋放核酸，其是一種損傷相關(guān)分子樣式的分子，其可刺激先天性免疫系統(tǒng) 并使其與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相連結(jié)。例如，在角膜絲狀體中已報(bào)導(dǎo)有胞外DNA鏈，其經(jīng)常存在 于DED患者的角膜中。角膜前淚膜中的脫屑細(xì)胞是胞外DNA的潛在來源。淚液含有若干種 嗜中性白血球胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NET)組分。嗜中性白血球在 眼表上經(jīng)歷低水平增補(bǔ)，且在眼表發(fā)炎期間淚膜中存在大量嗜中性白血球，此對(duì)于癥狀發(fā) 展及擴(kuò)增具有顯著作用。淚液中亦經(jīng)報(bào)導(dǎo)為有嗜中性白血球彈性蛋白酶及組蛋白。該等報(bào) 導(dǎo)證明在淚液中存在胞外DNA、組蛋白、嗜中性白血球、嗜中性白血球彈性蛋白酶及核酸酶 且可能顯示用于在淚膜中連續(xù)產(chǎn)生及清除胞外DNA所存在的機(jī)制。
[0007] 淚膜（例如眼生物膜及黏液膜）中的胞外DNA可在與核酸相關(guān)眼病相關(guān)聯(lián)的病變 中具有作用?？膳c眼粘液膜及/或生物膜的形成相關(guān)聯(lián)的核酸相關(guān)眼病呈現(xiàn)潛在的失能病 狀，其對(duì)與視力相關(guān)的生活品質(zhì)造成不利的影響。其可導(dǎo)致眼部不適及/或視覺功能退化， 例如閱讀速度及對(duì)比敏感度。
[0008] 盡管核酸相關(guān)眼病具有高發(fā)病率，但目前尚無針對(duì)該等病狀的相符的有效治療。 由于傳統(tǒng)上認(rèn)為高滲血癥（hyperosmolarity)及發(fā)炎是干眼病的主要病因，因此目前治療 例如集中于使用眼瞼衛(wèi)生、局部抗生素、口服四環(huán)素（tetracycline)、消炎藥及/或皮質(zhì)類 固醇。該等治療時(shí)常無效或有效性不定。因此，需要新的治療形態(tài)來治療例如可由結(jié)合眼 粘液膜及/或生物膜產(chǎn)生/形成核酸所導(dǎo)致的核酸相關(guān)眼病，例如DED。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本文提供一種用于治療核酸相關(guān)眼病的組合物。該等疾病可能與眼淚品質(zhì)不良有 關(guān)，其可與眼睛表面上或眼睛內(nèi)部的核酸生物膜/粘液膜形成相關(guān)。所述核酸可為胞外。 此疾病的一者為干眼病（DED)。該組合物可包含核酸酶以及眼用賦形劑。核酸酶可為去氧 核糖核酸酶（DNase)或核糖核酸酶（RNase)或其組合。核酸酶可為核酸內(nèi)切酶或核酸外切 酶。DNase可為去氧核糖核酸酶I (DNase I)、去氧核糖核酸酶II (DNase II)、去氧核糖核 酸酶III或微球菌核酸酶。RNase可為核糖核酸酶A (RNase A)、核糖核酸酶H (RNase H)、 核糖核酸酶I (RNase I)、核糖核酸酶II (RNase II)、核糖核酸酶III (RNase III)、核糖核 酸酶D (RNase D)、核糖核酸酶L (RNase L)、核糖核酸酶P (RNase P)、核糖核酸酶PH (RNase PH)、核糖核酸酶PhyM(RNase PhyM)、核糖核酸酶R(RNase R)、核糖核酸酶T(RNase T)、核糖 核酸酶T1 (RNase Tl)、核糖核酸酶T2 (RNase T2)、核糖核酸酶U2 (RNase U2)、核糖核酸酶 VI (RNase VI)、核糖核酸酶V (RNase V)、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I或核糖核酸外切 酶II。所述DNase或RNase可為重組的。組合物可更包含拮抗劑或抑制劑。拮抗劑或抑制 劑可選自由以下所組成的群組：抗生素化合物、toll樣受體拮抗劑（toll-like receptor antagonist)、第一型干擾素拮抗劑、抗菌肽抑制劑、MyD88抑制劑、類固醇、抗過敏化合物、 及嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑及前述的組合。
[0010] 本文亦提供一種治療核酸酶相關(guān)眼病的方法。該方法可包括向眼睛投予有效治療 眼病的量的上述核酸酶組合物與眼用賦形劑。眼睛的眼表可含有淚膜，其可為生物膜或粘 液膜。生物膜或黏液膜可含有核酸。所述核酸可為胞外核酸。所述核酸可為DNA、RNA或其 組合。淚膜在投予組合物之前可含有小于3. 14奈克/毫升的核酸酶。淚膜在投予組合物 之前可含有小于〇.〇5孔尼茲單位（Kunitz unit)的核酸酶活性。有效量的組合物可含有5 奈克/毫升與3毫克/毫升之間的核酸酶。有效量的組合物可含有100奈克/毫升與200 奈克/毫升之間的核酸酶。
[0011] 核酸相關(guān)眼病可為DED、彌漫性板層角膜炎（diffuse lamellar keratitis)、 隱形眼鏡相關(guān)角膜炎、眼內(nèi)炎或感染性結(jié)晶狀角膜病變、眼疤痕性類天皰瘡（ocular cicatricial pemphigoid, 0CP)、干性角膜結(jié)膜炎(keratoconjunctivitis sicca, KCS)、修格連氏癥候群（Sjogren syndrome, SS)、修格連氏癥候群相關(guān)的干性角膜結(jié)膜 炎（Sjogren syndrome associated keratoconjunctivitis sicca)、非修格連氏癥候群 相關(guān)的干性角膜結(jié)膜炎（non-Sjogren syndrome associated keratoconjunctivitis sicca)、干性角膜炎、干性癥候群、干眼癥、淚膜失調(diào)（tear film disorder)、淚液產(chǎn) 生減少、水樣淚液缺乏性干眼癥（aqueous tear deficiency, ATD)、及瞼腺功能失調(diào) (meibomian gland dysfunction, MGD)。DED例如可為自體免疫DED或與修格連氏癥候 群相關(guān)的DED。DED可歸因于一或多種病因，包括：衰老、使用隱形眼鏡及使用藥物。抗生 素可為安比西林（ampicillin)、阿莫西林（amoxicillin)/克拉維酸（clavulanate)、甲 硝唑（metronidazole)、克林達(dá)霉素（clindamycin)、紅霉素（erythromycin)、正大霉素 (gentamicin)、萬古霉素（vancomycin)、環(huán)丙沙星（ciproflaxin)、克林達(dá)霉素、四環(huán)素、抗 焦慮劑或其組合。toll樣受體拮抗劑可為包含序列TTAGGG的寡核苷酸。寡核苷酸可由序 列TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(SEQ ID N0:1)組成。第一型干擾素拮抗劑可為拮抗或競爭 性地抑制第I型干擾素與其受體（例如受體次單元IFNAR-1及/或IFNR-2)結(jié)合的任何 化合物。該化合物可為抗-IFNa抗體?？咕囊种苿┛蔀榧?xì)菌胞外多醣。嗜中性白血球 彈性蛋白酶抑制劑可選自由以下所組成的群組：0N0-5046、MR-889、L-694, 458、CE-1037、 GW-311616TEI-8362、0N0-6818、AE-3763、FK-706、ICI-200, 880、ZD-0892 及 ZD-8321。
[0012] 本文亦提供一種判斷受檢者是否患有核酸酶相關(guān)眼病的方法。該方法可包括自受 檢者收集眼淚樣本?？墒勾藰颖九c結(jié)合DNA的染料（例如picogreen)接觸。作為另一選 擇，可使樣本與去氧核糖核酸酶接觸，且隨后與染料接觸。測(cè)量色彩強(qiáng)度并與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣本 中的染料熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較。與對(duì)照組相比，樣本中的染料熒光強(qiáng)度水平增加可指示干眼 病。
[0013] 本文亦提供一種治療眼部細(xì)菌感染的方法。該方法包括向眼睛投予有效治療此感 染的量的包含核酸酶的組合物。組合物可經(jīng)注射至眼睛中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1顯示DED的生物學(xué)示意圖。在受DED影響的眼睛的眼表上發(fā)現(xiàn)胞外DNA。此 胞外DNA可來自兩種主要來源：嗜中性白血球及結(jié)膜與其他角膜細(xì)胞。嗜中性白血球胞外 DNA形成嗜中性白血球胞外誘捕網(wǎng)（NET)。該等NET具有發(fā)炎性及血管生成性分子，例如抗 菌肽、嗜中性白血球彈性蛋白酶及與其相關(guān)的組蛋白。來自結(jié)膜細(xì)胞以及NET中的胞外DNA 作為「損傷相關(guān)分子樣式」（damaged associated molecule patterns，DAMPS)。DAMPs 觸 發(fā)并維持發(fā)炎。DNA DAMPS是通過toll樣受體9 (TLR9)而增加第一型干擾素，這使得更多 地出現(xiàn)若干種發(fā)炎介體。
[0015] 圖2顯示轉(zhuǎn)移至經(jīng)硅烷涂布的粘性載片上且經(jīng)蘇木精及伊紅（eosin)染色的細(xì) 胞。核及鏈?zhǔn)墙?jīng)蘇木精染色，分別顯示存在胞內(nèi)及胞外DNA，這進(jìn)一步指示NET的存在。
[0016] 圖3顯示經(jīng)用于核酸的DAPI染色劑染色的間接免疫熒光的共軛焦影像（63倍）。 染色劑由細(xì)胞核以及胞外DNA鏈吸收。圖3顯示存在胞外DNA，此對(duì)于NET的形成而言是重 要的。
[0017] 圖4顯示存在來自細(xì)胞的嗜中性白血球及鏈作為胞外DNA。首先以間接免疫熒光 對(duì)細(xì)胞染色。（B)顯示展現(xiàn)核與胞外DNA的胞外鏈樣結(jié)構(gòu)。隨后洗滌該等細(xì)胞，并以蘇木精 及伊紅染色以證明存在來自細(xì)胞的嗜中性白血球及鏈，由此證明NET的存在。
[0018] 圖5顯示一種共軛焦影像，藉此針對(duì)嗜中性白血球彈性蛋白酶、組蛋白及DAPI的 一級(jí)抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢查。為嗜中性白血球彈性蛋白酶染色的顆粒與組蛋白 及核酸具有共同定位。
[0019] 圖6顯示眼表上存在NET (A)。在以去氧核糖核酸酶處理后，鏈狀胞外DNA消失，但 仍維持細(xì)胞完整性（B)。自同一受檢者收集二種樣本（A)與（B)。將樣本A以PBS處理20 分鐘，隨后以DAPI染色。將樣本B以去氧核糖核酸酶（100國際單位/毫升（IU/毫升）） 處理20分鐘，隨后以DAPI染色。
[0020] 圖7顯示證明眼表上存在NET并使其自黏液分化。以DAPI染色來自結(jié)膜表面的 粘液檢體檢體。對(duì)核進(jìn)行染色；但不染色黏液。
[0021] 圖8進(jìn)一步證明存在來自獲得圖7中的檢體的同一受檢者的粘液。以希夫過碘酸 (Periodic Acid Schiff，PAS)對(duì)檢體染色。染色顯示存在粘液鏈。
[0022] 圖9顯示在誤差柱中的標(biāo)準(zhǔn)偏差下，干眼（席爾默測(cè)試（Schirmer' s Test)〈5) 與正常眼淚產(chǎn)生（席爾默測(cè)試>5)相比之圖。干眼病中胞外DNA的光學(xué)密度與正常眼淚 產(chǎn)生相比存在顯著差異。干眼中的光學(xué)密度（17834. 14)大于正常眼淚產(chǎn)生中的光學(xué)密度 (12609. 86)。因此，在干眼病中，由席爾默濾紙獲得的胞外DNA的量與正常眼淚產(chǎn)生時(shí)的席 爾默量相比而言較大。
[0023] 圖10顯示與具有正常眼淚產(chǎn)生的人類（無干眼）相比，在具有嚴(yán)重干眼細(xì)胞的人 類中與干擾素 α?、干擾素 iKTLR-9及Myd88基因的含量相關(guān)的定量即時(shí)PCR數(shù)據(jù)。該等 基因的含量在具有干眼及眼淚缺乏的患者的結(jié)膜中增加數(shù)倍。該等途徑（TLR-9及Myd88) 受胞外DNA刺激，因此提供支持胞外DNA刺激眼表發(fā)炎的受體及轉(zhuǎn)錄資料。下游發(fā)炎介體 (干擾素 α及β)在干眼患者中亦增加。
[0024] 圖11顯示來自席爾默試條壓印的材料。（Α1、Α2):使用席爾默試條（Α1，箭頭）及 經(jīng)硅烷涂布的玻璃載片（Α2)的壓印細(xì)胞學(xué)方法。（Β) :Η&Ε染色顯示脫落的表面細(xì)胞。（C): 在DAPI染色結(jié)膜壓印材料后的寬視場熒光顯微鏡影像展現(xiàn)正常受檢者（C1)中的短且稀疏 的胞外DNA(eDNA)鏈（箭頭）與DED患者（箭頭）中的多個(gè)長eDNA鏈（C2)。（D):在DAPI 染色后的共軛焦免疫熒光影像顯示多個(gè)鏈（箭頭）及具有多葉核的嗜中性白血球。（E): 共軛焦免疫熒光染色影像顯示組蛋白（E1，綠色）、嗜中性白血球彈性蛋白酶（E2,紅色）及 eDNA (E3,藍(lán)色）是NET的分子組分（E4,疊加）。箭頭指示NET鏈。E2中的插圖顯示具有經(jīng) DAPI染色的多葉形細(xì)胞核（multilobed nucleus)的嗜中性白血球。比例尺：B、Cl、C2及 D(50微米）；E1及E2插圖（10微米）。
[0025] 圖12顯示粘液膜中的eDNA及嗜中性白血球胞外誘捕網(wǎng)（NET)。（A):患有嚴(yán)重眼 淚缺乏DED的患者眼睛的臨床相片。箭頭指示角膜與球結(jié)膜（A1)及下穹窿（A2)上的黏液 膜。插圖顯示粘液膜的放大圖。（B):粘液膜的細(xì)胞學(xué)檢查。（Bl) :H&E染色顯示表面上皮 細(xì)胞及多個(gè)嗜中性白血球。（B2) :DAPI染色顯示存在eDNA鏈（箭頭）及嗜中性白血球的 多葉核。（B3):嗜中性白血球彈性蛋白酶免疫染色（紅色）證明存在嗜中性白血球。（C) : 共軛焦免疫熒光染色影像顯示嗜中性白血球彈性蛋白酶（C1，紅色）、組蛋白（C2,綠色）及 eDNA (C3,藍(lán)色）是NET的分子組分（C4,疊加）。箭頭指示NET鏈。（D):進(jìn)行激光捕獲顯微 剖檢（Laser capture microdissection，LCM)以捕獲經(jīng)DAPI染色的鏈，從而證明其中存在 DNA。在D1中，箭頭指示eDNA鏈。在D2中，星號(hào)占據(jù)鏈中LCM后的區(qū)域。（03) :eDNA鏈分 道中的GAPDHPCR產(chǎn)物證明存在DNA物質(zhì)。比例尺：B1、B2及B3(20微米）；C、D1及D2(50 微米）。
[0026] 圖13顯示嗜中性白血球（A1-A4):在黏液膜（A1，箭頭）及eDNA鏈（A1，箭頭）中 存在抗菌肽（綠色）?？咕呐c嗜中性白血球彈性蛋白酶（A2,紅色）及DAPI核染色劑（A3， 藍(lán)色）具有共同定位。（B1-B4) :嗜中性白血球（B1，箭頭）中存在抗菌肽（綠色）且其與 嗜中性白血球彈性蛋白酶（B2,紅色）及DAPI (B3,藍(lán)色）具有共同定位。（C1-C4):抗菌肽 (C1，箭頭）及經(jīng)DAPI染色的核物質(zhì)（C3,箭頭）自嗜中性白血球擠出形成NET。比例尺：10 微米。
[0027] 圖14顯示DED患者與對(duì)照物中的基因表現(xiàn)。㈧：使用席爾默I測(cè)試的測(cè)量的平均 水樣淚液的產(chǎn)量在DED患者中顯著較低。（B):將席爾默條壓印于玻璃載片上后，測(cè)量eDNA 的長度。eDNA的長度在DED患者中顯著較大。（C):使用Picogreen檢定測(cè)量席爾默條上的 eDNA的量。DED患者具有顯著較大的eDNA的量。（D) :eDNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因在來自 DED患者的脫落結(jié)膜細(xì)胞中顯著過度表現(xiàn)。（E):發(fā)炎基因表現(xiàn)在DED患者中亦顯著增加。 *ρ〈0· 05〇
[0028] 圖15顯示淚液（A1-A6)中存在核酸酶及去氧核糖核酸酶I :免疫熒光顯微鏡影像 顯示人類淚腺中的去氧核糖核酸酶1(A1-A3,紅色）。通過肽競爭（peptide competition) (A4-A6)及同型對(duì)照染色（isotype control staining)(未顯示）證明染色的特異性。（B): 正常受檢者眼淚中的核酸酶活性。去氧核糖核酸酶I ELISA顯示其在正常淚液中的濃度為 3. 14奈克/毫升。在去氧核糖核酸酶檢測(cè)套組（DNase Detection Kit)中，正常眼淚完全 降解DNA(眼淚分道）。因此，淚液核酸酶活性大于0.05孔尼茲單位。（C):使用FRET檢定 定量眼淚中的核酸酶活性。對(duì)比DED患者（藍(lán)色）與健康個(gè)體（綠色）中的核酸酶活性的 代表圖顯示DED患者中的核酸酶活性降低。（D) :DE：D患者中的核酸酶活性與健康個(gè)體相比 顯著較低。*P〈〇. 05,比例尺：20米。
[0029] 圖16顯示涂于細(xì)菌培養(yǎng)盤上的粘液膜?；加袊?yán)重淚液缺乏干眼病的患者的眼表 上可具有粘液膜。使用無菌eSwab自眼表提起黏液膜。觀測(cè)革蘭氏陽性球菌（Gram positive cocci)的生長，將其鑒別為凝固酶陰性葡萄球菌物種。（A)血液瓊脂培養(yǎng)盤顯示釘頭細(xì)菌 群落。（B)對(duì)來自培養(yǎng)群落的涂片進(jìn)行背光活/死染色顯示活球菌（綠色）與死球菌（紅 色）混雜。該等實(shí)驗(yàn)證明在干眼患者的眼表上的粘液膜中存在細(xì)菌。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 本
【發(fā)明者】驚人地發(fā)現(xiàn)，在存在或不存在抗生素的情形下，可通過核酸酶以及眼用 賦形劑來治療核酸相關(guān)眼病，例如DED及DED相關(guān)病狀。此發(fā)現(xiàn)的中心在于在患有核酸相 關(guān)眼?。ɡ鏒ED)的受檢者的眼表面上存在嗜中性白血球胞外誘捕網(wǎng)（NET)。NET是由染 色質(zhì)（其包括核酸，例如DNA)、嗜中性白血球彈性蛋白酶、組蛋白及顆粒蛋白組成的胞外結(jié) 構(gòu)。NET可提供抗微生物活性的局部濃度，且因此在發(fā)炎位點(diǎn)是普遍的。
[0031] 1.定義
[0032] 本文所用的術(shù)語僅為描述特定實(shí)施例的目的且不欲具限制性。如說明書及隨附的 申請(qǐng)專利范圍中所用，除非上下文另外明確指示，否則單數(shù)形式的「一」及「該」是指包括復(fù) 數(shù)個(gè)提及物。
[0033] a.對(duì)照
[0034] 本文所用的「對(duì)照」可意謂已知未患有干眼病或未受細(xì)菌感染的組合物或樣本 (陰性對(duì)照）。陽性對(duì)照可意謂患有核酸相關(guān)眼病或受細(xì)菌感染的樣本。任何對(duì)照均可包 含已知量的胞外DNA。
[0035] 為詳述本文的數(shù)字范圍，明確涵蓋其間具有相同精確度的每個(gè)中介數(shù)字。舉例言 之，對(duì)于6至9的范圍而言，除6與9之外涵蓋數(shù)字7與8,且對(duì)于范圍6. 0至7. 0而言，明 確涵蓋數(shù)字 6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 及 7. 0。
[0036] 2.基于核酸酶的組合物
[0037] 本文提供一種基于核酸酶的組合物（"核酸酶組合物"），其能夠自眼睛表面或眼 睛內(nèi)部移除核酸。核酸可為胞外的。核酸酶組合物可含有一或多種核酸酶。核酸酶可為去 氧核糖核酸酶或核糖核酸酶。核酸酶組合物也可含有眼用賦形劑。核酸酶組合物可更含有 一或多種抗生素化合物、抗病毒化合物、消炎劑、toll樣受體拮抗劑、第一型干擾素拮抗劑、 抗菌肽抑制劑、MyD88抑制劑、類固醇、抗過敏化合物及/或嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制 齊?。作為另一選擇，核酸酶組合物可不含抗生素化合物、抗病毒化合物、消炎劑、toll樣受 體拮抗劑、第一型干擾素拮抗劑、抗菌肽抑制劑及/或嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑中 的任一者，而是以與抗生素化合物、toll樣受體拮抗劑、第一型干擾素拮抗劑、抗菌肽抑制 劑及/或嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑中一或多者的組合形式來使用。
[0038] 可在使用之前適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)核酸酶組合物的pH及/或容積滲透濃度。核酸酶組合 物的pH可在4與9之間、5與8之間、6與7之間或6. 5與7. 5之間。核酸酶組合物的pH 可為 4· 1、4· 2、4· 3、4· 4、4· 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9、5· 0、5· 1、5· 2、5· 3、5· 4、5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、 5. 9、6. 0、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9、7. 0、7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、 7· 8、7· 9、8· 0、8· 1、8· 2、8· 3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 7、8· 9 或 9· 0。核酸酶的 pH 可為 7· 4。
[0039] 核酸酶組合物的容積滲透濃度可為低滲透濃度或等張滲透濃度。舉例言之，去氧 核糖核酸酶組合物可具有界于100毫滲透壓莫耳/升與500毫滲透壓莫耳（mOsm) /升之間、 150毫滲透壓莫耳/升與450毫滲透壓莫耳/升之間、200毫滲透壓莫耳/升與400毫滲透 壓莫耳/升之間、250毫滲透壓莫耳/升與350毫滲透壓莫耳/升之間、275毫滲透壓莫耳 /升與325毫滲透壓莫耳/升之間、100毫滲透壓莫耳/升與150毫滲透壓莫耳/升之間、 150毫滲透壓莫耳/升與200毫滲透壓莫耳/升之間、150毫滲透壓莫耳/升與300毫滲透 壓莫耳/升之間、200毫滲透壓莫耳/升與300毫滲透壓莫耳/升之間、0毫滲透壓莫耳/ 升與100毫滲透壓莫耳/升之間、25毫滲透壓莫耳/升與75毫滲透壓莫耳/升之間、50毫 滲透壓莫耳/升與125毫滲透壓莫耳/升之間或0毫滲透壓莫耳/升與50毫滲透壓莫耳 /升之間的容積滲透濃度。
[0040] a.核酸酶
[0041] 本發(fā)明所涵蓋的核酸酶是包括去氧核糖核酸酶及核糖核酸酶。
[0042] 去氧核糖核酸酶可為催化DNA主鏈中的磷酸二酯鍵水解裂解的任何酶。此酶的一 者為去氧核糖核酸酶。去氧核糖核酸酶的例子包括（但不限于）：去氧核糖核酸酶I (DNase I)、去氧核糖核酸酶Π (DNase II)及微球菌核酸酶。去氧核糖核酸酶可為重組人類去氧核 糖核酸酶或動(dòng)物來源形式（例如，牛）或微生物來源形式。重組DNase I可為去氧核醣酶 α，其可以商標(biāo)名稱PULMOZYME11購自Genentech，Inc。去氧核糖核酸酶變異體可通 過例如移除信號(hào)肽、突變受質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)或胺基酸取代來改變其遺傳組成以產(chǎn)生過度活躍變 異體或更穩(wěn)定變異體而產(chǎn)生。舉例言之，可組合或單獨(dú)使用DNase II或其變異體DNase樣 I、II 或 III。
[0043] 核糖核酸酶可為催化RNA主鏈中的磷酸二酯鍵水解裂解的任何酶。一種此酶為 核糖核酸酶。核糖核酸酶的例子包括（但不限于）：核糖核酸酶A(RNase A)、核糖核酸酶 H(RNase H)、核糖核酸酶I(RNase I)、核糖核酸酶II(RNase II)、核糖核酸酶III(RNase III)、核糖核酸酶D(RNase D)、核糖核酸酶L(RNase L)、核糖核酸酶P(RNase P)、核糖核 酸酶PH(RNase PH)、核糖核酸酶PhyM(RNase PhyM)、核糖核酸酶R(RNase R)、核糖核酸酶 T(RNase T)、核糖核酸酶Tl(RNase T1)、核糖核酸酶T2(RNase T2)、核糖核酸酶U2(RNase U2)、核糖核酸酶VI (RNase VI)、核糖核酸酶V(RNase V)、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I 及核糖核酸外切酶II。核糖核酸酶可為重組人類核糖核酸酶或動(dòng)物或微生物來源形式（例 如，牛）。核糖核酸酶變異體可通過例如移除信號(hào)肽、突變受質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)或胺基酸取代來改 變其遺傳組成以產(chǎn)生過度活躍變異體或更穩(wěn)定變異體而產(chǎn)生。
[0044] 核酸酶可僅裂解核酸分子末端的殘基（去氧核糖核酸外切酶或核糖核酸外切酶， 核酸外切酶的類型）。核酸酶可為核酸內(nèi)切酶，其可單獨(dú)使用或與另一種核酸酶組合使用。 核酸內(nèi)切酶的例子為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白及RNase A。核酸酶可沿鏈在任何位置裂解（去氧核糖 核酸內(nèi)切酶或核糖核酸內(nèi)切酶，核酸內(nèi)切酶的子集）。核酸酶關(guān)于其切割的DNA序列可不加 區(qū)別。核酸酶可具序列特異性。核酸酶可僅裂解雙鏈核酸、僅裂解單鏈核酸，或裂解雙鏈與 單鏈核酸二者。
[0045] 核酸酶劑量可由醫(yī)生例如不經(jīng)過度實(shí)驗(yàn)而確定。倘若存在任何相反適應(yīng)癥、耐受 性或類似病狀，則可調(diào)整劑量。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可容易地評(píng)估該等因素，且基于此資訊來確 定欲如本文所述使用的核酸酶的特定有效濃度。核酸酶存在于核酸酶組合物中的量可介于 5奈克/暈升與3暈克/暈升之間、1暈克/暈升與3暈克/暈升之間、2暈克/暈升與3暈 克/暈升之間、10奈克/暈升與900奈克/暈升之間、20奈克/暈升與800奈克/暈升之 間、30奈克/毫升與700奈克/毫升之間、40奈克/毫升與600奈克/毫升之間、50奈克/ 毫升與600奈克/毫升之間、60奈克/毫升與500奈克/毫升之間、70奈克/毫升與400 奈克/毫升之間、80奈克/毫升與300奈克/毫升之間、90奈克/毫升與200奈克/毫升 之間、50奈克/毫升與250奈克/毫升之間、100奈克/毫升與200奈克/毫升之間、150奈 克/暈升與250奈克/暈升之間、100奈克/暈升與150奈克/暈升之間或90奈克/暈升 與100奈克/毫升之間。核酸酶存在于核酸酶組合物中的量可為10奈克/毫升、20奈克/ 暈升、30奈克/暈升、40奈克/暈升、50奈克/暈升、60奈克/暈升、70奈克/暈升、80奈 克/毫升、90奈克/毫升、100奈克/毫升、110奈克/毫升、150奈克/毫升、200奈克/毫 升、250奈克/毫升、300奈克/毫升、350奈克/毫升、400奈克/毫升、450奈克/毫升、500 奈克/毫升、550奈克/毫升、600奈克/毫升、650奈克/毫升、700奈克/毫升、750奈克/ 暈升、800奈克/暈升、850奈克/暈升、900奈克/暈升、950奈克/暈升、1暈克/暈升、2 毫克/毫升或3毫克/毫升。如本文中更詳細(xì)描述，組合物可以合適劑型（例如，滴眼劑） 經(jīng)手動(dòng)傳遞至眼睛，或借助通常提供定量藥物的合適微滴或噴霧裝置來傳遞。
[0046] (1)眼用賦形劑
[0047] 所述眼用賦形劑可為任何眼用賦形劑。眼用賦形劑可為緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤 劑及/或抗氧化劑。緩沖劑可為硼酸及/或磷酸。緩沖劑可使核酸酶組合物的pH變化最小 化。張力調(diào)節(jié)劑可提供等張環(huán)境且可包括氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂及/或硼酸?？寡趸瘎├?如包括偏亞硫酸氫鈉及EDTA?？寡趸瘎┛捎糜谳o助穩(wěn)定核酸酶組合物。濕潤劑（其包括聚 乙烯醇（PVA)及聚山梨醇酯80)使得核酸酶組合物可展布于眼睛上。其他眼用賦形劑包括 苯扎氯銨（BAK)、乙二胺四乙酸（EDTA)、碳酸鈉（purite)、氯丁醇、過硼酸鈉及山梨酸、過硼 酸鈉、碳酸鈉、多元醇、甘油、聚山梨醇酯80、葡聚糖70、丙二醇及聚乙二醇（例如PEG-400)。 眼用賦形劑可為軟膏，例如礦物油、白石蠟脂、白軟膏或羊毛脂。類似于水性媒劑，石蠟脂及 礦物油可充當(dāng)軟膏調(diào)配物中的媒劑以增加眼部接觸時(shí)間。該等成分可有助于在眼球表面上 形成一閉塞性膜且通過增強(qiáng)粘液素及水性層來改良淚膜的組成。眼用賦形劑可提供粘液素 樣特性及/或減少由于蒸發(fā)而損失水性層。眼用賦形劑可充當(dāng)載劑，例如如下文所述的醫(yī) 藥學(xué)上可接受的載劑。
[0048] (2)抗生素
[0049] 所述抗生素可為任何抗生素?？股乜蔀榘脖任髁?、阿莫西林/克拉維酸、甲硝唑、 克林達(dá)霉素、紅霉素、正大霉素、萬古霉素、環(huán)丙沙星、克林達(dá)霉素、四環(huán)素、抗焦慮劑、阿米 卡星（amikacin)、卡那霉素（kanamycin)、新霉素（neomycin)、奈替米星（netilmicin)、鏈 霉素（streptomycin)、托普霉素（tobramycin)、替考拉寧（teicoplanin)、萬古霉素、阿奇 霉素（azithromycin)、克拉霉素（clarithromycin)、克拉霉素（clarithromycin)、地紅霉 素（dirithromycin)、紅霉素、羅紅霉素（roxithromycin)、醋竹桃霉素（troleandomycin)、 阿莫西林、安比西林、阿洛西林（azlocillin)、羧節(jié)西林（carbenicillin)、氯扎西 林（clozacillin)、雙氯西林（dicloxacillin)、氟氯西林（flucozacillin)、美洛 西林（mezlocillin)、萘夫西林（nafcillin)、盤尼西林（penicillin)、哌拉西林 (piperacillin)、替卡西林（ticarcillin)、桿菌膚（bacitracin)、黏桿菌素（colistin)、 多黏菌素 B (polymyxin B)、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin)、依諾沙星（enoxacin)、加替 沙星（gatifloxacin)、左氧氟沙星（levofloxacin)、洛美沙星（lomefloxacin)、莫 西沙星（moxifloxacin)、諾氟沙星（norfloxacin)、氧氟沙星（oflazacin)、曲伐沙 星（trovafloxacin)、橫胺米?。╩afenide)、乙酉先橫胺（sulfacetamide)、橫胺甲二 唑（sulfamethizole)、柳氮橫胺卩比陡（sulfasalazine)、橫胺異惡唑（sulfisoxazole)、 三甲氧節(jié)二氨啼陡（trimethoprim)、磺胺甲基異惡唑（cotrimoxazole)、地美環(huán)素 (demeclocycline)、強(qiáng)力霉素（soxycycline)、二甲胺四環(huán)素（minocycline)、多西環(huán)素 (doxycycline)或氧四環(huán)素（oxytetracycline)。所述抗生素可為一眼科上可接受的抗生 素。
[0050] (3)抗病毒物
[0051] 所述抗病毒化合物可為任何抗病毒物?？共《净衔锟蔀榘涂f (abacavir)、阿昔洛韋（acyclovir)、阿德福韋（adefovir)、金剛焼胺（amantadine)、 安普那韋（amprenavir)、安普利近（ampligen)、阿比朵爾（arbidol)、阿扎那韋 (atazanavir)、阿曲派拉（atripla)、波西普韋（boceprevir)、西多福韋（cidofovir)、 地瑞納韋（darunavir)、地拉夫定（delavirdine)、地達(dá)諾新（didanosine)、二十二醇 (docosanol)、依度尿苷（edoxudine)、依法韋侖（efavirenz)、恩曲他濱（emtricitabine)、 恩夫韋地（enfuvirtide)、恩替卡韋（entecavir)、泛昔洛韋（famcyclovir)、福米韋 生（fomivirsen)、福沙那韋（fosamprenavir)、更昔洛韋（gancyclovir)、伊巴他濱 (ibacitabine)、伊木那韋（imunovir)、碘苷（idoxuridine)、咪喹莫特（imiquimod)、萌地 那韋（indinavir)、拉米咲定（lamivudine)、洛匹那韋（lopinavir)、洛韋胺（loviride)、 馬拉韋羅（maraviroc)、嗎啉胍（moroxydine)、噴昔洛韋（pencyclovir)、卩瓜雷米韋 (peremivir)、普可那利（pleconaril)、利巴韋林（ribavirin)、利托那韋（ritonavir)、 沙奎那韋（saquinavir)、特拉匹韋（telaprevir)、替諾福韋（tenofovir)、特魯瓦 達(dá)（truvada)、伐昔洛韋（valacyclovir)、纟顏更昔洛韋（valgancyclovir)或扎那米韋 (zanamivir)。所述抗病毒物可為一眼科上可接受的抗病毒物。
[0052] (4)消炎藥
[0053] 所述消炎藥可為非類固醇或類固醇消炎藥。消炎藥可為環(huán)孢靈（cyclosporine) 或環(huán)孢靈A。環(huán)孢靈A可為0.05%濃度的環(huán)孢靈A(例如，RESTASIS^)。所述消炎藥可 為一眼科上可接受的消炎藥。
[0054] (5)Toll樣受體-9拮抗劑
[0055] 所述Toll樣受體9 (TLR9)可識(shí)別區(qū)別微生物DNA與哺乳動(dòng)物DNA的特異性未甲基 化CpG寡核苷酸（ODN)序列。toll樣受體拮抗劑可為可中和CpGODN的刺激作用的任何寡 核苷酸。該等寡核苷酸可由C或A的三個(gè)連續(xù)G下游來表征。此外，添加第四個(gè)G(G-四分 體）可增加0DN的抑制能力。最有效的抑制序列為含有TTAGGG的序列，例如（TTAGGG) 4(SEQ ID NO: 1)。例如參見圖1。拮抗劑寡核苷酸可通過例如在內(nèi)體小泡中干擾CpG ODN與TLR9 的共同定位來起作用。所述toll樣受體-9拮抗劑可為一眼科上可接受的toll樣受體-9 拮抗劑。
[0056] (6)第一型干擾素拮抗劑
[0057] 所述第一型干擾素是對(duì)病毒感染及某些胞內(nèi)寄生蟲的防御反應(yīng)的一部分。同時(shí)， 該等蛋白具有針對(duì)某些病毒疾病、腫瘤及多發(fā)性硬化癥的治療用途。在某些疾病狀態(tài)中可 不當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生第一型干擾素。
[0058] 第一型干擾素拮抗劑可為拮抗或競爭性地抑制第I型干擾素的任何化合物。該化 合物例如可為抗-干擾素 α抗體。該化合物可拮抗或抑制結(jié)合其受體的第一型干擾素。該 化合物可拮抗或抑制結(jié)合其受體次單元（IFNAE-1或IFNR-2)的第一型干擾素。拮抗劑或 競爭性抑制劑可阻斷原生干擾素的生物學(xué)活性。所述第一型干擾素拮抗劑可為一眼科上可 接受的第一型干擾素拮抗劑。
[0059] (7)抗菌肽抑制劑
[0060] 所述抗菌肽抑制劑可為能夠阻斷或減小抗菌肽的生物學(xué)活性的任何抑制劑，其可 穩(wěn)定眼睛眼表上的胞外DNA?？咕囊种苿┑睦訛榧?xì)菌胞外多醣。所述抗菌肽抑制劑可 為一眼科上可接受的抗菌肽抑制劑。
[0061] (8)MyD88 抑制劑
[0062] 所述MyD88抑制劑可為可抑制或減小MyD88的生物學(xué)活性或表現(xiàn)的任何化合物。 MyD88抑制劑可為抑制MyD88均二聚作用的肽或小分子，例如ST2825 (Sigma Tau，波梅齊 亞，意大利）、合成寡肽IMG2205 (Imgenex Corporation,圣地亞哥，加利福尼亞州）及/或 MyD88抑制肽（MIP)。MyD88抑制劑可抑制MyD88結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)搭配物。所述MyD88抑制 劑可為一顯性陰性MyD88蛋白。所述MyD88抑制劑可為一抑制MyD88表現(xiàn)的反義siRNA或 shRNA分子。
[0063] (9)嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑
[0064] 所述嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑可為可抑制或減小嗜中性白血球彈性蛋白 酶的生物學(xué)活性的任何化合物，其是在發(fā)炎期間由嗜中性白血球所分泌的絲胺酸蛋白酶。 舉例言之，所述抑制劑可為合成的、天然的、可逆的或不可逆的。舉例言之，所述嗜中性白血 球彈性蛋白酶抑制劑可為 0N0-5046、MR-889、L-694, 458、CE-1037、GW-311616 或 TEI-8362。 所述嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑可為0N0-6818、AE-3763、FK-706、ICI-200,880、 ZD-0892 或 ZD-8321。參見例如調(diào)研藥物專家評(píng)論（Expert Opinion on Investigational Drugs) ,2002年7月，第11卷，第7期：第965-980頁（作為C0PD的治療的嗜中性白血球 彈性蛋白酶抑制劑，Hiroyuki Ohbayashi)。所述嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑可為一眼 科上可接受的嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑。
[0065] b.醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑
[0066] 核酸酶化合物可并入適合投予受檢者（例如患者，可為人類或非人類）的醫(yī)藥組 合物中。核酸酶組合物通常包含適合眼科傳遞的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者 已知合適的眼用載劑且所有該等現(xiàn)有載劑均可用于本發(fā)明中。可用于促進(jìn)且加速局部組合 物經(jīng)皮傳遞至眼睛或附件組織中的合適的載劑包括（但不限于）醇（乙醇、丙醇及壬醇）、 脂肪醇（月桂醇）、脂肪酸（戊酸、己酸及癸酸）、脂肪酸酯（肉豆蘧酸異丙酯及正己酸異丙 酯）、烷基酯（乙酸乙酯及乙酸丁酯）、多元醇（丙二醇、丙二酮及己三醇）、亞砜（二甲亞 砜及癸基甲基亞砜）、酰胺（脲、二甲基乙酰胺及吡咯啶酮衍生物）、界面活性劑（月桂基硫 酸鈉、鯨錯(cuò)基三甲基溴化銨、泊咯沙姆（polaxamer)、司盤類（spans)、吐溫類（tweens)、膽 鹽及卵磷脂）、萜烯（d_檸檬烯、α-萜品醇、1，8-桉醚及薄荷酮）及烷酮（N-庚烷及N-壬 烷）。此外，經(jīng)局部投予的組合物包含表面粘附性分子調(diào)節(jié)劑，其包括（但不限于）鈣黏蛋 白拮抗劑、選擇素拮抗劑及整合素拮抗劑。組合物視情況更含有選自由以下所組成的群組 的化合物：生理學(xué)上可接受的鹽、泊咯沙姆（poloxamer)類似物與卡波普（carbopol)、卡波 普/羥丙基甲基纖維素（HPMC)、卡波普-甲基纖維素、羧甲基纖維素（CMC)、玻尿酸、環(huán)糊精 及石油。此外，經(jīng)局部投予的組合物可包含表面粘附性分子調(diào)節(jié)劑，其包括（但不限于）鈣 黏蛋白拮抗劑、選擇素拮抗劑及整合素拮抗劑。因此，特定載劑可采用無菌眼用軟膏、乳霜、 凝膠、溶液或分散液的形式。合適的眼用載劑亦包括緩釋聚合物（例如，"Ocusert"聚合物、 "Hydron"聚合物等）。
[0067] 亦可使用穩(wěn)定劑，例如螯合劑，例如EDTA。也可使用抗氧化劑，例如亞硫酸氫鈉、 硫代亞硫酸鈉、8-羥基喹啉或抗壞血酸。對(duì)于水性調(diào)配物而言，通常將由現(xiàn)有眼用防腐劑 來維持無菌性，例如氯丁醇（chiorbutanol)、苯扎氯銨、鯨錯(cuò)基氯化批錠、苯基萊鹽、硫柳萊 等，且以無毒且一般在水溶液重量的約0. 001至約0. 1 %之間變化的量來使用。用于軟膏 的現(xiàn)有防腐劑包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯及對(duì)羥基苯甲酸丙酯。典型軟膏基質(zhì)包括白石蠟脂及 礦物油或液體石蠟脂。然而，經(jīng)防腐的水性載劑較佳。溶液可以合適劑型（例如，滴眼劑） 經(jīng)手動(dòng)傳遞至眼睛，或借助通常提供定量藥物的合適微滴或噴霧裝置來傳遞。合適眼用載 劑的例子包括含有微量（亦即，小于約5重量％ )羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇、羧甲基纖 維素、羥乙基纖維素、甘油及EDTA的無菌、實(shí)質(zhì)上等張的水溶液。溶液較佳是維持在實(shí)質(zhì) 上中性的pH，且與適當(dāng)量的現(xiàn)有緩沖劑（例如，磷酸鹽、硼酸鹽、乙酸鹽、三羥甲基氨基甲烷 (tris))等張。
[0068] 醫(yī)藥學(xué)上可接受的眼用載劑可更包含大量輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、防腐 劑或緩沖劑，其可增強(qiáng)核酸酶、抗生素化合物、抗病毒化合物、toll樣受體拮抗劑、第一型干 擾素拮抗劑、抗菌肽抑制劑及/或嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑的存放期或有效性。 [0069] 有多種傳遞系統(tǒng)為已知且可用于投予本文所述的適用于治療或緩解核酸相關(guān)眼 病或其一或多種癥狀的組合物，例如囊封于脂質(zhì)體、微粒、微囊中?？赏ㄟ^注射投予組合物。 舉例言之，可將組合物注射至眼睛中。核酸酶組合物可為液體滴眼劑、凝膠或軟膏形式，其 可直接涂覆至受影響眼睛的眼表。滴劑、凝膠或軟膏可根據(jù)醫(yī)生說明及/或根據(jù)劑量推薦 來涂覆。舉例言之，一滴含有1〇〇奈克/毫升與200奈克/毫升之間核酸酶的組合物可每 天投予1至10次、每天投予1至7次、每天投予1至4次或每天投予1至3次。
[0070] 本文所述的核酸酶組合物可通過隱形眼鏡而傳遞至眼睛。舉例言之，可將組 合物并入鏡片中或涂布于鏡片上。組合物是由隱形眼鏡聚合物化學(xué)結(jié)合或物理包埋 (entrapped)。作為另一選擇，由以與治療性藥物組合物相同速率釋放的聚合物組合物化學(xué) 結(jié)合或物理包埋著色添加劑，從而使該著色添加劑的強(qiáng)度變化指示保持結(jié)合或包埋于聚合 物內(nèi)的治療性藥物組合物的量或劑量變化。作為另一選擇，或著額外地，于隱形眼鏡聚合物 中化學(xué)結(jié)合或物理包埋紫外線（UV)吸附劑。所述隱形眼鏡是疏水性或親水性的。
[0071] 用于促進(jìn)疏水性鏡片傳遞本發(fā)明組合物的例示性物質(zhì)包括（但不限于）阿 美?？?A (amefocon A)、阿昔?？?A (amsilfocon A)、爾奎那?？?A (aquilafocon A)、 阿?？礎(chǔ) (arfocon A)、開布福康A(chǔ) (cabufocon A)、開布福康B (cabufocon B)、卡布昔 福康 A (carbosilfocon A)、奎?？?A (crilfocon A)、奎?？?B (crilfocon B)、地美福 康 A (dimefocon A)、因伏?？?A (enf lufocon A)、因伏落福康 B (enf lofocon B)、艾瑞福 康 A(erifocon A)、伏歐落?？?A(fluorofocon A)、伏昔?？?A(flusilfocon A)、伏昔 ?？?B(flusilfocon B)、伏昔福康 C(flusilfocon C)、伏昔?？?D(flusilfocon D)、伏 昔?？?E(flusilfocon E)、黑沙?？?A(hexafocon A)、后佛福康 A(hofocon A)、亥布 ?？礎(chǔ)(hybufocon A)、依他必思伏歐落?？礎(chǔ)(itabisfluorofocon A)、依他伏歐落福 康 A(itafluorofocon A)、依他?？?A(itafocon A)、依他?？?B(itafocon B)、可?？?A(kolfocon A)、可?？?B(kolfocon B)、可福康 C(kolfocon C)、可?？?D(kolfocon D)、 落提?？礎(chǔ)(lotifocon A)、落提?？礏(lotifocon B)、落提福康C(lotifocon C)、美拉福 康 A(melafocon A)、米嘎福康 A(migafocon A、奈福康 A(nefocon A)、奈福康 B(nefocon B)、奈福康 C(nefocon C)、央昔?？?A(onsifocon A)、歐匹福康 A(oprifocon A)、歐可喜 伏?？?A (oxyfluflocon A)、帕伏?？?B (paflufocon B)、帕伏?？?C (paflufocon C)、 帕伏?？?D(paflufocon D)、帕伏?？?E(paflufocon E)、帕伏?？?F(paflufocon F)、 帕昔?？?A(pasifocon A)、帕昔?？?B(pasifocon B)、帕昔?？?C(pasifocon C)、帕 昔?？?D(pasifocon D)、帕昔福康 E(pasifocon E)、配迷?？?A(pemufocon A)、包羅 ?？?A(porofocon A)、包羅?？?B(porofocon B)、落伏福康 A(roflufocon A)、落伏福 康 B(roflufocon B)、落伏?？?C(roflufocon C)、落伏?？?D(roflufocon D)、落伏福 康 E (rof lufocon E)、落昔?？?A (rosilfocon A)、沙他?？?A (satafocon A)、昔伏福 康 A(siflufocon A)、西拉?？?A(silafocon A)、絲特若?？?A(sterafocon A)、蘇洛 福康A(chǔ)(sulfocon A)、蘇洛?？礏(sulfocon B)、特拉?？礎(chǔ)(telafocon A)、替昔?？?A(tisilfocon A)、妥洛?？礎(chǔ)(tolofocon A)、催?？礎(chǔ)(trifocon A)、烏尼福康A(chǔ)(unifocon A)、維納福康 A(vinafocon A)及威洛福康 A(wilofocon A)。
[0072] 用于促進(jìn)親水性眼鏡傳遞本發(fā)明組合物的例示性物質(zhì)包括（但不限于）阿 巴菲康A(chǔ)(abafilcon A)、阿考菲康A(chǔ)(acofilcon A)、阿考菲康B(acofilcon B)、艾克庫菲 康 A (acquafilcon A)、阿洛菲康 A (alofilcon A)、阿爾法菲康 A (alphafilcon A)、阿姆 菲康 A(amfilcon A)、阿替菲康 A(astifilcon A)、阿拉菲康 A(atlafilcon A)、巴拉菲康 A (balafilcon A)、必思菲康 A (bisfilcon A)、巴菲康 A (bufilcon A)、庫菲康 A (comfilcon A)、克羅菲康 A(crofilcon A)、環(huán)菲康 A(cyclofilcon A)、達(dá)菲康 A(darfilcon A)、德他菲 康 A(deltafilcon A)、德他菲康 B(deltafilcon B)、地莫費(fèi)爾康 A(dimefilcon A)、卓克 斯菲康 A(droxfilcon A)、依拉菲康 A(elastofilcon A)、依匹昔菲康 A(epsilfilcon A)、 艾司菲康 A(esterifilcon A)、愛他非爾康 A(etafilcon A)、福可菲康 A(focofilcon A)、 咖弗康 A(galyfilcon A)、珍菲康 A(genfilcon A)、戈伐菲康 A(govafilcon A)、海菲康 A(hefilcon A)、海菲康 B(hefilcon B)、海菲康 C(hefilcon C)、海拉菲康 A(hilafilcon A)、 海拉菲康 B(hilafilcon B)、海西菲康 A(hioxifilcon A)、海西菲康 B(hioxifilcon B)、海 西菲康 C(hioxifilcon C)、氫菲康 A(hydrofilcon A)、利諾菲康 A(lenefilcon A)、利克菲 康 A(licryfilcon A)、利克菲康B(licryfilcon B)、利多菲康 A(lidofilcon A)、利多菲 康 B(lidofilcon B)、若他拉菲康 A(lotrafilcon A)、若他拉菲康 B(lotrafilcon B)、馬 菲康 A(mafilcon A)、馬沙菲康 A(mesafilcon A)、美他菲康 B(methafilcon B)、米帕菲康 A(mipafilcon A)、奈弗康A(chǔ)(nelfilcon A)、奈曲?？礎(chǔ)(netrafilcon A)、奧庫菲康A(chǔ)(ocufilcon A)、奧庫菲康 B、C (ocufilcon B、C)、奧庫菲康 D (ocufilcon D)、奧庫菲康 E (ocufilcon E)、奧菲康 A(ofilcon A)、奧馬菲康 A(omafilcon A)、奧昔菲康 A(oxyfilcon A)、噴他菲 康 A(pentafilcon A)、波菲爾康 A(perfilcon A)、哌菲康 A(pevafilcon A)、菲莫菲爾康 A(phemfilcon A)、聚麥康（polymacon)、斯弗康 A(senofilcon A)、西拉費(fèi)爾康（silafilcon A)、西歐可喜菲康（siloxyfilcon A)、舒菲康 A(surfilcon A)、替菲康 A(tefilcon A)、他爪菲 康A(chǔ)(tetrafilcon A)、催菲康A(chǔ)(trilfilcon A)、維菲康A(chǔ)(vifilcon A)、維菲康B(vifilcon B) 及賽洛菲康A(chǔ)(xylofilcon A)。
[0073] 組合物可以固體、糊劑、軟膏、凝膠、液體、氣霧劑、薄霧、聚合物、薄膜、乳液或懸浮 液的形式投予。此外，組合物可并入或涂布于隱形眼鏡或藥物傳遞裝置上，由此可自眼鏡或 裝置擴(kuò)散一或多個(gè)分子或以暫時(shí)受控的方式釋放一或多個(gè)分子。隱形眼鏡組合物可保留于 眼表上，例如若視力矯正需要鏡片時(shí)，或者隱形眼鏡是隨時(shí)間而溶解，同時(shí)向緊密并置的組 織中釋放組合物。類似地，所述藥物傳遞裝置是在各種實(shí)施態(tài)樣中視情況為生物可降解或 是永久性的。
[0074] 具體而言，一或多種核酸酶組合物例如可封裝于氣密性密封的容器中，例如指示 核酸酶的量的安瓿或扁囊劑。在一實(shí)施例中，一或多種核酸酶組合物以在氣密性密封容器 中的干燥殺菌凍干粉末或無水濃縮物形式供應(yīng)且可復(fù)原（例如，以水或鹽水）至適當(dāng)濃度 以用于向受檢者投藥。在一實(shí)施態(tài)樣中，一或多種組合物是以在氣密性密封容器中的干燥 無菌凍干粉末形式以至少〇. 01暈克、〇. 05暈克、0. 1暈克、0. 25暈克、0. 5暈克、1暈克、1. 5 暈克、2. 0暈克、5暈克的單位劑量來供應(yīng)，例如至少10暈克、至少15暈克、至少25暈克、至 少35毫克、至少45毫克、至少50毫克、至少75毫克或至少100毫克。凍干組合物應(yīng)于初 始容器中儲(chǔ)存于2°C至8°C之間，且組合物應(yīng)在復(fù)原后1周內(nèi)、例如5天內(nèi)、72小時(shí)內(nèi)、48小 時(shí)內(nèi)、24小時(shí)內(nèi)、12小時(shí)內(nèi)、6小時(shí)內(nèi)、5小時(shí)內(nèi)、3小時(shí)或1小時(shí)內(nèi)投予。在另一實(shí)施態(tài)樣 中，液體形式的投藥核酸酶組合物是在氣密性密封容器中以至少〇. 25毫克/毫升，例如至 少0. 5暈克/暈升、至少1暈克/暈升、至少2. 5暈克/暈升、至少5暈克/暈升、至少8暈 克/暈升、至少10暈克/暈升、至少15暈克/kg、至少25暈克/暈升、至少50暈克/暈升、 至少75毫克/毫升或至少100毫克/毫升供應(yīng)。液體形式應(yīng)于其初始容器中儲(chǔ)存于2°C至 8°C之間。
[0075] 醫(yī)藥組合物可包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的核酸酶。"治療有效量"是指 在達(dá)成所需治療結(jié)果所必要的劑量及時(shí)間方面有效的量。組合物的治療有效量可由熟習(xí)此 項(xiàng)技術(shù)者來確定且可根據(jù)例如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別及體重以及組合物在個(gè)體中引 發(fā)所需反應(yīng)的能力等因素而變化。治療有效量亦為治療有益作用超過核酸酶的任何毒性或 有害作用的量。"預(yù)防有效量"是指在達(dá)成所需預(yù)防結(jié)果所必要的劑量及時(shí)間方面有效的 量。通常由于在疾病之前或在疾病的較早期階段使用預(yù)防劑量，因此預(yù)防有效量將小于治 療有效量。
[0076] c.受檢者
[0077] 受檢者可為哺乳動(dòng)物，其可為人類或非人類。受檢者可為需要治療核酸相關(guān)眼病。
[0078] 3.治療核酸相關(guān)眼病的方法
[0079] 本文提供一種治療核酸相關(guān)眼?。ɡ鏒ED)的方法。核酸酶組合物可與罹患核 酸相關(guān)眼?。ɡ鏒ED)的受檢者的眼睛接觸。
[0080] a.核酸酶組合物與眼睛接觸
[0081] 核酸酶組合物可借助任何方式與眼睛接觸。與眼睛接觸的方式可使得將核酸酶組 合物局部涂覆或注射至眼睛中。如本文所述，當(dāng)局部投予或注射時(shí)，可以熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者熟 知的多種方式來調(diào)配組合物，參見例如雷明頓（Remington)所著的由位于賓夕法尼亞州伊 斯頓的由麥克出版有限公司（Mack Pub. Co.，Easton，Pa.)于1995年出版的《醫(yī)藥科學(xué)與 對(duì)藥物劑型的介紹》（Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)第19版。核酸酶組合物可與如本文所述的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑一起調(diào) 配。例如參見章節(jié)3(b)。
[0082] 上文在標(biāo)題為"醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑"的章節(jié)下也描述劑量、有效量及使去氧核 糖核酸酶組合物與眼睛接觸的其他投藥途徑。
[0083] b.核酸相關(guān)眼病
[0084] 核酸相關(guān)眼病可因自體免疫病狀、眼淚產(chǎn)生減少、微生物感染、眼淚組成變化及/ 或環(huán)境條件而導(dǎo)致。該等病狀例如可減小眨眼速率及/或?qū)е卵劬櫥蛔恪Ｊ軝z者可通 過檢測(cè)選自由干燥、刺癢、毛刺、發(fā)癢、灼熱或壓迫感、刺激、疼痛、發(fā)紅、發(fā)炎、流淚及淚水過 度所組成的群組的征象或癥狀而識(shí)別為罹患核酸相關(guān)眼病或相關(guān)病癥。受檢者的眼淚組合 物可能不足以用于適當(dāng)?shù)难劬M織潤滑。核酸相關(guān)眼病可在眼睛上、眼睛中或眼睛周圍為 發(fā)炎、細(xì)菌增殖及/或細(xì)菌感染提供環(huán)境。核酸相關(guān)眼病可因眼睛上或眼睛中的淚膜（例 如生物膜或黏液膜）而導(dǎo)致。淚膜可在與眼睛接觸的物質(zhì)（例如隱形眼鏡）或植入眼睛中 的物質(zhì)（例如鞏膜壓扣、眼內(nèi)鏡片、人工角膜移植及青光眼排水植入物）上形成。
[0085] 核酸相關(guān)眼病可為核酸產(chǎn)生及清除機(jī)制失調(diào)所導(dǎo)致，淚液及淚膜核酸酶的含量及 /或活性因此不足，例如使得胞外DNA及嗜中性白血球胞外誘捕網(wǎng)（NETS)在淚膜中積聚并 促使眼表發(fā)炎。核酸相關(guān)疾病可因與正常受檢者相比眼淚中的核酸酶活性減小或核酸酶含 量減小而導(dǎo)致。
[0086] 核酸相關(guān)眼病可為干眼病、眼疤痕性類天皰瘡（0CP)、干性角膜結(jié)膜炎（KCS)、修 格連氏癥候群（SS)、修格連氏癥候群相關(guān)的干性角膜結(jié)膜炎、非修格連氏癥候群相關(guān)的干 性角膜結(jié)膜炎、干性角膜炎、干性癥候群、干眼癥、淚膜失調(diào)、淚液產(chǎn)生減少、水樣淚液缺乏 性干眼癥（ATD)、瞼腺功能失調(diào)（MGD)及蒸發(fā)損失、彌漫性板層角膜炎、隱形眼鏡相關(guān)角膜 炎、眼內(nèi)炎或感染性結(jié)晶狀角膜病變。核酸相關(guān)眼病可為過敏性眼睛病狀。過敏性眼睛病 狀可因存在NETS或嗜酸性白血球胞外誘捕網(wǎng)而產(chǎn)生。
[0087] 患有核酸相關(guān)疾病的受檢者的眼淚或淚膜中的核酸酶含量可小于3. 14奈克/毫 升核酸酶。舉例言之，患有核酸相關(guān)疾病的受檢者的眼淚中的核酸酶含量可小于3. 00奈克 /毫升核酸酶、小于2. 50奈克/毫升核酸酶、小于2. 00奈克/毫升核酸酶、小于1. 50奈克 /毫升核酸酶、小于1. 〇〇奈克/毫升核酸酶、小于3. 00奈克/毫升核酸酶、小于0. 50奈克 /毫升核酸酶或小于〇. 25奈克/毫升核酸酶。患有核酸相關(guān)疾病的受檢者的眼淚或淚膜 中的核酸酶活性水平可等于或小于0. 05孔尼茲單位。患有核酸相關(guān)疾病的受檢者的眼淚 中的核酸酶活性水平可小于〇. 04孔尼茲單位、小于0. 03孔尼茲單位、小于0. 02孔尼茲單 位、小于0. 01孔尼茲單位或小于0. 05孔尼茲單位。一個(gè)孔尼茲單位可定義為在指定條件 下，在25°C及pH 5. 0下作用于高度聚合DNA時(shí)，使260奈米下的吸光度每毫升增加0. 001 的核酸酶量。
[0088] ⑴淚膜
[0089] 可含有核酸與NET積聚的淚膜可為生物膜或粘液膜。生物膜可由細(xì)菌產(chǎn)生。粘液 膜可由眼睛的結(jié)膜產(chǎn)生。在過敏性眼睛病狀中可存在粘液膜或生物膜。患有核酸相關(guān)眼病 的受檢者的眼表上或眼睛中的生物膜及粘液膜可含有胞外DNA、NETS及/或嗜中性白血球。 NETS可含有胞外DNA、組蛋白、抗菌肽及/或嗜中性白血球彈性蛋白酶。
[0090] (a)干眼病（DED)
[0091] DED可為可歸因于多種因素中任一者的任何眼睛疾病或病癥。在某些變化形式中， 待治療的DED是由除了同種免疫反應(yīng)以外的任何病狀所引起的DED。例如在某些角膜移植 患者中可產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)（alloimmune response)。更具體而言，在某些變化形式中，待 治療的DED是自體免疫DED或與修格連氏癥候群相關(guān)的DED。DED可是由于眼表上存在胞外 DNA、眼淚過度快速蒸發(fā)（蒸發(fā)性干眼）及/或眼淚產(chǎn)生不足。亦參見圖1及其描述。在某 些變化形式中，干眼病歸因于一或多種選自以下的病因：衰老、使用隱形眼鏡及使用藥物。 在某些變化形式中，干眼病系LASIK屈光手術(shù)的并發(fā)癥。在其他變化形式中，在未經(jīng)歷任何 種類眼睛手術(shù)的受檢者中產(chǎn)生DED，例如治療DED并非由LASIK手術(shù)、角膜移植手術(shù)或其他 眼部手術(shù)導(dǎo)致的受檢者。
[0092] 在DED受檢者的眼表上可存在胞外DNA、NET及嗜中性白血球且在黏液膜及/或生 物膜中大量存在。NET可由胞外DNA、組蛋白、抗菌肽及嗜中性白血球彈性蛋白酶組成。淚 液核酸酶活性在DED受檢者中可顯著減小，而眼表上胞外DNA的量可增加。胞外DNA信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的基因表現(xiàn)（例如TLR9、MyD88及第I型干擾素）以及發(fā)炎性細(xì)胞激素介白素-6 及腫瘤壞死因子α在DED患者中亦可增加。核酸酶活性缺乏可使得胞外DNA及NET在淚 膜（例如角膜前淚膜、粘液淚膜或生物膜）中積聚且可導(dǎo)致眼表發(fā)炎。
[0093] 4.治療眼部感染的方法
[0094] 胞外核酸是淚膜的一種組分。本文所述的核酸酶組合物可用于治療眼表上或眼睛 內(nèi)（眼內(nèi)）的細(xì)菌感染及與生物膜形成相關(guān)的發(fā)炎。
[0095] 本文提供一種治療眼部感染及/或眼部發(fā)炎的方法。核酸酶組合物可與罹患感染 的受檢者的眼睛接觸。感染可為細(xì)菌感染或病毒感染?？扇缟衔乃觯▍⒁娬鹿?jié)3 (a))使 組合物與眼睛接觸，例如藉由向眼表局部涂覆或通過注射至眼睛中。因此，該組合物可在眼 內(nèi)使用。
[0096] 5.套組
[0097] 本文提供一種套組，其可用于治療或診斷核酸相關(guān)眼病。該套組可包含核酸酶。核 酸酶可為包含眼用賦形劑的核酸酶組合物。組合物可在容器中含有抗生素化合物、抗病毒 化合物、toll樣受體拮抗劑、第一型干擾素拮抗劑、抗菌肽抑制劑及/或嗜中性白血球彈性 蛋白酶抑制劑中之一或多者，以用于治療受影響的眼睛。該套組可在二個(gè)或二個(gè)以上容器 中包含核酸酶組合物及抗生素化合物、to 11樣受體拮抗劑、第一型干擾素拮抗劑、抗菌肽抑 制劑及/或嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑中之一或多者，以用于治療受影響的眼睛。該 套組可包含滴管或?yàn)V紙作為樣本收集構(gòu)件。滴管或?yàn)V紙可用于自眼睛表面收集眼淚。二個(gè) 或二個(gè)以上容器可一起封裝于（例如）紙板箱中。該套組亦可包括一組使用說明書，其提 及核酸酶組合物及（若存在）抗生素化合物、抗病毒化合物、toll樣受體拮抗劑、第一型干 擾素拮抗劑、抗菌肽抑制劑及/或嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑。說明書可描述如何進(jìn) 行及/或監(jiān)控本文所述的方法。
[0098] 6.診斷方法
[0099] 本文提供一種判斷受檢者是否患有核酸相關(guān)眼病的方法。該方法可包含自受檢 者收集眼淚樣本?？赏ㄟ^使用上述套組來獲得樣本。此樣本可與結(jié)合核酸的染料（例如， picogreen)接觸。作為另一選擇，樣本可與核酸接觸且隨后與染料接觸?？蓽y(cè)量色彩強(qiáng)度 且與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣本中的染料熒光強(qiáng)度相比較。與對(duì)照組相比，樣本中的染料熒光強(qiáng)度水平 增加可指示干眼病。染料強(qiáng)度可指示眼睛表面上的胞外核酸的含量。染料強(qiáng)度且因此胞 外核酸的含量可指示疾病的嚴(yán)重程度。舉例言之，若使用picogreen，則尤其較對(duì)照組（亦 艮P，陰性對(duì)照組）更高的綠色色彩強(qiáng)度可指示受檢者患有嚴(yán)重的干眼病。視所用染料類型 而定，也可使用此方法來確定眼睛表面上的核酸酶含量。
[0100] 本發(fā)明具有多個(gè)方面，由以下非限制性實(shí)施例加以說明。
[0101] 實(shí)施例
[0102] 實(shí)施例1
[0103] 測(cè)定眼表上的胞外DNA的方法（也參見圖2-圖9及其描述）
[0104] 使用席爾默試紙自干眼患者收集樣本。席爾默測(cè)試是在眼睛檢查期間進(jìn)行的常規(guī) 測(cè)試。席爾默測(cè)試是由將薄條濾紙置于下方側(cè)眼瞼下5分鐘而組成。隨后取出紙條且測(cè)量 紙的潤濕量。以毫米計(jì)測(cè)量。若此值小于5,則診斷為干眼病。通常在測(cè)試后丟棄此紙條。 然而，在本發(fā)明的研究中，使用此紙而非將其丟棄。
[0105] 在紙觸碰眼瞼及球結(jié)膜時(shí)，來自該等區(qū)域的細(xì)胞粘附至濾紙。在來自Tekdon公司 的經(jīng)硅烷涂布粘著劑涂布的載片上收集來自該紙的細(xì)胞。在此方法中，自每一患者獲得四 個(gè)載片。將載片儲(chǔ)存于10%甲醛中至少半小時(shí)后，進(jìn)行染色。隨后以蘇木精及伊紅對(duì)該等 載片染色，以嗜中性白血球彈性蛋白酶、組蛋白及髓過氧化酶抗體進(jìn)行免疫染色以確定NET 的存在。隨后以半胱天冬酶3抗體對(duì)載片進(jìn)行免疫染色用于細(xì)胞凋亡。
[0106] 關(guān)于蘇木精及伊紅染色，將細(xì)胞在10%甲醛中固定至少半小時(shí)。將載片在蘇木精 中浸漬7分鐘，繼而洗滌。隨后將載片在洗酸劑中浸漬4次，繼而洗滌且隨后在染藍(lán)劑中浸 漬2分鐘。將載片簡單洗滌，繼而以伊紅浸漬2分鐘。洗滌后，將載片在室溫下風(fēng)干、以蓋 玻片覆蓋且在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)。
[0107] 使用針對(duì)（a)嗜中性白血球彈性蛋白酶（Dakocytomation-單克隆小鼠抗-人類 嗜中性白血球彈性蛋白酶）及組蛋白（圣克魯茲生物技術(shù)公司，圣克魯茲，加利福尼亞州 (Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA))以及 4'，6_ 二甲脈基 _2_ 苯基Π 引哚（亦 艮P，DAPI (Vector實(shí)驗(yàn)室，伯林蓋姆，加利福尼亞州（Burlingame, CA)))、（b)髓過氧化酶及 組蛋白（Santa Cruz Biotechnology,圣克魯斯，加利福尼亞州）以及DAPI的抗體進(jìn)行雙重 免疫染色以證實(shí)在眼表上存在NET。使經(jīng)硅烷涂布的載片上的細(xì)胞在10%甲醛中固定至少 半小時(shí)。隨后使用PBS+0. 025% Triton-X 100將載片洗滌二次，震蕩5分鐘。隨后在室溫 下，以PBS中的10%標(biāo)準(zhǔn)血清+1% BSA阻斷細(xì)胞2小時(shí)。對(duì)于嗜中性白血球彈性蛋白酶， 以1:400的比率使用PBS稀釋一級(jí)抗體，且對(duì)于組蛋白，則以1:200的比率，使用PBS稀釋 一級(jí)抗體。且將具有一級(jí)抗體的載片在4°C下培育隔夜。在隔夜培育后，使用PBS+0. 025% Triton將細(xì)胞洗滌二次，震蕩5分鐘。在下一步驟中，添加針對(duì)嗜中性白血球彈性蛋白酶 (紅色）及針對(duì)組蛋白（綠色）的二級(jí)抗體，將其使用PBS+1 % BSA稀釋且在室溫下培育1 小時(shí)。1小時(shí)后，將載片在PBS中沖洗三次歷時(shí)5分鐘且以DAPI (Vector Labs，伯靈格姆， 加利福尼亞州）進(jìn)行對(duì)比染色。隨后，在倒置顯微鏡（卡爾蔡司股份有限公司，漢堡，德國 (Carl Zeiss Meditec GmbH,漢堡，德國））下觀測(cè)載片。
[0108] 為定量胞外DNA，以100U/毫升DNasel (來自Fermentas生命科學(xué)公司，漢諾威 市，MD)培育含有胞外DNA及細(xì)胞的濾紙。隨后添加0. 5莫耳/升（M)EDTA以終止核酸酶 活性且收集上清液。添加 Picogreen(英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州（Invitrogen, Carlsbad, CA))(-種DNA熒光DNA染料）且由熒光光譜測(cè)定法定量DNA含量。
[0109] 去氧核糖核酸酶處理：對(duì)于每位患者而言收集來自結(jié)膜的四個(gè)樣本且進(jìn)行處理： 樣本1-以DAPI染色（對(duì)照）；樣本2-以去氧核糖核酸酶處理（100IU/毫升，歷時(shí)20分鐘） 并以DAPI染色；樣本3-以熱失活去氧核糖核酸酶處理（100IU/毫升，歷時(shí)20分鐘）并以 DAPI染色；樣本4-浸泡于PBS中并以DAPI染色。
[0110] 隨后在倒置顯微鏡（Carl Zeiss Meditec GmbH,漢堡，德國）下觀測(cè)樣本。通過使 用Axiovision及Neurolucida軟體獲取影像來進(jìn)行定量。計(jì)算值并使用Microsoft Excel 繪圖。參見圖9及其描述。
[0111] 實(shí)施例2
[0112] 用于實(shí)施例3及4的方法
[0113] 研究群體：登記癥狀性眼淚缺乏DED患者及眼淚正常產(chǎn)生的無癥狀 (asymptomatic)健康個(gè)體，并為提供其在機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)（Institutional Review Board) 批準(zhǔn)協(xié)議下根據(jù)Helsinki陳述的書面知情同意。若患者主訴任何DED癥狀（干燥、刺激、 砂粒感、光敏性或異物感）且另外具有嚴(yán)重水樣淚液缺乏，則包括該等患者，定義為在5分 鐘內(nèi)席爾默I值< 5毫米（無麻醉）。若個(gè)體無眼部癥狀且在5分鐘內(nèi)的席爾默I值> 12 毫米（無麻醉），則包括在對(duì)照組中。
[0114] 結(jié)膜脫落細(xì)胞及粘液膜分析：通過在下眼瞼邊緣上方、側(cè)向及中間第三個(gè)接合點(diǎn) 處置放席爾默試條（Haag-Streit，埃塞克斯，英國（E SSeX，UK))歷時(shí)5分鐘來進(jìn)行無局部麻 醉的席爾默I測(cè)試。以毫米計(jì)來記錄試條濕潤。由于試條接觸眼瞼及球結(jié)膜，因此該等區(qū)域 的細(xì)胞在移除試條時(shí)脫落。將粘附至試條的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至經(jīng)硅烷涂布的粘附性載片。即刻將 載片在中性緩沖10%甲醒（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州（St. Louis，M0))中固定30 分鐘后，進(jìn)一步分析。使用一次性微毛細(xì)管玻璃管（5微升（μ 1)體積；Sigma-Aldrich)在 球結(jié)膜上或自下結(jié)膜穹窿收集粘液膜。將粘液膜擴(kuò)散于經(jīng)硅烷涂布的載片上且進(jìn)行處理。
[0115] 蘇木精及伊紅（H&E)染色：將具有結(jié)膜脫落細(xì)胞的載片（η = 15)或具有粘液膜 的載片（η = 10)以蘇木精（Η-3401，Vector Labs,伯靈格姆，加利福尼亞州）染色、在酸中 沖洗、浸漬于染藍(lán)溶液中且以伊紅（賽默飛世爾科技公司，沃爾瑟姆，馬塞諸塞州（Thermo Scientific，Waltham，ΜΑ))進(jìn)行對(duì)比染色。使用直立 Axioscope 100 顯微鏡（Carl Zeiss Meditec GmbH,漢堡，德國）檢查載片、使用Zeiss MRc彩色照相機(jī)成像并使用Zeiss Axiovision進(jìn)行分析。
[0116] 免疫染色與共軛焦顯微法：進(jìn)行免疫熒光染色及共軛焦顯微法以定位如前所述的 NET及胞外DNA(eDNA)的分子組分。使載片在0. 025% Triton X-100中滲透5分鐘且在室 溫下以PBS中1%牛血清白蛋白（BSA)及10%標(biāo)準(zhǔn)驢血清阻斷2小時(shí)。將載片在4°C下以 于阻斷溶液中稀釋（1:200)的一級(jí)抗體培育隔夜。將載片在PBS中洗滌四次（每次15分 鐘）并以經(jīng)阻斷溶液稀釋（1:200)的二級(jí)抗體培育1小時(shí)。將含有4'，6_二甲脒基-2-苯 基口引哚（DAPI ;目錄號(hào)H-1200, Vector Labs)的Vectashield mounting培養(yǎng)基置放于載片 上且以玻璃蓋玻片覆蓋。所用一級(jí)抗體為：（1)小鼠單克隆抗-人類嗜中性白血球彈性蛋 白酶（純系NP57, DAK0,格洛斯楚普，丹麥（Glostrup，Denmark)) ;(2)山羊多克隆抗-組 蛋白 H2B(目錄號(hào) SC-8650，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，加利福尼亞州）及 (3)兔多克隆抗-抗菌肽（目錄號(hào)ab64892, Abeam,坎布里奇，馬塞諸塞州（Cambridge, ΜΑ))。所用二級(jí)抗體對(duì)于嗜中性白血球彈性蛋白酶而言為Dylight 594結(jié)合的抗-小 鼠免疫球蛋白G(IgG) (1:1000,杰克遜免疫研究實(shí)驗(yàn)室，西樹林，賓夕法尼亞州（Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA))且對(duì)于組蛋白及抗菌膚而言為FITC 480 抗-山羊 IgG(1:200，Jackson Immunoresearch Laboratories)。使用 LSM 710META 共輒 焦顯微鏡（Carl Zeiss Meditec GmbH,漢堡，德國）分析檢體。首先使患者樣本成像以最優(yōu) 化熒光信號(hào)，之后，立即使用相同設(shè)定使陰性對(duì)照載片（省略一級(jí)抗體）成像。先前已證實(shí) 一級(jí)抗體抗-嗜中性白血球彈性蛋白酶及抗-抗菌肽的特異性。
[0117] 淚腺DNase I免疫染色：由存檔非發(fā)炎性及非惡性淚腺活體組織切片（η = 5)獲 得淚腺切片￠-8微米）。將切片在56°C下脫蠟30分鐘，繼而進(jìn)行等級(jí)醇連續(xù)處理。處理切 片以如上所述進(jìn)行染色。所用一級(jí)抗體為兔多克隆抗-DNase 1(1:50,目錄號(hào)HPA010703， Sigma Prestige，St.Louis，M0)。二級(jí)抗體為 Dylight 594-結(jié)合的抗-兔 IgG。陰性對(duì)照為： (1)省略一級(jí)抗體、（2)兔多克隆IgG同型對(duì)照物（目錄號(hào)ab27427, Abeam)及（3)以一級(jí) 抗體預(yù)培育的肽（目錄號(hào)為HPA010703的肽，Atlas抗體AB，斯德哥爾摩，瑞典（Stockholm， Sweden))。如上所述進(jìn)行成像及分析。
[0118] eDNA鏈的激光捕獲顯微剖檢：如上所述在膜載片（目錄號(hào)11505158, Leica，索爾 姆斯，德國（Solms，德國））上進(jìn)行席爾默試條壓印。將載片在10%甲醛中固定30分鐘， 并在1XPBS中洗滌。將載片以DAPI染色、在PBS中簡單洗滌，并在37°C下干燥30分鐘。 觀測(cè)經(jīng)DAPI染色的eDNA鏈、解剖，并使用PALM激光捕獲顯微剖檢顯微鏡（Carl Zeiss， Thomwood，NY)捕獲。將捕獲的鏈?zhǔn)占谡掣叫陨w中，并使用DNAzol(目錄號(hào)1-0503-027， Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞州）根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案提取DNA。使用GoTaq PCR 套組（目錄號(hào)M7122,普洛麥格，麥迪遜，威斯康星州（Promega，Madison, WI))根據(jù)制造商 的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行PCR。使用基因特異性引子擴(kuò)增人類GAPDH基因（目錄號(hào)PPH00150F，SA生 物科學(xué)，弗雷德里克，馬里蘭州（SA Biosciences，F(xiàn)rederick，MD))。使PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳， 并在經(jīng)2%溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上觀測(cè)。
[0119] 眼表eDNA的定量：我們使用兩種策略來計(jì)算眼表上eDNA的量。首先，在來自玻璃 載片上的席爾默試條壓印的脫落材料中測(cè)定eDNA鏈的總長度。其次，使用DNase I自席爾 默試條提取eDNA，并使用picogreen DNA熒光染料測(cè)定熒光強(qiáng)度。
[0120] eDNA長度：固定具有席爾默試條壓印的載片，并以DAPI進(jìn)行染色。使用倒置顯微 鏡（Axio Observer，Zeiss)成像5個(gè)隨機(jī)的20X物鏡視場，并使用Neurolucida軟體（MBF 生物科學(xué)公司，威利斯頓，VT)進(jìn)行分析。追蹤eDNA纖維，并使用如前文關(guān)于角膜神經(jīng)所述 的Neuroexplorer(MBF Bioscience)來計(jì)算長度。將干眼患者（η = 10)中的平均總eDNA 長度與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組（η = 10)相比較。
[0121] Picogreen檢定：如前所述進(jìn)行Picogreen檢定。將接觸結(jié)膜的席爾默試條的折疊 末端收集于微量離心管（eppendorf tube)中，并添加200微升的100U/毫升DNase I (目錄 號(hào) EN0521，F(xiàn)ermentas Life Sciences，Hanover，MD)。20 分鐘后，以 0· 5 毫莫耳 / 升（mM) EDTA終止核酸酶活性，并移除席爾默試條末端。添加 Picogreen DNA熒光染料（目錄號(hào) P7589，Invitrogen 檢測(cè)科技），并使用酶標(biāo)儀（Synergy Hl，BioTek，Winooski, VT)測(cè)定突 光強(qiáng)度。平均各數(shù)值，并在DED患者（η = 10)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組（η = 10)之間進(jìn)行比較。
[0122] 脫落結(jié)膜細(xì)胞基因表現(xiàn)：自來自DED患者（η = 20)及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組（η = 16)的席爾默試條上的脫落結(jié)膜細(xì)胞提取RNA。將席爾默試條的折疊末端直接置于 TRIzoldnvitrogen)中以供RNA提取，此系根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案來進(jìn)行的。使用RT2第一 鏈 eDNA 合成套組（RT2First Strand eDNA Synthesis Kit) (SABiosciences)，以 1000 奈克 總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將所得eDNA使用RT2Nano PreAMP套組根據(jù)制造商的說明進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。 使用7900HT ABI即時(shí)儀器，以SYBR進(jìn)行即時(shí)定量PCR(qPCR)。經(jīng)由即時(shí)qPCR分析eDNA信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表現(xiàn)及發(fā)炎性細(xì)胞激素。
[0123] 除非另外說明，否則所有引子及試劑均購自SABiosciences。所用引子為toll樣 受體 9(TLR 9 ;目錄號(hào) PPH01809A)、干擾素-a(INFA ;目錄號(hào) PPH01321A)、MyD88(目錄號(hào) PPH00911A)、干擾素 -β (INFB;目錄號(hào) PPH00384E)、IL-6(目錄號(hào) PPH00560B)、TNF-a(目錄 號(hào)PPH00341E)及甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶（GAPDH ;目錄號(hào)PPH00150F)。使用以下循環(huán)條 件，以25微升的總體積檢定樣本，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行二重復(fù)：在95°C下10分鐘，在95°C下15秒鐘進(jìn) 行40個(gè)循環(huán)及在60°C下60秒鐘。使用人類染色體組DNA污染對(duì)照來證實(shí)擴(kuò)增試劑未受染 色體組DNA污染。對(duì)于資料分析而言，將DED患者每個(gè)基因的循環(huán)閾值（CT)標(biāo)準(zhǔn)化為正常 受檢者的相應(yīng)值，并使用A CT方法來計(jì)算倍數(shù)變化。
[0124] 淚液中的核酸酶活性及DNase I :使用狹縫燈生物顯微鏡，使用一次性微毛細(xì)管玻 璃管來收集眼淚。將管置于下結(jié)膜穹窿中，且通過毛細(xì)作用收集眼淚。將眼淚轉(zhuǎn)移至無去 氧核糖核酸酶的微量尚心管中以供分析。
[0125] 正常淚液中的核酸酶活性：根據(jù)制造商的說明，使用DNA消化檢定（去氧核糖核酸 酶檢測(cè)套組，Μ0-ΒΙ0 Laboratories, Carlsbad,加利福尼亞州）定量DED患者（η = 5)與 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組（η = 5)中的淚膜核酸酶活性。使眼淚樣本及DNA標(biāo)準(zhǔn)物（1-kb DNA梯）在經(jīng) 2%溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上電泳，并使用UV-透照器進(jìn)行拍照。通過將DNA標(biāo)準(zhǔn)物的 帶強(qiáng)度及樣式與眼淚樣本相比較來評(píng)估去氧核糖核酸酶活性。若淚液中存在核酸酶，則存 在拖尾且樣本泳道中的帶強(qiáng)度減小。若DNA梯完全降解，則核酸酶活性大于0. 05孔尼茲單 位，此是以此方法檢測(cè)的上限。
[0126] 淚液中的核酸酶活性：使用基于熒光共振能轉(zhuǎn)移（FRET)的檢定來比較來自DED 患者（η = 17)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組（η = 15)的淚液中的總核酸酶活性。進(jìn)行FRET核酸酶檢 定。FRET受質(zhì)（一種PRMEHME?qPCR探針）是購自集成DNA科技公司（Integrated DNA Technologies)(克勒爾維爾，愛荷華州（Coralville，ΙΑ))。其是由在5'末端經(jīng)Cy3突光 團(tuán)改質(zhì)且在3'末端經(jīng)黑洞抑止劑2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)改質(zhì)的短（15mer)的 單鏈寡核苷酸組成。寡核苷酸受質(zhì)的序列為5'CCC CGG ATC CAC CCC 3'（SEQ ID N0:2)。 當(dāng)寡核苷酸完整時(shí)，Cy3與BHQ2足夠接近以抑止熒光。在寡核苷酸裂解時(shí)，Cy3熒光與裂解 量成正比且可用于定量核酸酶活性。觀測(cè)到三種等級(jí)的HPLC純化FRET受質(zhì)的產(chǎn)量的相當(dāng) 大的變化（對(duì)于250奈莫耳合成等級(jí)而言為21. 1及35. 8奈莫耳，且對(duì)于1微莫耳合成等 級(jí)而言為124. 5奈莫耳），因此我們尚未匯集資料并報(bào)導(dǎo)以1微莫耳等級(jí)進(jìn)行的淚液核酸 酶活性分析。產(chǎn)量變化來自于HPLC純化過程且與FRET受質(zhì)純度反向相關(guān)。如上所述收集 眼淚樣本。在冰上培育樣本直至進(jìn)行檢定。在樣本收集3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢定。向微量滴定盤 中添加眼淚樣本（5微升）。向含有眼淚樣本的孔中添加 FRET受質(zhì)（2. 5奈莫耳，于50微 升緩沖溶液中）。在37°C、激發(fā)光552奈米及發(fā)散光580奈米下使用酶標(biāo)儀（Synergy H1， BioTek)測(cè)量發(fā)射的熒光（RFU)及熒光變化速率。在讀數(shù)前將培養(yǎng)盤攪動(dòng)5秒鐘，并以3秒 鐘的間隔獲取讀數(shù)歷時(shí)30分鐘。對(duì)于分析，平均每位患者在30分鐘內(nèi)的動(dòng)態(tài)RFU測(cè)量值。
[0127] 淚液中的DNase I定量：我們使用市售的人類DNase 1ELISA套組（目錄號(hào) E0100214,生命科學(xué)先進(jìn)科技公司（Life Sciences Advanced Tech),圣彼德斯堡，佛羅里 達(dá)州（St. Petersburg，F(xiàn)L))來測(cè)定淚液中DNase I的量。自健康受檢者收集25微升淚液 (η = 5)及0. 5毫升唾液（η = 5)。將唾液在4°C下以15, OOOrpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)）離心5分 鐘，并分析25微升上清液。向抗體預(yù)涂布微量滴定盤中的適當(dāng)孔中添加標(biāo)準(zhǔn)物或樣本（25 微升），并根據(jù)制造商的說明進(jìn)行檢定。此檢定的靈敏度為〇. 1奈克/毫升。
[0128] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對(duì)于DED患者及正常受檢者計(jì)算平均值及平均標(biāo)準(zhǔn)誤差，并使用學(xué) 生七測(cè)試（Student t-test)進(jìn)行分析。使用Microsoft Excel office統(tǒng)計(jì)學(xué)軟體封裝進(jìn) 行分析及繪圖。0.05認(rèn)為系統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0129] 實(shí)施例3
[0130] 眼表上存在eDNA及嗜中性白血球胞外誘捕網(wǎng)（NET)
[0131] 研究群體包括DED患者（η = 37位患者，73只眼睛），其平均水樣淚液產(chǎn)量為 2. 76±0. 35毫米。正常個(gè)體（η = 18位個(gè)體，36只眼睛）的平均水樣淚液產(chǎn)量為19. 1±1. 25 毫米，顯著大于DED患者（ρ〈0. 001)?；颊呋加蟹切薷襁B氏干眼（η = 33)(其包括例如特發(fā) 性、LASIK后、神經(jīng)營養(yǎng)性及眼疤痕性類天皰瘡的病源）及修格連氏疾病（η = 4)。
[0132] 眼表上存在eDNA及嗜中性白血球胞外誘捕網(wǎng)（NETs):在來自嚴(yán)重DED患者的結(jié) 膜細(xì)胞上進(jìn)行H&E及免疫熒光染色。細(xì)胞源自在玻璃載片上進(jìn)行席爾默I測(cè)試后的試條壓 ?。▓D11，A1、A2)。H&E染色顯示存在單一或成組的脫落結(jié)膜細(xì)胞。細(xì)胞為圓形或卵形，其 具有嗜酸性細(xì)胞質(zhì)及均一圓形嗜堿性核（圖11，B)。DAPI核染色展現(xiàn)正常受檢者中的少量 稀疏eDNA鏈（圖11，C1)及DED患者中的大量長eDNA鏈（圖11，C2)。共軛焦顯微法展現(xiàn) 在eDNA鏈之間存在嗜中性白血球（圖11，D)。組蛋白（圖11，E1)及嗜中性白血球彈性蛋 白酶（圖11，E2)與經(jīng)DAPI染色的eDNA鏈共同定位，證明該等為NET(圖11，E4)。為排除 eDNA可為壓印細(xì)胞學(xué)的人工制品的可能性，對(duì)使用相同方法獲得的脫落頰粘膜細(xì)胞進(jìn)行分 析。未觀測(cè)到eDNA鏈（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0133] 在球結(jié)膜/角膜（圖12，A1)上或下穹窿中（圖12，A2)存在的粘液膜上進(jìn)行H&E 及免疫熒光染色。粘液膜呈現(xiàn)為泡沫性白色粘液狀聚集，有時(shí)因眨眼而分散。使用微毛細(xì)管 提起該等粘液膜用于分析。在某些情況下，在微毛細(xì)管中抽取混濁白色流體。然而，分析仍 展現(xiàn)類似結(jié)果。H&E顯示在粘液膜內(nèi)存在大量嗜中性白血球及脫落細(xì)胞（圖12，B1)。DAPI 染色顯示eDNA(圖12，B2)及大量嗜中性白血球彈性蛋白酶陽性嗜中性白血球（圖12，B3)。 嗜中性白血球彈性蛋白酶（圖12，C1)及組蛋白（圖12，C2)與經(jīng)DAPI染色的eDNA鏈共同 定位，證明該等是NET (圖12, C4)。
[0134] 為證明經(jīng)DAPI染色的鏈含有DNA，使用激光捕獲顯微剖檢顯微鏡自膜載片捕獲經(jīng) DAPI染色的鏈（圖12，D1及D2)。如由GAPDH基因產(chǎn)物PCR擴(kuò)增所示，胞外經(jīng)DAPI染色的 鏈含有DNA (圖12，D3)。
[0135] 研究NET中存在抗菌肽：抗菌肽存在于粘液膜內(nèi)（圖13, A1)且與嗜中性白血球 彈性蛋白酶及經(jīng)DAPI染色的核物質(zhì)共同定位（圖13, A4)?？咕囊啻嬖谟谑戎行园籽?球內(nèi)（圖13，B4)?？咕?、核物質(zhì)及嗜中性白血球彈性蛋白酶自嗜中性白血球擠出而形成 NET (圖 13, C1-4)。
[0136] 關(guān)于眼表上eDNA的量，DED患者與正常受檢者相比具有顯著較低的水樣淚液產(chǎn)量 (圖14，A)。與正常受檢者（1·58±0·47毫米）相比，DED患者中的eDNA鏈長度（15·0±4·2 毫米）顯著較大（ρ = 〇. 002)(圖14, Β)。如由Picogreen檢定所測(cè)量，與對(duì)照組相比 (13055. 5± 1787. 2RFU)，DED 患者中眼表上 eDNA 的量（20137. 2± 1507. 3RFU)亦顯著較大 (p = 0· 006)(圖 14, B)。
[0137] 實(shí)施例4
[0138] eDNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑基因表現(xiàn)
[0139] 在脫落結(jié)膜細(xì)胞上進(jìn)行qPCR以確定eDNA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的基因表現(xiàn)的倍數(shù)變化 (圖14, D)。在來自DED患者的結(jié)膜細(xì)胞中，TLR9、Myd88及IFN-第I型（IFNA與IFNB) 的表現(xiàn)以及發(fā)炎性基因 IL-6與TNF-a顯著增加。所觀測(cè)DED患者中的基因表現(xiàn)的倍數(shù)增 加為：TLR9(5. 57±1· 6, p = 0· 003)、Myd88(4. 20±6, ρ〈0· 0001)、IFNA(3. 09±0· 5, p = 0· 0003)、INFB(4. 18±0· 6，ρ〈0· 0001)、TNF-a(20. 6±10· 0，p = 0· 03)及 IL-6(17. 3±3· 1， ρ〈0· 0001)。
[0140] 實(shí)施例5
[0141] DED患者中的核酸酶缺乏
[0142] 淚液中存在核酸酶及DNase I。使用DNase I特異性抗體使淚腺切片免疫染色。 DNase I定位于淚腺腺泡內(nèi)層的上皮細(xì)胞內(nèi)（圖15,A)。在眼淚樣本上進(jìn)行ELISA以確定眼 淚及唾液中DNase I的量（圖15,B1)。眼淚中的DNase I濃度為3. 14±0. 49奈克/毫升， 且唾液中的DNase I濃度為4. 21±1. 14奈克/毫升。使用去氧核糖核酸酶檢測(cè)套組檢定 定量眼淚中的核酸酶活性（圖15, B2)。正常受檢者與DED患者的眼淚中的核酸酶活性大于 0. 05孔尼茲單位。此檢定無法用于定量及比較DED患者與正常受檢者的淚液核酸酶活性， 因?yàn)?. 05孔尼茲單位是此方法的檢測(cè)上限。因此，使用基于FRET的核酸酶活性檢定來比較 DED患者與正常受檢者之間的總核酸酶活性（圖15, C1)。與對(duì)照組（52843. 6±724. 4RFU) 相比，DED患者中的總核酸酶活性（36749. 2±3898. 6RFU，p = 0. 003)顯著較低（圖15，C2)。
[0143] 實(shí)施例6
[0144] 經(jīng)核酸酶介導(dǎo)的NET溶解
[0145] 為證實(shí)核酸酶治療對(duì)于治療與DED相關(guān)的eDNA鏈的治療價(jià)值，以DNase I處理源 自DED患者的席爾默條壓印的脫落材料。如圖6(A)中所示，在自DED患者眼睛的眼表取樣 的未經(jīng)處理脫落材料中發(fā)現(xiàn)大量eDNA鏈。然而，在以DNase I將如圖6A中所示的相同物 質(zhì)培育20分鐘后，無可辨識(shí)的eDNA鏈（圖6 (B))。此結(jié)果顯示，眼表eDNA鏈可經(jīng)DNase I 處理而溶解。
[0146] 實(shí)施例7
[0147] 淚膜中的細(xì)菌
[0148] 患有嚴(yán)重眼淚缺乏的干眼病患者的眼表中可能具有粘液膜。使用無菌eSwab自眼 表提起黏液膜。觀測(cè)革蘭氏陽性球菌的生長，將其鑒別為凝固酶陰性葡萄球菌物種。參見 圖16A及圖16B。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于治療核酸相關(guān)眼病的組合物，其中，該組合物包含核酸酶以及眼用賦形劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，該核酸酶是去氧核醣核酸酶（DNase)、核糖核 酸酶（RNase)或其組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，該Dnase是核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中，該Dnase是選自由以下所組成的群組：去氧核 糖核酸酶I (DNase I)、去氧核糖核酸酶II (DNase II)、去氧核糖核酸酶III (DNase III)、 微球菌核酸酶、及重組DNase。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中，該重組DNase I為去氧核醣酶a (dornase alpha) (PULMOZYME?)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中，該Rnase是選自以下所組成的群組：核糖核酸 酶A (RNase A)、核糖核酸酶H (RNase H)、核糖核酸酶I (RNase I)、核糖核酸酶II (RNase Π )、核糖核酸酶III (RNase III)、核糖核酸酶D (RNase D)、核糖核酸酶L (RNase L)、核 糖核酸酶P (RNase P)、核糖核酸酶PH (RNase PH)、核糖核酸酶PhyM (RNase PhyM)、核糖 核酸酶R (RNase R)、核糖核酸酶T (RNase T)、核糖核酸酶T1 (RNase T1)、核糖核酸酶T2 (RNase Τ2)、核糖核酸酶U2 (RNase U2)、核糖核酸酶VI (RNase VI)、核糖核酸酶V(RNase V)、寡核糖核酸酶（Oligoribonuclease)、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II、及重組核 糖核酸酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，該眼用賦形劑是選自由以下所組成的群組：緩 沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤濕劑、抗氧化劑、及前述的組合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，還包含選自由以下所組成的群組的拮抗劑或 抑制劑：抗生素化合物、toll樣受體拮抗劑（t〇ll _like receptor antagonist)、第一型干 擾素拮抗劑、抗菌肽抑制劑（cathelicidin inhibitor)、MyD88抑制劑、類固醇、抗過敏化 合物、及嗜中性白血球彈性蛋白酶抑制劑（neutrophil elastase inhibitor)、及前述的組 合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，該組合物的形式是固體、軟膏、凝膠、液體、氣 溶膠、薄霧、聚合物、隱形眼鏡、膜、乳液或懸浮液。
10. -種用于治療核酸相關(guān)眼病的方法，其包括向眼睛投予有效治療該核酸相關(guān)干眼 病的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，該眼睛的眼表（ocular surface)是含有淚膜。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，該淚膜是生物膜或黏液膜。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，該生物膜或粘液膜含有核酸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，該核酸是細(xì)胞外核酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，該核酸是DNA、RNA或其組合。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，該組合物的有效量含有5奈克/毫升至3毫克 /暈升的該核酸酶。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，該組合物的有效量含有1毫克/毫升至3毫克 /暈升的該核酸酶。
18. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，該核酸相關(guān)眼病是選自由以下所組成的群組： 干眼病、板層角膜炎、隱形眼鏡相關(guān)角膜炎、眼內(nèi)炎、感染性結(jié)晶狀角膜病變、眼疤痕性類天 皰瘡（ocular cicatricial pemphigoid, OCP)、干性角膜結(jié)膜炎（keratoconjunctivitis sicca, KCS)、修格連氏癥候群（Sjogren syndrome, SS)、修格連氏癥候群相關(guān)的干性角膜 結(jié)膜炎（Sjogren syndrome associated keratoconjunctivitis sicca)、非修格連氏癥候 群相關(guān)的干性角膜結(jié)膜炎（non-Sjogren syndrome associated keratoconjunctivitis sicca)、干性角膜炎、干性癥候群、干眼癥、淚膜失調(diào)（tear film disorder)、淚液產(chǎn)生減 少、水樣淚液缺乏性干眼癥（aqueous tear deficiency, ATD)、及瞼腺功能失調(diào)（meibomian gland dysfunction, MGD)〇
19. 一種用于治療眼細(xì)菌感染的方法，其包括向眼睛投予有效治療該感染的量的根據(jù) 權(quán)利要求1所述的組合物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，該組合物是經(jīng)注射至眼睛中。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，該感染是在眼睛上或在眼睛中形成細(xì)菌生物 膜的結(jié)果。
22. -種用于判斷受檢者是否患有核酸相關(guān)眼病的方法，其包括： (a) 自受檢者收集一眼淚樣本； (b) 使該眼淚樣本與去氧核醣核酸酶（DNase)接觸； (c) 使（a)或（b)的樣本與結(jié)合至DNA的染料接觸； (d) 測(cè)量色彩強(qiáng)度； (e) 與正常對(duì)照樣本中的染料熒光強(qiáng)度相比較； 其中，當(dāng)步驟（a)或步驟（b)的樣本中的染料熒光強(qiáng)度水平與對(duì)照組相比增加，顯示為 生物膜相關(guān)的眼病。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，該核酸相關(guān)眼病是選自由以下所組成的 群組：干眼病、彌漫性板層角膜炎、隱形眼鏡相關(guān)角膜炎、眼內(nèi)炎、感染性結(jié)晶狀角膜病 變、眼疤痕性類天皰瘡（0CP)、干性角膜結(jié)膜炎（KCS)、修格連氏癥候群（SS)、修格連氏癥 候群相關(guān)的干性角膜結(jié)膜炎（Sjogren syndrome associated keratoconjunctivitis sicca)、非修格連氏癥候群相關(guān)的干性角膜結(jié)膜炎（non-Sjogren syndrome associated keratoconjunctivitis sicca)、干性角膜炎、干性癥候群、干眼癥、淚膜失調(diào)（tear film disorder )、淚液產(chǎn)生減少、水樣淚液缺乏性干眼癥（ATD)、及瞼腺功能失調(diào)（MGD)。
【文檔編號(hào)】A61K9/08GK104220087SQ201280069247
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月12日
【發(fā)明者】S·賈音 申請(qǐng)人:美國伊利諾大學(xué)理事會(huì)