專利名稱：線蟲的5ht的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定控制線蟲、昆蟲和其他無脊椎害蟲的化合物。特別是，本發(fā)明涉及分離并克隆編碼線蟲5HT3受體的多核苷酸。該受體可以用于多種試驗，鑒定和/或評價作為線蟲殺蟲劑、昆蟲殺蟲劑和/或其他害蟲殺蟲劑的化合物。
背景技術(shù)：
很多種類的線蟲是寄生蟲，具有顯著的醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)意義。例如，Strongylida、圓線蟲科、Ascaradida、Oxyurida和Trichocephalida的線蟲包括很多種，可以導(dǎo)致人類、羊、牛、豬和其他種屬動物的疾病。而且，Orders Tylenchida和Aphelenchida等的線蟲也包括很多種，它們是重要農(nóng)作物和真菌的寄生蟲。
據(jù)保守估計，由于植物寄生線蟲對主要糧食作物的損害，每年可導(dǎo)致美國770億美圓的損失[Evans，K.and Haydock，P.1999.Control of plantparasitic nematodes.Pesticide Outlook.107-111]。但不幸的是，對植物寄生線蟲的可選擇控制方法卻很少。薰劑如溴化甲烷由于其對臭氧層的有害作用而逐漸退出銷售和應(yīng)用領(lǐng)域，而目前可供應(yīng)用的其他試劑也在毒性最大的不欲殺蟲劑之列。
動物寄生線蟲可以感染人類、寵物和家畜，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致嚴重的病廢和經(jīng)濟損失。這類寄生蟲包括鉤蟲和蛔蟲。它們可以導(dǎo)致貧血、體重減輕、超免疫反應(yīng)和其他并發(fā)癥，包括家畜的死亡。目前只有少數(shù)幾種藥物可以用于人類和動物的該類疾病治療，但是，特別是在獸醫(yī)領(lǐng)域，由于耐藥性的發(fā)生，很多現(xiàn)存藥物的療效正在下降。
由于上述原因，鑒定新型殺線蟲化合物的需求持續(xù)存在。
咽泵是線蟲攝食和線蟲維持其“流體靜力學(xué)骨骼”能力的基礎(chǔ)[Brownlee，D.J.A.et al.1997.Actions of the anthelmintic ivermectin on thepharngeal muscle of parasitic nematode.Ascaris suum.Parasitology，115553-561]。線蟲的咽泵業(yè)已成為驅(qū)蟲和殺線蟲劑的良好靶器官。特別是，抑制咽泵是伊維菌素的主要作用模式，伊維菌素是一種特別成功的現(xiàn)代線蟲殺蟲劑和昆蟲殺蟲劑。伊維菌素的作用是抑制存在于線蟲和昆蟲咽部和其他組織的谷氨酸受體[Brownlee，D.J.A.et al.1997.supra]。在線蟲咽部鑒定新的分子靶位可以使殺線蟲化合物和殺昆蟲化合物的發(fā)現(xiàn)過程大大簡化，因為分子靶位的知識可以幫助引導(dǎo)化合物的選擇和/或設(shè)計。而且，由于靶位代表分子受體，分離受體基因的可能性為應(yīng)用克隆受體篩選天然產(chǎn)物集和合成化合物文庫提供了前景。在這些篩選過程中發(fā)現(xiàn)的活性分子可能用于控制線蟲、昆蟲和其他害蟲。該示例包括大環(huán)內(nèi)酯類線蟲殺蟲劑(阿維菌素)，該藥物開始作為驅(qū)蟲劑進行注冊，但現(xiàn)在已作為殺蟲劑得到廣泛應(yīng)用。
相比于線蟲導(dǎo)致的損害，我們對昆蟲導(dǎo)致的損害更加了解。例如，世界范圍內(nèi)化學(xué)性昆蟲殺蟲劑的市場大約為120億美圓，絕大部分用于農(nóng)作物保護，也有一部分用于動物和公共衛(wèi)生。該市場以每年大約5％的速度增長。這些控制成本只是世界范圍內(nèi)農(nóng)作物和家畜經(jīng)濟損失成本的一部分。昆蟲在介導(dǎo)人類主要疾病方面的作用也已眾所周知。特別是，吸吮植物害蟲如蚜蟲和plant-hoppers在其經(jīng)濟重要性和殺蟲劑市場中的價值僅次于毛蟲。它們在歐洲和亞洲特別重要。盡管有一些現(xiàn)存殺蟲劑對這些害蟲具有活性，但其中很多毒性較高，而且耐藥性的發(fā)生也導(dǎo)致一些問題的出現(xiàn)。因此，發(fā)現(xiàn)對這類害蟲具有活性的新型殺蟲劑的需求也很旺盛。
而且，具有穿透和吸吮功能口器的昆蟲是導(dǎo)致人類和家畜疾病的主要媒介。這些媒介包括蚊子(如瘧疾、日本腦炎、登革熱等)、higher flies(如盤尾絲蟲病)和true bugs(如錐蟲病)?，F(xiàn)存的控制方法越來越依賴于殺蟲劑(如用氯菊酯處理蚊帳)，因為還沒有可用的藥物治療或藥物治療失敗。因此，也存在發(fā)現(xiàn)對這類害蟲具有活性的新型殺蟲劑的需求。
已知血清素(5羥色胺，5-HT)對秀麗新桿線蟲和其他線蟲的行為具有多種很深的影響。在秀麗新桿線蟲中，外源性應(yīng)用5-HT可以導(dǎo)致運動減弱，咽泵增強，排卵增加和排便減少。它還涉及雄性交配行為。外源性5-HT的這些作用之所以能夠發(fā)生，是因為5-HT是一種線蟲的天然神經(jīng)遞質(zhì)，對這些行為具有影響功能。例如，兩種血清素能神經(jīng)元(NSM)位于咽部，而HSNL和HSNR血清素能神經(jīng)元則與陰戶相聯(lián)。但是，根據(jù)脊椎動物5-HT的生物學(xué)知識，這些行為很可能是通過作用于不同細胞中存在的不同受體得到控制的。
已知脊椎動物血清素受體可以分為兩個截然不同的多基因超家族。其中一個是視紫質(zhì)/β-腎上腺素能受體超家族，包括5-HT1、5-HT2、5-HT4、5-HT5、5-HT6和5-HT7型的7-跨膜G-蛋白連接受體。5-HT3型受體屬于煙堿-乙酰膽堿受體(nAChR)、GABA-、氨基乙酸和谷氨酸門控離子通道超家族，是五聚體，4-跨膜配體門控離子通道。通常觀察到的該家族生理表達的五聚體受體包括兩種或更多種亞單位類型，每一類型都是一個單獨基因的產(chǎn)物。盡管功能性離子通道可以通過實驗應(yīng)用包括相同亞單位的五聚體獲得，但對于它們的通道傳導(dǎo)性，卻與體內(nèi)存在的雜五聚體離子通道不完全相同。在哺乳動物5-HT3門控離子通道中，可靠的電生理特性只有在含有5-HT3A和5-HT3B亞單位的雜聚離子通道中才能獲得[Davies，P.A.et al.1999.The 5-HT3Bsubunit is a major determinant ofserotonin receptor function.Nature.397，359-363]。已知哺乳動物5-HT3受體可以形成通道，控制鈣離子通過細胞膜，當它們被激活時，傾向于激活細胞。在這方面，與很多其他物質(zhì)類似，它們與煙堿乙酰膽堿受體密切相關(guān)。GABAA門控離子通道、氨基乙酸門控離子通道和無脊椎動物特異性谷氨酸門控離子通道都控制陰離子的通過，它們的激活通常使細胞膜超極化。應(yīng)該指出，盡管配體門控離子通道通常是雜五聚體(即，構(gòu)成該物質(zhì)的五個受體亞單位分別是兩種或兩種以上基因的產(chǎn)物)，如哺乳動物5-HT3受體明確所示[Davies，PA.et al.，1999，supra]，但由單獨亞單位構(gòu)成功能性通道也是可能的，而且，表達的單獨亞單位可以按照真實預(yù)期藥理學(xué)與血清素能配體結(jié)合[(如，Maricq，A.V.et al.，1991.Primarystructure and functional expression of the 5-HT3receptor，a serotonin-gatedion channel.Science，254)]。這意味著根據(jù)已知5-HT3受體，可以應(yīng)用表達的單獨亞單位進行功能性和放射性配體結(jié)合，篩選激動劑和拮抗劑。
在7-跨膜5-HT受體中，業(yè)已克隆了多種無脊椎動物同系物。這些物質(zhì)與脊椎動物樣本具有顯著的序列差異，但仍然可以通過脊椎動物受體的分子系統(tǒng)發(fā)育進行判斷。根據(jù)業(yè)已研究的程度，在脊椎動物和非脊椎動物受體之間還存在一些藥理學(xué)差異。
迄今為止，尚無在無脊椎動物物種中克隆陽離子5-HT3受體亞單位的報道。最近報道的一項針對散大蝸牛的電生理研究檢測了一種通道，該通道的傳導(dǎo)性質(zhì)和血清素能藥理學(xué)提示是5-HT3受體[Green，K.A.et al.1996.Ligand gated ion channels opened by 5-HT in molluscan neurones.Brit.J.Pharmacol.119602-608]。但是，一名在秀麗新桿線蟲神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域最著名的研究人員指出，“在秀麗新桿線蟲數(shù)據(jù)庫中沒有序列與親離子血清素受體亞型5-HT3顯著相似”[Niacaris，T.，and Avery L.，Expressionpatterns of candidate serotonin receptors.The Worm Breeder’s Gazette.1520，1998]。本發(fā)明發(fā)明者業(yè)已從無脊椎動物秀麗新桿線蟲中分離了三種編碼5-HT受體亞單位的多核苷酸分子，根據(jù)序列功能區(qū)分析和綜合同源性分析，顯示它們是5-HT3受體亞單位。本發(fā)明的發(fā)明者還獲得了藥理學(xué)證據(jù)，提示線蟲咽泵(已知咽泵涉及線蟲攝食和內(nèi)部液體靜壓的維持)受具有5-HT3特征的受體控制，而且，對這些基因中的一種進行雙鏈RNA介導(dǎo)的基因抑制，可以降低咽部對外源性血清素的反應(yīng)。因此克隆公開的秀麗新桿線蟲5-HT3受體亞單位對于鑒定新型殺線蟲化合物具有相當重要的意義。
最近，Ranganathan，R.et al.(2000.MOD-1 is serotonin-gated chloridechannel that modulates locomotary behaviour in C.elegans.Nature.408470-475)描述了一種來自秀麗新桿線蟲的新型血清素門控離子通道。它似乎可以控制線蟲對食物的運動，控制陰離子，與所有已知其他5-HT受體不同，它具有全新的藥理學(xué)特征，如它對5-HT3受體特異性抑制劑沒有反應(yīng)，但卻對一些其他血清素能制劑表現(xiàn)應(yīng)答。這些結(jié)果提示，存在著第二類血清素門控離子通道，與包括5-HT3A和5-HT3B的類型截然不同。但Ranganathan，R.et al.的結(jié)果卻沒有提示，在秀麗新桿線蟲或其他無脊椎動物中是否存在5-HT3受體。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種編碼無脊椎動物5-HT3受體亞單位的分離多核苷酸分子，包括基本對應(yīng)于序列1-6中任一序列的核苷酸序列，或者與序列1-6所示任一或全部核苷酸序列存在75％以上(更優(yōu)選85％以上，最優(yōu)選95％以上)的同源性。
第一方面的多核苷酸分子可以與表達必需或增強表達的核苷酸序列元件操作性相連。例如，多核苷酸分子可以與任何適宜的啟動子序列(如構(gòu)建或誘導(dǎo)啟動子)、增強子序列或其他調(diào)控表達元件操作性相連。方便的做法是，可以將第一方面的多核苷酸分子引入表達盒或載體，使其編碼的5-HT3受體亞單位得到表達。
因此，本發(fā)明的第二方面提供了一種表達盒或表達載體，包括第一方面的多核苷酸分子。
本發(fā)明的第三方面提供了應(yīng)用第二方面表達盒或載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物、昆蟲、植物、酵母或細菌宿主細胞。
第三方面的宿主細胞可以用來表達一種或多種類型的5-HT3受體亞單位(如5-HT3A和5-HT3B受體亞單位)，使其能在所述細胞中組成5-HT3受體的同聚物或異聚物。為了產(chǎn)生異聚5-HT3受體，需要應(yīng)用兩種或多種表達盒或載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中每種表達盒或載體含有的多核苷酸分子編碼不同的5-HT3受體亞單位。此外，也可應(yīng)用單獨的表達盒載體，該載體含有兩種或多種多核苷酸分子，每種編碼不同的5-HT3受體亞單位。
優(yōu)選地，所述宿主細胞表達的多核苷酸分子可以使5-HT3受體在宿主細胞的表面表達。
本發(fā)明的第四方面提供了制備5-HT3受體的方法，包括在一定條件下培養(yǎng)第三方面的宿主細胞，所述條件使多核苷酸分子能夠表達，并可選地，恢復(fù)表達受體。
優(yōu)選地，宿主細胞是哺乳動物細胞或源于昆蟲的細胞。當細胞是哺乳動物細胞時，現(xiàn)在優(yōu)選COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚胎腎293細胞。當細胞是源于昆蟲的細胞時，現(xiàn)在優(yōu)選昆蟲Sf9細胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，5-HT3受體在宿主細胞表面表達。
本發(fā)明的第五方面提供了無脊椎動物的5-HT3受體，該受體包括至少一個亞單位，該亞單位的特征在于N末端氨基酸序列選自下述序列MIICYSCLTV(序列7)，MLLPILLHFL(序列8)或MRRRFEIGIA(序列9)，或基本純形式的該受體功能等價片段。
優(yōu)選地，至少一個亞單位具有的氨基酸序列基本對應(yīng)于序列10，11或12所示的序列。
本發(fā)明的第六方面提供了鑒定和/或評價殺線蟲化合物的實驗方法，該方法包括在一定條件下讓備選殺線蟲化合物與第五方面的5-HT3受體或其功能等價片段接觸，或與第三方面轉(zhuǎn)染了一種或多種表達盒或載體并表達5-HT3受體的細胞接觸，檢測所述5-HT3受體或其功能等價片段活性的增強或減弱，所述一定條件是指能夠激活5-HT受體的條件。
可以通過檢測細胞膜電壓或Ca2+水平變化，確定5-HT3受體或其功能等價片段活性的增強或減弱。
接觸步驟包括讓5-HT3受體或其功能等價片段與備選殺線蟲化合物和血清素能配體同時接觸。
本發(fā)明的第七方面提供了鑒定和/或評價殺線蟲化合物的實驗方法，該方法包括在一定條件下讓預(yù)定劑量的適宜標記的血清素能配體和預(yù)定劑量的備選殺線蟲化合物一起與第五方面的5-HT3受體或其功能等價片段接觸，或與第三方面轉(zhuǎn)染了一種或多種表達盒或載體并表達5-HT3受體的細胞接觸，其中所述血清素能配體和所述備選殺線蟲化合物可以與5-HT3受體或其功能等價片段競爭性結(jié)合，然后測定結(jié)合和/或未結(jié)合標記血清素能配體的量。
適宜標記的血清素能配體優(yōu)選5-羥色胺(5-HT)。血清素能配體可以應(yīng)用例如任意放射性同位素(如H3)、酶、生物素/親和素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光分子進行標記。
在第七方面的方法中，5-HT3受體、功能等價片段或表達5-HT3受體的細胞優(yōu)選固定在支持物上(如96孔板的孔壁)。這使未結(jié)合的血清素能配體可以通過本領(lǐng)域常規(guī)方法容易地洗脫去除。
此外，第一方面的多核苷酸分子，特別是那些包括序列1-6所示任一核苷酸序列中全部或至少10個核苷酸部分的多核苷酸分子，都可作為探針，從其他物種中檢測編碼同源5-HT3受體亞單位的多核苷酸序列。
這些探針可以采用常規(guī)分子克隆技術(shù)(如，見Sambrook，J.et al.1989.Molecular cloninga laboratory manual，2ndedition.Vol.1-3.Cold SpringHarbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor)進行制備，將第一方面的多核苷酸分子或其部分導(dǎo)入適宜細菌質(zhì)粒(如多拷貝細菌質(zhì)粒，如pUC系列質(zhì)粒，包括pBlueScript(Stratagene，La Jolla，California))的多克隆位點，然后通過眾所周知的電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化細菌細胞系(如DH10B；LifeTechnologies，Grand island，New York)?？梢匀鏢ambrook，J.et al.所述[1989，supra]，在小規(guī)模液體培養(yǎng)中使宿主細菌細胞系生長到高密度后，通過堿溶解分離質(zhì)粒DNA，隨后進行苯酚氯仿純化(所謂的小質(zhì)粒制備)，也可以應(yīng)用多種商業(yè)試劑盒中的任何一種，這些試劑盒基于質(zhì)粒DNA的固相吸附，然后進行選擇性洗脫(如“ultraclean MiniPlasmid PrepKit”Mo Biol Laboratories Inc.，Solana Beach，California)。隨后，如本領(lǐng)域眾所周知，可以通過限制性內(nèi)切酶消化將作為探針的克隆多核苷酸分子或其部分從質(zhì)粒上切除下來。此外，探針還可以通過多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增產(chǎn)生，應(yīng)用第一方面的多核苷酸分子或其部分作為模板DNA，兩個PCR引物具有適宜長度(如15-30核苷酸)，其中之一與多核苷酸分子或其部分的5’端同源，另一個與多核苷酸分子或其部分的3’端同源?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域眾所周知的任意方法進行PCR(如，Innis，M.A.et al.1990.PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications.AcademicPress，San Diego，California所述)。
在低熔點瓊脂糖凝膠中通過片段大小分離法純化探針，然后通過溴化乙啶染色或其他任何核酸熒光染料染色，并在紫外燈下顯帶，切下含有探針的瓊脂糖區(qū)域，通過熔化瓊脂糖基質(zhì)和選擇性沉淀DNA(如Sambrook J.et al.1989，supra)收獲探針，或者通過瓊脂糖的化學(xué)溶解，然后應(yīng)用glass milk或任一基于從瓊脂糖凝膠基質(zhì)中固相回收DNA的商業(yè)試劑盒(如QIAquick PCR purification kit QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)吸附探針。
可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的方法對探針進行標記，包括應(yīng)用P32標記的缺口平移法，應(yīng)用例如Giga引物DNA標記試劑盒(GeneWorks，Adelaide)進行的P32標記的隨機引物法，或應(yīng)用生物素或地高辛標記，或應(yīng)用半抗原標記探針，所述半抗原可以進行酶標檢測，如應(yīng)用過氧化物酶、HRP或熒光素酶標記，產(chǎn)生有色產(chǎn)物或化學(xué)發(fā)光或其他發(fā)光信號。
可以從這些物種中制備用于探針檢測的靶DNA(如cDNA和基因組文庫)，希望在這些物種中獲得與本發(fā)明多核苷酸分子同源的多核苷酸序列，開始可以從這些動物或植物寄生性線蟲種(如捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，豬蛔蟲，雞蛔蟲，Pratylenchus sp.，Globodera sp.，南方根結(jié)線蟲，或者從昆蟲任意物種中獲得，包括那些具有病害特征的昆蟲，順序為鱗翅目(如Helicoverpa sp.、Heliothis sp)，雙翅目(如銅綠蠅、Simulium sp、Anophelessp、庫蚊、伊蚊)，半翅目(如Myzus sp、桉蚜)，或者來自任何其他無脊椎動物的組織，特別是那些具有穿透和/或吸吮功能口器以及以消化道吸吮或泵功能的方式攝食或附著于宿主的無脊椎動物)中獲得大約100mg(或以上)的組織。起始組織可以包括整個生物體，也可以包括咽部及其相關(guān)神經(jīng)結(jié)構(gòu)可以包括完整的消化道及其相關(guān)神經(jīng)結(jié)構(gòu)。理想狀況是，起始組織來自已知表達5-HT3受體的生命階段。該信息可以通過應(yīng)用探針進行某生命階段RNA印跡分析獲得，但是如果該信息無法獲得，方便可能的方法是應(yīng)用混合生命階段的組織作為起始組織。
可以應(yīng)用大量商業(yè)試劑盒如QuickPrep微量RNA純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，N.J.)從組織中方便制備用于合成cDNA文庫的mRNA。此外，還可應(yīng)用諸如Chomczynski P.andSacchi N.(1987.Single-step method of RNA isolation by acid guanidiumthiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem.162156-159)描述的傳統(tǒng)方法制備總RNA，然后通過寡聚脫氧胸苷纖維素色譜純化mRNA(Sambrook J.et al.，1989，supra)?？梢詰?yīng)用多種商業(yè)試劑盒方便地從mRNA制備cDNA，如TimeSaver cDNA合成試劑盒(AmershamPharmacia Biotech Inc.Piscataway，N.J.)，并通過傳統(tǒng)連接技術(shù)將獲得的cDNA池插入到商業(yè)λ臂中。可以通過商業(yè)渠道獲得多種按規(guī)格裁切的λ噬菌體變異株。一種適宜的變異株為Promega Corporation(Madison，Wisconsin)出品的磷酸酯酶化的λgt10-NotI。其他包括λ-Zap(Stratagene，La Jolla，California)或λ-Excel(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，N.J.)。然后可以將插入了cDNA的λ噬菌體DNA池通過將其與商業(yè)λ包裝提取物混合，組裝到感染噬菌體顆粒庫中，所述商業(yè)λ包裝提取物如MaxPlax包裝提取物(Epicentre Technologies，Corporation，Madison，Wisconsin)。這樣cDNA就可以進行篩檢了。還可以對這些流程稍加改變(Sambrook J.et al.1989，supra)，進行cDNA表達文庫的建立。
可以如下所述獲得同源多核苷酸序列。文庫篩檢一旦文庫建立，就可用來感染支持溶菌酶感染的大腸桿菌細胞系(如在應(yīng)用λ菌株λgt10菌株時，可以應(yīng)用C600hfl，Promega，Corporation.Madison，Wisconsin)，所述大腸桿菌細胞業(yè)已在瓊脂平板上備出(Sambrook J.et al.1989，supra)。將菌斑印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或尼龍(如Hybond N+，Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，N.J.)或其他適宜濾器上。每次可以篩檢數(shù)量級大約為50,000-100,000或更多的來自該cDNA的獨立噬菌體集合。為了達到該目標，應(yīng)用標記探針探測濾器。為了從秀麗新桿線蟲以外的物種中獲得編碼同源受體亞單位的多核苷酸序列，必須在不同嚴格程度的條件下進行探針雜交和洗脫程序，所述條件包括低度嚴格條件。因此，在0.1-5倍SSC范圍內(nèi)(Sambrook J.etal.1989，supra)和65-45℃溫度范圍內(nèi)進行探針雜交和洗脫。為了從相關(guān)程度很遠的線蟲種屬中獲得同源多核苷酸序列，可以應(yīng)用系統(tǒng)發(fā)育步移法。該方法包括應(yīng)用秀麗新桿線蟲相關(guān)序列作為探針，從系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)程度較近的物種中獲得同源序列，例如，可以從另一桿狀線蟲如Steinernema carpocapsae中制備、篩檢文庫，然后通過重復(fù)上述步驟，從相關(guān)程度更遠的線蟲如圓線蟲科的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中制備文庫，然后應(yīng)用秀麗新桿線蟲探針或從S.carpocapsae中獲得的同源序列制備的探針篩檢捻轉(zhuǎn)血矛線蟲文庫，從后面的物種中獲得同源受體的多核苷酸序列。如上所述，該過程可以重復(fù)進行，通過反復(fù)進行的產(chǎn)生探針、構(gòu)建cDNA文庫和篩檢文庫，可以從任一線蟲種中分離同源多核苷酸序列。多聚酶鏈反應(yīng)法從第二種物種中分離編碼同源受體亞單位的多核苷酸序列的另一種方法是應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)從第二種物種中擴增同源探針，然后如上所述標記探針，并應(yīng)用這些探針從適宜的cDNA文庫中分離克隆。在該過程中，設(shè)計的簡并PCR引物應(yīng)包括編碼已知氨基酸的所有可能的核苷酸組合，所述氨基酸位于序列高度保守或中度保守區(qū)域。通過比較序列10、11和12顯示的氨基酸序列和如圖3所示的同源5-HT3受體的氨基酸序列，可以鑒定這些高度保守或中度保守的區(qū)域。此外，在這種比較中，也可以包括其他無脊椎動物的同源序列，如可以應(yīng)用BLAST檢索公開核酸數(shù)據(jù)庫如GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫，鑒定同源cDNA公開表達序列標簽，也可以應(yīng)用BLAST檢索其他無脊椎動物基因組數(shù)據(jù)庫，特別是黑腹果蠅基因組數(shù)據(jù)庫，可以獲得同源序列。這些比較可以通過應(yīng)用多重比對運算法則達成，如威斯康星州立大學(xué)Genetics ComputingGroup編寫的GCG序列分析軟件包中的“pileup”“clustalw”和“ecustalw”運算法則。近似的運算法則可以從大多數(shù)主要計算機平臺獲得。
同源多核苷酸分子可以用來在其他無脊椎動物物種中表達5-HT3受體亞單位，可以用于與本發(fā)明第七和第八方面相似的實驗。
因此，本發(fā)明第八方面提供了鑒定和/或評價殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物的實驗方法，所述方法包括(i)從秀麗新桿線蟲以外的無脊椎動物中分離多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括編碼5-HT3受體亞單位的核苷酸序列，并代表序列1-6所示全部或任一核苷酸序列的同系物；(ii)表達所述多核苷酸分子，產(chǎn)生5-HT3受體或其功能等價片段；(iii)讓產(chǎn)生的至少一種5-HT3受體或其功能等價片段在一定條件下與備選殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物接觸，所述條件能夠激活5-HT受體；和(iv)檢測產(chǎn)生的5-HT3受體或其功能等價片段活性的增強或減弱。
步驟(iii)提及的5-HT3受體或其功能等價片段可以存在于細胞表面(如宿主細胞表達步驟(i)所述的多核苷酸分子)，也可以存在于細胞裂解液中(如表達步驟(i)所述多核苷酸分子的宿主細胞裂解液)，或者該5-HT3受體或其功能等價片段以基本純的形式存在。
本發(fā)明的第九方面提供了鑒定和/或評價殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物的實驗方法，所述方法包括(i)從秀麗新桿線蟲以外的無脊椎動物中分離多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括編碼5-HT3受體亞單位的核苷酸序列，并代表序列1-6所示全部或任一核苷酸序列的同系物；(ii)表達所述多核苷酸分子，產(chǎn)生5-HT3受體或其功能等價片段；(iii)讓產(chǎn)生的至少一種5-HT3受體或其功能等價片段在一定條件下與預(yù)定劑量的適宜標記的血清素能配體和預(yù)定劑量的備選殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物接觸，其中所述血清素能配體和所述備選化合物可以與5-HT3受體或其功能等價片段競爭性結(jié)合；和(iv)測定結(jié)合和/或標記的血清素能配體的量。
本發(fā)明第十方面提供了一種應(yīng)用第七或第八方面的實驗方法鑒定的殺線蟲化合物。
本發(fā)明的第十一方面提供了應(yīng)用第九或第十方面的實驗方法鑒定的殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物。
本發(fā)明的另一方面還提供了殺滅寄生蟲(如線蟲、絳蟲或其他扁形蟲)的方法，所述方法包括將該寄生蟲暴露于有效劑量的化合物下，所述化合物可以改變該寄生蟲的5-HT3受體活性。
優(yōu)選地，所述化合物抑制血清素能配體導(dǎo)致的5-HT3受體激動。該化合物的有效劑量范圍是在生物整體水平≤100μM，優(yōu)選≤10μM，更優(yōu)選≤1μM。化合物可以結(jié)合獸醫(yī)或藥理學(xué)可接受載體，或者任何是適宜的載體。
本發(fā)明的另一方面還提供了包括有效劑量化合物的殺寄生蟲組合物，所述化合物可以改變該寄生蟲的5-HT3受體活性。
本發(fā)明還以化合物的形式提供了針對某些昆蟲(如吸吮昆蟲，如蚜蟲或其他具有肌肉攝食機制的昆蟲)有效的昆蟲殺蟲劑，所述化合物可以改變該寄生蟲的5-HT3受體活性。
本發(fā)明的另一方面還提供了殺滅昆蟲的方法，該方法包括將該昆蟲暴露于有效劑量的化合物下，所述化合物可以改變該寄生蟲的5-HT3受體活性。
優(yōu)選地，所述化合物抑制血清素能配體導(dǎo)致的5-HT3受體激動。該化合物的有效劑量范圍是在生物整體水平≤100μM，優(yōu)選≤10μM，更優(yōu)選≤1μM。提供的化合物可以與農(nóng)業(yè)可接受載體相結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面還提供了包括有效劑量化合物的殺昆蟲組合物，所述化合物可以改變該寄生蟲的5-HT3受體活性。
本說明書中涉及的同源百分比是應(yīng)用BLAST程序blastn計算的，如Altschul，S.F.et al.1997 Capped BLAST and PSI-BLASTa new generationof protein database search programs，Nucleic Acids Research.Vol.25，No.17，pp.3389-3402(1997)所述。
本文所用術(shù)語“5-HT3受體”是指具有下述(1)-(3)中1個或多個特征的受體(1)是血清素門控分子離子通道，該通道控制陽離子的傳導(dǎo)，包括5個受體亞單位，每個亞單位具有煙堿樣跨膜拓撲學(xué)特征(N末端，大的細胞外功能區(qū)，3個跨膜螺旋，大的細胞內(nèi)功能區(qū)，1個跨膜螺旋，C末端)。
(2)如果是哺乳動物5-HT3受體，則其包括與其他已知哺乳動物5-HT3A或5-HT3B亞單位高度同源的亞單位。如果是無脊椎動物5-HT3受體，則其包括的亞單位的氨基酸與哺乳動物5-HT3受體亞單位的同源水平高于與已知哺乳動物煙堿乙酰膽堿受體亞單位的同源水平。
(3)具有特征性藥理學(xué)性質(zhì)，即它與已知5-HT3受體特異性激動劑和拮抗劑的結(jié)合選擇性高于它與其他5-HT受體類型激動劑和拮抗劑的結(jié)合選擇性。
本文所用術(shù)語“血清素能配體”是指能與一種或多種血清素受體亞型選擇性結(jié)合的任意化合物。它可能激活受體(激動劑)，也可能阻止除它之外的其他配體與受體結(jié)合激動受體(拮抗劑)，它還可能兼具激動劑/拮抗劑的雙重特征。
本文在涉及核苷酸序列時所用術(shù)語“基本對應(yīng)于”試圖在核苷酸序列中包括少量變異，這是因為DNA密碼子的簡并性不會導(dǎo)致編碼的無脊椎動物5-HT3受體發(fā)生改變。而且，該術(shù)語還試圖在序列中包括其他少量變異，這種變異可能需要用來增強在某特定系統(tǒng)中的表達，但在這種情況下，變異應(yīng)不導(dǎo)致編碼蛋白生物活性的降低。
本文在涉及核苷酸序列時所用術(shù)語“基本對應(yīng)于”試圖在氨基酸序列中包括少量變異，這種變異不導(dǎo)致無脊椎動物5-HT3受體生物活性的降低。這些變異可以包括保守氨基酸取代?？赡艿娜〈荊，A，V，I，L，M；D，E；N，Q；S，T；K，R，H；F，Y，W，H；以及P.Nα-堿性氨基酸。
本說明書貫穿全文所用的術(shù)語“包括”試圖指在包括或不包括進一步的一種步驟、組分或特征或一組步驟、組分或特征時，包括的所述一種步驟、組分或特征，或一組步驟、組分或特征。
本說明書中包括的任何文本探討、法案、材料、設(shè)備、論文等，其目的只是為本發(fā)明提供背景。它不應(yīng)被視作一種允許，就是這些材料的任何一部分或全部構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)的部分基礎(chǔ)或本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的基本常識，因為它在本申請每個權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期之前就存在于澳大利亞了。
在此之后，本發(fā)明將以下述非限制性實施例和相應(yīng)附圖的形式進行闡述。
圖2是在0.325mM血清素存在的情況下，MDL72222對秀麗新桿線蟲血清素刺激咽泵抑制效果的典型劑量反應(yīng)曲線。在該實驗中，MDL72222的IC50大約比血清素濃度低25μM(即數(shù)量級)。
圖3提供了已知哺乳動物5-HT3代表序列、已知脊椎動物和無脊椎動物nAChR代表序列、三種ACeDB推導(dǎo)受體基因(F18G5.4.pep，F(xiàn)25G6.4/CE09640.pep和C31H5.3.pep)和三種實驗測定的相關(guān)但不同的秀麗新桿線蟲5-HT3序列(F18，DIY和DIAY)的分子系統(tǒng)發(fā)育圖。該分子系統(tǒng)發(fā)育將三種秀麗新桿線蟲5-HT3受體亞單位定位于一個框架，該框架通過代表性篩選哺乳動物5-HT3受體序列(包括最近發(fā)現(xiàn)的5-HT3B)和已知昆蟲、線蟲和人類nAChR序列得到創(chuàng)建。秀麗新桿線蟲基因組計劃將F18G5.4指定為理論乙酰膽堿受體樣蛋白，也是“配體門控離子通道”。該分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，根據(jù)整體同源性水平，F(xiàn)18G5.4是秀麗新桿線蟲現(xiàn)存序列中與以前鑒定的哺乳動物5-HT3受體最接近的。秀麗新桿線蟲基因組計劃將F25G6.4/CE09640指定為“配體門控離子通道”，將C31H5.3指定為推導(dǎo)5-HT3受體。但本發(fā)明發(fā)明者進行的系統(tǒng)發(fā)育分析卻顯示，這兩種序列與目前已知的5-HT3和nAChR的相關(guān)程度較遠，就象這兩種序列的彼此相關(guān)程度一樣。另一方面，大膽的氨基酸三元組卻提示了發(fā)育樹每個分支DIY位點的序列。在這方面發(fā)現(xiàn)，CE09640和C31H5.3與5-HT3A的相似性較與nAChR的相似性更高。
圖4顯示了在三個分離的獨立實驗中，敲除F18信使RNA的雙鏈RNA，血清素對咽泵的刺激作用。在每種情況下，按照Timmons，L.andFire，A.(1998.Specific interference by ingested dsRNA.Nature.395854)等所述，給線蟲喂養(yǎng)大腸桿菌HT115，所述大腸桿菌或者表達部分F18基因“F18”，或者表達空雙鏈dsRNA表達質(zhì)粒“pL4440”作為對照。在第三個實驗中(圖4c)，還包括第二種對照“pCB6”，包括同一質(zhì)粒表達的不相關(guān)dsRNA。在每一個實驗中，個體線蟲根據(jù)其泵率等級在X軸排序。應(yīng)該指出，用于刺激線蟲的血清素濃度在圖4a和4b中是3.25mM，在圖4c中是1mM。應(yīng)用F18抑制泵率外的其他影響，將在下面的實施例5中給予描述。
除非有其他提示，在下面闡述的實驗中，秀麗新桿線蟲Bristol N2菌株(Brenner，S.1974.The genetics of Caenorhabditis elegans.Genetics.7771-94)在室溫、NGM瓊脂上(Sulston，J.and Hodgkin，J.1988.“Methods”in The nematode Caenorhabditis elegans.W.B.Wood pp 587-606.ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)培養(yǎng)，喂食HMS174大腸桿菌(Campbell J.L.et al.1978.Genetic recombination and complementationbetween bacteriophage T7 and cloned fragments of T77 DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.752276-2280)。實施例1在秀麗新桿線蟲中藥理學(xué)鑒定一種以前未知的5-HT3受體，該受體負責(zé)控制咽泵速率和強度眾所周知，在其他影響中，濃度為微摩爾到毫摩爾的血清素可以增加線蟲咽泵的泵率和強度(見

圖1，該圖顯示了血清素對咽泵作用的劑量反應(yīng)曲線)。5-HT3受體類型選擇激動劑脊椎動物5-HT受體的藥理學(xué)已經(jīng)比較明了，目前臨床應(yīng)用的很多化合物都作用于血清素能系統(tǒng)。盡管對無脊椎動物5-HT受體的藥理學(xué)知之甚少，而且它與脊椎動物的受體存在一些重要差異，但在作用于脊椎動物某一給定亞型受體的化合物和無脊椎動物同系物之間，似乎存在比較廣泛的對應(yīng)性。
因此進行了如下研究，其中，將已知濃度的選擇性5-HT1、5-HT2和5-HT3受體激動劑施于瓊脂，秀麗新桿線蟲在沒有食物的情況下生長在瓊脂上，觀察這些物質(zhì)對運動和咽泵的影響2-3小時。表1給出了選擇性5-HT1、5-HT2和5-HT3受體激動劑的結(jié)果。聯(lián)合應(yīng)用兩種5-HT1受體激動劑對咽泵沒有影響，每種激動劑的濃度為6mM。運動受到抑制，但大多數(shù)線蟲在轉(zhuǎn)移到新鮮瓊脂平板后恢復(fù)了運動能力。一種特異性5-HT2受體激動劑也沒有刺激泵功能。而一種特異性5-HT3受體激動劑(3mM)則可引起咽泵的明顯刺激作用，與最大濃度的5-HT作用類似。在實驗的全部處理過程中，沒有線蟲死亡。選擇性5-HT3受體拮抗劑還進行研究觀察了脊椎動物選擇性5-HT3受體拮抗劑對5-HT誘導(dǎo)的咽泵功能增強的抑制能力。選擇的兩種抑制劑是恩丹西酮(葛蘭素威康出品的一種藥物，用于預(yù)防化療引起的嘔吐)和MDL 72222(托烷基二氯安息香酸(tropanyl dichlorobenzoate)，業(yè)已報道，前者對蝸牛5-HT3樣離子通道的抑制作用顯著弱于脊椎動物5-HT3受體(蝸牛和脊椎動物的IC50分別為10μM和100pM)[Green，K.A.et al.1996，supra]，后者對蝸牛5-HT門控傳導(dǎo)的IC50為1μM[Green，K.A.et al.1996，supra]。
在存在6.5mM 5-HT的情況下，以100μM濃度應(yīng)用的兩種抑制劑均未降低泵率(結(jié)果未顯示)。但是，6.5mM的5-HT超過EC50幾乎20倍(見圖1)，因此可能競爭過了抑制劑，特別是如果這些抑制劑與無脊椎動物受體亞型的親和力不是特別高。在第二個實驗中，兩種抑制劑一起應(yīng)用，每種抑制劑的濃度為325μM，而5-HT的濃度降為325μM(即大約EC50)。5-HT的作用全部逆轉(zhuǎn)(見表2)。在沒有5-HT存在的情況下，兩種拮抗劑共同應(yīng)用的效果是刺激泵功能，盡管與5-HT的作用程度不同。在第三個實驗中，當抑制劑單獨應(yīng)用，其摩爾濃度與5-HT相同時(即5-HT和抑制劑的濃度均為0.325mM)，每種抑制劑都可顯著抑制咽泵泵率(表3)。在這些條件下，MDL72222似乎比恩丹西酮更有效，前者可以單獨完全逆轉(zhuǎn)5-HT的作用。沒有一種抑制劑可以單獨刺激咽泵。
在另一個實驗中，進行了劑量反應(yīng)研究，研究測定了在血清素0.325mM的情況下，MDL72222對咽泵泵率和強度的影響(圖2)。在該濃度5-HT存在的情況下，MDL72222的IC50大約為30μM，即比5HT的EC50低10倍。實施例2選擇性5-HT3受體拮抗劑是秀麗新桿線蟲的線蟲殺蟲劑，是吸吮昆蟲桃蚜(半翅目蚜科)的昆蟲殺蟲劑，是咀嚼昆蟲棉鈴蟲(鱗翅目夜蛾科)的拒食素上述數(shù)據(jù)提示，存在于秀麗新桿線蟲體內(nèi)，很可能也存在于其他線蟲體內(nèi)的5-HT3受體介導(dǎo)了咽泵對外源性或內(nèi)源性血清素反應(yīng)的泵率(和強度)增加，所述其他線蟲對血清素的反應(yīng)形式與秀麗新桿線蟲類似。因為咽泵對于線蟲攝食和維持線蟲“流體靜力學(xué)骨骼”至關(guān)重要[Brownlee，D.J.A.et al.1997，supra]，而且咽泵也是以前建立的線蟲殺蟲劑靶器官，因此進行了研究，評價按照長期暴露協(xié)議，選擇性5-HT3受體拮抗劑是否可以發(fā)揮線蟲殺蟲劑的作用。
在在六孔組織培養(yǎng)平板的NGM瓊脂上(Sulston，J.and Hodgkin，J.1988.supra)培養(yǎng)秀麗新桿線蟲，喂食HMS/174大腸桿菌菌株(CampbellJ.L.et al.1978.Genetic recombination and complementation betweenbacteriophage T7 and cloned fragments of T77 DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.752276-2280)，每孔含2ml瓊脂。應(yīng)用≤65μl的丙酮作為載體，將MDL72222以特定濃度整合到瓊脂中。對照孔僅含65μl丙酮。將5-11 L1階段的秀麗新桿線蟲轉(zhuǎn)移到每孔，22℃孵育直到4周。表4總結(jié)了結(jié)果。所有濃度＞10μM的MDL72222均導(dǎo)致了發(fā)育遲緩。MDL72222濃度＞80μM，在3天內(nèi)導(dǎo)致40％線蟲死亡。這些濃度可以導(dǎo)致線蟲在一周內(nèi)死亡，而且它們幾乎所有的后代都無法從卵中孵化。因此，細菌食物也有很長一段時間保持未食狀態(tài)。
MDL72222濃度＞20μM可以在21天內(nèi)導(dǎo)致90-100％的死亡率，而較低濃度如10μM和5μM也在21天導(dǎo)致50-100％的死亡率。MDL72222濃度最低時，線蟲死亡延遲，直至細菌食物全部消耗后。在這些濃度下，與對照孔線蟲相比仍然存在清晰差異，對照孔線蟲在食物供應(yīng)耗竭后形成dauer larvae，而即使暴露于最低濃度MDL72222的線蟲，在食物供應(yīng)耗竭后也無法作出適宜反應(yīng)，最終死亡。重復(fù)表3顯示的實驗，得到的結(jié)果基本相同。
由于選擇性5-HT3受體拮抗劑對秀麗新桿線蟲的殺蟲效果，我們檢測了5-HT3受體拮抗劑，以確定它們對昆蟲害蟲兩個種棉鈴蟲和桃蚜是否具有相似效果。當通過表面污染整合到人工飼料后(Teakle，R.E.andJensen，J.M.1985.Heliothis punctiger，in Handbook of insect rearing.P.Singh and R.F.Moore，Vol.2，pp 312-322，Elsevier.Amsterdam)發(fā)現(xiàn)，MDL72222對新生棉鈴蟲的生長發(fā)育具有輕度拒食素效應(yīng)，所述棉鈴蟲具有咬和咀嚼口器(表5)。恩丹西酮對棉鈴蟲的效果不顯(未給出結(jié)果)。
還檢測了MDL72222對綠桃蚜(桃蚜)的效果。生物實驗涉及在人工飼料中檢測3種不同濃度(1mM，100μM，10μM)的化合物。對于非水溶性化合物，可以應(yīng)用無毒表面活性劑強行溶解。對于每種化合物的每種濃度，都進行10次重復(fù)實驗進行檢測。每次重復(fù)實驗都在Parafilm小袋中用待測溶液喂養(yǎng)5只蚜蟲5天。蚜蟲的存活情況和生長率在不同檢測濃度和對照組中進行比較，所述對照溶液只含有人工飼料和表面活性劑。MDL72222可以導(dǎo)致桃蚜的劑量依賴性死亡和顯著體重減輕(表6)。恩丹西酮對桃蚜的效果不顯(未給出結(jié)果)。
很明顯，MDL72222對無脊椎動物5-HT3受體來說，是較恩丹西酮更強的抑制劑。
因此，可以得出結(jié)論，能夠抑制線蟲和昆蟲(以及具有相似攝食機制、維持turgor壓機制或通過口腔吸引附著于宿主的其他無脊椎動物)5-HT3受體的制劑將普遍成為這些品種的殺蟲劑，所述昆蟲的攝食機制包括肌肉泵。還可以得出結(jié)論，線蟲和其他無脊椎動物的5-HT3受體及其亞單位代表了理想的篩選分子目標，可以鑒定并優(yōu)化新的無脊椎動物高度選擇性的強效殺蟲劑。實施例3序列分析1.眾所周知，脊椎動物7-跨膜G-蛋白連接超家族的胺能受體具有氨基酸的DRY三元組，其位置與第三個跨膜片段的一個末端鄰近。本發(fā)明發(fā)明者進行的分析顯示，4個脊椎動物品種的5-HT3A受體具有保守的DRY三元組。
2.在對已知哺乳動物5-HT3代表序列、已知脊椎動物、昆蟲和線蟲nAChR代表序列和三種本發(fā)明線蟲5-HT3受體序列(以前指定為理論乙酰膽堿樣受體F18G5.4，推導(dǎo)的5-HT3受體C31H5.3和配體門控離子通道F25G6.4/CE09640)進行eclustalw(圖3)比對發(fā)現(xiàn)，后三者不屬于任何一種已知的哺乳動物亞型5-HT3受體亞單位。但是，F(xiàn)18G5.4是與哺乳動物5-HT3受體關(guān)系最近的序列，F(xiàn)25G6.4/CE09640在預(yù)期位點含有一個DIY序列功能區(qū)，而C31H5.3在相同位點含有一個DIAY(序列13)修飾功能區(qū)。實施例4克隆構(gòu)建表達盒通過自動運行“GeneFinder”，在秀麗新桿線蟲基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定實施例3所述的3個序列。因為不可能得出這些序列是全長序列或真實序列的結(jié)論，也不可能得出它們在體內(nèi)是以GeneFinder鑒定的形式表達的結(jié)論，所以本發(fā)明發(fā)明者克隆并表達了3種cDNA(DIY，F(xiàn)18和DIAY)，這三個序列由秀麗新桿線蟲基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定的F25G6.4/CE09640、F18G5.4和C31H5.3序列部分編碼。
1.從混合生命階段的秀麗新桿線蟲中制備寡聚脫氧胸苷引導(dǎo)的cDNA。將其一部分克隆到λgt10中產(chǎn)生cDNA文庫。另一部分作為模板，擴增可用于每個靶基因的序列特異性探針。在每種情況下，根據(jù)GeneFinder預(yù)期的cDNA設(shè)計獨特序列引物對，應(yīng)用該引物對跨越三種預(yù)期cDNA的中央?yún)^(qū)(0.5-1.0kb)。盡管在理論上這種方法可能由于GeneFinder預(yù)測失誤而存在失敗的可能，但隨后對擴增產(chǎn)物的序列分析卻提示，在全部三種情況下，均獲得了所需靶序列的真實片段。
2.應(yīng)用隨機引物法從擴增子中制備32P標記探針，然后在高度嚴格雜交條件下，通過標準菌斑印跡法，應(yīng)用獲得的探針篩檢收獲雜交cDNA克隆。
3.對于DIY，從文庫中收獲了一個單獨的大克隆。但是，序列分析卻發(fā)現(xiàn)，該克隆含有一個剪接謬誤，導(dǎo)致引入大量框架內(nèi)終止密碼子。從獨立cDNA文庫池中收獲兩個獨立的PCR擴增子，重新構(gòu)建編碼預(yù)期編碼序列的cDNA，方法是將PCR片段與cDNA克隆的中央?yún)^(qū)域連接，這樣可以消除剪接謬誤。
4.對于DIAY，從文庫中收獲了兩個獨立的大克隆。序列分析及與ACeDB基因組序列的對比發(fā)現(xiàn)，這兩個克隆都是真實克隆，攜帶完整的編碼序列。
5.對于F18，從文庫和幾個確證了3’序列的短克隆中收獲了一個單獨的大克隆。但是，較長的序列在5’端卻沒有編碼可能的可裂解信號肽。應(yīng)用錨定PCR對覆蓋這一區(qū)域的其他序列進行了深入研究，所述PCR在3’端應(yīng)用兩個巢式F18特異性引物，在5’端應(yīng)用一個單獨的λ噬菌體特異性引物。應(yīng)用cDNA文庫中獨立的池作為模板，獲得了兩個獨立卻相同的擴增子，序列分析時發(fā)現(xiàn)，該擴增子預(yù)言了可能可裂解的N末端信號肽。通過將一個PCR擴增子片段與cDNA克隆5’端連接，重新構(gòu)建了編碼該預(yù)期編碼序列的序列。
通過雙鏈測序和下述序列分析，確證了實驗測定克隆的真實性-比較cDNA序列與秀麗新桿線蟲基因組序列。
-存在一個大約1.5-2kb的開放閱讀框。
-預(yù)測配體門控離子通道亞單位的膜拓撲學(xué)。
-預(yù)測N末端可裂解信號肽。
-通過多個獨立克隆確證序列，所述克隆可以從cDNA文庫中通過篩選獲得，也可以從獨立cDNA池中通過PCR獲得。
在每種情況下，對cDNA進行實驗克隆和序列分析都發(fā)現(xiàn)，GeneFinder對三種cDNA序列的預(yù)測均存在錯誤，特別是在內(nèi)含子-外顯子邊界比對時。部分對應(yīng)于ACeDB預(yù)期基因CE09640/F25G6.4的真實分離cDNA被命名為DIY(序列5)。部分對應(yīng)于GeneFinder預(yù)測cDNAC31H5.3的真實重建cDNA被命名為“DIAY”(序列6)。同樣，部分對應(yīng)于GeneFinder預(yù)測cDNA F18G5.4的真實重建cDNA被命名為“F18”(序列4)。
將三種cDNA(DIY，F(xiàn)18和DIAY)插入到哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1(In-Vitrogen，Groningen，The Netherlands)中，轉(zhuǎn)染COS-7L細胞，使每個受體亞單位在細胞表面表達。還將三種cDNA插入到相關(guān)載體pcDNA3.1/myc-His(In-Vitrogen，Groningen，The Netherlands)中，并使其作為融合蛋白在C-myc和6-His標簽的上游表達。業(yè)已顯示，該類型融合蛋白在HEK細胞中不干擾哺乳動物5-HT3A亞單位的表達(Lankiewicz，S.et al.，2000.Phosphorylation of the 5-hydroxytryptamine(5-HT3)receptor expressed in HEK293 cells.Receptors and Channels.79-15)(also related LGIC receptor subunits in COS-7L cells；Johnson andTrowell，unpublished observatiohs)。這些表達載體的正確框架內(nèi)構(gòu)建通過序列分析得到確證。實施例5應(yīng)用RNAi技術(shù)敲除功能性F-18知DIAY對F18，DIY和DIAY的每種cDNA，本發(fā)明發(fā)明者應(yīng)用獨特序列PCR引物擴增了cDNA 0.5-1.0kb之間的中央部分。將擴增子連接于質(zhì)粒dsRNA表達載體pL4440的多克隆位點[Fire，A.et al.1998.Patent andspecific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditiselegans.Nature，391.806-811]，然后用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌HT115宿主菌株。HT115經(jīng)遺傳學(xué)處理，去除了雙鏈核糖核酸酶，含有由IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)可誘導(dǎo)啟動子控制的T7 RNA多聚酶，因此應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細菌可以導(dǎo)致ds RNA形式擴增子的高水平表達。
應(yīng)用堿性次氯酸鹽處理成蟲，制備無污染秀麗新桿線蟲L1階段[Sulston J.and Hodgkin，J.1988，supra]，然后引入NGM瓊脂皮氏培養(yǎng)皿，其中含有IPTC誘導(dǎo)表達來自感興趣基因的dsRNA的細菌。允許線蟲發(fā)育到成蟲階段，然后應(yīng)用血清素刺激，通過顯微鏡錄像記錄血清素對咽泵泵率和強度的影響。
在三個獨立實驗中觀察到，F(xiàn)18 dsRNA可以抑制血清素刺激的咽泵泵率(圖4和表7)以及終球開放程度/收縮強度(表7)。在第三個實驗中，評價了線蟲的攝食效力，方法是在熒光珠存在的情況下，用血清素刺激線蟲個體，觀察熒光珠的攝入情況。在暴露于F18 dsRNA的線蟲中，胃腸道熒光珠的數(shù)量明顯低于對照組，而且熒光珠進入胃腸道的深度在前者也較近。
將這些結(jié)果綜合起來發(fā)現(xiàn)，敲除功能性F18對咽泵的特異性作用非常近似于特異性5-HT3受體拮抗劑MDL72222的作用，并強烈提示，F(xiàn)18編碼線蟲5-HT3受體的一個亞單位。
兩種在作用效果方面的主要差異是，MDL72222可以完全抑制所有檢測線蟲的泵功能，而在功能敲除組，盡管全體線蟲的平均泵率低于對照組，但只有一小部分的線蟲泵功能被完全阻斷(圖4)。已知通過攝食的RNAi敲除技術(shù)缺乏完全的滲透性，特別是對于神經(jīng)元(Schuske，K.etal.2000.Snap-back RNAin neurons.The Worm Breeders’Gazatte.1618)，而且需要依賴誘導(dǎo)協(xié)議[Kamath，R.S.et al.2000.Effectiveness ofspecific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNAin Caenorhabditis elegans.Genome Biology.21-10]。因此，為了建立業(yè)已獲得的F18的抑制程度，將已經(jīng)鑒定的來自F18 RNAi組和對照pL4440質(zhì)粒組的線蟲個體集合分為三組，所述線蟲個體的泵率已經(jīng)預(yù)先建立，然后在Corbett Research Rotorgene熱循環(huán)儀上進行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，檢測F18 RNA的水平。與標準比較發(fā)現(xiàn)，即使在對照線蟲中，F(xiàn)18 mRNA的量也低于≤3只線蟲的可定量范圍。但是，在所有樣本中檢測F18信使是可能的，提示F18 mRNA的抑制不是絕對的。
應(yīng)該指出，在F18敲除線蟲和正常線蟲之間存在的另一種差異是，前者咽部明顯解剖學(xué)缺陷的發(fā)生率非常高。初步高分辨率顯微鏡提示，這可能是由于增生和NSM運動神經(jīng)元精細過程退化導(dǎo)致的。
表1.5-HT3受體類型選擇性激動劑對秀麗新桿線蟲咽泵功能和運動功能的影響

表2.兩種5-HT3受體類型選擇性拮抗劑聯(lián)合應(yīng)用對秀麗新桿線蟲咽泵功能和運動功能的影響

表3.一種5-HT3受體類型選擇性拮抗劑對秀麗新桿線蟲咽泵功能和運動功能的影響

表4.5-HT3受體類型選擇性拮抗劑MDL-72222對線蟲生長和存活的影響

表5.應(yīng)用5-HT3受體類型選擇性拮抗劑MDL-72222 7天對棉鈴蟲生長的影響，每組含24只幼蟲。因為幼蟲的體重是通過全體稱重計算平均體重，所以無法估計差異。

表6.應(yīng)用5-HT3受體類型選擇性拮抗劑MDL-72222 5天后對桃蚜生長和存活的影響

表7.部分F18 cDNA RNAi介導(dǎo)的基因敲除的實驗總結(jié)。顯示了對泵率和牙齒張開程度的影響。

應(yīng)該指出，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明宗旨和范疇的前提下，對本發(fā)明闡述的特定實施方案進行多種改變和/或修飾。因此，本發(fā)明實施方案僅是為了闡述方便，絕非對本發(fā)明的限制。
序列表<110>聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織<120>線蟲的5HT3受體，編碼該受體的多核苷酸分子及其拮抗劑<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1908<212>DNA<213>秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)<400>1atgatcatat gttattcgtg tctaactgtc tccattcttc taaccattaa atttgtacca 60tgtcgatttg ctggaattga acaccaaaat acgaaaagtc gtgtgcattt ctcgttgctg 120gatagtagac aagaaaatga cactaatcac tttgagatag cagaagcaaa gttccagaaa 180ccccacaatg aggaaaacac aataggtacg attacaaaat ttgctccatc ggtacaagaa 240caacacagtt ctgcggtaat tccaatgccc cactttgacc agaaccggct tgagcaagct 300cttcggatca agggctcaat tgatggaacc gaagaggctt tgtacaggtc tctactagat 360catactgttt acgaaaaaga tgtgaggcca tgtatacatc actctcaacc aacaaatgtc 420acatttggat ttcttctcaa tcagattgtg gaaatggatg aacgaaatca agctctaaca 480accagaagct ggctgaatat caattggatg gatcctcgat tatcgtggaa tgaaagcctt 540tggtctgaaa ttaaagcaat atatattcca catgcaagaa tctggaaacc cgatataatt 600ctggtaaaca acgctatccg agaatactat gcatccctcg tctccaccga tgtaatggtc 660acaagtgacg gaaacgtgac atggctgttt tccgcactat ttaggagttc ttgtccaata 720cgggttcgat 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10<210>9<211>10<212>PRT<213>秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)<400>9Met Arg Arg Arg Phe Glu Ile Gly Ile Ala1 5 10<210>10<211>635<212>PRT<213>秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)<400>10Met Ile Ile Cys Tyr Ser Cys Leu Thr Val Ser Ile Lau Leu Thr Ile1 5 10 15Lys Phe Val Pro Cys Arg Phe Ala Gly Ile Glu His Gln Asn Thr Lys20 25 30Ser Arg Val His Phe Ser Leu Leu Asp Ser Arg Gln Glu Asn Asp Thr35 40 45Asn His Phe Glu Ile Ala Glu Ala Lys Phe Gln Lys Pro His Asn Glu50 55 60Glu Asn Thr Ile Gly Thr Ile Thr Lys Phe Ala Pro Ser Val Gln Glu65 70 75 80Gln His Ser Ser Ala Val Ile Pro Met Pro His Phe Asp Gln Asn Arg85 90 95Leu Glu Gln Ala Leu Arg Ile Lys Gly Ser Ile Asp Gly Thr Glu Glu100 105 110Ala Leu Tyr Arg Ser Leu Leu Asp His Thr Val Tyr Glu Lys Asp Val115 120 125Arg Pro Cys Ile His His Ser Gln Pro Thr Asn Val Thr Phe Gly Phe130 135 140Leu Leu Asn Gln Ile Val Glu Met Asp Glu Arg Asn Gln Ala Leu Thr145 150 155 160Thr Arg Ser Trp Leu Asn Ile Asn Trp Met Asp Pro Arg Leu Ser Trp165 170 175Asn Glu Ser Leu Trp Ser Glu Ile Lys Ala Ile Tyr Ile Pro His Ala180 185 190Arg Ile Trp Lys Pro Asp Ile Ile Leu Val Asn Asn Ala Ile Arg Glu195 200 205Tyr Tyr Ala Ser Leu Val Ser Thr Asp Val Met Val Thr Ser Asp Gly210 215 220Asn Val Thr Trp Leu Phe Ser Ala Leu Phe Arg Ser Ser Cys Pro Ile225 230 235 240Arg Val Arg Tyr Tyr Pro Phe Asp Asp Gln Gln Cys Asp Leu Lys Phe245 250 255Ala Ser Trp Ser His Asp Ile Thr Glu Ile Asn Leu Gly Leu Asn Thr260 265 270Asp Lys Gly Asp Leu Ser Ser Tyr Met Asn Asn Ser Glu Phe Asp Leu275 280 285Val Asp Met Thr Ala Val Arg Glu Val Val Thr Phe Pro Ser Asp Thr290 295 300Asn Ser Asp Trp Pro Ile Ile Val Ile Arg Ile His Met His Arg Arg305 310 315 320Pro Leu Phe Tyr Val Phe Asn His Ile Val Pro Cys Val Leu Ile Ser325 330 335Ser Met Ala Val Leu Gly Phe Leu Met Pro Pro Glu Thr Gly Glu Lys340 345 350Ile Ash Met Ile Ile Thr Thr Leu Leu Ser Met Gly Val Tyr Leu Gln355 360 365Ser Ile Thr Glu Ser Ile Pro Pro Thr Ser Glu Gly Val Pro Leu Ile370 375 380Gly Met Tyr Tyr Val Ser Ser Leu Leu Met Val Cys Leu Ala Thr Cys385 390 395 400Val Asn Val Ile Thr Leu Asn Met His Arg Asn Gly Ala Ala Asn Gln405 410 415Gly Arg His Val Pro Ala Trp Met Gln Lys Trp Ile Leu Gly Tyr Leu420 425 430Ala Thr Phe Met Arg Met Ser Ile Arg Glu Pro Asp Ser Ile Ala Leu435 440 445Leu Lys Ala Ser Gln Ser Lys Lys Ser Thr Ile Arg Arg Ser Ser Ile450 455 460Leu Arg Asp Leu Lys Arg Val Lys Asn Met Ser Asn Val Arg Ala Lys465 470 475 480Ser Lys Glu Gln Asn Ala Asn Arg Glu Cys Glu Cys Met Asp Pro Leu485 490 495Val His Ile Tyr Ala Glu Ser Ile Met Ser Cys Leu Ala Ala Asp Thr500 505 510Lys Pro Met Asn Gly Ser Thr Ile Arg Glu Asp Phe Ala Ser Glu Ser515 520 525Thr Phe Leu Gly Arg Val Val Ser Asp Gly Ile Met Pro Arg Ile Ser530 535 540Ala Ser Ser Asn Ser Val Leu Thr Glu Phe Glu Thr Arg Phe Arg Arg545 550 555 560Ile Leu Lys Arg Val Tyr Arg Ser Leu Gln Gln His Glu Ile Arg Glu565 570 575Glu Ile Leu Asp Glu Arg Ser Arg Ile Gln Trp Gln Trp Gln Gln Leu580 585 590Ala Ser Val Val Asp Arg Leu Leu Leu Cys Leu Phe Cys Thr Ala Thr595 600 605Leu Phe Thr Ile Ile Cys Leu Leu Ile Val Pro Val Ala Tyr Arg Asp610 615 620Asn Asp Ser Met Leu Ser Phe Leu Asn Phe Phe625 630 635<210>11<211>479<212>PRT<213>秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)<400>11Met Leu Leu Pro Ile Leu Leu His Phe Leu Leu Leu Ile Thr Gln Leu1 5 10 15Asn Gly Ser Pro Ala Glu Val Arg Leu Ile Asn Asp Leu Met Ser Gly20 25 30Tyr Val Arg Glu Glu Arg Pro Thr Leu Asp Ser Ser Lys Pro Val Val35 40 45Val Ser Leu Gly Val Phe Leu Gln Gln Ile Ile Asn Leu Ser Glu Lys50 55 60Glu Glu Gln Leu Glu Val Asn Ala Trp Leu Lys Phe Gln Trp Arg Asp65 70 75 80Glu Asn Leu Arg Trp Glu Pro Thr Ala Tyr Glu Asn Val Thr Asp Leu85 90 95Arg His Pro Pro Asp Ala Leu Trp Thr Pro Asp Ile Leu Leu Tyr Asn100 105 110Ser Val Asp Ser Glu Phe Asp Ser Ser Tyr Lys Val Asn Leu Val Asn115 120 125Tyr His Thr Gly Asn Ile Asn Trp Met Pro Pro Gly Ile Phe Lys Val130 135 140Ser Cys Lys Leu Asp Ile Tyr Trp Phe Pro Phe Asp Glu Gln Val Cys145 150 155 160Tyr Phe Lys Phe Gly Ser Trp Thr Tyr Thr Arg Asp Lys Ile Gln Leu165 170 175Glu Lys Gly Asp Phe Asp Phe Ser Glu Phe Ile Pro Asn Gly Glu Trp180 185 190Ile Ile Ile Asp Tyr Arg Thr Asn Ile Thr Val Lys Gln Tyr Glu Cys195 200 205Cys Pro Glu Gln Tyr Glu Asp Ile Thr Phe Thr Leu His Leu Arg Arg210 215 220Arg Thr Leu Tyr Tyr Ser Phe Asn Leu Ile Ala Pro Val Leu Leu Thr225 230 235 240Met Ile Leu Val Ile Leu Gly Phe Thr Val Ser Pro Glu Thr Cys Glu245 250 255Lys Val Gly Leu Gln Ile Ser Val Ser Leu Ala Ile Cys Ile Phe Leu
260 265 270Thr Ile Met Ser Glu Leu Thr Pro Gln Thr Ser Glu Ala Val Pro Leu275 280 285Leu Gly Val Phe Phe His Thr Cys Asn Phe Ile Ser Val Leu Ala Thr290 295 300Ser Phe Thr Val Tyr Val Gln Ser Phe His Phe Arg Asn Gln His Val305 3l0 315 320His Glu Arg Met Asp Phe Trp Met Arg Phe Ile Leu Leu Glu Trp Ser325 330 335Pro Trp Leu Leu Arg Met Lys Met Pro Asp Arg Glu Asn Asn Phe Gln340 345 350Thr Leu Thr Glu Ser Trp Lys Gly Arg Asn Arg Arg Glu Ser Met Ala355 360 365Arg Thr Ala Phe Glu Tyr Ala Asp Gly Pro Val Thr Gln Ile His Ser370 375 380Met Gly Ile Met Leu Lys Asp Asn Phe Glu Glu Leu Ile Tyr Gln Val385 390 395 400Lys Gln Glu Lys Ile Ala Asp Glu Lys Gly Ile Glu Arg Leu Arg Val405 410 415Leu Gln Lys Ile Tyr Asp His Val Lys Met Ile Arg Glu His Asp Asp420 425 430Asp Asn Asp Glu Asp Ser Arg Val A1a Leu Glu Trp Arg Phe Ala Ala435 440 445Ile Val Val Asp Arg Leu Cys Leu Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ile Val450 455 460Val Val Ser Ile Ile Ile Ala Leu Arg Ala Pro Tyr Leu Phe Ala465 470 475<210>12<211>554<212>PRT<213>秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)<400>12Met Arg Arg Arg Phe Glu Ile Gly Ile Ala Phe Phe Phe Ala Leu Phe1 5 10 15Arg Val Ile Trp Thr Gly Asp His Glu Arg Arg Leu Tyr Ala Lys Leu20 25 30Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Leu Ala Arg Pro Val Arg Asn Glu Ser Glu35 40 45Ala Val Val Val Leu Leu Gly Met Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Asp Ile50 55 60Asp Glu Lys His Gln Ile Met Asn Ser Ser Val Trp Leu Arg Met Ser65 70 75 80Trp Thr Asp His Tyr Leu Thr Trp Asp Pro Ser Glu Phe Gly Asn Ile85 90 95Lys Glu Val Arg Leu Pro Ile Asn Asn Ile Trp Lys Pro Asp Val Leu100 105 110Leu Tyr Asn Ser Val Asp Gln Gln Phe Asp Ser Thr Trp Pro Val Asn115 120 125Ala Val Val Leu Tyr Thr Gly Asn Val Thr Trp Ile Pro Pro Ala Ile130 135 140Ile Arg Ser Ser Cys Ala Ile Asp Ile Ala Tyr Phe Pro Phe Asp Thr145 150 155 160Gln His Cys Thr Met Lys Phe Gly Ser Trp Thr Tyr Ser Gly Phe Phe165 170 175Thr Asp Leu Ile Asn Thr Thr Ile Ser Pro Ala Thr Tyr Lys Pro Asn180 185 190Gly Glu Trp Glu Leu Leu Gly Leu Thr Ser Gln Arg Ser Ile Phe Phe195 200 205Tyr Glu Cys Cys Pro Glu Pro Tyr Tyr Asp Val Thr Phe Thr Val Ser210 215 220Ile Arg Arg Arg Thr Leu Tyr Tyr Gly Phe Asn Leu Leu Leu Pro Cys225 230 235 240Met Leu Ile Ser Ser Leu Ala Leu Leu Ser Phe Thr Leu Pro Ala Asp245 250 255Cys Gly Glu Lys Leu Asn Leu Gly Val Thr Ile Phe Met Ser Leu Cys260 265 270Val Phe Met Ile Met Val Ala Glu Ala Met Pro Gln Thr Ser Asp Ala275 280 285Leu Pro Leu Ile Gln Ile Tyr Phe Ser Cys Ile Met Phe Gln Val Gly290 295 300Ala Ser Val Val Ala Thr Val Ile Ala Leu Asn Phe His His Arg Ser305 310 315 320Pro Glu Gln Tyr Lys Pro Met Asn Lys Phe Leu Lys Thr Leu Leu Leu325 330 335Gly Trp Leu Pro Thr Leu Leu Gly Met Glu Arg Pro Asp Val Leu Glu340 345 350Leu Ser Val His Gly Ala His Tyr Ala Ser Asp Asn Lys Lys Lys Gln355 360 365Arg Gln Tyr Leu Ile Glu Val Glu Arg His Ile Leu Thr Arg Pro Asn370 375 380Gly Asn Gly His Ser Ala Val Asp Lys Ala Val His Leu Asp Leu Ser385 390 395 400Thr Gly Asn Pro His Ser Asp Ala Lys Lys Ser Ser Pro Ser Pro Lys405 410 415Arg Thr Ser Ala Ser Ile Met Gly Met Thr Gly Leu Pro Thr Thr Gln420 425 430Met Asn Gly Ala Leu Asp Ser Ser Ile Asn Lys Tyr Thr Cys Thr Lys435 440 445Val Thr Arg Pro Leu Glu Asn Gly Ser Ala Thr Ile Asn His Lys Ser450 455 460Ser Pro Gln Ile Asn Pro Ile Asn Asn Asn Asn Ile Tyr Lys Cys Ala465 470 475 480Asn Asn Gln Lys Thr Gln Phe Glu Asp Arg His Phe His His Ile Leu485 490 495Asn Glu Leu Arg Val Ile Ser Ala Arg Val Arg Lys Glu Glu Ala Met500 505 510His Ala Leu Gln Ala Asp Trp Met Phe Ala Ser Arg Val Val Asp Arg515 520 525Val Cys Phe Leu Ala Phe Ser Ala Phe Leu Phe Met Cys Thr Ala Ile530 535 540Ile Ser Tyr Asn Ala Pro His Leu Phe Val545 550<210>13<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說明保守基序<400>13Asp Ile Ala Tyr權(quán)利要求
1.編碼無脊椎動物5-HT3受體亞單位的分離的多核苷酸分子，包括的核苷酸序列與序列1-6所示任一或全部核苷酸序列存在75％以上的同源性。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列與序列1-6所示任一或全部核苷酸序列存在85％以上的同源性。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列與序列1-6所示任一或全部核苷酸序列存在95％以上的同源性。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列基本對應(yīng)于序列1-6所示任一項的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列基本對應(yīng)于序列1所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列基本對應(yīng)于序列2所示的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列基本對應(yīng)于序列3所示的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列基本對應(yīng)于序列4所示的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列基本對應(yīng)于序列5所示的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求1的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括的核苷酸序列基本對應(yīng)于序列6所示的核苷酸序列。
11.含有前述權(quán)利要求任意一種多核苷酸分子的表達盒或載體。
12.轉(zhuǎn)化了至少一種權(quán)利要求11的表達盒或載體的哺乳動物、昆蟲、植物、酵母或細菌宿主細胞。
13.權(quán)利要求12的宿主細胞，其中所述宿主細胞表達無脊椎動物5-HT3受體同聚物。
14.權(quán)利要求12的宿主細胞，其中所述宿主細胞表達無脊椎動物5-HT3受體異聚物。
15.權(quán)利要求13或14的宿主細胞，其中所述5-HT3受體在宿主細胞的表面表達。
16.制備5-HT3受體的方法，包括在一定條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11-15任一項的宿主細胞，所述條件使5-HT3受體能夠表達，任選地，收獲表達的5-HT3受體。
17.無脊椎動物5-HT3受體，包括至少一個亞單位，該亞單位的特征在于其N末端氨基酸序列選自下述序列MIICYSCLTV(序列7)，MLLPILLHFL(序列8)或MRRRFEIGIA(序列9)，或基本純形式的該受體功能等價片段。
18.權(quán)利要求17的受體，其中所述至少一個亞單位含有基本對應(yīng)于序列10、11或12顯示的氨基酸序列。
19.鑒定和/或評價殺線蟲化合物的實驗方法，該方法包括在一定條件下讓備選殺線蟲化合物與權(quán)利要求17或18的5-HT3受體或其功能等價片段接觸，或與權(quán)利要求15的表面表達5-HT3受體的宿主細胞接觸，并檢測所述5-HT3受體或其功能等價片段活性的增強或減弱，所述一定條件是指能夠激活5-HT受體的條件。
20.權(quán)利要求19的實驗方法，其中5-HT3受體或其功能等價片段活性的增強或減弱可以通過測定細胞膜電壓或Ca2+的水平變化進行檢測。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中5-HT3受體或其功能等價片段同時與備選殺線蟲化合物和血清素能配體接觸。
22.鑒定和/或評價殺線蟲化合物的實驗方法，該方法包括在一定條件下讓預(yù)定劑量的適宜標記的血清素能配體和預(yù)定劑量的備選殺線蟲化合物一起與權(quán)利要求17或18的5-HT3受體或其功能等價片段接觸，或與權(quán)利要求15的表面表達5-HT3受體的細胞接觸，其中所述血清素能配體和所述備選殺線蟲化合物可以與5-HT3受體或其功能等價片段競爭性結(jié)合，然后測定結(jié)合和/或未結(jié)合標記血清素能配體的量。
23.權(quán)利要求19-22任一項的實驗方法，其中所述血清素能配體是5-羥色胺。
24.一種探針，包括序列1-6所示任意一種核苷酸序列中全部或至少10個核苷酸部分。
25.鑒定和/或評價殺線蟲、殺昆蟲和其他殺害蟲化合物的實驗方法，所述方法包括(i)從秀麗新桿線蟲以外的無脊椎動物中分離多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括編碼5-HT3受體亞單位的核苷酸序列，并代表序列1-6所示全部或任一核苷酸序列的同系物；(ii)表達所述多核苷酸分子，產(chǎn)生5-HT3受體或其功能等價片段；(iii)讓產(chǎn)生的至少一種5-HT3受體或其功能等價片段在一定條件下與備選殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物接觸，所述條件能夠激活5-HT受體；和(iV)檢測產(chǎn)生的5-HT3受體或其功能等價片段活性的增強或減弱。
26.權(quán)利要求25的實驗方法，其中5-HT3受體或其功能等價片段活性的增強或減弱可以通過測定細胞膜電壓或Ca2+的水平變化進行檢測。
27.權(quán)利要求25或26的實驗方法，其中5-HT3受體或其功能等價片段同時與備選殺線蟲化合物和血清素能配體接觸。
28.鑒定和/或評價殺線蟲、殺昆蟲和其他殺害蟲化合物的實驗方法，所述方法包括(i)從秀麗新桿線蟲以外的無脊椎動物中分離多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括編碼5-HT3受體亞單位的核苷酸序列，并代表序列1-6所示全部或任一核苷酸序列的同系物；(ii)表達所述多核苷酸分子，產(chǎn)生5-HT3受體或其功能等價片段；(iii)讓產(chǎn)生的至少一種5-HT3受體或其功能等價片段在一定條件下與預(yù)定劑量的適宜標記的血清素能配體和預(yù)定劑量的備選殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物接觸，其中所述血清素能配體和所述備選化合物可以與5-HT3受體或其功能等價片段競爭性結(jié)合；和(iV)測定結(jié)合和/或未結(jié)合標記血清素能配體的量。
29.權(quán)利要求25-28任一項的實驗方法，其中所述血清素能配體是5-羥色胺。
30.由權(quán)利要求19-23任一項的實驗方法鑒定的殺線蟲化合物。
31.由權(quán)利要求25-29任一項的實驗方法鑒定的殺線蟲、殺昆蟲和/或其他殺害蟲化合物。
32.殺滅寄生蟲的方法，所述方法包括將寄生蟲暴露于有效劑量的化合物下，所述化合物可以改變該寄生蟲5-HT3受體的活性。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述化合物能夠抑制由血清素能配體導(dǎo)致的5-HT3受體激動。
34.權(quán)利要求32或33的方法，其中所述化合物的有效劑量范圍為0.1-10μM。
35.權(quán)利要求32-33任一項的方法，其中寄生蟲是線蟲。
36.權(quán)利要求32-35任一項的方法，其中所述化合物選自恩丹西酮和托烷基二氯安息香酸。
37.殺滅寄生蟲的組合物，包括有效劑量的可以改變寄生蟲5-HT3受體活性的化合物。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述化合物能夠抑制由血清素能配體導(dǎo)致的5-HT3受體激動。
39.權(quán)利要求37或38的組合物，其中所述化合物的有效劑量范圍為0.1-10μM。
40.權(quán)利要求37-39任一項的組合物，其中所述寄生蟲是線蟲。
41.權(quán)利要求37-40任一項的組合物，其中所述化合物選自恩丹西酮和托烷基二氯安息香酸。
42.殺滅昆蟲的方法，所述方法包括將昆蟲暴露于有效劑量的化合物下，所述化合物可以改變該昆蟲5-HT3受體的活性。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述化合物能夠抑制由血清素能配體導(dǎo)致的5-HT3受體激動。
44.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述化合物的有效劑量范圍為0.1-10μM。
45.權(quán)利要求42-44任一項的方法，其中昆蟲是吸吮昆蟲或具有基于肌肉泵攝食機制的其他昆蟲。
46.權(quán)利要求42-45任一項的方法，其中所述化合物選自恩丹西酮和托烷基二氯安息香酸。
47.殺昆蟲組合物，包括有效劑量的可以改變昆蟲5-HT3受體活性的化合物。
48.權(quán)利要求47的組合物，其中所述化合物能夠抑制由血清素能配體導(dǎo)致的5-HT3受體激動。
49.權(quán)利要求47或48的組合物，其中所述化合物的有效劑量范圍為0.1-10μM。
50.權(quán)利要求47-49任一項的組合物，其中所述寄生蟲是線蟲。
51.權(quán)利要求47-50任一項的組合物，其中所述化合物選自恩丹西酮和托烷基二氯安息香酸。
52.一種源于秀麗新桿線蟲以外的無脊椎動物的分離多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包括編碼5-HT3受體亞單位的核苷酸序列，并代表序列1-6所示全部或任一核苷酸序列的同系物。
全文摘要
本發(fā)明披露了無脊椎動物的5HT
文檔編號C12N5/10GK1401001SQ01805079
公開日2003年3月5日 申請日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月15日
發(fā)明者S·C·特羅維爾, M·M·杜曼茨克, 廖春燕, P·D·伊斯特 申請人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織