專利名稱：線性探針載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請要求的優(yōu)先權(quán)申請是2000年1月10日提出的美國專利申請60/175,225、2000年3月20日提出的美國專利申請60/190,495以及2000年10月30日提出的美國專利申請60/244,418，正如以下所充分闡述的，這些申請在此作為參考全部并入文本。
以有效和經(jīng)濟的方式生產(chǎn)微陣列的能力，是全球范圍內(nèi)的研究者相當感興趣的，并且具有重要的商業(yè)價值。再怎么說也不會夸大微陣列技術(shù)對于生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)以及對于整個衛(wèi)生保健領(lǐng)域的重要性。微陣列能夠顯著提高傳統(tǒng)生物化學實驗的效率。原來可能花費幾年的試驗現(xiàn)在幾小時甚至幾分鐘內(nèi)就能夠完成。該技術(shù)的應用不僅影響到衛(wèi)生保健領(lǐng)域，而且還影響到基因分型、疾病診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、法學、農(nóng)學、生物戰(zhàn)，甚至生物計算機。各種類型的微陣列生產(chǎn)設(shè)備和技術(shù)業(yè)已被描述。
目前的技術(shù)開發(fā)方向仍然是在剛性基片上制備更稠密的二維探針陣列。但是該途徑存在許多問題。首先，隨著陣列中測試位點的增多，制造一個陣列或多個陣列的復雜性也大大增加了。其次，將作為探針的生物分子放置到特定測試位點上的常規(guī)方法(照相平版印刷術(shù)、機械點樣術(shù)和噴墨術(shù))耗時、昂貴、經(jīng)常缺少所需的準確度并且不能滿足所需的尺寸限制。探針的原位照相平版印刷合成是一種不能提供滿意的準確度并具有有限范圍的探針長度的勞動量大的技術(shù)。機械點樣術(shù)是一種慢工藝過程，其中最小的測試位點尺寸受到該工藝性質(zhì)的限制?；瘜W噴墨術(shù)具有與原位合成類似的不準確性以及與機械點樣類似的對測試位點尺寸的限制。第三，由于制造各個陣列所需的復雜性和極高的精確性以及產(chǎn)量較低，因此每一陣列的制造成本非常高，制造含有足以評估復雜生物樣品的探針的陣列往往需要幾千美元。第四，用于檢測探針-樣品雜交體的讀取設(shè)備的本已經(jīng)相當高的花費和復雜性，都隨著陣列密度的增大而增加，并且因為該讀取設(shè)備必需以非常高的空間精確度(10μm級)來進行二維掃描，所以每一掃描的處理時間也隨著二維探針陣列密度的增大而延長。
此外，微陣列的基本操作原理包括使固定在基片上的探針與樣品液中的特異性分子反應。雜交需要為探針提供足夠的遇到其互補分子的機會。在現(xiàn)存的系統(tǒng)中，通過擴散或驅(qū)動樣品液穿過微陣列可實現(xiàn)這一點。前者是一個隨機過程，而后者需要復雜的微流系統(tǒng)。
因此，需要一種容易、快速構(gòu)建的廉價探針載體，這種載體能夠容納數(shù)千個或數(shù)十萬個探針、能夠壓制儲存和使用、能夠以較高的產(chǎn)率來生產(chǎn)、易于使探針/靶高效率地相互作用并且無需昂貴和高精度的讀取設(shè)備、能夠與探針本身一起承載基片上各個探針或探針組的有關(guān)詳細信息、能夠容納定制組中不同長度和復雜程度的探針，而且這種載體被壓制、易于使用且廉價到足以以最終形成的高準確度進行一次性使用。
還需要這些探針載體的改進的包裝，由此使所需的雜交液量最小并且大量的探針可以固定在基片上，而尺寸不會如二維標準基因芯片矩陣所需的那樣隨之增大。
本發(fā)明提供了一種探針載體，在該載體中，在一長條狀柔性基片上，多種探針固定在不同的區(qū)域，每一區(qū)域有一種探針，基片的長度與寬度之比至少大約為5∶1、至少為50∶1、至少為500∶1、至少為10,000∶1或者至少為100,000∶1。在一實施方案中，每一含有探針的區(qū)域的長度不超過1000微米，在另一實施方案中，每一含有探針的區(qū)域的長度不超過500微米，在又一實施方案中，每一含有探針的區(qū)域的長度不超過100微米，在另一實施方案中，每一含有探針的區(qū)域的長度不超過50微米，在又一實施方案中，每一含有探針的區(qū)域的長度不超過20微米。
本發(fā)明還提供了一種探針載體，在該載體中，在一柔性基片上，多種探針固定在不同的區(qū)域，每一區(qū)域有一種探針，基片的長度與寬度之比至少大約為5∶1，其中基片具有表面層，而且這些探針固定在層表面上。另一方面，本發(fā)明在第一層和所述基片之間還有第二層。在一實施方案中，第一層包含硅石，而第二層包含一種金屬材料。
本發(fā)明還提供了以一個行列的形式固定在柔性基片表面上的線性一維探針排列，其中探針的線性密度為每線性厘米超過10種探針，或者優(yōu)選的是每線性厘米為50種探針。本發(fā)明的另一方面是，探針的線性密度為每線性厘米超過100種探針，本發(fā)明的又一方面是，探針的線性密度為每線性厘米超過200種探針，本發(fā)明的再一方面是，探針的線性密度為每線性厘米超過500種探針。
另外，本發(fā)明提供了多種固定在柔性帶形基片表面的不同區(qū)域上的探針，每一區(qū)域有一種探針，其中該帶的厚度不超過500微米。本發(fā)明的另一方面是，該帶的厚度不超過100微米，又一方面，該帶的厚度不超過20微米。
本發(fā)明還提供了多種固定在柔性纖維基片表面的不同區(qū)域上的探針，每一區(qū)域有一種探針，其中纖維的直徑不超過500微米。本發(fā)明的另一方面是，纖維的直徑不超過200微米，又一方面，纖維的直徑不超過100微米，再一方面，纖維的直徑不超過20微米。
本發(fā)明的所有上述方面還包括傳送有關(guān)第一組探針信息的第一標記物和傳送有關(guān)第二組探針信息的第二標記物。在一些實施方案中，這些標記物是光學標記物例如光學條形碼或熒光標記物，在另一實施方案中，這些標記物可以是磁性的。在包括標記物的一個實施方案中，探針是多核苷酸，在包括標記物的另一個實施方案中，探針是多肽，在包括標記物的又一個實施方案中，探針是抗體，在包括標記物的另一個實施方案中，探針選自細胞表面受體、寡糖、多糖和脂質(zhì)。
而且，在所有上述實施方案中，無論它們是否包括標記物，該裝置都還包括第一層，并且探針固定在該層上；這層可以是由硅石構(gòu)成的?；蛘呤牵撗b置包括第一層和第二層；第一層可以是硅石，而第二層可以是金屬材料。如果第二層是金屬的，那么其還是可磁化的。
在所有上述實施方案中，探針可以點的線性結(jié)構(gòu)或者條(與基片的長軸具有一個角度)的線性結(jié)構(gòu)來排列。
而且，在所有上述實施方案中，這些探針可以是多核苷酸或者多肽或者抗體或者配體或者選自細胞表面受體、寡糖、多糖和脂質(zhì)。如果探針是多核苷酸，那么它們可以是DNA，而且如果是DNA，那么它們可以是單鏈DNA。
用于本發(fā)明的基片可以是石英玻璃或者塑料或者金屬材料或者聚合物，并且如果是聚合物，那么該聚合物可以選自聚酰亞胺和聚四氟乙烯。優(yōu)選的基片是光學纖維。如果基片是金屬材料，那么它還可以在基片與探針之間有一個層，從而使探針固定在該層上；這一層可以是硅石。而且，金屬基片可以磁化。
本發(fā)明可以圍繞一個轉(zhuǎn)鼓或者多個轉(zhuǎn)鼓來纏繞。它還可以在一有或無水平支架上自身纏繞為平螺旋，而且還可以固定到平螺旋中心的一個卷筒上。另外，在該螺旋中的基片的最外端可以延伸并固定到第二卷筒上。
一個不同方面是，本發(fā)明包括一種用于將多種探針液輸送到基片上以便印制探針陣列的裝置。一般而言，該裝置包括具有多個孔的儲存器和一組毛細管，其中毛細管的布置使得每一毛細管的一端都與儲存器內(nèi)的一個孔相連，從而孔中的內(nèi)容物可進入毛細管，而毛細管的另一端排列為平的單一行列。在該裝置的一個實施方案中，儲存器是微滴定板上的多個孔。當使用本發(fā)明的這種裝置時，通過在儲存器與毛細管之間施加一個壓差和/或在儲存器與基片之間提供一個電壓，可使探針液從儲存器的孔內(nèi)移動到毛細管內(nèi)。毛細管可以平行定位并可穿過長條狀探針基片的縱軸，以便將一排探針沉積到基片上。以下還要更詳細描述探針沉積的其它方法。
第二種探針輸送裝置具有以類似于傳送帶的方式構(gòu)成的一排探針容器。這排容器以一個速度和方向移動，從而與以另一個速度和方向移動的基片交叉，由此將探針一個挨一個地沉積到基片上。在另一種構(gòu)型中，這排探針容器移動，從而與一排移動的由柔性材料束制成的點樣器交叉，由此每一點樣器與一個容器交叉，從而將探針從容器輸送到點樣器。輸送機例如也可以移動基片，從而使基片與攜帶探針的那排點樣器交叉，由此每一點樣器在從容器中拾取探針之后將該探針沉積到基片上。這排點樣器可以構(gòu)建成一個回路，而且這些點樣器在將探針沉積到基片上之后以及在返回容器之前可以在洗滌站進行洗滌。
本發(fā)明還包括若干將探針從流體輸送裝置沉積到基片表面上的方法。在一種方法中，將探針在基片上涂成條。該探針可以承載在薄的柔軟彈性點樣器上，該點樣器以涂刷運動接觸基片表面，以便涂畫該條帶。在一實施方案中，該點樣器可以是石英毛細管或纖維。另外地，毛細管或纖維可以由其它材料諸如能夠輸送含有探針的流體的金屬、陶瓷、聚合物或者其它材料制成。在其它方法中，這些探針作為多個條或點以非接觸的方式來沉積。這些方法包括磁的、電的、熱的、聲的和噴墨沉積。在磁沉積法中，探針附著在磁珠上。當攜帶固定在磁珠上的探針的點樣器與基片交叉時，放置在基片下面的電磁體被激活。由電磁體產(chǎn)生的磁場將探針從流體輸送裝置中吸引出來，從而將探針沉積到基片的表面上。在電沉積方法中，將適當極性的電壓施加到基片與傳送裝置之間，以建立一個電場，從而將帶電荷的探針(例如寡核苷酸)推到基片表面上。在熱沉積方法中，將快速局部加熱引入流體通路中，從而產(chǎn)生快速的局部體積膨脹(氣泡)將探針液推到基片上?？梢岳秒娮杓訜峋€以電的方式或者利用合適的激光以光的方式來引入快速加熱。在聲沉積法中，將超聲脈沖引入到探針液中，從而將液滴推到基片表面上。在噴墨沉積法中，在探針液容器中建立一壓電調(diào)節(jié)器。該壓電調(diào)節(jié)器被電壓信號激活，可快速減小容器的體積，由此將探針推到基片表面上。
在另一替換方法中，利用探針沉積裝置可實現(xiàn)將探針以條的形式涂在基片上，在該裝置中將纖維矩陣浸漬到儲存器的對應矩陣內(nèi)，每一儲存器都含有探針，然后纖維矩陣移動穿過基片的第一部分，并且纖維與基片的位置使得每一纖維沉積一條橫穿基片的分離的探針線，而所需的基片在線與線之間。在該方法中，纖維矩陣可以洗滌并浸漬到儲存器的另一矩陣內(nèi)，然后移動穿過基片的另一部分，從而沉積另一組探針條。
在所有的上述方法中，基片可以是平行排列的多個纖維，從而幾個纖維利用探針沉積裝置的一個通路來接收探針，或者該基片可以是條帶，其中，在探針沉積之后，該條帶可沿其長軸進行光學上的切割，從而產(chǎn)生多個攜帶探針的條帶。
在所有的上述方法中，這些探針可以共價鍵接到基片上。
在所有的上述方法中，還可包括將標記物施加到基片上的步驟。
在其它因素中，本發(fā)明是基于這樣的技術(shù)發(fā)現(xiàn)即，在柔性基片上具有一維探針構(gòu)型的探針載體提供了一種鑒定樣品中靶分子存在的簡便、經(jīng)濟、可靠且分類特異的方式。而且，在本發(fā)明探針載體上的探針不受尺寸限制。通過本文的討論，本發(fā)明的這些技術(shù)發(fā)現(xiàn)和優(yōu)點以及其它特征都是顯而易見的。
本發(fā)明包括一種新的改善與靶物雜交或與靶物反應的效率的方式。該方法包括移動探針載體使之穿過樣品液，從而增強了固定在載體上的探針與樣品液中其靶分子混合的機會。載體可以采用各種形式，這些形式包括細線、條帶、片、旋管、轉(zhuǎn)鼓或針。該運動形式包括探針載體的平移、轉(zhuǎn)動或振動，既可是單獨一種運動形式也可以是幾種運動形式的聯(lián)合。
本發(fā)明還包括雜交設(shè)備的幾種設(shè)計，其中將探針載體插入含有樣品液的室內(nèi)。使探針載體與室內(nèi)壁之間的縫隙最小，以減小樣品液的體積。驅(qū)動探針載體，使之在室內(nèi)移動，從而改善了探針/靶物相互作用的效率。增強雜交的另一種方法包括在探針載體與雜交室的壁之間施加一個電壓。在一極，電場將靶分子向載體上的探針處吸引，從而增大了靶分子的局部濃度并改善了雜交的可能性。在相反極，電場將靶分子從探針處排斥開，從而有助于增大雜交的特異性。通過以適當?shù)念l率改變極性，可以提高靶物與探針之間的雜交效率。
本發(fā)明可用于公知的點突變分析、表達分析、基因組指紋分析、多態(tài)性分析、連鎖分析、mRNAs和mRNA群體的鑒定、序列測定、序列確證、疾病診斷以及本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其它應用中。
圖3示出了制造探針載體的裝置和方法，其中多個管將探針從儲存器運送到基片并以條的形式將探針“涂”在基片上。
圖4示意性表示出一種制造探針載體的方法，其中分立的探針容器穿過一個或多個基片并且在每個探針容器經(jīng)過基片上時將探針沉積到基片上。
圖5示出了可用于前述制造技術(shù)中的多種類型的探針容器，以及每種探針容器用于將探針從載體沉積到基片上的裝置。
圖6a-6e示出了制造探針載體的多種方法。圖6a示出了其中探針以液體形式包含在各個儲存器內(nèi)的一種制造探針載體的方法。圖6b示出了一種制造探針載體的方法，其中具有多個點樣器的移動帶與儲存器交叉，從而每一點樣器都拾取一種分離的探針。圖6c示出了一種制造探針載體的方法，其中具有多個結(jié)合有探針的點樣器的移動帶與一個或多個基片交相并將探針沉積到其上。圖6d示出了一種制造探針載體的方法，其中可將多個點樣器排列成一個連續(xù)的回路，在該回路中各個點樣器可被洗滌并重新用于點樣由儲存器陣列提供的新探針。圖6e繪出了一種將探針從儲存器轉(zhuǎn)移到點樣器的方法。在這種結(jié)構(gòu)中，點樣器在基片下面移動并且將基片表面面朝下定位，從而使點樣器從基片的下面沉積探針。
圖7a和7b示出了構(gòu)造探針載體的另一種方法，其中點樣器的矩陣浸漬到孔的相應矩陣內(nèi)，矩陣中的每個孔都含有一種探針，其次點樣器矩陣以每一點樣器沉積一條分離的線的角度刷過一個或多個基片，然后點樣器陣列可被洗滌并移動到一個新的含有多個孔的探針矩陣中，并在基片的一個新的截面部分上重復浸漬-涂刷-洗滌這一循環(huán)操作。
圖8示出了探針載體針和探針載體棒的構(gòu)造。
圖9示出了探針載體針和探針載體棒的制造方法。


圖10a是旋管構(gòu)型的柔性探針載體的俯視圖。圖10b是旋管構(gòu)型的柔性探針載體的側(cè)視圖。圖10c是探針-載體細線的兩個相鄰線圈的剖面圖，其中探針固定在載體上的凹槽內(nèi)。
圖11a示出了包裝在小型盒內(nèi)的卷筒結(jié)構(gòu)的柔性探針載體。圖11b是卷筒形式的探針-載體的兩個層的剖面圖，其中探針固定在載體上的凹槽內(nèi)，該圖示出了凹槽內(nèi)固定的探針位置是如何使其避免與下一層摩擦的。
圖12示出了一種利用電場控制探針載體雜交的方法。
圖13示出了一種探針載體針雜交的方法。
圖14示出了一種利用探針載體針對標準微滴定板上的多個靶樣品進行平行雜交的方法。
圖15是沿棒的長軸所觀察到的用于探針載體棒的雜交設(shè)備的視圖。
圖16是用于探針載體旋管的雜交設(shè)備的側(cè)視圖。
圖17a和17b示出了用于探針載體卷筒的雜交設(shè)備。
圖18示出了用于掃描探針載體針或探針載體棒的讀取儀。
圖19示出了用于掃描探針載體旋管的讀取儀。
圖20示出了用于掃描探針載體卷筒的讀取儀。發(fā)明詳述1、探針載體裝置A一般描述利用一維探針陣列能夠容易地進行微陣列的掃描和成像，這是因為這樣的陣列無需二維成像所需的高精度。在以下文獻中可找到利用結(jié)合到光學纖維上的多核苷酸的許多裝置“核酸生物傳感器診斷法”Krull等人，WO#98/58079和WO#95/26416；“用于選擇性檢測混合流體樣品中的寡核苷酸樣本的纖維光學生物傳感器”Walt等人，WO#98/50782；“用于檢測和測定特異性序列化核酸的分析方法”Sutherland等人，EP#0245206；“基因探針生物傳感器方法”Squirrel，WO#93/06241；“核酸測定方法”Hirschfield，US 5,242,797；Piunno等人，用于熒光核酸測定的纖維光學DNA傳感器，分析化學(Anal.Chem.)672635-2643，1995；Uddin等人，用于熒光檢測三螺旋DNA的纖維光學生物傳感器，核酸研究(NucleicAcids.Res.)254139-4146，1997；Abel等人，用于檢測寡核苷酸的光學纖維漸消波生物傳感器，分析化學682905-2912，1996；Kleinjung等人，用于特異性測定飛摩爾的DNA寡聚體的纖維光學基因傳感器，分析化學學報(Anal.Chim.Acta)15051-58，1997；Zhang等人，用于檢測DNA雜交的化學發(fā)光纖維光學生物傳感器，分析通訊(Anal.Lett.)322725-2736，1999；Ferguson等人，用于分析基因表達的纖維光學DNA生物傳感器微陣列，自然生物技術(shù)(Nature Biotech.)，141681-1684，1996。
然而，這些裝置一般包括僅僅將一種探針分子序列附著到單個光學纖維的玻璃表面上。Krull等人(WO#98/58079)業(yè)已建立了使用多于一種探針類型的未示差混合物的理論，然而，探針分子的無組織分布明顯限制了這些技術(shù)中的不同探針序列的數(shù)目，探針分子的無組織分布需要每一單個探針分子由例如熒光標記物來標記(正如Krull等人所建議的)，以便鑒定該探針分子并將它與其本位的相鄰物(可以是具有不同序列的探針)區(qū)分開。另外，以前的方法僅僅使用了短的纖維(幾厘米或更少)，從而限定了能夠固定的探針的數(shù)目和種類。最后，以前的這些技術(shù)利用其上固定有探針的光學纖維，將光傳導給雜交標記物(一般為熒光團)或者傳導來自雜交標記物的光。該檢測技術(shù)依賴于來自光學纖維的漸消發(fā)光，而該發(fā)光固有地局限于與纖維表面緊緊相鄰的區(qū)域，因此不能辨別多組探針并在靈敏度上受到限制。而且，利用光學纖維本身來激發(fā)和發(fā)射光線限制了單獨利用光學纖維作為其上固定有探針的基片，并且阻礙使用其它基片例如金屬線或聚合物，而這些基片具有其它優(yōu)點諸如承載有關(guān)各個探針或探針組的信息的能力，以及雜交方面的優(yōu)點。
與所建立的DNA探針在平片上形成二維點矩陣的“基因芯片”技術(shù)不同，“探針載體細線”沿一定長度的薄柔性細線以一維陣列的形式固定探針。探針載體細線系統(tǒng)由以下三個基本要素構(gòu)成探針載體細線的構(gòu)造和制造、雜交和讀取。通過利用探針載體針、探針載體棒、探針載體旋管和探針載體卷筒技術(shù)而改進的探針載體細線的包裝，增大了探針的密度并增強了探針載體細線技術(shù)的固有優(yōu)點。本文所用的“柔性”，是指能夠彎曲、纏繞、盤繞或者另外彎曲到本發(fā)明的操作所需的程度而不會折斷。
如圖1所示，在本發(fā)明的一個實施方案中，探針作為長而薄的柔性基片(100)中心處的多個點(110)或者作為貫穿基片(100)寬度的窄條(參見圖4，404)來固定?；蛘呤牵结樋勺鳛槿舾蛇B續(xù)行列的點來固定，所述行列與基片的長軸呈一角度?；拈L度與寬度的比例至少大約為5∶1，優(yōu)選的是至少為50∶1，更優(yōu)選的是至少為500∶1，最優(yōu)選的是至少為10,000∶1?；刑结樀牟糠值拈L度與寬度的比例至少大約為5∶1，優(yōu)選的是至少為50∶1，更優(yōu)選的是至少為500∶1，最優(yōu)選的是至少為10,000∶1。這些長度與寬度的比例、基片的柔性以及探針以一維或者近似一維的排列來定位的特點使得制造、使用和分析探針載體的方法新穎而簡便。
本文所用的“一種探針”是能夠與特定樣品或部分樣品發(fā)生特異性結(jié)合或特異性反應的一種分子或一種分子結(jié)構(gòu)的一組拷貝。該組可含有任何數(shù)目的分子或多分子結(jié)構(gòu)拷貝。本文所用的“多種探針”是指多于一種的這樣的分子或多分子結(jié)構(gòu)系列。這些分子或多分子結(jié)構(gòu)可以是多核苷酸、多肽、寡糖、多糖、抗體、細胞受體、配體、脂質(zhì)、細胞、小分子(在篩分藥物中諸如用來篩分藥)或者這些結(jié)構(gòu)的組合，或者任一與感興趣的樣品或感興趣的部分樣品特異性結(jié)合或反應的其它結(jié)構(gòu)。這些探針可以通過共價或非共價附著的方式固定到基片上。本文所用的“柔性”是指能夠彎曲、纏繞、盤繞或者另外彎曲到本發(fā)明的操作所需的程度而不會折斷。基片的“寬度”被定義為整個包含在基片內(nèi)的與基片的長軸垂直的最長長度。含有探針的圓柱形部分諸如細線基片的“寬度”被定義為與基片的含有探針的部分的長軸垂直的、包含在基片的含有探針的部分內(nèi)的最長弧的線性距離?；暮刑结樀牟糠值拈L度是沿基片的長軸從基片上多種探針的第一種探針到最后一種探針的線性距離，或者，如果在形成探針組的探針之間具有相當大的間隔，那么長度是這組探針中的第一種探針到最后一種探針的線性距離。
與排列在平面上的常規(guī)二維微陣列一樣，本發(fā)明的裝置用于通過以下步驟來分析樣品1)首先，將已經(jīng)同樣品或樣品片段結(jié)合或反應的探針與沒有結(jié)合樣品的探針區(qū)分開，然后2)鑒定已經(jīng)結(jié)合樣品的那些探針。
鑒定探針的其它方式是利用能夠鑒定單種探針或探針組的標記物。這樣的標記物可用來傳送更多的信息，而不單單是鑒定探針。
探針載體的這種長、薄且具柔性的性質(zhì)使其本身適合于許多新的負載方式和用途?？梢栽S多形式來包裝探針載體，這些形式包括(但不限于)針、棒、旋管和卷筒。由于只需要極少的雜交液并加強了混合，因此顯著增強了雜交方法。以卷筒形式包裝的柔性探針在需要大體積、低至中等規(guī)模的微陣列的應用中特別有優(yōu)勢，諸如大醫(yī)院的疾病診斷和治療中所涉及的那些。在這些應用中，陣列中所需的探針數(shù)目較少(在幾百到幾千的范圍內(nèi))，但是每天可消耗相當多的同一類型的陣列。利用這種柔性探針載體形式，相同的若干組探針的數(shù)萬個拷貝沿細線的連續(xù)長度重復排列并密封在一個大旋管或卷筒內(nèi)。完全自動化的系統(tǒng)使用與分析過程的每一階段的設(shè)備(諸如雜交站和掃描儀)一體化。該機器在整個過程中以完全自動化的方式吸入病人的DNA樣品、傳送給柔性探針載體并產(chǎn)生分析結(jié)果，而無需人工介入。
B具體描述1.1基片本發(fā)明的基片可由不同材料制成?；囊笫牵渚哂凶銐虻娜嵝詠沓惺茉撗b置的制造和使用中所需的結(jié)構(gòu)變化，并且其能夠固定待使用的特定探針或者能夠變型(例如，通過涂布)，以便能夠進行這樣的固定?；€可包括由不同材料制成的不同的層，每一層在該裝置中都具有功能。
具體的實施方案需要不同程度的柔性?？赏ㄟ^承受纏繞到某一直徑(例如，10cm、5cm、2cm、1cm、0.5cm或0.1cm的直徑)的能力來測量柔性。用于本發(fā)明基片的優(yōu)選材料是石英玻璃、金屬材料、塑料以及強度足以承受制造和使用過程的聚合物。
為了固定多核苷酸和多肽，硅石即純玻璃是優(yōu)選的材料，這是因為多核苷酸和多肽能夠共價附著到處理過的玻璃表面上，并且硅石發(fā)出最小的熒光噪音信號。硅石可以是在另一種材料上的一層，或者可以是該裝置的核心或基層材料基片，或者二者兼具。本發(fā)明的一個實施方案包括利用金屬線作為核心基片，而在其上涂布有用于固定探針的硅石。另一實施方案包括利用塑料或聚合物帶作為基層基片，而在其上涂布用于固定探針的硅石。在該實施方案中，可加入另一金屬材料層，該層既可在帶的與硅石層相反的那一面，也可夾在硅石層與聚合物或塑料之間。本發(fā)明的又一實施方案是，在硅石核上具有一層金屬材料而在金屬材料上又有另一硅石層的硅石纖維；探針可固定在外面的硅石層上。
光學纖維。探針載體細線可由不同材料制成。優(yōu)選的材料是硅石，這是因為DNA可共價附著到處理過的玻璃表面上并且硅石發(fā)出最小的熒光噪音。與玻璃是硬性易破碎的材料這一常見認識相反，由硅石制成的纖維是柔性的并具有較大的彈性強度。例如，目前大規(guī)模生產(chǎn)的用于無線電通訊產(chǎn)業(yè)的光學纖維就是由硅石制成的。光學纖維是主要由硅石制成的基片材料并滿足所必需的要求。雖然這樣的纖維是為了傳輸光的目的制造的，但是本發(fā)明并不需要纖維的這個性質(zhì)(雖然該性質(zhì)在一些實施方案中用到)。相反地，是光學纖維的其它性質(zhì)使其對于本發(fā)明具有特別的優(yōu)越性。測得的光學纖維的機械強度為7Gpa，大約為最強的鋼的4倍，而重量僅為這種鋼的1/6。光學纖維還具有高度柔性。標準的125μm直徑的纖維可旋繞成5mm以下直徑的回路而不會折斷。
而且，制造光學纖維的過程使其本身可按規(guī)格改制，特別是按纖維的截面形狀而改制。光學纖維是由預制件制成的，預制件一般長為1米、直徑為3厘米并且用硅石制造。預制件的中心部分摻雜有鍺，從而產(chǎn)生引導光穿過的具有較高折射率的核芯。然后將預制件安裝到清潔室內(nèi)環(huán)境中的纖維牽引塔上，后者將預制件加熱到熔點并將纖維拉出到一個大的轉(zhuǎn)鼓上。纖維的截面形狀一般酷似預制件的截面形狀，并且可利用抽拉速度來控制纖維的直徑。市場上的大部分光學纖維都具有環(huán)形截面并且外徑為125μm。然而，其它直徑和形狀特別是“D”截面形狀也是有用的。如果為了儲存和易于使用，最終形成的探針載體圍繞自身進行纏繞，那么這種形狀尤其有用。如圖2a所示，可利用具凹槽的D形預制件來調(diào)節(jié)纖維的截面，從而纖維(200)具有其內(nèi)可固定探針(110)的凹槽或溝槽(202)。這種設(shè)計避免一層的探針與后續(xù)層的基片發(fā)生摩擦(如圖2b所示)，其中兩個連續(xù)層的截面所表示出的是，一個在另一個的頂部。
另外，由于材料的高純度和制造過程的細心控制，光學纖維幾乎沒有結(jié)構(gòu)缺陷。而且，光學纖維具有完美的尺寸精度。直徑被控制在±1μm之內(nèi)。最后，光學纖維的成本非常低，大約為1-2美金/米。這是因為纖維的制造過程相當?shù)睾唵蚊髁瞬⑶乙粋€預制件能夠產(chǎn)生高達100千米的標準無線通訊纖維。
采用結(jié)合到光學纖維上的多核苷酸的許多裝置在以下文獻中都有所描述“核酸生物傳感器診斷法”Krull等人，WO#98/58079和WO#95/26416；“用于選擇性檢測混合流體樣品中的寡核苷酸樣本的纖維光學生物傳感器”Walt等人，WO#98/50782；“用于檢測和測定特異性序列化核酸的分析方法”Sutherland等人，EP#0245206；“基因探針生物傳感器方法”Squirrel，WO#93/06241；“核酸測定方法”Hirschfield，US 5,242,797；Piunno等人，用于熒光核酸測定的纖維光學DNA傳感器，分析化學672635-2643，1995；Uddin等人，用于熒光檢測三螺旋DNA的纖維光學生物傳感器，核酸研究254139-4146，1997；Abel等人，用于檢測寡核苷酸的纖維光學漸消波生物傳感器，分析化學682905-2912，1996；Kleinjung等人，用于特異性測定飛摩爾的DNA寡聚體的纖維光學基因傳感器，分析化學學報15051-58，1997；Zhang等人，用于檢測DNA雜交的化學發(fā)光纖維光學生物傳感器，分析通訊322725-2736，1999；Ferguson等人，用于分析基因表達的纖維光學DNA生物傳感器微陣列，自然生物技術(shù)141681-1684，1996。
這些裝置一般包括僅僅將一種探針分子序列附著到單個光學纖維的玻璃表面上，從而大大限制了它們的使用價值。以前的方法只使用纖維的短短一部分(幾厘米或者更少)，因此限制了能夠固定的探針的數(shù)目和種類。最后，以前的技術(shù)采用其上固定有探針的光學纖維將光傳導給雜交標記物(一般為熒光團)或者傳導來自雜交標記物的光。該檢測技術(shù)依賴于來自光學纖維的漸消發(fā)光，而該發(fā)光固有地局限于與纖維表面緊緊相鄰的區(qū)域，因此不能辨別多組探針并在靈敏度上受到限制。而且，利用光學纖維本身來激發(fā)和發(fā)射光線限制了單獨利用光學纖維作為其上固定有探針的基片，并且阻礙使用其它基片例如金屬線或聚合物，而這些基片具有其它優(yōu)點諸如承載有關(guān)各個探針或探針組的信息的能力，以及雜交的優(yōu)點(如下所述)。
商業(yè)上的無線電通訊纖維涂布有一層無孔聚合物，這對于探針固定不是最佳的?？衫帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)(諸如US專利5,948,202中所描述的那些技術(shù)，該文獻在此全部并入本文作為參考)來去除這個涂層。然而，沒有該涂層的裸露纖維易于受到水蒸氣的攻擊，從而在纖維表面產(chǎn)生微裂紋并使其強度降解。結(jié)果，裸露的硅石纖維可能經(jīng)受不住雜交階段非常惡劣的環(huán)境。有幾種解決這個問題的方法。
一種方法是在探針固定之后沿長條狀圓柱或轉(zhuǎn)鼓將纖維纏繞成螺狀旋管。纖維并排就位于轉(zhuǎn)鼓上并附著到其固相表面上。探針沿纖維的一側(cè)排列，該側(cè)遠離附著到轉(zhuǎn)鼓上的纖維的那一側(cè)。轉(zhuǎn)鼓在樣品的雜交和雜交模式的檢測過程中為纖維提供機械支撐。
第二種方法是通過將一個或若干個涂層施加到硅石纖維上而增大了該纖維的強度，從而避免纖維被水蒸氣損壞并同時保持良好地結(jié)合探針。然后強化纖維可以纏繞在例如一個專門設(shè)計的卷筒上并裝入密封盒內(nèi)以便運輸和操縱?；瑥娀椒ǖ囊粋€例子是用金屬材料涂布纖維，然后添加一個硅石層。為了避免裸露的硅石纖維吸入潮氣，可添加一個或多個氣密層。適宜的涂布材料包括金、銀和鈦，這是由于這些金屬在化學溶液中具有相當?shù)亩栊?。在纖維光學無線通訊產(chǎn)業(yè)中還廣泛地使用碳涂料，以進行氣密密封。本發(fā)明在一個實施方案中還提供了在氣密層之上的另外一個硅石涂層，以便與DNA探針共價結(jié)合。通過低成本的溶膠-凝膠過程可形成這樣的涂層，并且該涂層提供了一個用于固定探針特別是通過共價結(jié)合固定探針的表面。
除了硅石以外，其它材料也可用作基片的主體。其包括薄金屬線或強聚合物(例如聚酰亞胺或聚四氟乙烯(PTFE))帶。再者，溶膠-凝膠硅石涂層可施加到基片上，以便易于結(jié)合探針。對于聚合物帶形基片，可以在帶與硅石之間施加一層金屬材料。
以上所述的所有基片設(shè)計中的金屬材料部分不僅保護和/或強化基片，而且在探針載體的制造過程中以及在結(jié)合帶電荷樣品的過程中還具有其它益處(以下將有所描述)。
基片是長條狀的。本文所用的“長條狀”是指，基片的長度與寬度的比例超過大約5∶1，優(yōu)選的是超過100∶1，更優(yōu)選的是超過1000∶1，最優(yōu)選的是超過10,000∶1。認為長度∶寬度之比可以更大，如至少100,000∶1或至少1,000,000∶1。正如以上所定義的，基片的“寬度”是指整個包含在基片內(nèi)的與基片長軸垂直的最長長度。如果基片具有不同的寬度，那么用于計算長度與寬度的比例的寬度是最長的寬度?；暮刑结樀牟糠值摹皩挾取笔侵缸铋L的弧度(對于含有探針的弧形區(qū)域來說，正如通常在類似于圓柱形螺旋的基片中所見到的)或者平面基片的大線性距離，其包含在基片的含有探針的部分內(nèi)并與基片的含有探針的部分的長軸垂直?；摹伴L度”是指基片長軸的長度。如果基片具有多于一個的長度，那么利用這些長度中的最短長度來計算長度與寬度的比例。
基片的截面可以是任何形狀。本文所用的“截面”是指穿過基片、與基片的長軸垂直的平面部分。雖然截面可以是任何形狀，但是有兩種特定形狀代表了本發(fā)明的不同實施方案。首先，本文所用的“帶”是指應用帶狀、條狀或片狀基片的實施方案，其截面是長條狀或近似于長條狀或者是平行四邊形的。這樣的帶將具有與截面區(qū)域的寬度對應的厚度。在本發(fā)明的不同實施方案中，該厚度不超過500微米，或者不超過100微米，或者不超過50微米，或者不超過20微米。其次，本文所用的“纖維”是指應用纖維狀、細線狀或絲線狀基片的實施方案，其截面是圓形的。截面可以是環(huán)形、橢圓形或部分環(huán)形，例如纖維具有D形截面。該截面具有一直徑，該直徑在本文中是指截面的最長線性尺寸。在本發(fā)明的多個實施方案中，纖維的直徑不超過500微米，或者不超過200微米，或者不超過100微米，或者不超過50微米，或者不超過20微米。術(shù)語“帶”和“纖維”指代表截面形狀范圍中的兩個部分。然而，本發(fā)明可具有任何形狀的截面?；删哂写蠹s與纖維長軸平行運行的一個或多個凹槽，而探針固定在這些溝槽內(nèi)(如圖2a所示)。這樣的溝槽在截面上被看成一個凹槽。利用這樣的溝槽或凹槽可減小或消除固定在溝槽內(nèi)的探針與其它表面之間的摩擦；例如，當基片圍繞自身纏繞成螺旋形時，固定在一個繞組上的探針由于凹入溝槽內(nèi)而避免與下一繞組上的基片接觸。具有這種凹槽的D形截面易于將一層繞組堆積在下一層上，并保護探針。其它實施方案可采用不同的截面，這些截面在使用本裝置時是有用的并且對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
1.2.探針本文所用的“探針”是能夠與特定樣品或部分樣品特異性結(jié)合的一種分子或多分子結(jié)構(gòu)的一組拷貝。本文所用的“多種探針”是指多于這樣一組分子的結(jié)構(gòu)。利用共價或非共價附著法可以將探針固定到基片上。探針可以是多核苷酸、多肽、寡糖、多糖、抗體、細胞受體、配體、脂質(zhì)、細胞或這些結(jié)構(gòu)的組合，或者是任一與感興趣的樣品或感興趣的部分樣品特異性結(jié)合的其它結(jié)構(gòu)。這組探針的選擇取決于該裝置的用途。例如，如果該裝置用多核苷酸作為探針，那么如果進行的是序列分析，則優(yōu)選一整組或接近整組的n個核苷酸；美國專利US 5,700,637和6,054,270中較充分描述了這些探針組的用途，這兩篇專利在此全部并入本文作為參考。另一方面，如果利用裝置來分析基因或基因組中的突變或多態(tài)性，那么對于感興趣的特定基因或多個基因中，探針優(yōu)選代表一完整突變組或所選擇的突變組(突變例如替換、缺失以及插入突變)的多核苷酸。作為另一個例子，在諸如癌癥相關(guān)的突變診斷中，已知與某一種癌癥或幾種癌癥相關(guān)的一組基因中的特定突變“熱點”，是其互補多核苷酸用作探針組的區(qū)域。這些例子僅僅示出了為特定裝置所選的不同定制組的探針，并集中在多核苷酸，這是由于這些是現(xiàn)在最常用的探針種類；應該理解，其它種類的探針和其它多核苷酸組對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說也是顯而易見的。
本文所周的“多核苷酸”是指任何長度的核苷酸的聚合形式，這些核苷酸包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類似物。本文所用的術(shù)語“多核苷酸”和“核苷酸”可以互換使用。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)并且可以實施已知或未知的任何功能。術(shù)語“多核苷酸”包括雙鏈或單鏈的以及三螺旋分子。除非另外專指或需要，否則本文所述的包括多核苷酸的本發(fā)明的任何實施方案均包含雙鏈形式和已知或預測構(gòu)成雙鏈形式的兩個互補單鏈形式中的每一種。相對短的多核苷酸(少于大約100個核苷酸)還可稱作寡核苷酸。
以下是多核苷酸的非限定性例子基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針以及引物。多核苷酸可包括修飾核苷酸例如甲基化核苷酸以及核苷酸類似物。嘌呤和嘧啶的類似物在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，包括(但不限于)吖丙啶基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨甲基尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、5-戊炔尿嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。利用尿嘧啶來取代脫氧核糖核酸中的胸腺嘧啶，也被認為是嘧啶的類似物形式。
如果存在的話，在裝配聚合物之前或之后進行核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾?？衫梅呛塑账岢煞謥碇袛嗪塑账岬男蛄?。在聚合之后諸如通過與標記成分結(jié)合還可以進一步修飾多核苷酸。該定義中所包括的其它類型的修飾為，例如“帽結(jié)構(gòu)”、將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替換、核苷酸間修飾例如具有不帶電荷鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、膦酰胺化物、氨基甲酸酯等)的那些修飾以及具有電荷鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)的那些修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的那些修飾、含有烷基化物的那些修飾、具有修飾鍵(例如α-端基異構(gòu)核酸等)的那些修飾，以及多核苷酸的未修飾形式。
另外，通常存在于糖中的任何羥基都可被膦酸酯基團、磷酸酯基團所取代，或者被標準的保護基團所保護，或者被激活從而又與其它核苷酸或固相支持體鍵合。5’和3’端OH基可以被磷酸化或用胺或1-20個碳原子的有機封端基團部分來取代。其它羥基也可被衍生成標準的保護基團。
多核苷酸還含有本領(lǐng)域內(nèi)通常所公知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，其包括(但不限于)2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-氟或2’-疊氮-核糖、碳環(huán)糖類似物、α-端基異構(gòu)糖、差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖景天庚酮糖、無環(huán)類似物和無堿基核苷類似物(例如甲基核苷)。正如以上所指出的，一個或多個磷酸二酯鍵可被替代連接基團所取代。這些替代連接基團包括(但不限于)這樣一些實施方案，在這些實施方案中，磷酸酯被P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲?；?所取代，其中每個R或R’各自為H或任選地含有醚(-O-)鍵的取代或未取代烷基(1-20個碳)、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或環(huán)氧基。并不是多核苷酸中的所有鍵都必需相同。糖、嘌呤和嘧啶的類似物形式的取代在設(shè)計最終產(chǎn)物時是有益處的，例如可替換像聚酰胺主鏈這樣的主鏈結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以互換使用，是指任何長度的氨基酸聚合物。該聚合物可是線性的或者分支的，它可包括修飾氨基酸并可被非氨基酸中斷。這些術(shù)語還包含已經(jīng)天然或者間插修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵的形成、糖基化、類脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?諸如與標記成分結(jié)合)。該定義內(nèi)還包括的是例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然的氨基酸等)的多肽，以及本領(lǐng)域內(nèi)公知的其它修飾。多肽可以單鏈或締合鏈存在。
本文所用的“配體”是與特異受體結(jié)合的分子。該受體可以是細胞受體或者是另一分子的一部分，例如酶別構(gòu)改性劑的受體。配體的例子包括(但不限于)酶輔因子、底物和抑制劑、酶的別構(gòu)改性劑、細胞膜受體、毒素和毒液的激動劑和拮抗劑、病毒表位、半抗原、激素、凝集素和藥物(例如鴉片制劑和類固醇)。
本文所用的“細胞受體”是細胞分子，其通常既可以位于胞內(nèi)也可以與細胞膜相連，并且對于給定的配體具有親和性。這些細胞受體的例子包括(但不限于)激素受體、細胞轉(zhuǎn)運蛋白、細胞因子受體和神經(jīng)遞質(zhì)受體。
1.3.探針的固定利用任何可獲得的方式將本發(fā)明的寡核苷酸探針添加、固定、提供和/或施加到固相支持體的表面上，從而將寡核苷酸固定、定位、提供和/或施加到固相支持體上的某一部位。利用噴墨印刷法(US 4,877,745)、照相平版印刷術(shù)(參見US專利號5,919,523、5,837,832、5,831,070、5,770,722和5,593,839)、絲印法、膠版印刷法、擊打法、利用x-y單元和光柵技術(shù)使用微量移液管的機械施加法、或者在放置結(jié)合成分時可提供所需的準確度和空間分離程度的任何其它方法，將不同樣本放置到特定的位點上。
正如在Southern等人的(US專利號5,770,367、5,700,637和5,436,327)、Pirrung等人的(US專利號5,143,854)、Fodor等人的(US專利號5,744,305和5,800,992)以及Winkler等人的(US專利號5,384,261)中所描述的，組合陣列法業(yè)已成功地用于需要短序列聚合物的情形中。在這些“基因芯片”中，寡核苷酸探針(20-25個核苷酸)或者肽核酸(PNAs)的制備既可在微陣列制造過程中原位產(chǎn)生，也可利用傳統(tǒng)方法脫機并點到微陣列上。Fodor等人的US專利號5,445,934和5,744,305描述了含有多個序列的基片(密度為每平方厘米含有400個或更多的不同探針)的制造過程。利用固相化學和照相平版印刷術(shù)來合成這些芯片。這些組合方法產(chǎn)生了明顯的生物和化學多樣性，但是卻不能構(gòu)建大的高分子的微陣列并且實施起來也比較昂貴和困難。
利用噴墨分配器設(shè)備將小滴液體沉積在固相基片上。以下文獻中已經(jīng)記載利用這樣的技術(shù)制造生物和化學陣列Brennan(US專利號5,474,796)、Tisone(US專利號5,741,554)和Hayes等人(US專利號5,658,802)。這些非接觸技術(shù)不能輕而易舉地排列大量樣品，也不能控制最終獲得的微陣列的質(zhì)量。
正如在Augenlicht(US專利號4,981,783)、Drmanac等人的(US專利號5,525,464)、Roach等人的(US專利號5,770,151)、Brown等人的(US專利號5,807,522)和Shalon等人的(US專利號6,110,426)中所描述的，第三類列陣設(shè)備利用直接表面接觸印刷術(shù)來工作。在這種形式中，探針是長的互補DNAs(cDNAs)(500-5000堿基長)，其是在固定之前利用傳統(tǒng)方法合成的。這些技術(shù)作為基于套管軸的點樣器所存在的缺陷是，不能精確地攝取和分配樣品并且缺乏耐用性。
Martinsky等人(US專利號6,101,946)描述了一種電子放電機(EDM)的應用，該機器可固定到用于精確和自動進行三維運動的運動控制系統(tǒng)上。如Brown和Shalon的US專利號5,807,522(1998)所述，寡核苷酸引物也可以施加到固相支持體上。另外，利用機器人系統(tǒng)(諸如由GeneticMicroSystems(Woburn，MA)、GeneMachines(San Carlos，CA)或CartesianTechnologies(Irvine，CA)制造的機器人系統(tǒng))可以將引物施加到固相支持體上。
可以利用各種方法將寡核苷酸結(jié)合到固相基片上。通過采用可發(fā)生化學反應的固相基片，可以提供存在于核酸上的化學反應基團，該基團將與化學活性固相基片表面發(fā)生反應?？梢孕纬晒桴?，以便將核酸共價鍵合到表面上?？衫糜袡C加聚物(例如苯乙烯、丙烯酸酯和異丁烯酸酯、乙烯醚和酯等)來代替硅石的官能度，其中所存在的官能度可以與核酸上存在的官能度反應。還可按照常規(guī)方式提供氨基、活性鹵化物、羧基、硫醇基、環(huán)氧化物等。這些鍵可以是酰胺、脒、胺、酯、醚、硫醚、二硫醚等。用于形成這些共價鍵的方法在US專利號5,565,324以及其中所提到的參考文獻中有所描述。
可以利用引物延伸法或者采用修飾NTPs制備具有用于結(jié)合的配體和序列標志的核酸，其中引物可以具有配體和/或序列標志，修飾dNTPs具有配體和/或序列標志。對于RNA，可以使用體外轉(zhuǎn)錄，即利用噬菌體啟動子(例如T7、T3或SP6)和由DNA編碼的序列標志，以及在包括標記NTP(例如生物素-16-UTP)的NTPs的存在下，分別用T7、T3或SP6聚合酶進行轉(zhuǎn)錄，由此最終得到的RNA在預定位點上具有寡核苷酸序列標志和相對隨機地分布在鏈中的結(jié)合配體。
在本發(fā)明中，探針可以在基片上原位合成或者先制備然后固定到基片上。對于多核苷酸，該技術(shù)在US專利號5,419,966中已經(jīng)有所描述，該文獻在此作為參考并入本文?；蛘呤?，可以用分段的方式從單個的單體或者較小的多核苷酸或其它亞單位來合成多聚探針(諸如多核苷酸)。優(yōu)選的是，探針被固定在基片的不同區(qū)域。另外，一個特定區(qū)域中固定有多于一種的探針，而通過諸如利用不同顏色的熒光標志進行差異標記，將一種特定類型的單一探針分子與其它探針分子區(qū)分開來。本文所用的“固定”是指，利用共價或非共價的方式使探針附著到基片上，二者之間的親和力足以承受制造、樣品結(jié)合、樣品分析這些步驟，并且如果需要的話，還可以重新使用。
用于衍生固相支持體以固定多核苷酸和多肽的方法和材料在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且在諸如US專利號5,744,305和5,919,523中有所描述，這兩篇文獻在此作為參考全部并入本文。對于非共價附著，優(yōu)選的方法是利用生物素-鏈親和素結(jié)合法，但是能夠提供必需的親和力的任何非共價結(jié)合法都可用于本發(fā)明。
除了寡核苷酸或任何其它有機本體以外，還可以使用分子集合體，如為細胞器(例如細胞核、線粒體、細胞質(zhì)、脂質(zhì)體等)或者細胞(原核的和真核的)的情形。結(jié)合成分可以直接結(jié)合到固相基片上或者利用一種或多種中間體間接結(jié)合到固相基片上，其中這些中間體用作結(jié)合成分與固相基片之間的橋梁。一般來說，在分子共價結(jié)合到固相基片表面上的情形中，可以利用各種反應官能度來激活基片表面，這取決于結(jié)合成分的性質(zhì)以及固相基片表面的性質(zhì)。
例如，可以利用各種方法將寡核苷酸結(jié)合到固相基片上。在使用化學反應固相基片時，可提供一種存在于核酸上的化學反應基團，該基團將與化學活性固相基片表面發(fā)生反應?？梢孕纬晒桴ィ员銓⒑怂峁矁r鍵合到表面上。可利用有機加聚物(例如苯乙烯、丙烯酸酯和異丁烯酸酯、乙烯醚和酯等)來代替硅石的官能度，其中有機加聚物所存在的官能度可以與核酸上存在的官能度反應。還可按照常規(guī)方式提供氨基、活性鹵化物、羧基、硫醇基、環(huán)氧化物等。鍵可以是酰胺、脒、胺、酯、醚、硫醚、二硫醚等。用于形成這些共價鍵的方法在US專利號5,565,324以及其中所提到的參考文獻中有所描述。
可以用引物延伸法或者采用修飾NTPs制備具有用于結(jié)合的配體和序列標志的核酸，其中引物可以具有配體和/或序列標志，修飾dNTPs具有配體和/或序列標志。對于RNA，可以使用體外轉(zhuǎn)錄，即利用噬菌體啟動子(例如T7、T3或SP6)和由DNA編碼的序列標志，以及在包括標記的NTP(例如生物素-16-UTP)的NTPs的存在下，分別用T7、T3或SP6聚合酶進行轉(zhuǎn)錄，由此最終得到的RNA在預定位點上具有寡核苷酸序列標志和相對隨機地分布在鏈中的結(jié)合配體。
1.4.標記物通過利用探針或探針組的標記物可以確定每一探針在基片上的位置以及有關(guān)探針和/或探針-樣品復合物的其它信息。這些標記物可用于常規(guī)的二維陣列以及本發(fā)明的一微結(jié)構(gòu)中。本文所用的“標記物”是指在基片和/或探針上、在基片和/或探針中或與基片和/或探針相連的任何可鑒定標記、排列或其它結(jié)構(gòu)或模式，它們傳送與某一探針或探針組有關(guān)的信息。一種類型的標記物是光學的。標記物還可以空間標記物(即基片上探針排的間隔)和/或條形碼、熒光標記物、化學發(fā)光標記物或者能夠用光檢測的任何其它標記物。另一種類型的標記物是磁標記物。因為基片含有可磁化的金屬元件，所以本發(fā)明本身為這樣的標記物。這些標記物可以與探針位于基片的同一側(cè)面上，也可以位于探針所在的基片的另一側(cè)面上，或者可以夾在中間或摻入基片內(nèi)部。用于空間標記和/或其它信息的一種方法是用一層磁薄膜覆蓋探針所在的基片的相反側(cè)面。然后在制造過程中利用磁的方式記錄空間或探針鑒定。這種方法的一個重要優(yōu)點是，在雜交階段可以把與靶物有關(guān)的其它信息寫在基片自身上。并且在掃描階段，也可以將掃描參數(shù)和其它數(shù)字輸出值寫在同一帶上，以便進一步參照。其它類型的標記物對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
1.5探針組探針可以成組固定在基片上，每一組具有一些共同的特征。例如，如果探針是核苷酸，那么需要共同雜交條件的一組核苷酸可以沿基片的某一長度進行固定，而需要與之不同的雜交條件的另一組可以沿基片的另一長度進行固定。利用這種方式，每一組探針都可在一組不同的條件下暴露給樣品，從而使樣品的結(jié)合最佳化。
另外地，單一探針載體可承載不同組的探針，以便診斷不同的疾病。例如，沿一段載體定位的一組探針用于診斷HIV，而另一組探針用于診斷皰疹等疾病。另一個例子是，一個載體或載體的一部分專用于HER-2/neu基因。HER-2基因也稱作HER-2/neu和c-erbB2，它在正常細胞生長的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，但是在癌的發(fā)育過程中，該基因得到擴增。擴增的HER-2基因?qū)е略谀[瘤細胞表面上的蛋白質(zhì)受體過度產(chǎn)生。這些特異性蛋白質(zhì)與其它循環(huán)生長因子結(jié)合，從而導致腫瘤的生長失控。該探針載體含有HER-2/neu基因及其變體的探針。
在另一實施方案中，探針組是重復的，從而使一個載體可重復用于相同的測定，而一組新的探針可用于每一后續(xù)測定。
1.6裝置的結(jié)構(gòu)探針可以任何結(jié)構(gòu)固定到基片上，這些結(jié)構(gòu)使得能夠?qū)⒁呀?jīng)結(jié)合有樣品的探針與那些未結(jié)合有樣品的探針區(qū)分開或者鑒定出來。實現(xiàn)這一點的最簡單方式是，將探針放在不同的區(qū)域，每一區(qū)域有一種探針。這些區(qū)域可以是多個點(如圖1所示)或者多條線(如圖4，404所示)。這些區(qū)域可以作為沿基片的長軸或者與之平行的一排來構(gòu)成。探針可直接附著到基片上，或者，在另一實施方案中，探針可以先附著到小珠上，然后將小珠附著到基片上。使探針附著到不同材料的小珠上的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且在諸如WO 99/60170中有所描述，該文獻在此作為參考全部并入本文。另一可能的替代結(jié)構(gòu)是有多排點，從而在給定的一排上含有多種探針。
如圖1所示，以位于長而薄的柔性細線基片100中心處的點或者貫穿基片100的寬度的窄條的形式來固定DNA探針110。通過印在探針組之間的空間130內(nèi)的空間標記物和/或條形碼120來實現(xiàn)探針的鑒定?；蛘呤?，將這些標記物印在細線基片的另一側(cè)上。如果必要的話，細線100可具有特定的截面形狀。如圖2a所示，可調(diào)節(jié)纖維的截面，以便使纖維200具有一個凹槽或者溝槽202，而探針110固定在其中。這種設(shè)計避免一層的探針與后續(xù)層的基片發(fā)生摩擦(如圖11B所示)，兩個連續(xù)層的截面所表示出的是，一個在另一個的頂部。
探針載體的長而薄以及柔軟的特性使其適合于許多新的負載方式、設(shè)置和使用方式?？梢栽S多形式來包裝該探針載體，這些形式包括(但不限于)針、棒、旋管和卷筒。由于只需要很少的雜交液并且增強了混合，因此相當增強了雜交方法。以卷筒形式包裝的柔性探針載體在需要大體積、低至中等規(guī)模的微陣列的應用(諸如與疾病診斷有關(guān)的那些應用)中特別具有優(yōu)勢。在這些應用中，陣列中所需的探針數(shù)少(在幾百至幾千的范圍內(nèi))，但是每天卻需要消耗相當大量的同一類型的陣列。利用這種柔性探針載體形式，相同探針組的數(shù)萬個拷貝沿細線的一個連續(xù)長度反復排列并密封在一個大的旋管或卷筒內(nèi)。
通過圍繞圓筒或管的一部分細線纏繞一定長度的現(xiàn)成的柔性探針載體，而制備針或棒形包裝。在優(yōu)選實施方案中細線并排地緊緊位于支撐圓筒的外表面上，并且可利用膠水、粘固劑或其它方式永久地固定到其上。探針載體針與探針載體棒之間的差別在于尺寸。探針載體針通常具有小于10mm的直徑，而探針載體棒要大些并且可以具有更大的直徑，由此可容納非常多的探針。例如，1.5米長、50μm直徑的細線在纏繞到5mm直徑的探針載體針上之后僅僅占據(jù)一個5mm的較短部分，但是假定沿細線具有100μm的探針空間，其可承載大約15,000個探針。另一方面，30mm寬、40mm直徑的探針載體棒在沿70米長、50μm直徑的細線可容納700,000個探針。
在一探針載體旋管中，將現(xiàn)成的柔性探針載體細線纏繞到一個平盤形旋管內(nèi)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，細線上的探針暴露在盤的一側(cè)，而另一側(cè)利用環(huán)氧、粘固劑或其它適宜的方式永久地固定到固相盤形平面支持體上。任選地，將探針沉積在探針載體細線表面上的凹槽內(nèi)?？梢杂靡粚щ妼宇A先覆蓋該平面支持體，以便易于雜交控制。假設(shè)50μm直徑的細線，40mm直徑的探針載體旋管可容納高達24米的探針載體細線，承載240,000個探針。
探針載體卷筒的結(jié)構(gòu)非常類似于探針載體旋管。然而，與探針載體旋管不同的是，探針載體細線不會永久地附著到支撐表面上，由此為了雜交、讀取或其它目的，可使得細線從卷筒上展開。另外，由于在卷筒內(nèi)每一圈細線都堆積在彼此的頂部，因此探針載體細線的截面形狀的設(shè)計要避免DNA探針與相鄰圈內(nèi)的探針載體細線發(fā)生摩擦。還是如圖17所示，可以制備一個盒，以便保護探針載體卷筒并使其易于纏繞和展開。另外，多個卷筒可堆積在一個盒內(nèi)。
2.探針載體的制造在本文所述的探針沉積技術(shù)的某些實施方案中，類似于纖維或帶的基片確實適合連續(xù)、高速的大批生產(chǎn)。圖3-7示出了制造系統(tǒng)設(shè)計的例子。雖然常規(guī)的點樣技術(shù)可用來產(chǎn)生不同的區(qū)域(每一區(qū)域含有一種探針)，但是本發(fā)明的一方面是，采用在基片上涂刷或噴涂探針的技術(shù)。這樣的技術(shù)與基片的實質(zhì)上一維的性質(zhì)結(jié)合，使其適合制造系統(tǒng)，在這些制造系統(tǒng)中，可高速并高精度地一次生產(chǎn)相同帶或纖維的多個拷貝。
2.1多股刷圖3表示的是這種裝置及其制造方法的一個示范實施方案。一種制造方法(如圖3所示)包括將在適當?shù)囊后w中或者本身就是液體(例如，在室溫下是液體或者在適當?shù)臏囟认履軌蛞夯闹|(zhì))的探針傳送到管內(nèi)，并且通過相對于基片移動管、同時將探針液從管中驅(qū)動到基片上，從而將探針從管中沉積到基片上。應該理解，這種運動是相對的并且通過移動管組件、移動基片或者二者都移動來完成的。在沉積過程中，毛細管尖可與基片表面接觸。另外，該尖端可在基片表面之上或之下移動一段較短的距離。利用非接觸沉積方法之一將探針液沉積到基片上。這些方法包括將探針附著到懸浮在探針液中的磁珠上并將一個電磁體放在基片下面。當毛細管與基片交叉(毛細管經(jīng)過基片的鄰近處)時該磁體被激活，從而將磁珠及其相連的探針吸引到基片表面上。另一非接觸沉積方法是，將一金屬層覆蓋到毛細管的兩個端面以及基片表面或者基片下面的支持體上，然后在毛細管與基片或者基片的支持體之間施加一個高壓。所產(chǎn)生的電場將帶電荷的探針(例如寡核苷酸)拉到基片表面上。利用上述兩種方法的任一種，如果電激發(fā)信號是一非常短的脈沖，那么探針將作為一個點沉積到基片上。如果信號代表的是毛細管與基片交叉的大多數(shù)時間或者全部時間，那么結(jié)果將是基片上的一個探針條?？梢赃x擇條件以確保探針固定到基片上?？梢詫⒍鄠€管合并到一起，從而制成一個能夠同時沉積多個探針條的“刷子”。而且，可以排列多個這樣的刷子，以便當不同的刷子相對于基片移動并沉積探針條時，可以使沉積的探針數(shù)目同時或者順序地成倍增加。另外，如果基片是纖維，則可以將幾個纖維基片放在適當位置以使一個刷子的一劃動作將探針條沉積在所有的基片上?；蛘呤?，利用一較寬的帶形基片來接收探針條，然后將該帶在縱向上切成多個單獨的更薄的帶?？梢岳斫?，這樣一種制造方法大大地增加了可以同時產(chǎn)生的探針載體的數(shù)目，從而增加了產(chǎn)量并降低了成本。還應該理解，易于采用標準的大批量生產(chǎn)方法(諸如傳送帶的使用)以自動實施并控制本文提到的這種制造方法以及其它制造方法。
在圖3中，將一排柔性毛細管300膠粘到標準微滴定板302的每一個孔下面的一個洞內(nèi)。毛細管300也可從頂部插入孔內(nèi)。然后毛細管300排成一個線性陣列，從而形成“刷子”304。將每種單獨的DNA探針儲藏到板上分離的孔內(nèi)并通過壓差或者通過在孔與刷子304的尖端之間施加一個電壓而將其驅(qū)動到與孔相連的毛細管300內(nèi)。因為DNA分子帶負電荷，所以應該向孔端施加負極?？梢詷?gòu)建多個這樣的毛細管刷子。填充毛細管之后，使毛細管陣列移動，以“刷”過固定的探針載體帶形基片306并沉積DNA探針110陣列，然后帶形基片306移向新的位置，以便使第二毛細管“刷”304能夠?qū)⒏嗟奶结?10沉積到后序的部位上?；蛘呤?，利用同一刷子沿帶形基片306沉積相同探針陣列的更多拷貝。另外，將大量的細線基片平行放置到刷子的下面，以便使每一個“涂刷”動作都能夠在不同的細線或帶上產(chǎn)生一維探針陣列的多個拷貝。
該技術(shù)以及提到的所有技術(shù)的另一個精華是，還沉積或者獲得探針110的標記物(參見，例如圖1)。這些標記物可為探針之間或者在其周圍的間隔，或者它們可以是光學條形碼(圖1，120)或熒光標記物或編碼在基片的金屬部件上的磁標記物，或者是用于鑒定特定探針或探針組的任何其它方式。這些標記物可以在基片的沉積有探針的那一側(cè)或者在與之相反的那一側(cè)，或者兩側(cè)都有。應該理解，基片可以只有一個表面(例如，具有環(huán)形截面的纖維)，并且上下文中的詞語“側(cè)面”是指沉積有探針的表面的特定區(qū)域。在具有更確定的頂部表面和底板表面的帶形基片中，“側(cè)面”是指這些頂部或底板表面之一。
可以利用各種方式來提供將探針從儲存器驅(qū)動到管內(nèi)并驅(qū)動到基片上的力。例如，可以建立壓差?；蛘呤?，如果探針帶電荷(例如當探針為DNA時)，那么在儲存器與基片之間可以建立電位差，從而探針從儲存器和管中移動到基片上。該基片可含有形成電極的金屬部件(例如金屬層)。
2.2探針印刷頭圖4示出了探針載體細線制造系統(tǒng)的第二種設(shè)計，其中每種探針儲藏在印刷系統(tǒng)408的“印刷頭”410內(nèi)。在以恒定速度Vh移動的傳送帶400上將大量這樣的印刷頭410排列成一維陣列。傳送帶可通過帶輪或絞盤412纏繞到卷筒406內(nèi)，以便節(jié)省空間。印刷頭之間的空間有幾毫米大并且足以容納每種探針的儲存器。將探針載體帶形基片402放在印刷頭陣列下面，并且基片402也以恒定的較慢速度Vt移動。當印刷頭與探針載體帶形基片402交叉時，其將一個點或一個條“印刷”在探針載體帶形基片402上。假設(shè)傳送帶上的兩個相鄰印刷頭之間的空間是Lh，而探針載體帶形基片402上的兩個相鄰探針之間所需的空間為Lp，則可以精確控制印刷頭傳送帶的速度Vp和探針載體帶形基片402的速度Vt，以便滿足Vp/Vt＝Lp/Lt。在這種方式中，DNA條404的線性陣列可以連續(xù)的方式高速沉積到探針載體帶形基片402上。由于基片正在移動或者基片與傳送帶以導致探針線與基片長軸垂直的一個角度交叉，因此探針線可以斜穿過基片。反之，使基片停止，而印刷頭進行印刷，然后在施加下一種探針之前前進到下一印刷部位。
系統(tǒng)內(nèi)的每一印刷頭包括容納一定量探針樣品的儲存器和將探針傳送到探針載體或帶形細線基片上的裝置。將探針分散到為探針傳送和固定到基片上提供必要條件的液體內(nèi)(或者探針本身就是液體)，而該液體的確切性質(zhì)取決于特定的探針和特定的基片。
圖5示出了印刷頭的一些可能設(shè)計。在圖5a中，一非常薄的柔性纖維500附著于探針儲存器504下面的一個小開口502。纖維500是親水的，從而通過表面張力或毛細管效應將探針液拉到其表面上。另外，纖維500必須為薄(＜80μm)的柔性且不變形的塑煉材料。涂布有金屬或尼龍的固相或空心硅石纖維是一種較好的候選材料。當印刷頭與探針載體帶形基片402交叉時，它將探針當作“墨水”“涂”探針條至探針載體帶形基片402的表面。在為金屬涂布的纖維時，可以將負壓施加到纖維上，以便將DNA樣品推到探針載體細線或者帶上。
圖5(b)-(h)示出了基于噴墨原理的不同設(shè)計，其中在探針儲存器的底部產(chǎn)生一個針孔。將脈沖能量引入儲存器，該能量將來自針孔的液滴噴射到其下面的探針載體細線上。在圖5b中，壓環(huán)506膠粘在儲存管的壁上，這個環(huán)在一電壓下擠壓管并噴射液滴。在圖5c中，壓膜506覆蓋在儲存器504頂部的隔膜508上，該壓膜與壓環(huán)具有相同的功能，但是當采用大量的儲存器504時壓膜更便宜些。在圖5d中，經(jīng)過電阻線510的電流脈沖利用局部加熱產(chǎn)生氣泡，氣泡又推出液滴。在圖5e中，通過外部超聲轉(zhuǎn)換器512引入噴射能量。在圖5f中，儲存管是透明的并且通過將激光器514聚焦到管內(nèi)的光吸收片上而實現(xiàn)加熱。在圖5g中，儲存器516是由金屬制成的。在儲存器與探針載體帶形基片402(或者探針載體帶形基片402之下的物體)之間施加一個高壓且負極位于儲存器。由于DNA載體帶負電荷，因此電場將樣品噴射到探針載體帶形基片402的表面上。在圖5h中，探針分子附著到懸浮在儲存器518內(nèi)的流體520中的磁珠上。將電流脈沖施加到基片下面的電磁體519上，以便將探針從儲存器下面的小開口吸引到基片表面402上。注意，在設(shè)計5e-5h中，致動器在外部并且不與印刷頭一起移動。由于每個儲存器(504或516或518)只在固定部位與探針載體帶形基片402交叉一次，因此在系統(tǒng)中僅僅需要一個這樣的致動器。假設(shè)儲存器的間隔為2mm，則150,000個儲存器陣列就是300米長并且能夠容納在直徑小于80cm的一個卷筒內(nèi)。
2.3點樣器和儲存器圖6示出了另一探針載體制造系統(tǒng)設(shè)計，其中前述設(shè)計的印刷頭結(jié)構(gòu)被分成“點樣器結(jié)構(gòu)”和“儲存器結(jié)構(gòu)”。每種探針都有自己的儲存器，為了降低成本，儲存器的結(jié)構(gòu)保持簡單。圖6a示出了可能的儲存器設(shè)計之一，其中液體內(nèi)壓與表面張力的總和導致含有探針110的液體600在開口612處稍稍膨脹。在傳送帶上組裝大量的儲存器602，從而形成一個線性陣列。如圖6b所示，通過例如將薄金屬帶制成微型齒的線性結(jié)構(gòu)或者將短的硅石纖維606膠粘到柔性金屬帶608上，可制造點樣器結(jié)構(gòu)604?？梢允褂卯a(chǎn)生一排適合傳送探針的纖維的任何材料或若干材料的組合。點樣器尖端懸掛在儲存器開口之上，兩者之間有一小段距離，以使尖端接觸探針液。當點樣器由高彈性材料(例如硅石纖維)制成時，點樣器尖端實際上可以稍稍降低開口，從而使點樣器能夠微觸到開口內(nèi)，以便收集探針液。按照箭頭614和616所指示的不同方向以諸如恒定的速度驅(qū)動點樣器和儲存器結(jié)構(gòu)進行移動。當點樣器與儲存器602的開口612交叉時，一滴探針液600將從儲存器中轉(zhuǎn)移出來，從而在點樣器上形成液滴610。利用交叉持續(xù)時間以及點樣器的形狀和尺寸來控制液滴中的液量。以這樣的方式(以后將有所描述)來設(shè)計點樣器和儲存器結(jié)構(gòu)的移動模式即，使每一連串的點樣器與相應連串的儲存器交叉，以便使每一點樣器承載不同的探針液滴。然后，如圖6c所示，點樣器結(jié)構(gòu)604移動并與按照使點樣器結(jié)構(gòu)與基片交叉的方向移動的基片618交叉。與儲存器的設(shè)置一樣，每一點樣器606的尖端可以物理形式接觸基片或者可以懸掛在基片之上一小段距離(幾十毫米)，該距離使得液滴610接觸基片618。將探針液滴從點樣器結(jié)構(gòu)傳送到基片上，以便在基片上形成線性探針結(jié)構(gòu)630。如果探針帶電，那么當一特定的點樣器與帶有電荷的探針儲存器(將吸引探針)交叉時，可通過電子學方式使其帶電，然后當該點樣器隨后與基片交叉時，使其上的電荷變成相反電荷，以便將探針從點樣器排斥到基片上。這種高超的設(shè)計使得能夠始終如一地精確控制點樣器上的液滴尺寸。這種將探針材料傳送到基片上的方法稱作“點樣”，并廣泛地在實驗室內(nèi)手工使用。
另外，如圖6d所示，點樣器結(jié)構(gòu)604可在一個環(huán)中移動，而結(jié)構(gòu)中點樣器的數(shù)目遠遠小于探針總數(shù)。點樣器離開基片618之后，它可以在洗滌區(qū)620進行洗滌、在干燥區(qū)622進行干燥并且通過環(huán)繞移動而重新用來使626又與探針儲存器結(jié)構(gòu)624交叉。由于洗滌是與點樣平行完成的，因此其不影響制造產(chǎn)量。按照本發(fā)明的點樣器易于清洗。
在圖6e所示的另一結(jié)構(gòu)中，探針儲存器可以是在其底部638具有小開口636的直管632或孔634。由于重力和毛細管力的綜合作用，探針液600在開口處向下膨脹。點樣器606從探針儲存器的下面與其交叉并將一些探針液600收集在其尖端。然后，點樣器移動并與探針載體基片610交叉并以與圖6c類似的結(jié)構(gòu)(只是點樣器載體406現(xiàn)在是在基片下面通過而不是在其上通過)在基片上涂畫一窄條。使基片面向下定位，以便用點樣器涂畫。包括探針收集、點樣、洗滌和干燥的整個制造系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)都與圖6d所示的類似。
在上述兩種制造系統(tǒng)中，每種成分以預先規(guī)定的恒定速度移動。這樣減小了運動控制和精確要求的復雜性。另外，可以連續(xù)制造大量探針載體100而無需人工介入。結(jié)果，制造產(chǎn)量非常高。而且，如果采用硅石纖維或薄線作為探針載體基片，那么許多纖維可平行附著到用于制造階段的寬載體帶。于是，可以同時制造同一探針載體細線的多個拷貝。
在加工廠可以采用寬帶基片，而探針液滴沉積在貫穿帶的一條線上(如圖6d的區(qū)域628中所示出的)。在探針沉積之后切割這條寬帶，從而產(chǎn)生相同探針載體細線100的許多拷貝(如圖1所示)。另外，還顯著增加了產(chǎn)量。這兩個系統(tǒng)設(shè)計因此適合于在專門的中心微陣列制造廠進行大批量生產(chǎn)。在本發(fā)明的一個系統(tǒng)中，細線上的探針之間的間隔和儲存器(以及點樣器)之間的間隔分別為100μm和5mm。假設(shè)細線基片以1cm/s的速度移動，則儲存器和點樣器陣列以50cm/s的速度移動(這是易于做到的)。而且，在載體帶618被分成20個細線基片的情形中，上述兩個系統(tǒng)設(shè)計每7.5秒應該能夠制造出150,000個探針陣列。
2.4點樣器矩陣圖7示出了第四種制造系統(tǒng)設(shè)計，該系統(tǒng)具有更大的靈活性并且特別適合于小規(guī)模探針載體的定制。圖7a是系統(tǒng)的俯視圖，而圖7b是系統(tǒng)的前視圖。在此處，探針儲藏在標準的微滴定板或類似的矩陣容器700內(nèi)。一個匹配點樣器矩陣702與板上的孔矩陣具有相同的間隔。與常規(guī)的點樣針不同，正如在前一系統(tǒng)中所用的那樣，每個點樣器都是薄的柔性親水纖維704。點樣器矩陣首先浸漬到孔矩陣內(nèi)，然后移動以與探針載體帶形基片706交叉，其中探針載體帶形基底706暫時保持靜止狀態(tài)。點樣器移動的方向與探針載體帶形基片706垂直，但是矩陣排的方向以小角度α傾斜。每個點樣纖維將產(chǎn)生貫穿探針載體帶形基片706的分離的線708(參見放大圖)，此處α＝arc.sin[LC/(C+1)LR] (1)其中LC和LR分別是點樣器矩陣的列和行內(nèi)的纖維間距，而C是點樣器矩陣中的列的數(shù)目。
點樣器矩陣陣列在清洗區(qū)710進行洗滌和清洗并且在干燥站712進行干燥。同時，探針載體帶形基片706前進到一個新的部分并承載新的孔矩陣712，以便準備下一個“浸漬和點樣”循環(huán)。在這種設(shè)計中，探針載體帶形基片706上的探針之間的間距由LC/(R+1)給出，并且大約為250μm。當以259um的探針間距承載10,000種探針的探針載體帶形基片706有2.5米長時(其可纏繞到直徑小于3cm的一個卷筒內(nèi))，這樣的密度對于較小規(guī)模的定制陣列是有用的。
3.探針載體的包裝探針載體細線平臺的柔性使所制造的探針載體細線可被包裝成各種不同形式，這些形式包括(但不限于)探針載體針、探針載體棒、探針載體旋管和探針載體卷筒。探針載體細線基片的優(yōu)良強度、精度和柔性對于探針載體細線制造和讀取過程中所要求的精確的探針定位和傳送是理想的。假設(shè)探針的間距和細線厚度都是100μm，則沿15米的細線可容納整個人類基因組(約150,000個基因)，而該細線可纏繞成1.5cm高、3cm直徑的立體旋管或者0.1mm厚、直徑小于4cm的卷筒。于是，對于較大探針的成型而言探針載體細線包裝是優(yōu)選的。以下描述了包裝探針載體細線和帶的幾種方式。
3.1探針載體針和探針載體棒如圖8所示，通過圍繞長條狀支撐件804(例如固相圓筒或管)立體纏繞一定長度的所制造的探針載體細線100，可制成探針載體針810和探針載體棒820。緊緊纏繞的細線100并排806位于支撐圓筒804外表面的一部分802上，并通過膠結(jié)劑、粘合劑或其它方式永久地附著到其上。為了控制雜交，在纏繞過程之前用導電材料涂布圓筒804。探針110位于探針載體細線100的一側(cè)上，該側(cè)遠離探針載體細線100的與支撐件804接觸的那一側(cè)。
正如以前所討論的，探針載體針810與探針載體棒820之間的差別是相對尺寸和形狀。探針載體針810通常具有小于10mm的直徑，而探針載體棒820更大些并因此容納更多的探針。例如，1.5米長、50μm直徑的細線在纏繞到直徑為5mm的針810上之后只占據(jù)5mm這么短的部分，但是卻大約可承載15,000種探針(假設(shè)沿細線100的探針間距為100μm)。另一方面，30mm寬、40mm直徑的探針載體棒820沿70米長、50μm直徑的細線100可容納700k的探針。在一實施方案中，柔性探針載體可以是承載以二維陣列固定的探針的帶形基片。例如在圖3和4中表示出這種陣列的制造。這種柔性探針載體帶可以圍繞針810或棒820進行盤繞，而不是纏繞探針載體細線100。
可以高產(chǎn)量地有效生產(chǎn)上述的探針載體針810和探針載體棒820。如圖9所示，在細線制造過程中以及將細線或帶放到支撐圓筒上之前，在沿探針載體細線或帶100的任何兩組探針之間插入一定長度的“空”間距904。然后沿長的支撐圓筒804連續(xù)纏繞探針載體細線100。在某些位置用環(huán)氧或其它粘合劑預先涂布圓筒804，以便粘附承載探針110的部分探針載體細線100。在環(huán)氧凝固之后，以適當?shù)拈g隔切割其上具有細線100的長圓筒804，從而產(chǎn)生多個具有探針載體細線100的探針載體針810或探針載體棒820，其中細線100附著有探針100并圍繞圓筒纏繞，而且在圓筒的某一部分902上。因為未用環(huán)氧預先涂布空白細線所附著的支撐圓筒804的904部分，所以在切割之后該空白細線將松開并從該圓筒斷開，由此使原始支撐圓筒的904部分暴露出來，該部分在雜交過程中可用于裝配入適配器中。
3.2 探針載體旋管在圖10示出的探針載體旋管中，將所制造的探針載體細線100纏繞成平的盤形旋管1012。圖10a示出了探針載體旋管1012組件的俯視圖，而圖10b示出了該組件的側(cè)視圖。細線100上的探針110暴露在盤1012的一側(cè)，而另一側(cè)通過環(huán)氧、粘合劑或其它適當?shù)姆绞接谰玫馗街焦滔嗥矫嬷伪P1010上。注意，在圖10c(該圖是探針載體旋管1012的截面1000的放大圖)中，探針110沉積在探針載體細線100表面上的凹槽202內(nèi)。該特性在這種包裝形式中是任選的。用導電層預先覆蓋平面支撐體1010，以便易于控制雜交，這將在以下詳細討論。假設(shè)細線的直徑為50μm，則直徑為40mm的探針載體旋管1012可容納承載240,000種探針的高達24米的細線。
3.3探針載體卷筒探針載體卷筒1110的結(jié)構(gòu)非常類似于探針載體旋管的結(jié)構(gòu)。然而，與探針載體旋管1012不同的是，探針載體細線100不會永久附著到支撐表面1010上，由此為了雜交、讀取和其它目的，使細線從圓筒展開(雖然細線的端部可附著到基片上)。另外，如圖11b所示，由于細線100的每一圈在卷筒1110內(nèi)都堆積在彼此的頂部，因此可以設(shè)計探針載體細線100的截面形狀，以避免DNA探針與相鄰圈的細線發(fā)生摩擦?？梢赃x擇用來生產(chǎn)探針載體細線100的基片的截面，以便纖維200具有凹槽或溝槽202(探針110固定在其內(nèi))。這種設(shè)計避免一層探針與后序?qū)拥幕l(fā)生摩擦。而且，如圖11a所示，可以制備盒1100，以保護卷筒1110并使其易于纏繞和展開。另外，多個卷筒1110可堆積在一個盒1100內(nèi)。
4.雜交本發(fā)明的裝置的用途包括1)制備樣品；2)形成探針-樣品復合物；以及3)分析結(jié)合模式，以便鑒定樣品所結(jié)合的各種探針。
樣品的制備隨著樣品種類的不同而不同。用于分析多核苷酸的樣品制備方案包括用熒光標志標記樣品，以便易于進行步驟3)，即分析結(jié)合模式，該制備方案在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。參見例如，US專利號5,800,992，該文獻在此作為參考全部并入本文。在為多核苷酸的情況下，利用公知技術(shù)(例如限制性內(nèi)切酶消化法)使樣品片斷化，然后將其轉(zhuǎn)化為單鏈形式并且用適當?shù)臒晒鈽酥緲擞浽搯捂溒巍?br> 當樣品與該裝置接觸時，對特定探針具有親和力的樣品或樣品片段與那些探針結(jié)合。本發(fā)明的微陣列通常利用DNA的互補鏈的雜交作為結(jié)合方法。DNA的雜交很大程度上取決于雜交條件，這些條件已經(jīng)得到廣泛的研究和描述(參見例如，US專利號6,054,270和5,700,637，這兩篇文獻在此作為參考全部并入本文)。
然而，本發(fā)明還包括任何類型的樣品-探針結(jié)合，該結(jié)合使得可從測定已經(jīng)與樣品或樣品片段結(jié)合的探針中得到信息。這些例子包括通過分別利用不同的抗體或抗原作為探針而測定樣品中抗原或抗體的特性，或者利用與激素結(jié)合的受體來鑒定樣品中的激素等。對樣品/探針對的列表可擴大到任何配對組，這些配對組能夠以足以進行鑒定的親和力和特異性彼此互相結(jié)合，而且樣品/探針對的例子對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說也是顯而易見的。
核酸的雜交通常包括以高度特異性檢測大量非靶核酸中的少數(shù)靶核酸(DNA和RNA)。嚴格的雜交條件是保持所需程度的特異性所必需的，并且諸如鹽、溫度、溶劑、變性劑和去污劑這些試劑與條件的多種組合可用于此目的。業(yè)已在各種形式的固相支持體上進行核酸的雜交(參見例如，Beltz，G.A.等人的“酶學方法”(Methods in Enzymology)，100卷，B部分，19266-308，Academic Press，NY(1985))。
最近對DNA微陣列技術(shù)的開發(fā)使得在一個固相支持體上進行多種靶分子的大規(guī)模測定成為可能。通常，包括寡核苷酸陣列的DNA芯片由許多以規(guī)則的模式與固相支持體相連的單個寡核苷酸組成，從而每種寡核苷酸都位于已知的部位上。陣列產(chǎn)生以后，將含有靶序列的樣品暴露到陣列中，并與陣列上所結(jié)合的互補寡核苷酸雜交，然后利用各種方法、最常用的是放射性或熒光標記物進行檢測。US專利號5,837,832(Chee等人)以及相關(guān)的專利申請中都描述了固定用于雜交的寡核苷酸探針陣列，以及檢測樣品中的特異性核酸序列。
本發(fā)明還提供了一些專門設(shè)計的用于基于微陣列的探針載體細線雜交的設(shè)備。在現(xiàn)存系統(tǒng)中，通過自然擴散或強制液體循環(huán)來實現(xiàn)雜交。裝置形式較慢并且隨后的系統(tǒng)制造起來較復雜。在本發(fā)明的一個實施方案中，雜交室的設(shè)計可確保在探針載體細線或其包裝形式與雜交室內(nèi)壁之間只有一非常薄的靶流層。以這種方式，雜交只需非常少量的靶液，從而改善了探針分子與靶分子之間的接觸。由此通過例如使探針載體細線100或其包裝形式穿過靶流移動而使雜交加速。
另外，通過在探針載體細線的支持體與雜交室內(nèi)壁之間施加一個電壓，還可控制雜交過程。在該過程中，通過加入陽離子、體積排阻和離液劑，也可使雜交加速。當一個陣列包括幾千個地址時，重要的是，正確連接的產(chǎn)物序列有與適當?shù)刂冯s交的機會。通過使寡核苷酸在所用的高溫下進行熱運動，或者通過使與陣列表面接觸的流體進行機械運動，或者通過利用電場使寡核苷酸穿過陣列移動，可實現(xiàn)這一點。雜交之后，用低嚴格性洗滌緩沖液和高嚴格性洗滌緩沖液依次洗滌陣列。
如圖12所示，當探針載體細線100具有正極時，靶液中的DNA分子被引向探針載體細線100，在細線表面附近產(chǎn)生暫時的局部濃度，從而使雜交增強。如果極性相反，則電場將排斥不相配的核酸分子使之遠離探針110，而雜交探針保留其靶分子，由此使雜交的特異性增大。因此，可以在探針載體細線100或其支持體1200與雜交室壁1210之間施加AC振蕩電壓1220，以改善該過程的效率。支持體1200和雜交室壁1210具有導電涂層1212，以便使該過程易于進行。如下所述，所有的探針載體細線形式還可以在雜交過程中轉(zhuǎn)動，從而增大了攪拌和混合并由此使探針與靶分子之間的接觸改善?？梢岳盟⒆拥幕h(huán)在移動電極上傳導電壓。這種電滑環(huán)的設(shè)計在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。
如圖13所示，通過將探針載體針810直接塞入含有靶液1310的孔1300內(nèi)，可使探針載體針810雜交?？?300的直徑僅僅稍稍大于探針載體針810的外徑。由于在探針載體針810與液孔1300的內(nèi)壁之間只有一層非常薄的靶液1310，因此所需的靶液最少。例如，假設(shè)孔的直徑為8mm，探針載體針的直徑只有50μm，纏繞的截面有5mm高，則3μl的靶液就足以覆蓋探針載體針的整個有效截面。探針載體針可進行上下移動1330或前后1332轉(zhuǎn)動，或者這兩種運動的組合，以便增大雜交速度。因為探針載體針810、探針載體棒820和探針載體旋管1012上的螺旋纏繞模式，所以轉(zhuǎn)動運動不僅沿包裝的圓環(huán)方向而且沿包裝的軸向或徑向方向來驅(qū)動靶液。它在由探針載體細線100覆蓋的整個表面區(qū)域上有效地移動靶液中的分子。
可以將多個探針載體針810塞入適配器1400內(nèi)，以便形成與空間螺距和標準微滴定板1420的模式匹配的矩陣。以這種方式，可通過以下步驟在標準微滴定板1420內(nèi)直接平行完成多個雜交過程首先將每個探針載體針810浸漬到標準微滴定板1420的相應孔1410內(nèi)(如圖4所示)，然后任意上下移動適配板或者轉(zhuǎn)動各個探針載體針。
探針載體棒820可以在與探針載體針類似的但較大雜交室內(nèi)進行雜交?；蛘呤?，采用圖15所示的雜交室設(shè)計1500。轉(zhuǎn)動探針載體棒820到1520處以便使靶液1510在探針之上移動。因為探針載體棒820上的探針載體細線100的螺旋纏繞模式，所以靶液1510不僅沿棒820的圓環(huán)方向而且還沿其軸向方向移動，由此覆蓋探針載體棒820上的所有探針部位。在探針載體細線100與雜交室壁1500之間施加AC振蕩電壓1530，以便改善該過程的效率。
探針載體旋管1012的雜交室設(shè)計1600如圖16所示，通過機械驅(qū)動或磁驅(qū)動將前后轉(zhuǎn)動1620引入到該旋管中，并且在旋管支持體與室之間施加AC振蕩電壓變換1630，以增強雜交效率。
圖17a示出了用于從探針載體轉(zhuǎn)筒1110上展開的探針載體細線100雜交的室設(shè)計1700，其中通過將蓋1770蓋在基片1780上的窄槽上，形成基本上不透水的毛細管1760。槽的截面尺寸稍稍大于探針載體細線(如圖17b所示)。在蓋上蓋之前將靶液1750引入槽的中間部分，或者在將蓋蓋到槽上之后使靶液通過蓋上的小開口1790引入。使探針載體細線100通過雜交室前后移動，以增強雜交效率。由于細線是疏水性的，因此通過毛細管力將靶液保留在槽內(nèi)。再者，通過在探針載體細線100上的金屬層與雜交室1700的毛細管1760內(nèi)壁之間施加交流電壓1730，可進一步改善雜交效率。
5.讀取儀利用具有激光或?qū)拵Ъぐl(fā)的掃描顯微鏡可讀取上述的所有探針載體細線包裝。利用掃描電子顯微鏡、共聚焦顯微鏡、電荷耦合裝置、掃描隧道電子顯微鏡、紅外顯微鏡、原子力顯微鏡、電導以及熒光或磷成像，可完成掃描。然而，在用于不同探針載體細線形式的讀取儀器中，優(yōu)選提供特殊的掃描運動。
正如圖18中所示意性示出的，將探針載體針810和探針載體棒820都可插入讀取儀的適配器中，該儀器設(shè)計為可固定針或棒的端部并以預定的速率沿縱軸轉(zhuǎn)動1810和/或移動1812。該運動使得所有探針沿光學激發(fā)和讀取透鏡1800下面的探針載體細線100分布?；蛘呤?，探針載體針810或探針載體棒820可轉(zhuǎn)動1810，而光學頭1800沿針或棒的軸移動，以便掃描固定在探針載體針810或探針載體棒820上的探針載體細線100的長度。
同樣，如圖19所示，通過引入旋管1012的轉(zhuǎn)動1910和沿旋管的徑向方向在旋管1012與光學讀取頭1900之間的相對移動(1912運動)，可掃描探針載體旋管1012。
在圖20所示的探針載體轉(zhuǎn)筒掃描器中，包含在盒1100內(nèi)的探針載體卷筒1110使在光學讀取頭2002和標記物讀取儀2004之下經(jīng)過的一段未纏繞的探針載體細線100展開。這個未纏繞的探針載體細線100承載在光學讀取頭2002之下移動的所有探針組并能夠保持靜止?？梢詫⒃撐蠢p繞的探針載體細線100收集到第二卷筒2012內(nèi)。
6.探針載體的使用方法該裝置使其適用于許多領(lǐng)域。利用多核苷酸作為探針的裝置可用于已知點的突變分析、基因組指紋分析、連鎖分析、mRNAs和mRNA群體的鑒定、序列測定、疾病診斷以及多態(tài)性分析。利用抗體作為探針的裝置在診斷中是特別有用的。與其它探針有關(guān)的其它用途對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
這些裝置的用途包括1)制備樣品(如果必要的話)；2)形成探針-樣品復合物；3)分析結(jié)合模式以便鑒定結(jié)合有樣品的各種探針。
6.1.樣品的制備樣品的制備隨著樣品種類的不同而不同。用于多核苷酸分析的樣品制備方案包括用熒光標志標記樣品以便易于進行步驟3)即分析結(jié)合模式，并且該方案在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(參見例如，US專利號5,800,992，該文獻在此作為參考全部并入本文)。在多核苷酸的情形中，利用已知技術(shù)例如限制性內(nèi)切酶消化法使樣品片段化，再使其傳化為單鏈形式，并且用適當?shù)臒晒鈽酥緲擞浽搯捂溒巍?br> 6.2.探針-樣品復合物的形成當樣品與裝置接觸時，對特定探針具有親和力的樣品或樣品片段與那些探針結(jié)合。目前的微陣列一般利用DNA的互補鏈的雜交作為結(jié)合方法。DNA的雜交很大程度上取決于雜交條件，這些條件已經(jīng)得到廣泛的研究和描述(參見例如，US專利號6,054,270和5,700,637，這兩篇文獻在此作為參考全部并入本文)。
然而，本發(fā)明還包括任何類型的樣品-探針結(jié)合，該結(jié)合使得從確定何種探針已經(jīng)與樣品或樣品片段結(jié)合中得到信息。僅僅作為一個例子，樣品可包括許多種分子，其中一些是酶。用來分析該樣品的裝置的探針是多種酶的底物(此處，“底物”一詞的意思是，酶作為催化劑起作用時的反應物)，并且通過確定何種底物-探針在接觸后與酶結(jié)合來獲得樣品中酶的特性。其它例子包括通過利用不同的抗原作為探針來確定樣品中抗體的特性，或者利用與激素結(jié)合的受體來鑒定樣品中的激素等。樣品/探針對目錄表可擴大到任何配對組，這些配對能夠以足以進行鑒定的親和力和特異性彼此互相結(jié)合，而且樣品/探針對的例子對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說也是顯而易見的。
本發(fā)明一方面能夠大大增強帶電樣品的結(jié)合。該性能是在基片上施加電壓的結(jié)果，其中基片含有金屬元件或者是導電的。例如，如果DNA是待分析樣品，那么穿過基片的振蕩電壓將交替地吸引帶負電荷的DNA到探針載體上，然后再排斥它。吸引使互補鏈易于結(jié)合，而排斥期間將有利于非特異性結(jié)合或不完全雜交樣品的釋放。相同的原理適用于任何種類的帶電樣品，并且增大了樣品結(jié)合的效率和保真度。
6.3結(jié)合模式的分析在結(jié)合模式的分析中一般有兩個步驟定位已經(jīng)結(jié)合樣品的探針，以及對那些探針進行鑒定。可能的是，如果特定樣品與其相應探針的結(jié)合產(chǎn)生對于該樣品/探針對來說是獨一的變化，那么對于特定的樣品/探針對，這兩個步驟可減為一個。
可以利用允許定位的任何方式將探針-樣品對與未結(jié)合樣品的探針區(qū)分開來。許多這樣的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)都是公知的。例如，利用檢測所用的標記物類型的標準方法，可進行標記的樣品多核苷酸的檢測。于是，例如可直接檢測熒光標記物或放射性標記物。其它標記技術(shù)要求標記物(例如生物素或洋地黃毒甙)是在樣品的制備過程中摻入樣品中的，并且利用抗體或者其它結(jié)合分子(例如鏈親和素)來檢測該標記物，其中所述結(jié)合分子是被標記的或者自身可與標記分子結(jié)合，例如標記分子可為與熒光分子(例如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅和羅丹明)結(jié)合或者與酶活性分子結(jié)合的抗-鏈親和素抗體或抗-洋地黃毒甙抗體。無論新合成分子上的標記物是什么，以及無論標記物是直接在樣品內(nèi)還是連接在與樣品結(jié)合的分子上(或者結(jié)合與樣品結(jié)合的分子)，這些標記物(例如熒光的、酶的、化學發(fā)光的或比色的)都可用激光掃描儀或CCD攝像機或X射線膠片(取決于標記物)或用于檢測特定標記物的其它適宜裝置來檢測。例如，在用于基因分析的多核苷酸微陣列的大部分應用中，將樣品多核苷酸片段化，然后用熒光標記物標記每一樣品片段。與探針多核苷酸陣列接觸之后，利用樣品上的熒光標志定位已經(jīng)與互補探針多核苷酸雜交的樣品片段。沒有結(jié)合樣品片段的探針就沒有這樣的熒光標記物?？蓪ζ渌愋偷姆肿永缈贵w、酶等進行類似的熒光標記。其它類型的標志例如放射性標記物、化學發(fā)光標記物、磷光標記物、磁標記物等對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
對于檢測結(jié)合有樣品的探針，光檢測方式是優(yōu)選的，雖然也可以采用其它檢測方法例如放射性方法、原子光譜法等。對于光檢測方式，可以采用熒光法、磷光法、吸收法、化學發(fā)光法等。最便利的是熒光法，其可以有許多形式?？梢岳脝为毜臒晒鈩┗蛘叱蓪Φ臒晒鈩?，特別是在希望具有多個發(fā)射波長(具有大的斯托克斯漂移(至少20nm))時。所例舉的熒光劑包括熒光素、羅丹明、德克薩斯紅、花菁、藻紅素、噻唑橙和藍等等。當使用成對染料時，可以在一種分子上使用一種染料，而在與第一種分子結(jié)合的另一種分子上使用另一種染料。重要的因素是，當兩種成分結(jié)合時這兩種染料靠得足夠近，足以進行有效的能量傳輸。
本發(fā)明提供了使分析中的第二步驟(即鑒定結(jié)合有樣品或樣品片段的特異性探針的步驟)流水線化并擴大的機會。在常規(guī)的探針微陣列中(例如多核苷酸陣列)，通過確定探針在陣列中的x-y位置可鑒定探針；每種探針的x-y位置是已知的。利用公知技術(shù)確定探針的位置需要復雜和昂貴的成像設(shè)備。因為本發(fā)明的探針是以一維行列排列的，所以位置分析要容易得多并且不需要復雜的設(shè)備，這是因為僅僅有一維(而不是二維)需要跟蹤(如同在被卷繞的細線中)。
在本發(fā)明的任何實施方案中，使用與探針或探針組相聯(lián)的標記物提供了掌握探針線索的方式。這一點在前面已經(jīng)討論過。標記物可以是簡單的或復雜的，可以與探針在基片的同一側(cè)或不同側(cè)，可以多于一種類型，可以含有更多的，而非僅僅含有該探針或多種探針特性的信息。
本發(fā)明的探針載體可用來構(gòu)建以最小體積包裝的非常大的探針陣列，這些陣列隨后與靶核酸雜交。芯片的雜交模式的分析提供了靶核苷酸序列的立即指紋鑒定結(jié)果?？梢詫δＪ竭M行人工或計算機分析，但是顯然，由雜交進行的位置測序適合于計算機分析和自動化。已經(jīng)開發(fā)出可應用于本文所述方法中的序列重建的算法和軟件(R.Drmanac等人，J.Biomol.Struc.& Dyn.51085-1102，1991；P.A.Pevzner，J.Biom0l.Struc.& Dyn.763-73，1989，它們在此專門引用作為參考)。
按照本發(fā)明制備的含有固定化核酸序列的柔性探針載體可用于許多基因應用中的大規(guī)模雜交分析，這些分析包括已知點的突變分析、基因組指紋分析、連鎖分析、mRNAs和mRNA群體的鑒定、序列測定、疾病診斷以及多態(tài)性分析。利用抗體作為探針的裝置在診斷中是特別有用的。與其它探針有關(guān)的其它用途對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
對于基因作圖，將基因或克隆DNA片段與DNA片段的一個有序陣列雜交，并且通過被檢測陣列的象素或象素模式而明確確定施加到陣列上的DNA特性。Nelson等人的“自然遺傳學(Nature Genetics)”，411-18(1993)中描述了此類用于產(chǎn)生基因圖的陣列的一種應用。在構(gòu)建基因組的物理圖譜時，使固定化的克隆DNA片段陣列與其它的克隆DNA片段雜交，以便確定探針混合物中的克隆片段是否重疊并因此鄰接陣列上的固定化克隆。例如，基因組分析，I卷基因圖譜和物理圖譜(Genome Analysis，vol.IGenetic and Physical Mapping.)(K.E.Davies和S.M.Tilghman編輯)冷泉港實驗室出版社，39-81頁Lehrach等人的“基因組作圖和測序中的雜交指紋分析”(1990)描述了這種過程。
固定化DNA片段的柔性探針載體還可用于遺傳診斷。為了說明起見，可以用病人的DNA的標記混合物來探測含有多種形式的一個突變基因或多個基因的探針載體，而病人的DNA標記混合物只與基因的固定形式之一相互作用。這種相互作用的檢測可導致醫(yī)學診斷結(jié)果。而且，某些基因的表達水平的檢測可診斷某些醫(yī)學疾病。例如，在大約25％的早期乳腺癌中可擴增出導致p185HER-2生長因子受體過度表達的HER-2/neu(c-erbB-2)基因。已確定HER-2/neu為一大群病人和具有非常長(30年)的隨訪期的群體中早期乳腺癌的一個重要的獨立預后因素。新的數(shù)據(jù)已開始暗示，HER-2/neu不僅可以用作預后因素，而且還可用作預見性HER-2/neu單克隆抗體。HER-2/neu編碼185kD跨膜癌基因蛋白，該基因在一些乳腺癌病人中被擴增和/或過表達，與無HER-2/neu擴增的婦女相比它是通常與較差預后相關(guān)的一個特性。雖然對該基因座已經(jīng)研究了許多年，但是與最常用的方法(Southern印跡法和免疫組織化學染色法)相關(guān)的技術(shù)問題業(yè)已導致數(shù)據(jù)有一些不一致。Pegram M.D.等人的“HER-2/neu作為響應乳腺癌治療的預見性標志物”，乳腺癌研究與治療BreastCancer Research and Treatment 52(1-3)65-77，1998。由本發(fā)明獲得的多個樣品的快速處理使得可以快速測試多個對照組，從而避免了數(shù)據(jù)的不一致。
7.探針載體的應用固定化DNA片段的柔性探針載體還可用于DNA探針的診斷。例如，通過使未知病原體的DNA樣品與含有許多種類的已知病原體DNA的探針載體進行雜交，可以明確鑒定病原體微生物的特性。類似的技術(shù)還可用于任何有機體的明確基因分型。有遺傳興趣的其它分子例如cDNAs和RNAs可以固定到探針載體上或者另外地用作施加到探針載體上的被標記探針的混合物。
在一種應用中，代表多個基因的cDNA克隆的探針載體與來自有機體的總cDNA進行雜交，以便為了研究和診斷目的而監(jiān)測基因表達。用一種有色熒光團標記來自正常細胞的總cDNA，而用另一種有色熒光團標記來自病理細胞的總cDNA，然后將這兩種cDNA樣品同時雜交到相同的cDNA克隆陣列上，使得可以這兩種熒光團強度之比來測定差異基因表達。該雙色實驗可用來監(jiān)測不同組織類型、疾病狀態(tài)、對藥物的反應或?qū)Νh(huán)境因素的反應中的基因表達。
這種方法僅僅作為舉例而并不是對本發(fā)明范圍的限制，它可用來針對疾病基因中的所有已知突變同時篩選許多病人。本發(fā)明可以例如一個矩陣內(nèi)的96個相同探針載體針的形式來使用，其中每一探針載體針都含有例如代表給定基因的所有已知突變的1500個DNA片段。可對來自96位病人的每一DNA樣品的感興趣的區(qū)域擴增、標記并雜交到96個單獨的陣列中，并且每一測定都是在10微升的雜交液中進行的。將該銜接矩陣作為一片材料來孵育、漂洗并利用標準的放射性、熒光或比色檢測裝置檢測和分析(Maniatis等人，1989)，其中所述銜接矩陣含有用96位病人的樣品測定的全部96個相同的探針載體針。以前，這樣的方法包括在96個分離的密封室內(nèi)對96個分離的膜進行操縱、處理和示蹤。通過用最少的雜交液在一個步驟中處理全部96個病人的樣品，可明顯地節(jié)省時間和成本。
該測定方式可反轉(zhuǎn)，其中將病人或有機體的DNA作為探針成分來固定，并且每一探針載體與不同的突變等位基因或遺傳標志物進行雜交。還可用探針載體矩陣來進行平行的非DNA ELISA測定。而且，本發(fā)明可采用所有的標準檢測方法。
本發(fā)明一方面包括利用偶聯(lián)的連接酶檢測反應(LDR)和聚合酶鏈反應(PCR)來檢測核酸序列差異(正如Baranyi等人的題為“利用偶聯(lián)的連接酶檢測反應和聚合酶鏈反應來檢測核酸序列差異”的US專利號6,027,889中所公開的，該文獻在此作為參考全部并入本文)。
除了上述所列的基因應用以外，利用本發(fā)明所述的裝置可以制造所有細胞、肽、酶、抗體、抗原、受體、配體、磷脂、聚合物、藥物制品或化學物質(zhì)陣列，以便醫(yī)學診斷、藥物探索、分子生物學、免疫學和毒理學中的大規(guī)模篩選測定。
本說明書中所提到的所有出版物和專利申請都可以相同程度作為參考并入本文，盡管每一種獨立的出版物或?qū)＠暾埗紝ｉT和單獨指出是作為參考引用的。
雖然為了清楚和理解起見，已經(jīng)借助闡述和舉例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行了描述，但是這并不意味著將本發(fā)明窮舉或限定為所公開的這些確切形式。在不脫離本發(fā)明精髓的情況下所作出的許多改變和變型，都是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的教導下容易實現(xiàn)的。因此本發(fā)明的范圍只由后面所附的權(quán)利要求書及其等同物來限定。
權(quán)利要求
1.一種用探針特異性鑒定樣品的裝置，其包括具有第一基片表面、一定長度和寬度的柔性長條狀基片；以及固定在基片表面的含有探針部分的獨立區(qū)域上的多種不同探針，每一個所述獨立區(qū)域含有一種探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中所述裝置還包括傳送有關(guān)第一組所述探針的信息的第一標記物和傳送有關(guān)第二組所述探針的信息的第二標記物。
3.一種用探針特異性鑒定樣品的裝置，包括基片；固定在基片表面的含有探針部分的獨立區(qū)域上的多種不同探針，每一個所述獨立區(qū)域含有一種探針；以及傳送有關(guān)第一組所述探針的信息的第一標記物和傳送有關(guān)第二組所述探針的信息的第二標記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的裝置，其中基片和探針封裝在一個容器內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項的裝置，其中第一和第二標記物是磁性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項的裝置，其中第一標記物是磁性的，而第二標記物是一種光學標記物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的裝置，其中第一和第二標記物是光學標記物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的裝置，其中所述光學標記物是光學條形碼。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的裝置，其中所述光學標記物為熒光的。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項所述的裝置，其被構(gòu)造為承載探針的帶形裝置，其中所述基片包括厚度不超過500微米、具有一表面的柔性帶形基片；且其中所述多種不同的探針固定在基片表面的含有探針部分的獨立區(qū)域上，每一個所述獨立區(qū)域含有一種探針。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的裝置，其中帶形基片的厚度不超過100微米。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的裝置，其中帶形基片的厚度不超過20微米。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項的裝置，其被構(gòu)造為承載探針的纖維裝置，其中所述基片包括具有長度、直徑和一個表面的柔性纖維基片，該直徑不超過500微米；且其中所述多種不同的探針固定在基片表面的含有探針部分的獨立區(qū)域上，每一個所述獨立區(qū)域含有一種探針。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的承載探針的纖維，其中纖維基片的直徑不超過200微米。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的承載探針的纖維，其中纖維基片的直徑不超過100微米。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的承載探針的纖維，其中纖維基片的直徑不超過20微米。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求1-16中任意一項所述的裝置，其中所述裝置包含探針的線性一維排列，其中所述多種探針固定在基片的表面上并以每線性厘米超過50種探針的線性密度排列在一個單一行列中。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的裝置，其中排列在基片上的所述單一行列中的探針的線性密度超過100種探針/線性厘米。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的裝置，其中排列在基片上的所述單一行列中的探針的線性密度超過200種探針/線性厘米。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的裝置，其中排列在基片上的所述單一行列中的探針的線性密度超過500種探針/線性厘米。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求1-20中任意一項所述的裝置，其中該裝置還包括基片表面上的第一層；以及其中所述多種不同的探針固定在所述第一層表面的含有探針的部分上，所述含有探針的部分具有一定的長度和寬度，以至于使含有探針部分的長度與含有探針部分的寬度的比例超過5∶1。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的裝置，其中所述第一層包括硅石。
23.根據(jù)權(quán)利要求21-22中任意一項的裝置，其還包括在所述第一層與所述基片之間的第二層。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的裝置，其中所述第二層包括一種金屬材料。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的裝置，其中所述第二層是可磁化的。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求1-25中任意一項的裝置，其中基片包括一種選自石英玻璃、塑料材料、聚合材料和金屬材料的材料。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的裝置，其中基片包括光學纖維。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的裝置，其中基片包括所述的石英玻璃。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的裝置，其中基片包括所述的金屬材料。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的裝置，其中金屬基片是可磁化的。
31.根據(jù)權(quán)利要求26的裝置，其中基片包括所述的聚合材料。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的裝置，其中聚合材料選自聚酰亞胺和聚四氟乙烯(PTFE)。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求1-32中任意一項的裝置，其中含有一種探針的每一獨立區(qū)域具有不超過1000微米的長度。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的裝置，其中含有一種探針的每一獨立區(qū)域的所述長度不超過500微米。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的裝置，其中含有一種探針的每一獨立區(qū)域的所述長度不超過100微米。
36.根據(jù)權(quán)利要求33的裝置，其中含有一種探針的每一獨立區(qū)域的所述長度不超過50微米。
37.根據(jù)權(quán)利要求33的裝置，其中含有一種探針的每一獨立區(qū)域的所述長度不超過20微米。
38.一種根據(jù)權(quán)利要求1-37中任意一項的裝置，其中基片的長度與寬度的比例超過5∶1。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的裝置，其中基片的長度與寬度的比例超過100∶1。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的裝置，其中基片的長度與寬度的比例超過10,000∶1。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的裝置，其中基片的長度與寬度的比例超過100,000∶1。
42.一種根據(jù)權(quán)利要求1-41中任意一項的裝置，其中探針包括多核苷酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的裝置，其中多核苷酸包括DNA。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的裝置，其中DNA包括單鏈DNA。
45.一種根據(jù)權(quán)利要求1-41中任意一項的裝置，其中探針包括多肽。
46.一種根據(jù)權(quán)利要求1-41中任意一項的裝置，其中探針包括抗體。
47.一種根據(jù)權(quán)利要求1-41中任意一項的裝置，其中探針包括配體。
48.一種根據(jù)權(quán)利要求1-41中任意一項的裝置，其中探針選自細胞表面受體、寡糖、多糖和脂質(zhì)。
49.一種根據(jù)權(quán)利要求1-48中任意一項的裝置，其中探針是作為點的線性結(jié)構(gòu)排列的。
50.一種根據(jù)權(quán)利要求1-48中任意一項的裝置，其中探針是作為條的線性結(jié)構(gòu)排列的，所述條與基片的長軸呈一個角度。
51.一種根據(jù)權(quán)利要求1-50中任意一項的裝置，其中基片自身纏繞成一個螺管。
52.一種根據(jù)權(quán)利要求51的裝置，其中基片自身纏繞成一個平螺管。
53.一種根據(jù)權(quán)利要求51-52中任意一項的裝置，其中還包括基片螺管中心所附著的第一卷筒。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的裝置，其還包括第二卷筒，其中基片的最外端從螺管延伸出來，并且其中基片的最外端附著到第二卷筒上。
55.一種根據(jù)權(quán)利要求51-52中任意一項的裝置，其還包括基片所附著的平坦襯底。
56.一種根據(jù)權(quán)利要求1-51中任意一項的裝置，且其還包括第一轉(zhuǎn)鼓，其中基片圍繞所述轉(zhuǎn)鼓纏繞并附著到其上。
57.一種根據(jù)權(quán)利要求1-52中任意一項的裝置，且其還包括多個轉(zhuǎn)鼓，其中基片部分圍繞所述轉(zhuǎn)鼓纏繞并附著到其上，而且固定在所述基片部分的含有探針區(qū)段上的探針在基片的不同部分可以相同或者不同。
58.一種使靶分子結(jié)合到固定化探針上的裝置，其包括盤旋的柔性探針載體；以及固定在探針載體表面上的多種探針。
59.一種根據(jù)權(quán)利要求58的裝置，其中所述盤旋的柔性探針載體是一平螺管。
60.一種根據(jù)權(quán)利要求58-59中任意一項的裝置，其中所述探針載體包括柔性帶形基片。
61.一種根據(jù)權(quán)利要求60的裝置，其中所述柔性帶形基片承載二維探針陣列。
62.一種根據(jù)權(quán)利要求58-59中任意一項的裝置，其中所述探針載體包括柔性細線基片。
63.一種根據(jù)權(quán)利要求62的裝置，其中所述柔性細線基片承載一維探針陣列。
64.一種根據(jù)權(quán)利要求62-63中任意一項的裝置，其中柔性細線基片的截面形狀為D形，并且多種探針封固在細線基片表面上的凹槽內(nèi)，從而使多種探針免受盤旋的柔性探針載體的相鄰線圈之間的摩擦力。
65.一種根據(jù)權(quán)利要求58-64中任意一項的裝置，其中柔性探針載體包括與一個或多個不承載探針的空白部分交替存在的一個或多個承載探針的部分。
66.一種根據(jù)權(quán)利要求58-64中任意一項的裝置，其還包括長條狀支撐件，以及其中至少固定有一種探針的探針載體表面遠離所述支撐件。
67.一種根據(jù)權(quán)利要求58-64中任意一項的裝置，其還包括多個盤旋的柔性探針載體和多個長條狀支撐件，其中所述多個盤旋的探針載體中的每一個探針載體都圍繞所述多個支撐件中的相應長條狀支撐件各自旋繞，固定有至少一種探針的探針載體表面遠離支撐件，以及其中多個長條狀支撐件固定到一個平面支持體上。
68.一種根據(jù)權(quán)利要求66-67中任意一項的裝置，其中長條狀支撐件的直徑小于約10mm。
69.一種根據(jù)權(quán)利要求66-67中任意一項的裝置，其中長條狀支撐件的直徑在大約10mm-150mm之間。
70.一種根據(jù)權(quán)利要求69的裝置，其中所述直徑在大約10mm-40mm之間。
71.一種根據(jù)權(quán)利要求58-64中任意一項的裝置，其還包括具有一個軸的平面盤形支撐件，柔性探針載體旋繞在該支撐件上，其中固定有至少一種探針的探針載體表面遠離支撐件，并且多種探針環(huán)軸分布以接收靶分子。
72.一種根據(jù)權(quán)利要求71的裝置，其中平面盤形支撐件具有圍繞平面盤形支撐件表面上的軸的螺旋形槽，并且柔性探針載體沿該螺旋形槽結(jié)合到盤形支撐件上。
73.一種根據(jù)權(quán)利要求71或72的裝置，其中平面盤形支撐件的直徑在大約10-100mm之間并且承載高達大約1,000,000個探針。
74.一種根據(jù)權(quán)利要求66-73中任意一項的裝置，其中所述柔性探針載體通過粘合劑粘附到支撐件的至少一部分上。
75. 一種根據(jù)權(quán)利要求74的裝置，其中粘合劑是永久粘合劑。
76.一種根據(jù)權(quán)利要求74的裝置，其中粘合劑包括環(huán)氧粘固劑。
77.一種根據(jù)權(quán)利要求66-73中任意一項的裝置，其中支撐件包含磁性材料，柔性探針載體包含磁性材料，并且柔性探針載體通過探針載體的磁性材料與支撐件的磁性材料之間的磁力而固定。
78.一種根據(jù)權(quán)利要求77的裝置，其中支撐件的磁性材料包含至少一種磁珠。
79.一種根據(jù)權(quán)利要求66-73中任意一項的裝置，其中所述柔性探針載體是可拆裝地旋繞在支撐件上。
80.一種根據(jù)權(quán)利要求66-79中任意一項的裝置，其中柔性探針載體包括與一個或多個不承載探針的空白部分交替存在的一個或多個承載探針的部分，并且其中至少一個所述空白部分不附著到支撐件上。
81.一種根據(jù)權(quán)利要求66-80中任意一項的裝置，其中支撐件具有一導電涂層。
82.一種根據(jù)權(quán)利要求66-80中任意一項的裝置，其中支撐件是由一種金屬材料形成的。
83.一種根據(jù)權(quán)利要求66-82中任意一項的裝置，其中探針載體在探針載體表面上具有凹槽，該凹槽遠離探針載體與支撐件接觸的部位，而多種探針封裝在該凹槽內(nèi)。
84.一種根據(jù)權(quán)利要求66-83中任意一項的裝置，其中支撐件包含在一個盒內(nèi)。
85.一種根據(jù)權(quán)利要求58-84中任意一項的裝置，其中探針選自多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、寡糖、多糖、抗體、細胞受體、配體、脂質(zhì)、細胞以及這些物質(zhì)的組合。
86.一種根據(jù)權(quán)利要求58-84中任意一項的裝置，其中探針可以結(jié)合到一種靶物上，該靶物是選自多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、寡糖、多糖、抗體、細胞受體、配體、脂質(zhì)、細胞以及這些物質(zhì)的組合。
87.一種根據(jù)權(quán)利要求85-86中任意一項的裝置，其中多核苷酸選自基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針以及引物。
88.一種根據(jù)權(quán)利要求58-87中任意一項的裝置，其中探針載體包括選自以下的基片硅石、玻璃、光學纖維、金屬、可磁化的金屬、塑料、聚合物、聚酰亞胺和聚四氟乙烯。
89.一種根據(jù)權(quán)利要求58-88中任意一項的裝置，其中探針通過選自以下的方法固定到探針載體表面上噴墨印刷法、平版照相印刷術(shù)、絲印法、膠版印刷法、擊打法、利用x-y單元和光柵技術(shù)使用微量移液管的機械施加法。
90.一種根據(jù)權(quán)利要求58-89中任意一項的裝置，其中至少一種標記物位于探針載體上并與一種或多種固定化探針相鄰，而每一種標記物都攜帶至少一個對應于至少一種相鄰探針的信息。
91.一種根據(jù)權(quán)利要求90的裝置，其中至少一種標記物是選自光學標記物、空間標記物、條形碼、熒光標記物、化學發(fā)光標記物和磁標記物。
92.一種將多種探針沉積到基片上的裝置，包括包括孔陣列的儲存器；以及一排毛細管，其中每一毛細管具有第一端和第二端，這樣每一毛細管的所述第一端與儲存器的一個孔相連，從而孔中的內(nèi)容物可進入毛細管內(nèi)，而每一毛細管的所述第二端的布置使得毛細管的所有第二端形成一個平坦的單一行列。
93.制造承載探針的裝置的方法，包括將探針沉積到基片上，其中所述基片是柔性的，且為長條狀，并具有一個表面、一個長度和一個寬度。
94.根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中通過以點的形式進行點樣而將探針沉積到基片上，其中每一點包括一種探針。
95.根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中通過以條的形式進行涂畫而將探針沉積到基片上，其中每一條都包括一種探針。
96.制造承載探針的裝置的方法，包括通過涂畫第一條而將含有第一探針的第一液體沉積到一個基片上，其中所述基片具有一個表面、一個長度和一個寬度；以及通過涂畫第二條而將含有第二探針的第二液體沉積到該基片上。
97.一種根據(jù)權(quán)利要求93-96中任意一項的方法，其中基片的長度與寬度的比例超過5∶1。
98.根據(jù)權(quán)利要求97的方法，其中基片的長度與寬度的比例超過100∶1。
99.一種根據(jù)權(quán)利要求93-98中任意一項的方法，其中通過以下步驟將探針沉積到基片上將各種探針從儲存器轉(zhuǎn)移到管內(nèi)；以及將所述管置于距離基片表面足夠近的地方，以便將各種探針沉積到所述表面上。
100.權(quán)利要求99的方法，還包括在儲存器與管之間施加一個壓差，以便將探針從儲存器驅(qū)動到管內(nèi)。
101.根據(jù)權(quán)利要求99-100中任意一項的方法，其中還包括在儲存器與基片之間施加一個電壓，這樣該電壓起到將探針吸引到基片上的作用。
102.一種根據(jù)權(quán)利要求99-101中任意一項的方法，其中所述儲存器包括在微滴定板上的多個孔。
103.一種根據(jù)權(quán)利要求93-102中任意一項的方法，其中探針共價固定在基片上。
104.一種根據(jù)權(quán)利要求93-102中任意一項的方法，其中探針非共價固定在基片上。
105.一種根據(jù)權(quán)利要求93-104中任意一項的方法，其中通過以下步驟將探針沉積到基片上以第一速度移動一排探針沉積頭，而以第二速度移動基片，基片的位置使得基片與這排探針沉積頭交叉，其中每一個所述探針沉積頭都包括容納有含一種探針的液體的一個儲存器和一個薄的柔軟的親水性纖維，其中所述纖維用于將探針從儲存器傳送出探針沉積頭，并且其中所述第一速度與第二速度可以相同或不同；以及當所述多個探針沉積頭的第一探針沉積頭與基片交叉時，將探針從所述第一探針沉積頭沉積到基片上。
106.權(quán)利要求105的方法，其中所述探針沉積頭將探針涂刷到基片上。
107.一種根據(jù)權(quán)利要求105-106中任意一項的方法，其中探針沉積頭的行是單排行。
108.一種根據(jù)權(quán)利要求105-107中任意一項的方法，其中所述薄的柔軟的親水性纖維包括用選自金屬材料和尼龍的物質(zhì)涂布的硅石纖維。
109.權(quán)利要求108的方法，其中該物質(zhì)是一種金屬材料。
110.權(quán)利要求109的方法，其中在薄的柔軟的親水性纖維上的金屬材料與基片之間施加一個電壓，其中所述電壓起到將探針從纖維移到基片上的作用。
111.一種根據(jù)權(quán)利要求93-104中任意一項的方法，其中通過以下步驟將探針沉積到基片上以第一速度移動一排包括多個印刷噴嘴的探針沉積頭，而以第二速度移動基底，其中基片的位置使得它可與這排印刷噴嘴交叉，另外，金屬噴嘴包括容納一種液體的一個儲存器和該儲存器內(nèi)的一個針孔，所述液體中含有一種探針，而第一和第二速度為相同或不同；以及當所述多個印刷噴嘴的第一印刷噴嘴與基片交叉時，將探針從第一印刷噴嘴沉積到基片上。
112.權(quán)利要求111的方法，其中所述第一印刷噴嘴將所述探針以一個條沉積到基片上。
113.一種根據(jù)權(quán)利要求111-112中任意一項的方法，其中所述印刷噴嘴還包括一個加壓環(huán)和一個電源，其中將所述加壓環(huán)固定在印刷噴嘴儲存器的壁上并且在施加電壓時擠壓該儲存器。
114.一種根據(jù)權(quán)利要求111-112中任意一項的方法，其中所述印刷噴嘴還包括一個振膜、一個加壓膜和一個電源，其中所述振膜位于儲存器的頂部，而所述加壓膜被覆蓋在振膜上并且在施加電壓時使該振膜變形。
115.一種根據(jù)權(quán)利要求105-114中任意一項的方法，其中所述探針沉積頭在儲存器內(nèi)包括一個電源和一根電阻線。
116.一種根據(jù)權(quán)利要求99-108中任意一項的方法，其中在傳送探針時包括激活儲存器外部的超聲轉(zhuǎn)換器。
117.一種根據(jù)權(quán)利要求99-108中任意一項的方法，其中在傳送探針時包括用來自儲存器外部的激光源的光照射儲存器內(nèi)的一個光吸收片。
118.一種根據(jù)權(quán)利要求99-108中任意一項的方法，其中在傳送探針時包括激活與第一導電材料和第二導電材料都相連的電源，其中所述第一導電材料與儲存器壁相連，第二導電材料與基片相連，從而在兩個導電材料之間施加一個電壓可使探針從儲存器移動到基片上。
119.一種根據(jù)權(quán)利要求93-98中任意一項的方法，其中通過以下步驟將探針沉積到基片上以第一速度移動一排儲存器，而以第二速度移動一排刷子，刷子的布置使得可與這排儲存器交叉，其中每個所述儲存器都包括一種探針，而每個所述刷子都包括一股柔性材料，所述第一速度可與所述第二速度相同或不同，所述第一和第二速度的選擇使得每個刷子接觸儲存器內(nèi)包含的探針，由此將一部分探針從儲存器轉(zhuǎn)移到刷子上；以及以第三速度移動基片，所述第三速度可與所述第一和/或第二速度相同或不同，所述基片相對于這排刷子的位置使得每個刷子從儲存器中拾取所述探針之后可將該探針沉積到基片上。
120.權(quán)利要求119的方法，其中將刷子的行列構(gòu)造為環(huán)形。
121.一種根據(jù)權(quán)利要求119-120中任意一項的方法，其還包括在刷子將探針沉積到基片上之后以及返回到儲存器之前對刷子進行洗滌。
122.一種根據(jù)權(quán)利要求119-121中任意一項的方法，其中刷子包含金屬材料，且其中該方法還包括間歇地給每個刷子充電，以便在刷子將探針從探針儲存器轉(zhuǎn)移到刷子上時將探針吸引到刷子上，而在刷子將探針沉積到基片上時將探針從刷子上排斥下來。
123.一種根據(jù)權(quán)利要求119-122中任意一項的方法，其中將所述探針以一條沉積到基片上。
124.根據(jù)權(quán)利要求93-98中任意一項的方法，其中通過以下步驟將探針以條的形式涂畫到基片上將一組纖維浸漬到第一組孔內(nèi)，所述第一組孔中的每一個孔都含有一種探針，其中將所述組的纖維布置為第一矩陣，而將所述組的孔布置為第二矩陣，以便使第一矩陣的纖維與第二矩陣的孔對準；以及使纖維移動穿過基片的第一部分，而纖維與基片的位置使得每一纖維沉積一個貫穿基片的分離的探針條，并且條與條之間具有所需的間隔。
125.權(quán)利要求124的方法，還包括洗滌纖維；將纖維浸漬到第二組孔內(nèi)，所述第二組孔中的每一個孔都含有一種探針，其中將所述組的纖維布置為第一矩陣，而將所述第二組的孔布置為第三矩陣，以便使第一矩陣的纖維與第三矩陣的孔對準；以及使纖維移動穿過基片的第二部分，而纖維與基片的位置使得每一纖維沉積一個貫穿基片的分離的探針條，并且條與條之間具有所需的間隔。
126.根據(jù)權(quán)利要求93-125中任意一項的方法，其中基片是平行排列的多個纖維。
127.根據(jù)權(quán)利要求93-125中任意一項的方法，其中基片是一個帶。
128.權(quán)利要求127所述的方法，其還包括在探針沉積之后，沿帶的長軸將帶分成承載探針的帶的多個拷貝。
129.根據(jù)權(quán)利要求93-128中任意一項的方法，其還包括將所沉積的探針共價連接到基片上。
130.根據(jù)權(quán)利要求93-129中任意一項的方法，其還包括將第一組探針的第一標記物放置到基片上，并將第二組探針的第二標記物也放置到基片上。
131.一種用于檢測雜交液中靶分子存在的方法，包括使權(quán)利要求1-91中任意一項的裝置與所述雜交液接觸一段足夠的時間，從而使所述靶分子與所述裝置雜交；以及檢測所述裝置上靶分子的存在。
132.一種使靶分子與固定探針雜交的方法，該方法包括提供固定在一纏繞的柔性長條狀探針載體上的多種探針；以及使多種探針中的至少一種探針與含有所述靶分子的雜交液接觸。
133.一種根據(jù)權(quán)利要求132的方法，其中探針載體固定在一長條狀支撐件上，從而形成一個探針載體針或探針載體棒，且其中在所述探針與雜交液接觸時包括將所述探針置于使其與雜交室內(nèi)的雜交液接觸。
134.一種根據(jù)權(quán)利要求132-133中任意一項的方法，其中在所述探針與雜交液接觸時包括將多種探針浸漬到雜交液中。
135.一種根據(jù)權(quán)利要求132的方法，其中將多種探針固定到多個分立的纏繞的柔性長條狀探針載體上，所述每一探針載體各自固定在一個長條狀支撐件上，從而形成多個探針載體針或探針載體棒，并且多個探針載體針或棒固定在一個適配板上，從而形成具有空間間距的矩陣，并且為與微滴定板上的孔對應的模式，且其中在多種探針與雜交液接觸時包括將多個探針載體針或棒浸漬到微滴定板的孔內(nèi)。
136.一種用于讀取靶分子與固定化探針的雜交結(jié)果的方法，該方法包括利用權(quán)利要求132-135中任意一項的方法使靶分子與探針雜交，并且使探針載體件圍繞該探針載體的縱軸做旋轉(zhuǎn)運動，而同時又沿所述縱軸在所述探針載體件與讀取頭之間進行相對平行移動。
137.一種根據(jù)權(quán)利要求132的方法，其中探針載體固定在一平盤形支撐件上，并且在所述探針與雜交液接觸時包括將探針載體浸漬到雜交室內(nèi)的雜交液中。
138.一種用于讀取靶分子與固定探針的雜交結(jié)果的方法，該方法包括利用權(quán)利要求137的方法使靶分子與探針雜交，并且使該盤旋轉(zhuǎn)運動，而同時又沿盤的徑向方向在所述盤與讀取頭之間進行相對平行移動。
139.一種根據(jù)權(quán)利要求132-138中任意一項的方法，其中利用永久粘合劑將探針載體粘附到支撐件上。
140.權(quán)利要求139的方法，其中該永久粘合劑包括環(huán)氧粘固劑。
141.一種根據(jù)權(quán)利要求132的方法，其中纏繞的柔性長條狀探針載體在一長條狀支撐件上形成一平螺旋，從而形成一平卷筒形探針載體，而在所述探針與雜交液接觸時包括展開纏繞的柔性長條狀探針載體并使該柔性長條狀探針載體平移穿過雜交液。
142.權(quán)利要求141的方法，其中在該柔性長條狀探針載體平移穿過雜交液時包括抽取該柔性長條狀探針載體穿過含有雜交液的槽，所述槽包括一個稍稍大于探針載體的毛細管。
143.權(quán)利要求132的方法，其中將多種探針固定在多個分立的纏繞的柔性長條狀探針載體上，每個纏繞的柔性長條狀探針載體在一分立的長條狀支撐件上形成一個平螺旋，從而形成多個平卷筒形探針載體，而在所述探針與雜交液接觸時包括展開多個纏繞的柔性長條狀探針載體并使這些柔性長條狀探針載體平移穿過雜交液。
144.一種用于讀取靶分子與固定化探針的雜交結(jié)果的方法，該方法包括利用權(quán)利要求141-143中任意一項的方法使靶分子與探針雜交，并且將探針載體展開，以便驅(qū)動探針載體經(jīng)過讀取頭。
145.一種根據(jù)權(quán)利要求132-144中任意一項的方法，其中探針載體包含在一個盒內(nèi)。
146.一種根據(jù)權(quán)利要求132-145中任意一項的方法，且其還包括通過使探針載體進行至少一種旋轉(zhuǎn)和平移運動以改善雜交的效率。
147.一種根據(jù)權(quán)利要求146的方法，其中通過至少一種機械適配器和磁驅(qū)動，來賦予所述運動。
148.一種根據(jù)權(quán)利要求132-147中任意一項的方法，且其還包括通過將交流振蕩電壓施加到雜交液中，來改善雜交的效率。
149.一種根據(jù)權(quán)利要求148的方法，其中將所述的交流振蕩電壓施加到探針載體或探針載體所接觸的支撐件與含有雜交液的雜交室壁之間。
150.一種根據(jù)權(quán)利要求149的方法，其還包括在支撐件上提供一導電涂層。
151.一種根據(jù)權(quán)利要求132-150中任意一項的方法，其中所述固定化探針選自多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、寡糖、多糖、抗體、細胞受體、配體、脂質(zhì)、細胞以及這些物質(zhì)的組合。
152.一種根據(jù)權(quán)利要求132-150中任意一項的方法，其中所述靶分子選自多核苷酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、寡糖、多糖、抗體、細胞受體、配體、脂質(zhì)、細胞以及這些物質(zhì)的組合。
153.一種根據(jù)權(quán)利要求151-152中任意一項的方法，其中多核苷酸選自基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針以及引物。
154.一種根據(jù)權(quán)利要求132-153中任意一項的方法，其中探針載體包括選自硅石、玻璃、光學纖維、金屬材料、可磁化的金屬材料、塑料、聚合物、聚酰亞胺和聚四氟乙烯的基片。
155.一種根據(jù)權(quán)利要求132-154中任意一項的方法，其中探針載體是線狀的。
156.一種根據(jù)權(quán)利要求132-154中任意一項的方法，其中探針載體是一個帶。
157.一種根據(jù)權(quán)利要求132-156中任意一項的方法，其中探針載體在探針載體表面上具有一個凹槽，該凹槽遠離探針載體與其支撐件接觸的區(qū)域，并且多種探針封固在該凹槽內(nèi)。
158.一種根據(jù)權(quán)利要求132-157中任意一項的方法，其中利用以下技術(shù)將探針固定到探針載體表面上噴墨印刷法、照相平版印刷術(shù)、絲印法、膠版印刷法、擊打法、利用x-y單元和光柵技術(shù)使用微量移液管的機械施加法。
159.一種根據(jù)權(quán)利要求132-158中任意一項的方法，其中探針載體包含至少一種與所述多種探針中的一種或多種相鄰的標記物，其中所述標記物攜帶與標記物相鄰的探針對應的信息。
160.一種根據(jù)權(quán)利要求159的方法，其中至少一種標記物選自光學標記物、空間標記物、條形碼、熒光標記物、化學發(fā)光標記物和磁標記物。
161.一種用于讀取靶分子與固定化探針的雜交結(jié)果的方法，該方法包括利用權(quán)利要求132-160中任意一項的方法使靶分子與探針雜交，并且檢測靶分子的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種探針載體，在該載體上一柔性基片承載一維結(jié)構(gòu)的探針，其中每一種不同類型的探針都附著在基片的分立部分上。本發(fā)明還涉及一種探針載體，在該載體上諸如帶或纖維這樣的柔性基片承載二維探針結(jié)構(gòu)。而且，本發(fā)明還涉及用于制造和包裝柔性探針載體細線的系統(tǒng)。柔性探針載體細線被包裝成針、棒、旋管和卷筒的形式，從而增加了雜交的效率并產(chǎn)生用于運輸和使用探針的壓制形式。本發(fā)明公開了包裝的探針載體雜交的新方法。還公開了用于讀取包裝的探針載體雜交結(jié)果的方法。
文檔編號C12M1/00GK1406153SQ01805094
公開日2003年3月26日 申請日期2001年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月10日
發(fā)明者陳世平, 羅宇齡, 安東尼·C·陳 申請人:基因譜公司