專利名稱：青蒿素類化合物生物轉化制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及青蒿素類化合物生物轉化制備方法，具體說是利用已知微生物對青蒿素及其衍生物進行生物轉化制備青蒿素類化合物的方法。
背景技術：
微生物轉化是利用微生物產生的特異酶來完成特定的生化反應。微生物可產生多種酶，催化多種反應。例如，微生物轉化反應類型有氧化、還原、水解、取代、脫去、縮合及裂解反應等。如能利用單一酶，使其專一地催化特定的反應，就可以減少副產物，提高目的產物的生產效率。所以，如果要利用微生物轉化制備具有實用性的目的產物，首先必須篩選針對某類特定的底物產生所需要的反應的菌種，同時，為了提高目的物的生產效率，減少副產物，還需要研究生物轉化的條件，如反應時pH、底物濃度、培養(yǎng)基的組成。
目前，國外已有利用生物轉化制備青蒿素類化合物。例如Lee I.-S等人選用菌株Nacardia corallina(ATCC 19070)和Penicilium chrysogenum(ATCC 9480)對青蒿素進行生物轉化，得到脫氧青蒿素(deoxyartmisinin)和3α-羥基脫氧青蒿素(3α-hydrodeoxyartemisinin)，參見抗瘧藥倍半萜青蒿素的微生物轉化研究，天然產物雜志(Jounal of Natural Products)1989，52(2)337-341；Abourashed，E.A.和Hufford，C.D.選用菌株Cunninghamella elegans(ATCC 9275)對蒿甲醚進行生物轉化，得到3α-羥基蒿甲醚(3α-hydroxyartemether)、3β-羥基蒿甲醚(3β-hydroxyartemether)等5個產物，參見蒿甲醚的生物轉化，天然產物雜志(Jounal of Natural Products)1996，59(3)251-253。
淺灰色鏈霉菌ATCC13273在三項美國專利5,674,714、5,213,971、5,169,755中，均用于誘導細胞色素P-450酶，沒有檢索到其它用途。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是研究制備青蒿素類化合物的生物轉化方法，尤其是利用生物轉化方法制備具有生理活性的羥基化青蒿素類化合物的生物轉化方法，這需要選擇能夠對青蒿素類化合物產生羥化反應的菌種。
為了提高目的物的生產效率，減少副產物，本發(fā)明還需要研究對青蒿素類化合物進行羥化反應的生物轉化條件，如反應時pH、底物濃度、反應時間與培養(yǎng)基的組成，尤其需要在常規(guī)培養(yǎng)基的基礎上篩選合適的碳源、氮源和金屬離子。
本發(fā)明的技術方案是制備具有下列通式的青蒿素類化合物的方法，其特征在于利用保藏號為ATCC-13273的淺灰色鏈霉菌種微生物或其功能等同的變異體和突變體，對青蒿素、雙氫青蒿素或蒿甲醚進行生物轉化，得到下列青蒿素類化合物， 1)3α-羥基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羥基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；
7)10α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羥基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH311)3α-羥基蒿甲醚，R1＝OH，R2＝R5＝R3＝H，R4＝-OCH312)3β-羥基蒿甲醚，R1＝R5＝R3＝H，R2＝OH，R4＝-OCH3。
上述制備青蒿素類化合物的方法，培養(yǎng)基主要組成除20％馬鈴薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，微量VB1外，其特征在于碳源為葡萄糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源為蛋白胨、酵母膏、玉米粉、豆粉、脲素、碳酸銨、硝酸鈉、L-賴氨酸、DL-α-氨基丙酸，金屬離子為K+或Co2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+。
所述制備青蒿素類化合物的方法，培養(yǎng)基主要組成除20％馬鈴薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，VB1微量外，碳源選擇葡萄糖、淀粉、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源選擇酵母膏、玉米粉和/或DL-α-氨基丙酸，金屬離子選擇Mn2+較好。
所述制備青蒿素類化合物的方法，培養(yǎng)基主要由20％馬鈴薯煎煮液1000ml、VB1微量、金屬離子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)組成碳源8-12份氮源1-5份KH2PO41-3份MgSO4·7H2O 1份。
所述制備青蒿素類化合物的方法，較好的培養(yǎng)基主要由20％馬鈴薯煎煮液1000ml、VB1微量、金屬離子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)組成碳源10-11份氮源3-3.5份KH2PO42份MgSO4·7H2O 1份。
所述制備青蒿素類化合物的方法，其特征在于生物轉化是在pH5.0～7.5條件下進行；青蒿素、雙氫青蒿素和/或蒿甲醚的濃度為0.2～1mg/mL；生物轉化時間為36～108小時。
較理想的制備青蒿素類化合物的方法，其特征在于生物轉化是在pH6.0條件下進行，青蒿素、雙氫青蒿素和/或蒿甲醚的濃度為0.4-0.6mg/mL；生物轉化時間為80～90小時。
所述制備青蒿素類化合物的方法包括，利用保藏號為ATCC-13273的淺灰色鏈霉菌種微生物或其功能等同的變異體和突變體，在分別以玉米粉作為碳源或氮源、pH為6.0、含Mn2+的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)84小時，得到3α-羥基青蒿素。
制備青蒿素類化合物的方法還包括利用保藏號為ATCC-13273的淺灰色鏈霉菌種微生物或其功能等同的變異體和突變體，在分別以玉米粉作為碳源或氮源、pH為6.0、含Mn2+的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)84小時，得到3β-羥基青蒿素。
本發(fā)明還包括具有免疫活性的青蒿素類化合物，其特征在于具有如下通式 1)3α-羥基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羥基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7)10α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羥基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3。
上述方法中用微生物S.griseus對青蒿素、雙氫青蒿素和蒿甲醚進行了生物轉化，從發(fā)酵液中共分得12個轉化產物，其中3個為青蒿素的轉化產物、4個為雙氫青蒿素的轉化產物、5個為蒿甲醚的轉化產物。用IR、SCI-MS、ESI-MS、FAB-MS、HREI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMBC、1H-1H COSY等多種波譜手段進行了結構鑒定，共鑒定了12個，其中10個為新化合物。
具體實施方法實施例1具轉化活性微生物菌種的篩選本發(fā)明對14個菌種(株)進行了轉化篩選，結果表明Streptomyces griseus(ATCC-13273)對青蒿素、雙氫青蒿素和蒿甲醚均有較強的轉化能力。
菌種篩選所用液體培養(yǎng)基—豆粉葡萄糖培養(yǎng)基取葡萄糖20g，酵母浸膏5g，豆粉5g，NaCl 5g，K2HPO4 5g，蒸餾水1000mL，用6N的HCl調pH至7.0。分裝于150ml三角瓶，每瓶25ml，121℃、0.15Mpa滅菌20min。
菌種篩選時，保存菌種所用斜面固體培養(yǎng)基是在上述液體培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂，加熱溶解后，分裝于15mL具螺旋蓋的試管中，121℃、0.15Mpa滅菌20min后，斜置冷卻而成。
菌種保存與活化菌種接種于斜面固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d，然后保存于4℃的冰箱內。
菌種活化采用兩步活化法，參見Nair，M.S.R.，and Basile，D.V.Bioconversionof artenium B to artmisinn.天然產物雜志(Jounal of Natural Prodacts)1993，56(9)1559。先將菌種接種于液體培養(yǎng)基，28℃200r/min旋轉培養(yǎng)48h后，轉接于另一液體培養(yǎng)基，同條件培養(yǎng)24h。
加樣與取樣每瓶兩步活化的菌液(25ml)加入用DMF溶解制成150mg/mL的青蒿素溶液100μL，使每mL菌液含青蒿素0.6mg。同條件培養(yǎng)84h后，將發(fā)酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，殘渣少量丙酮溶解供薄層色譜鑒別用。
空白對照每瓶兩步活化的菌液加入DMF 100μL，同條件培養(yǎng)84h后，將發(fā)酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，殘渣少量丙酮溶解供薄層色譜鑒別用。
轉化產物的薄層色譜鑒別分別轉化后的樣品和空白對照溶液點于用0.3％CMC-Na制成的硅膠G薄層板上，石油醚-丙酮(3∶1)上行法展開，取出晾干溶劑后，噴以5％的香草醛-濃硫酸，電吹風加熱顯色，檢視轉化結果。
轉化結果見表1表.1.對青蒿素具轉化活性微生物菌種的篩選Organism Metabolie productionAmycolatopsis orientalis subsp.orientalis(ATCC-19795) -Aspergillus niger(CGMCC-3.4463)-Beauveria sp.(CGMCC-3.3574)-Caldariomyces fumago(ATCC-16373) -Candida rugosa(ATCC-14830) -Corynebacterium mediolarrum(ATCC-14004)-Cylindrocapon radicicola(ATCC-11011) +Gliocbadium deliquescens(NRRL-1086)-Nocardia sp.(NRRL-5646)-Peeudomonas putida(ATCC-33015) -Penicillium notatum(ATCC-36740)-Polyporus versicolor(ATCC-12679) -Rhizopus sp(NRRL-1478) +Streptomyces griseus(ATCC-13273) ++ATCC美國典型培養(yǎng)物保藏中心，NRRLNorthern RegionalResearch Laboratories，CGMCC中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心從所篩選的14個菌種可以看出，僅有3個菌種對青蒿素有催化轉化作用，其中以S.griseus的轉化能力最強。此后，又用S.griseus對雙氫青蒿素和蒿甲醚進行了轉化實驗，結果表明，該菌株對雙氫青蒿素和蒿甲醚亦有較強的轉化作用。因此，本發(fā)明選擇該菌株作為制備規(guī)模轉化的菌株。
實施例2青蒿素類化合物的生物轉化實驗材料與儀器微生物 本實驗所用微生物為淺灰色鏈霉菌Streptomyces griseus保藏號為ATCC-13273，在美國專利5,674,714、5,213,971、5,169,755中已公開。
試藥和試劑 青蒿素按文獻方法制備，參見陳有根、余伯陽等，青蒿素及其前體化合物的提取分離與鑒定，中草藥，2001；32(4)302-303，并經光譜鑒定其結構與文獻報道一致；雙氫青蒿素購自北京第六制藥廠；蒿甲醚購自昆明制藥股份有限公司。此三化合物分別用丙酮溶解制成濃度為240mg/mL的溶液，搖勻，作為轉化底物備用。
培養(yǎng)基 20％馬鈴薯煎煮液6000ml，玉米粉120g，MnSO41.50g，VB16g(6N NaOH或HCl調pH＝6.0)。分裝于24個1000ml三角瓶(每瓶200ml)和24個150ml三角瓶(每瓶25ml)，121℃、0.15Mpa滅菌20min。
儀器 WL-1型顯微熔點測定儀(未校正)；NICOLET Impact 410紅外光譜儀；VarianXL-500、XL-400和BRUKER ACF-300核磁共振儀；Finnigan FTMS-2000質譜儀(70eV)。
青蒿素、雙氫青蒿素和蒿甲醚的微生物轉化可以直接進行，也可以按上述文獻方法，將菌種進行活化或二次活化。
菌種活化菌種活化采用兩步活化法，先將菌種接種于8個150ml的三角瓶(內裝25ml液體培養(yǎng)基)中，28℃200r/min振蕩旋轉培養(yǎng)48h后，分別轉接于另8個1000ml的三角瓶(內裝200ml液體培養(yǎng)基)中，同條件培養(yǎng)24h。
加樣與取樣每瓶兩步活化的菌液(200ml)加用丙酮溶解制成240mg/mL的青蒿素溶液0.5mL。同條件培養(yǎng)84h后，將發(fā)酵液取出，過濾后合并，得濾液1.6L，用乙酸乙酯萃取3次(3.2L，1.6L×2)，合并萃取液，用Na2SO4脫水后，水浴55℃減壓回收乙酸乙酯，殘渣用少量氯仿溶出，得青蒿素的轉化混合物(I)0.840g，備用。同樣方法，制得雙氫青蒿素(II)0.967g和蒿甲醚的轉化混合物(III)0.935g。
轉化產物的分離上述混合物I，II和III分別用少量氯仿溶解后，加2g硅膠拌樣，氯仿濕法上樣上于裝有80g柱層硅膠(200-300目)的硅膠柱內，用氯仿-甲醇20∶1-5∶1梯度洗脫，由I得到1-3，II得到4-7，III得到8-12共12個化合物，所有化合物均用氯仿重結晶。 從青蒿素轉化獲得的新化合物1. 3α-羥基青蒿素(3α-hydroxylartemisinin)R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2. 3β-羥基青蒿素(3β-hydroxylartemisinin)R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3. 青蒿素酮-3(artemistone-3)R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H從二氫青蒿素轉化獲得的新化合物4. 3α-羥基雙氫青蒿素(3α-hydroxy-dihydroartemisinin)R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5. 3α-羥基-α-雙氫青蒿素(3α-hydroxy-α-dihydroartemisinin)R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6. 10α-羥基雙氫青蒿素(10α-hydroxy-dihydroartemisinin)R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7. 10α-羥基-α-雙氫青蒿素(10α-hydroxy-α-dihydroartemisinin)R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；從蒿甲醚轉化獲得的新化合物8. 3α，3β-二羥基蒿甲醚(3α，3β-dihydroxyartemether)R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39. 3β，10α-二羥基蒿甲醚(3β，10α-dihydroxyartemether)R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310. 3α，10α-二羥基蒿甲醚(3α，10α-dihydroxyartemether)R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3從蒿甲醚轉化獲得的已知化合物11. 3α-羥基蒿甲醚，R1＝OH，R2＝R5＝R3＝H，R4＝-OCH312. 3β-羥基蒿甲醚，R1＝R5＝R3＝H，R2＝OH，R4＝-OCH3。
上述轉化產物中10個新化合物的結構鑒定及波譜數據1、3α-羥基青蒿素白色針晶(CHCl3)；mp，161-162℃；IR(KBr)Vmax3523，1720，1114，1010，989，880，832(cm-1)；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.83(1H，s，H-7)，3.81(1H，td，J＝2.4，3.2Hz，H-3)，3.38(1H，q，J＝7.2Hz，H-11)，2.36(1H，m，H-5)，2.43(1H，td，J＝4.0，12.8Hz，H-9b)，2.03(2H，m，H-9a，4a)，1.89(2H，m，H-1，2b)，1.54(1H，br，HO-3)，1.50(1H，m，H-2)，1.47(1H，m，H-10a)，1.43(3H，s，H-15)，1.28(1H，td，J＝2.4，14.4Hz，H-4b)，1.18(3H，d，J＝7.2，H-13)，1.06(3H，d，J＝6.4，H-14)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ172.6(C-12)，105.5(C-8)，93.4(C-7)，79.2(C-6)，69.1(C-3)，43.4(C-1)，41.3(C-2)，37.6(C-5)，36.0(C-9)，32.3(C-11)，30.7(C-4)，25.2(C-15)，24.6(C-10)，15.8(C-14)，12.5(C-13)；CIMS m/z 299[M++1](37)，265(9)，253(43)，239(100)，235(39)，221(64)，207(52)；HREIMS[M+]298.1421(calc.for C15H22O6，298.1416)。
2、3β-羥基青蒿素白色針晶(CHCl3)；mp，158-159℃；IR(KBr)Vmax3469，1740，1113，1032，998，882，831(cm-1)；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.90(1H，s，H-7)，3.39(1H，q，J＝6.0Hz，H-11)，3.30(1H，td，J＝3.2，4.0Hz，H-3)，2.47(1H，td，J＝3.6，4.0，H-9a)，2.13(1H，m，H-4a)，2.09(2H，m，H-9b，5)，1.93(1H，m，H-10a)，1.64(1H，br，HO-3)，1.53(2H，m，H-1，9b)，1.47(3H，s，H-15)，1.41(1H，m，H-2)，1.23(1H，d，J＝26.8Hz，H-14)，1.19(1H，m，H-4b)，1.11(3H，d，J＝5.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ171.5(C-12)，105.4(C-8)，93.2(C-7)，78.8(C-6)，73.5(C-3)，48.0(C-1)，44.5(C-2)，42.2(C-5)，35.8(C-9)，32.5(C-4)，32.2(C-11)，25.2(C-15)，24.8(C-10)，15.5(C-14)，12.6(C-13)；CIMS m/z 299[M++1](54)，253(19)，239(66)，235(25)，221(7)，207(100)；HREIMS[M+]298.1421(calc.for C15H22O6，298.1416)。
3、青蒿酮-3白色針晶(CHCl3)；mp，164-165℃；IR(KBr)Vmax，1739，1714cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.17(1H，s，H-7)，3.41(1H，dt，J＝4.8，7.2Hz，H-5)，2.60(1H，m，H-10b)，2.50(1H，m，H-9b)，2.20(1H，m，H-10a)，2.19(1H，m，H-2)，2.15(1H，m，H-9a)，2.07(1H，d，J＝4.8Hz，H-4a)，1.84(1H，m，H-11)，1.82(1H，m，H-1)，1.66(1H，d，J＝5.2Hz，H-4b)，1.48(3H，s，H-15)，1.18(3H，d，J＝7.2Hz，H-13)，1.13(3H，d，J＝6.4Hz，H-14)；13C NMR(400MHz，CDCl3)δ205.8(C-3)，170.7(C-12)，105.8(C-8)，92.8(C-7)，77.9(C-6)，49.5(C-11)，48.6(C-1)，43.7(C-2)，38.3(C-4)，35.8(C-9)，33.0(C-5)，26.1(C-10)，25.1(C-15)，12.4(C-14)，11.9(C-13)；CIMS m/z 297[M++1](9)，233(34)，222(28)，206(63)，91(67)，55(60)，43(100)；HREIMS m/z 296.1359[M+](calcd for C15H20O6296.1260)。
4、3α-羥基雙氫青蒿素白色針晶(CHCl3)；m.p.134-136℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3500(OH)，1100，1038，880，827；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.64(1H，s，H-7)，5.26(1H，d，J＝3.2，H-12)，2.60(3H，s，H-16)，1.41(3H，s，H-15)，1.05(3H，d，J＝6.2，H-14)，0.95(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ104.4(C-8)，94.5(C-12)，90.9(C-7)，80.2(C-6)，74.2(C-3)，50.0(C-1)，44.4(C-2)，43.0(C-5)，36.2(C-9)，34.4(C-4)，31.1(C-11)，26.2(C-15)，24.7(C-10)，16.2(C-14)，13.1(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](18)，277(19)，251(22)，207(18)，173(17)，159(30)，137(50)，115(100)。
5、3α-羥基-α-雙氫青蒿素白色針晶(CHCl3)；m.p.134-136℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3500(OH)，1100，1038，880，827；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.45(1H，s，H-7)，4.74(1H，d，J＝8.8，H-12)，2.32(3H，s，H-16)，1.42(3H，s，H-15)，1.06(3H，d，J＝6.2，H-14)，0.94(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ104.2(C-8)，96.3(C-12)，87.4(C-7)，79.6(C-6)，73.9(C-3)，9.0.0(C-1)，44.1(C-2)，41.8(C-5)，36.1(C-9)，33.7(C-4)，30.5(C-11)，25.9(C-15)，24.6(C-10)，15.4(C-14)，12.7(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](18)，277(19)，251(22)，207(18)，173(17)，159(30)，137(50)，115(100)。
6、10α-羥基雙氫青蒿素白色針晶(CHCl3)；m.p.130-132℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3389 br(OH)，1092，1027，859，826；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.53(1H，s，H-7)，5.25(1H，d，J＝2.8，H-12)，2.61(3H，s，H-16)，1.41(3H，s，H-15)，1.02(3H，d，J＝6.4，H-14)，0.93(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400MHz，CDCl3)δ102.7(C-8)，94.8(C-12)，90.8(C-7)，80.4(C-6)，70.0(C-10)，59.8(C-1)，46.4(C-9)，44.6(C-5)，37.1(C-3)，35.5(C-2)，34.8(C-11)，24.5(C-4)，25.8(C-15)，21.3(C-14)，13.1(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](12)，277(38)，251(8)，207(12)，173(22)，159(26)，137(38)，115(100)。
7、10α-羥基-α-雙氫青蒿素白色針晶(CHCl3)；m.p.130-132℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)3389 br(OH)，1092，1027，859，826；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ5.32(1H，s，H-7)，4.73(1H，d，J＝9.2，H-12)，2.29(3H，s，H-16)，1.42(3H，s，H-15)，1.03(3H，d，J＝6.4，H-14)，0.92(3H，d，J＝7.2，H-13)；13C-NMR(400 MHz，CDCl3)102.4(C-8)，94.5(C-12)，87.5(C-7)，79.6(C-6)，69.4(C-10)，58.8(C-1)，45.3(C-9)，44.3(C-5)，37.0(C-3)，35.1(C-2)，30.8(C-11)，22.1(C-4)，25.8(C-15)，21.2(C-14)，12.7(C-13)；FAB-MS m/z 323[M++Na+](12)，277(38)，251(8)，207(12)，173(22)，159(26)，137(38)，115(100)。
8、3α，3β-二羥基蒿甲醚白色針晶(CHCl3)；IR(KBr)Vmax(cm-1)3528 br(OH)；1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.77(1H，s，H-7)，4.77(1H，d，J＝3.2，H-12)，3.48(3H，s，H-16)，3.06(1H，t，J＝14.6，H-4b)，2.67(1H，m，H-11)，2.43(3H，m，H-9b，4，2)，3.01(1H，m，H-9a)，1.93(2H，m，H-5，10b)，1.73(2H，m，H-1，10a)，1.50(3H，s，H-15)，1.07(3H，d，J＝6.7，H-14)，0.92(3H，d，J＝7.0，H-13)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)δ117.6(C-3)，104.4(C-8)，103.6(C-12)，86.91(C-7)，79.4(C-6)，56.3(C-16)，51.6(C-2)，47.5(C-1)，44.0(C-5)，39.9(C-4)，36.1(C-9)，30.9(C-11)，26.0(C-15)，25.7(C-10)，12.6(C-13)，11.8(C-14)；ESI-MSm/z 315[M++1](5)，284(12)，283(100)，224(21)，227(9)，195(8)，179(14)，161(29)。
9、3β，10α-二羥基蒿甲醚白色針晶(CHCl3)；m.p.123-125℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)，3380 br(OH)，1116，858，827；1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.21(1H，s，H-7)，4.74(1H，d，J＝2.8，H-12)，4.46(1H，td，J＝11.0，4.8，H-3a)，3.98(1H，dd，J＝7.9，9.4，H-10b)，3.49(1H，s，HO-3)，3.47(3H，s，H-16)，2.82(1H，m，H-11)，2.52(2H，m，H-9a，9b)，2.18(1H，s，HO-10)，1.87(1H，ddd，J＝12.7，12.7，4.8，H-4b)，1.57(2H，m，H-2，5)，1.45(3H，s，H-15)，1.32(1H，dd，J＝11.5，7.9，H-1)，1.20(3H，d，J＝7.9，H-13)，1.16(3H，d，J＝5.2，H-14)，1.16(H，m，H-4a)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)103.6(C-12)，δ102.7(C-8)，88.1(C-7)，81.0(C-6)，70.0(C-3)，69.1(C-10)，59.1(d，C-1)，56.0(s，C-16)，51.3(C-2)，46.3(C-9)，45.3(C-5)，33.1(C-4)，31.4(C-11)，25.7(C-15)，20.9(C-14)，15.6(C-13)；ESI-MS m/z 353[M++Na](100)，323(49)，307(37)，235(43)。
10、3α，10α-二羥基蒿甲醚白色針晶(CHCl3)；m.p.121-123℃；IR(KBr)Vmax(cm-1)，3380 br(OH)；1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ5.28(1H，s，H-7)，4.70(1H，d，J＝3.5，H-12)，3.43(3H，s，H-16)，1.47(3H，s，H-15)，1.24(3H，d，J＝6.9，H-13)，1.16(3H，d，J＝3.8，H-14)；13C-NMR(300MHz，CDCl3)103.6(C-12)，δ102.4(C-8)，86.8(C-7)，81.1(C-6)，70.1(C-3)，69.4(C-9)，56.1(s，C-16)，51.6(d，C-1)，46.7(C-5)，40.3(C-2)，37.5(C-4)，32.4(C-10)，31.4(C-11)，25.9(C-15)，17.8(C-14)，12.8(C-13)；ESI-MS m/z 353[M++Na](88)，323(62)，307(100)，235(64)。
實施例3青蒿素微生物轉化培養(yǎng)基中碳源、氮源、金屬離子的選擇對微生物Streptomyces griseus轉化青蒿素產生的主產物，尤其是3α-羥基青蒿素的轉化條件進行了篩選。
培養(yǎng)基碳源選擇培養(yǎng)基20％馬鈴薯煎煮液1000ml，碳源(葡萄糖或可溶淀粉、蔗糖、麥芽糖、檸檬酸、半乳糖、糊精、玉米粉、甘油)20g，酵母膏5g，豆粉5g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB1微量(pH5.0～7.5)。
氮源選擇培養(yǎng)基20％馬鈴薯煎煮液1000ml，葡萄糖20g，氮源(蛋白胨或牛肉膏、酵母膏、玉米粉、豆粉10g，或脲素、碳酸銨、硝酸鈉、L-賴氨酸、DL-α-氨基丙酸相當于硝酸鈉2g/L)，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB1微量(pH5.0～7.5)。
金屬離子選擇培養(yǎng)基20％馬鈴薯煎煮液1000ml，葡萄糖20g，酵母膏5g，豆粉5g，金屬離子(K+或Co2+、Fe3+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+)0.2mmol/L，VB1微量(pH5.0～7.5)。方法菌種保存與活化菌種接種于斜面固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d，然后保存于4℃的冰箱內。菌種活化采用兩步活化法，先將菌種接種于液體培養(yǎng)基，28℃200r/min振蕩旋轉培養(yǎng)48h后，轉接于另一液體培養(yǎng)基，同條件培養(yǎng)24h。
加樣與取樣每瓶兩步活化的菌液(25ml)加用DMF溶解制成150mg/ml的青蒿素溶液100μl。同條件培養(yǎng)36-120h后，分時取樣，將發(fā)酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，殘渣加色譜純甲醇溶解定容為10ml，用孔徑為0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液供高效液相測定用。
高效液相測定條件與方法Waters 600E高效液相色譜儀，4通道在線脫氣機，717型自動進樣器，996二極管陣列檢測器，Waters Symmetry C18層析柱。流動相乙腈-水35∶65；流速1.5ml/min；檢測波長200nm。
上述碳源考察研究結果表明菌種S.griseus在以玉米粉為碳源的培養(yǎng)基中對青蒿素的轉化能力最強；其次是淀粉、甘油、糊精和葡萄糖；在以檸檬酸為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長緩慢，對青蒿素幾乎沒有轉化能力。
氮源考察研究結果表明菌種S.griseus在以玉米粉為氮源的培養(yǎng)基中對青蒿素的轉化能力最強；其次是酵母膏和DL-α-氨基丙酸。
在含所考察的7種金屬離子培養(yǎng)基中，菌種S.griseus對青蒿素的轉化率都比較高，相比較而言，在含Mn2+的培養(yǎng)基中3α-羥基青蒿素得率最高。
實施例4青蒿素微生物轉化培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時間、加樣量的選擇對微生物Streptomyces griseus轉化青蒿素產生新產物的培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)時間、加樣量等條件的考察，培養(yǎng)基轉化用培養(yǎng)基20％馬鈴薯煎煮液1000ml，葡萄糖20g，酵母膏5g，豆粉5g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB1微量。
以上所有培養(yǎng)基均分裝于150ml三角瓶，每瓶25ml，121℃、0.15Mpa滅菌20min。方法菌種保存與活化菌種接種于斜面固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d，然后保存于4℃的冰箱內。菌種活化采用兩步活化法，先將菌種接種于液體培養(yǎng)基，28℃200r/min振蕩旋轉培養(yǎng)48h后，轉接于另一液體培養(yǎng)基，同條件培養(yǎng)24h。
加樣與取樣每瓶兩步活化的菌液(25ml)加用DMF溶解制成150mg/ml的青蒿素溶液30、60、100、130、160μl。同條件培養(yǎng)84h后(取樣時間考察除外)，將發(fā)酵液取出，加等量乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，殘渣加色譜純甲醇溶解定容為10ml，用孔徑為0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液供高效液相測定用。
高效液相測定條件與方法Waters 600E高效液相色譜儀，4通道在線脫氣機，717型自動進樣器，996二極管陣列檢測器，Waters Symmetry C18層析柱。流動相乙腈-水35∶65；流速1.5ml/min；檢測波長200nm。
實驗證明pH值對轉化具有較大影響。轉化培養(yǎng)基分別用1.0mol的鹽酸或氫氧化鈉調pH。分別考察了pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0青蒿素對轉化率的影響，結果pH在5.0～7.5范圍內均有利于轉化反應。在pH為5.0～7.5的范圍內，菌種的長勢隨pH值增大而增強，對青蒿素的轉化率也隨著增大，但3α-羥基青蒿素的得率卻以pH為6.0時最高。
不同取樣時間的轉化結果證明測試了12、36、60、84、108、132、156七個不同取樣時間青蒿素的轉化率，結果在轉化36-108小時期間均有較高的轉化率。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌種對青蒿素的消耗量增多，但當培養(yǎng)84h后，菌種長勢減弱。3α-羥基青蒿素的得率以培養(yǎng)84h取樣最高。
實施例5青蒿素類化合物的生物活性測定用淋巴細胞發(fā)光法比較了青蒿素、3α-青蒿素、3β-青蒿素3個化合物的免疫活性，結果表明青蒿素的轉化產物3α-羥基青蒿素、3β羥基青蒿素均具有很強的免疫增強活性。
1材料與儀器1.1藥品與試劑魯米諾(Luminol，Mark CO，F.R.G，終濃度10-5mmol/L)；葡聚糖F500(Pharmacia產品)；淋巴細胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)；植物血凝素(PHA，上海伊華臨床醫(yī)學科技公司，批號980101)；佛波豆蔻酸乙酯(PMA)，甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)均為Sigma公司產品；淋巴細胞(PMN)分離液(內含NaCl 140mmol/L，KCl 5mmol/L，MgCl21mmol/L，CaCl21mmol/L，NaH2PO41mmol/L，HEPES 10mmol/L，Tris 5mmol/L)；瑞特氏染液(南京建成生物工程研究所)；青蒿素；3α-羥基青蒿素、3β-羥基青蒿素為轉化獲得的新化合物；其余試劑均為國產分析純。
1.2儀器SHG-C型生物化學發(fā)光測量儀(上海上立檢測儀器廠)；FA-1104上皿電子天平，上海天平儀器廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司1.3動物，SD大鼠，體重180～250g，雌雄不拘。
2方法2.1 PMN的分離與保存取大鼠新鮮抗凝血，按文獻(陶憶訓等審編臨床免疫學檢查，上冊，上海，上?？萍汲霭嫔?，1983，p16-19)進行PMN分離。經葡聚糖沉淀40分鐘后，取上清液，經淋巴細胞分離液密度梯度離心分離出PMN。苔盼藍檢察PMN活力在3小時內為95％以上，瑞特氏染色法檢驗純度在95％以上。用含2％小牛血清的Hanks液調整細胞懸液濃度為5×106PMN/mL，4℃保存，12小時內使用活力恒定。
2.2化學發(fā)光的測定用SHG-C型生物化學發(fā)光測量儀測定化學發(fā)光(CL)反應。37℃循環(huán)水使樣品室溫度為37±0.5℃。取PMN懸液1mL，加1uminol 0.2mL，37℃水浴孵育10min，測PMN自發(fā)性CL 1min。加入不同濃度測試樣品，對照加HBSS 0.1mL，連續(xù)測定CL強度5min，然后立即加入PHA、PMA、fMLP，再連續(xù)測定10-15min。測定結果由生物-化學光度計6s積分自動記錄。參照文獻方法(張學軍等化學發(fā)光法測量人外周血分離的淋巴細胞和中性粒細胞的活性中華醫(yī)學雜志1992，15365；張學軍等活性氧清除劑和鈣通道阻斷劑對人淋巴細胞化學發(fā)光的影響生物化學和生物物理學進展1990，17444)。
2.3結果處理CL強度以mV表示。以PMN自發(fā)性CL為本底，加刺激劑PMA、FMLP和PHA后出現的CL最高值為峰值。實驗結果以峰值減去本底后的純峰值表示。每份標本檢測均做復管，統(tǒng)計數據取自3份以上標本的實驗結果。測試樣品影響大鼠PMN的CL程度以抑制率表示。
PMN-CL抑制率(％)＝[1-實驗組純峰值均數/對照組純峰值均數]×100％3、實驗結果(參見表2)
表2、對大鼠PMN的抑制率(％)濃度(mol/L)樣品10-510-6青蒿素 -0.31873.74333α-羥基青蒿素 -1.2392-1.20823β-羥基青蒿素 -9.0381-5.4654本發(fā)明用淋巴細胞化學發(fā)光法對青蒿素類3個化合物進行了體外免疫活性比較，結果表明青蒿素的轉化產物3α-羥基青蒿素和3β-羥基青蒿素具有顯著的免疫促進作用，而且在藥物濃度為10-5mol/L時，3β-羥基青蒿素的促進作用比青蒿素強約30倍。
權利要求
1.制備具有下列通式的青蒿素類化合物的方法，其特征在于利用保藏號為ATCC-13273的淺灰色鏈霉菌種微生物或其功能等同的變異體和突變體，對青蒿素、雙氫青蒿素或蒿甲醚進行生物轉化，得到下列青蒿素類化合物， 1)3α-羥基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羥基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7)10α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羥基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3。11)3α-羥基蒿甲醚，R1＝OH，R2＝R5＝R3＝H，R4＝-OCH312)3β-羥基蒿甲醚，R1＝R5＝R3＝H，R2＝OH，R4＝-OCH3。
2.根據權利要求1所述制備青蒿素類化合物的方法，培養(yǎng)基主要組成除20％馬鈴薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，微量VB1外，其特征在于碳源為葡萄糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源為蛋白胨、酵母膏、玉米粉、豆粉、脲素、碳酸銨、硝酸鈉、L-賴氨酸、DL-α-氨基丙酸，金屬離子為K+或Co2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+。
3.根據權利要求1或2所述制備青蒿素類化合物的方法，培養(yǎng)基主要組成除20％馬鈴薯煎煮液，KH2PO4，MgSO4·7H2O，微量VB1外，其特征在于碳源為葡萄糖、淀粉、糊精、玉米粉和/或甘油，氮源為酵母膏、玉米粉和/或DL-α-氨基丙酸，金屬離子為Mn2+。
4.根據權利要求1或2所述制備青蒿素類化合物的方法，培養(yǎng)基主要由20％馬鈴薯煎煮液1000ml、VB1微量、金屬離子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)組成碳源8-12份氮源1-5份KH2PO41-3份MgSO4·7H2O 1份。
5.根據權利要求4所述制備青蒿素類化合物的方法，培養(yǎng)基主要由20％馬鈴薯煎煮液1000ml、VB1微量、金屬離子0.1-0.3mmol/L和以下原料(按重量比)組成碳源10-11份氮源3-3.5份KH2PO42份MgSO4·7H2O 1份。
6.根據權利要求1或2所述制備青蒿素類化合物的方法，其特征在于生物轉化是在pH5.0～7.5條件下進行；青蒿素、雙氫青蒿素和/或蒿甲醚的濃度為0.2～1mg/mL；生物轉化時間為36～108小時。
7.根據權利要求6所述制備青蒿素類化合物的方法，其特征在于生物轉化是在pH6.0條件下進行，青蒿素、雙氫青蒿素和/或蒿甲醚的濃度為0.4-0.6mg/mL；生物轉化時間為80～90小時。
8.根據權利要求1-2所述制備青蒿素類化合物的方法，其特征在于利用保藏號為ATCC-13273的淺灰色鏈霉菌種微生物或其功能等同的變異體和突變體，在分別以玉米粉作為碳源或氮源、pH為6.0、含Mn2+的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)84小時，得到3α-羥基青蒿素。
9.根據權利要求1-2所述制備青蒿素類化合物的方法，其特征在于利用保藏號為ATCC-13273的淺灰色鏈霉菌種微生物或其功能等同的變異體和突變體，在分別以玉米粉作為碳源或氮源、pH為6.0、含Mn2+的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)84小時，得到3β-羥基青蒿素。
10.具有免疫活性的青蒿素類化合物，其特征在于具有如下通式 1)3α-羥基青蒿素，R1＝OH，R2＝R3＝H，R4+R5＝＝O；2)3β-羥基青蒿素，R1＝R3＝H，R2＝OH，R4+R5＝＝O；3)青蒿素酮-3，R1+R2＝＝O，R4+R5＝＝O，R3＝H4)3α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R4＝OH，R2＝R3＝R5＝H；5)3α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R5＝OH，R2＝R3＝R4＝H；6)10α-羥基雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R4＝OH；7)10α-羥基-α-雙氫青蒿素，R1＝R2＝R5＝H，R3＝R5＝OH；8)3α，3β-二羥基蒿甲醚，R1＝R2＝OH，R3＝R5＝H；R4＝-OCH39)3β，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R5＝H，R2＝R3＝OH，R4＝-OCH310)3α，10α-二羥基蒿甲醚，R1＝R3＝OH，R2＝R5＝H，R4＝-OCH3。
全文摘要
本發(fā)明公開了用淺灰色鏈霉ATCC13273微生物對青蒿素、雙氫青蒿素或蒿甲醚進行羥基化生物轉化的方法,從發(fā)酵液中共分得12個羥基化轉化產物,其中3個為青蒿素的羥基化轉化產物、4個為雙氫青蒿素的羥基化轉化產物、5個為蒿甲醚的羥基化轉化產物,其中10個為母核如下的新化合物。
文檔編號C12P17/18GK1382805SQ02112750
公開日2002年12月4日 申請日期2002年3月12日 優(yōu)先權日2002年3月12日
發(fā)明者余伯陽, 陳有根, 吳志峰 申請人:中國藥科大學