專利名稱：人成熟卵泡液在未成熟卵體外成熟技術(shù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
未成熟卵體外成熟(in-vitro maturation，IVM)是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中輔助生殖技術(shù)的一項前沿技術(shù)。自1978年世界上第一例“試管嬰兒”誕生以來，輔助生殖技術(shù)及其相關(guān)的一系列衍生技術(shù)發(fā)展迅速，幫助許多不孕夫婦獲得生育。但是其中一些婦女因各種原因不能獲得正常的成熟卵子，常規(guī)的輔助生殖技術(shù)對此也無能為力。未成熟卵體外成熟(in vitro maturation，IVM)技術(shù)就是將婦女卵巢中核泡期(GV stage)的未成熟卵取出，采用特殊的培養(yǎng)液模擬體內(nèi)的卵泡微環(huán)境，在體外短時間培養(yǎng)成熟后，再進行顯微授精，發(fā)育成胚胎后植入母體子宮腔內(nèi)。
1935年P(guān)incus和Enzmamn首次證實哺乳動物卵巢中未成熟卵母細胞脫離卵泡內(nèi)環(huán)境，在體外合適環(huán)境中培養(yǎng)能自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂而成熟。目前IVM技術(shù)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)的實際生產(chǎn)并逐步開始商業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化。直到1991年Cha等利用IVM技術(shù)才在世界上獲得了人類首例妊娠。
我國不孕癥患者中大約有25％是因為排卵障礙，其中相當一部分患者的卵子成熟有障礙，即使常規(guī)“試管嬰兒”技術(shù)也因此無能為力。IVM技術(shù)能夠?qū)⑽闯墒斓穆涯讣毎隗w外特殊的培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟，繼而完成體外受精-胚胎移植的過程，幫助這類患者妊娠。目前在世界范圍內(nèi)，僅有加拿大、南韓、日本、丹麥等為數(shù)不多的生殖中心為病人提供該技術(shù)治療，全世界僅約200例左右的IVM“試管嬰兒”誕生。
人未成熟卵母細胞的體外成熟技術(shù)現(xiàn)已在不育癥治療中逐漸顯示出了優(yōu)勢。但與其它哺乳類相比較，人未成熟卵母細胞的體外成熟率、受精率以及種植后的妊娠率均顯著低。而卵母細胞的成熟培養(yǎng)體系，培養(yǎng)液的成份和培養(yǎng)條件能影響甚至調(diào)節(jié)卵母細胞的減數(shù)分裂規(guī)律，是該技術(shù)的核心部分。目前有各種體外成熟的培養(yǎng)液報道，但目前還沒有較為理想穩(wěn)定的商品化未成熟卵體外成熟培養(yǎng)液問世。
該技術(shù)的臨床應(yīng)用不僅能夠幫助一些頑固性多囊卵巢綜合征、有卵巢過度刺激病史、及某些卵子成熟障礙的不育患者獲得妊娠，大大節(jié)約促超排卵藥物的昂貴費用，以及藥物對卵巢刺激帶來的諸多副作用，而且能為人類卵子發(fā)生發(fā)育機制的基礎(chǔ)研究提供重要的理論依據(jù)。特別是對未成熟卵的冷凍保存、復(fù)蘇、成熟和受精的臨床價值更為重要，使“卵子庫”的建立成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是建立一種高效、價廉、方便實用的未成熟卵體外成熟系統(tǒng)，即未成熟卵體外成熟培養(yǎng)液，以期獲得較高的臨床妊娠率。
本發(fā)明的技術(shù)方案為首次將人成熟卵泡液作為重要成分，加入培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液成分包括Ham′s F-10或TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Sigma，USA)，10％SSS(人體代血清，Irven，USA)，0.05-0.1IU/ml rFSH(Serono，Switzerland)，0.2-0.7IU/ml HCG(Serono，Switzerland)，0.2-1.5ug/ml 17β-E2(Sigma，USA)，以及10-15％人成熟卵泡液。供者的成熟卵泡液經(jīng)過56℃滅活30分鐘，過濾滅菌，-20℃凍存。
南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/江蘇省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科臨床生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室的研究人員在動物實驗研究的基礎(chǔ)上，自2001年以來，采用本發(fā)明技術(shù)配制的含人成熟卵泡液的培養(yǎng)系統(tǒng)，進行了IVM技術(shù)的臨床實驗研究，經(jīng)過對13例患者15個IVM周期的治療，共獲得5例臨床妊娠(第一例于2001年11月9日(39+周)上午因嬰兒臀位行剖腹產(chǎn)，9時35分順利出生一健康女嬰，體重2900g，Apgar評分滿分)，臨床妊娠率為33.3％(5/15)，已接近并達到國際先進水平。
該發(fā)明技術(shù)制備的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液高效、價廉、方便、以及來源容易，取得良好的臨床效果。該培養(yǎng)液可制成商品化的制劑，用于未成熟卵體外成熟技術(shù)。
具體實施例方式
1.患者進行輕微的促排卵準備和子宮內(nèi)膜準備，B超監(jiān)測卵泡直徑平均在6-12mm時，在B超下經(jīng)陰道穿刺獲取未成熟卵子。
2.將未成熟卵取出，在本發(fā)明配制的含成熟卵泡液的培養(yǎng)液中，于37℃，5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)36-48小時，將卵丘顆粒細胞除去，對卵子進行成熟度評分，未成熟卵的成熟率達68.4％。
3.取得丈夫精子處理后，將呈現(xiàn)第一極體成熟標志的成熟卵，按單精子卵漿內(nèi)注射方法進行體外受精，受精率達75％，體外培養(yǎng)2-3天，將卵裂至4-8細胞的胚胎種植到母親子宮內(nèi)。
4.母親的子宮內(nèi)膜按卵子成熟和受精的時相，進行同步化準備，接受胚胎著床，并進行健黃體和胚胎維持，妊娠率33.3％。
權(quán)利要求
1.一種含人成熟卵泡液的未成熟卵體外成熟培養(yǎng)液，其特征在于培養(yǎng)液由Ham′sF-10或TCM199，人代血清SSS，rFSH，HCG，17β雌二醇，以及人成熟卵泡液組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含人成熟卵泡液的未成熟卵體外成熟培養(yǎng)液，其特征是培養(yǎng)液由Ham′sF-10或TCM199，10％人代血清SSS，0.05-0.1IU/ml rFSH，0.2-0.7IU/ml HCG，0.2-1.5ug/ml 17β雌二醇，以及10-15％人成熟卵泡液組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含人成熟卵泡液的未成熟卵體外成熟培養(yǎng)液，其特征是培養(yǎng)液可制成商品化的制劑，用于未成熟卵體外成熟技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明屬于輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的含人成熟卵泡液的培養(yǎng)液用于人未成熟卵的體外培養(yǎng)技術(shù),其成分由Ham′sF－10或TCM199,人代血清SSS,rFSH,HCG,17β雌二醇,以及人成熟卵泡液組成。利用未成熟卵體外成熟技術(shù)(IVM),將卵子成熟障礙的不孕癥婦女的未成熟卵取出,采用本發(fā)明技術(shù)制備的培養(yǎng)液將其培養(yǎng)成熟,并在體外受精和進行胚胎移植,幫助其妊娠。獲得了65%的卵子成熟率和33.3%的妊娠率。本發(fā)明技術(shù)提供了一種高效、價廉、方便的人卵子體外成熟的培養(yǎng)液,并有可能將其制成商品化的制劑,用于人未成熟卵的體外成熟技術(shù)。
文檔編號C12N5/08GK1385523SQ02112608
公開日2002年12月18日 申請日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月29日
發(fā)明者錢云, 劉嘉茵, 冒韻東, 王淑玉, 丁衛(wèi), 楊乃明 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院