TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法
【專利說明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明為一種TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
二、【背景技術(shù)】
[0002]人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC是從正常人體臍帶分離得到的靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，可表達(dá)多種炎癥因子及與血管收縮或舒張相關(guān)的多種關(guān)鍵酶，是生理、藥理研究中廣泛應(yīng)用的細(xì)胞模型系統(tǒng)。
[0003]TNF-α是重要的促炎癥細(xì)胞因子，在心血管疾病中起重要作用。TNF-α是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，在心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要作用。TNF-α可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，繼而產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如細(xì)胞間粘附因子(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)，單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)等，從而引起白細(xì)胞及單核細(xì)胞遷移至血管屏蔽，引起血管炎癥反應(yīng)。正常內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)MCP-1，ICAM-1和VCAM-1蛋白，或表達(dá)量很少。經(jīng)TNF-α刺激之后，內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1 ,ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)明顯增加，且蛋白表達(dá)量的變化與TNF-α的濃度和刺激時間有密切關(guān)系。進(jìn)過我們實驗發(fā)現(xiàn)在TNF-α濃度為1ng / ml及刺激6h時，三者表達(dá)量均達(dá)到峰值。
[0004]利用TNF-α誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC產(chǎn)生炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，可以用于深入探討血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的機(jī)制，預(yù)防和調(diào)節(jié)過激的炎癥反應(yīng)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，對預(yù)防和治療血管炎癥疾病具有積極的意義。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題本發(fā)明主要是提供一種用TNF-α誘導(dǎo)來制備人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥細(xì)胞反應(yīng)模型的方法。
[0006]技術(shù)方案本發(fā)明為一種TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，包括:
[0007]DHUVEC細(xì)胞培養(yǎng)=HUVEC細(xì)胞用Μ199完全培養(yǎng)基(含酚紅、20%新生小牛血清、2mmol / L L-谷氨酰胺、100U / ml青霉素、100U / ml鏈霉素、100 μ g/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-肝素)置于37°C,5% CO2的溫箱中培養(yǎng)。
[0008]2)HUVEC樣品制備:待細(xì)胞長滿至80% -90%單層，用15ml的lmg/ml的I型膠原酶消化15-20min制備成細(xì)胞懸液，取1ul于血球計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*106 /ml ο
[0009]3) HUVEC細(xì)胞同步化:取2ml細(xì)胞懸液至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿至90%時，換無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24h，使所有細(xì)胞同步化。
[0010]4)TNF- α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞炎癥反應(yīng):加入終濃度為10ng/ml的TNF-α，刺激HUVEC細(xì)胞6h，取細(xì)胞上清液用ELISA法測定細(xì)胞炎癥因子MCP-1、ICAM-1、VCAM-1，蛋白含量均升聞。
[0011]有益效果本發(fā)明旨在建立一種簡單易行的炎癥反應(yīng)體外細(xì)胞模型。本方法選用TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的多種炎癥因子，明顯提高了 HUVEC細(xì)胞MCP-1、ICAM-U VCAM-1的蛋白表達(dá)含量。此炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，可以用于深入探討血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的機(jī)制，預(yù)防和調(diào)節(jié)過激的炎癥反應(yīng)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，對預(yù)防和治療血管炎癥疾病具有積極的意義。
四、【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0013]實施例1
[0014]用M199完全培養(yǎng)基在37°C，5% CO2的溫箱中培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞至細(xì)胞長滿80% -90%單層，用15ml的lmg/ml的I型膠原酶消化15_20min制備成細(xì)胞懸液，取1ul于血球計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*106 / ml。取2ml細(xì)胞懸液至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿至90 %時，換無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24h，使所有細(xì)胞同步化。加入終濃度為10ng/ml的TNF- α，刺激HUVEC細(xì)胞6h，取細(xì)胞上清液ELISA法在酶標(biāo)儀450nm下測定OD值，檢測細(xì)胞炎癥因子MCP-1、ICAM-U VCAM-1蛋白，結(jié)果表明MCP-1濃度從 0.130±0.007 μ g/L 上升到 0.608±0.018μ g/L(P < 0.001)，ICAM-1 濃度從0.133±0.002yg / L 上升到 0.669±0.033 μ g/L(P < 0.01)，VCAM-1 濃度從 0.147 μ g /L±0.0il μ g/L上升至IJ 0.538±0.019 μ g/L(P < 0.01)，三者的蛋白含量均升高。
【主權(quán)項】
1.TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，包括了以下步驟: 1)用Μ199完全培養(yǎng)基(I含酚紅、20%新生小牛血清、2mmol/ L L-谷氨酰胺、100U /ml青霉素、100U / ml鏈霉素、10yg / ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-肝素)置于37°C,5%CO2的溫箱中培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞 2)HUVEC細(xì)胞長滿至80% -90%單層，用15ml的lmg/ml的I型膠原酶消化15_20min制備成細(xì)胞懸液，取1ul于血球計數(shù)板上計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*106 / ml。 3)取2ml細(xì)胞懸液至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿至90%時，換無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24h，使所有HUVEC細(xì)胞同步化。 4)加入終濃度為1ng/ ml的TNF-α，刺激6h，取細(xì)胞上清，根據(jù)ELISA法，取細(xì)胞上清液在酶標(biāo)儀450nm下測定OD值看細(xì)胞炎癥因子MCP-1、ICAM-1、VCAM_1，發(fā)現(xiàn)蛋白含量均升高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，其特征在于=HUVEC細(xì)胞用Μ199完全培養(yǎng)基(含酚紅、20 %新生小牛血清、2mmol /L L-谷氨酰胺、100U / ml青霉素、100U / ml鏈霉素、10yg / ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-肝素)于37°C，5% CO2培養(yǎng)，長滿至80% -90%單層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，其特征在于:加入15ml的膠原酶I型(lmg / ml)在37°C消化制備成細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，其特征在于:細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為1*106 / ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，其特征在于:2ml細(xì)胞懸液至6孔板培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿至90%時換無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，其特征在于:加入終濃度為1ng / ml的TNF-α，刺激HUVEC細(xì)胞6h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，其特征在于:取細(xì)胞上清液用EELISA法，在酶標(biāo)儀450nm下測定OD值，檢測細(xì)胞炎癥因子MCP-1、ICAM-1、VCAM-1，蛋白含量均升高。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC炎癥反應(yīng)模型的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。內(nèi)容包括：1)HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)：HUVEC細(xì)胞用M199完全培養(yǎng)基置于37℃，5％CO2的溫箱中培養(yǎng)。2)HUVEC樣品制備：待細(xì)胞長滿至80％-90％單層，用15ml的1mg/ml的I型膠原酶消化15-20min制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1*106/ml。3)HUVEC細(xì)胞同步化：取2ml細(xì)胞懸液至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿至90％時，換無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24h，使所有細(xì)胞同步化。4)TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞炎癥反應(yīng)：加入終濃度為10ng/ml的TNF-α，刺激HUVEC細(xì)胞6h，取細(xì)胞上清液ELISA法測定細(xì)胞炎癥因子MCP-1、ICAM-1、VCAM-1，蛋白含量均升高。本發(fā)明建立起的HUVEC炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，簡便易行，可用于炎癥反應(yīng)機(jī)理研究和抗炎藥物的體外細(xì)胞實驗。
【IPC分類】C12N5-071
【公開號】CN104726393
【申請?zhí)枴緾N201310718727
【發(fā)明人】黃午陽, 王興娜, 李春陽, 閆征, 王帆, 王健
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年12月24日