專利名稱：制造1,4-二羥基-2萘甲酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及1，4-二羥基-2-萘甲酸(或1，4-二羥基-2-萘羧酸)(下文中也簡(jiǎn)稱為“DHNA”)的工業(yè)制造方法；含該化合物的藥物；含該化合物的食物和飲料并因而有助于改進(jìn)腸內(nèi)菌群、緩解乳糖不耐性引起的腹部不適、防止或治療代謝性骨疾病。
背景領(lǐng)域?qū)δ溉槲桂B(yǎng)嬰兒和牛乳喂養(yǎng)嬰兒中發(fā)現(xiàn)的腸內(nèi)菌群的對(duì)比研究表明雙歧桿菌有助于改善人體健康。如所證實(shí)的，體內(nèi)雙歧桿菌的量由于胃腸道疾病或類似疾病、或老化而顯著減少，促進(jìn)腸內(nèi)雙歧桿菌增殖對(duì)防止癌發(fā)生、腸腐敗、傳染病有效。因此，認(rèn)為腸內(nèi)雙歧桿菌的選擇性增殖對(duì)維持健康和防止及治療多種疾病包括生活方式-相關(guān)疾病非常重要。
通常，一些能促進(jìn)有益雙歧桿菌增殖的物質(zhì)-這種物質(zhì)稱為“雙歧因子”-被研究和報(bào)導(dǎo)。這些物質(zhì)的例子包括母奶中發(fā)現(xiàn)的N-乙酰氨基葡萄糖(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，90，219(1995))；肽-相關(guān)物質(zhì)(Am.J.Clin.Nutr.，32，1428(1974)和Agric.Biol.Chem.，48，2159(1984))；胡蘿卜提取物(日本生物科學(xué)、生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)化學(xué)雜質(zhì)(Journal of Japan Sciety for Bioscience，Biotechnology，and Agrochemistry)，55，499(1981)和Chem.Pharm.Bull.，(東京)14，1191(1966))；糖-相關(guān)物質(zhì)(Proceedings of Tohoku Fukushi University，10，313(1986))。
然而，制備任何這些能促進(jìn)雙歧桿菌增殖的物質(zhì)需要復(fù)雜的方法，這種物質(zhì)在僅選擇性增殖雙歧桿菌上的效果需要改進(jìn)。
考慮到前述內(nèi)容，本發(fā)明者對(duì)能選擇性促進(jìn)雙歧桿菌增殖的化合物進(jìn)行了廣泛的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些種類的萘醌衍生物和萘衍生物在促進(jìn)不同雙歧桿菌增殖上表現(xiàn)出強(qiáng)活性(如長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌(B.breve)、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、兩杈乳桿菌(B.bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)和假長(zhǎng)雙歧桿菌假長(zhǎng)亞種(B.pseudolongum)。同樣，除了這些已知化合物，本發(fā)明者描述了一種高活性的雙歧桿菌增殖促進(jìn)物質(zhì)且證實(shí)此物質(zhì)是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌，它是常規(guī)上未知(換句話說是新的)物質(zhì)且通過屬于丙酸桿菌屬的細(xì)菌在胞內(nèi)和胞外生成(日本專利申請(qǐng)公開(kokai)號(hào)8-98677)。此外，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌可有效作為防止或治療代謝性骨疾病如骨質(zhì)疏松癥的藥物(WO 01/28547)。
同時(shí)，已知DHNA可用作工業(yè)物質(zhì)如染料、顏料或感光物質(zhì)且發(fā)展了多種DHNA的有機(jī)化學(xué)合成方法(如日本專利申請(qǐng)公開(kokai)號(hào)57-128655、59-186942和60-104037)。然而，這種常規(guī)合成方法需要有機(jī)溶劑中的高溫、高壓反應(yīng)，或使用如非食用藥劑作為催化劑等。此外，通過這種方法從產(chǎn)生的DHNA中完全去除用于生產(chǎn)它的溶劑或藥劑有困難。因此，不認(rèn)為通過這種常規(guī)生產(chǎn)方法產(chǎn)生的DHNA在食物和飲料或藥物中是有用的。
發(fā)明的描述本發(fā)明者對(duì)多種化合物作了進(jìn)一步的研究，這些化合物具體對(duì)雙歧桿菌表現(xiàn)出增殖促進(jìn)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過屬于丙酸桿菌屬的細(xì)菌在胞內(nèi)和胞外生成大量1，4-二羥基-2-萘甲酸(DHNA)，含收集自所得培養(yǎng)物肉湯的1，4-二羥基-2-萘甲酸的組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽表現(xiàn)出緩解牛奶不耐性引起的腹部不適的效果，可用于防止或治療代謝性骨疾病，這是因?yàn)榇嘶衔锎龠M(jìn)造骨細(xì)胞分化和造骨細(xì)胞功能的表達(dá)、抑制造骨細(xì)胞形成。本發(fā)明在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成。1，4-二羥基-2-萘甲酸鹽的例子包括藥學(xué)或營養(yǎng)學(xué)上可接受鹽類。這些鹽的典型例子包括乙酸鹽、苯磺酸鹽、安息香酸鹽、碳酸氫鹽、乳酸鹽和檸檬酸鹽，它們不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，包括培養(yǎng)能制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的微生物，從而使微生物在培養(yǎng)物肉湯中產(chǎn)生1，4-二羥基-2-萘甲酸，收集這樣生成的1，4-二羥基-2-萘甲酸。
本發(fā)明還提供了含1，4-二羥基-2-萘甲酸的組合物，該組合物通過上述制造方法產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了用于緩解腹部不適的食物和飲料、緩解腹部不適的藥劑、腸功能調(diào)節(jié)劑、防止或治療代謝性骨疾病的食物和飲料、或防止或治療代謝性骨疾病的藥劑，藥劑包括含1，4-二羥基-2-萘甲酸的組合物作為活性成分，組合物通過上述制造方法、或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了含1，4-二羥基-2-萘甲酸的組合物的使用，組合物通過上述制造方法、或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽產(chǎn)生，用于生成緩解腹部不適的食物和飲料、緩解腹部不適的藥劑、腸功能調(diào)節(jié)劑、防止或治療代謝性骨疾病的食物和飲料、或防止或治療代謝性骨疾病的藥劑。
本發(fā)明還提供了治療腹部不適的方法、調(diào)節(jié)腸功能的方法、或治療代謝性骨疾病的方法，該方法包括施用有效劑量的組合物給需要的受試者，組合物含1，4-二羥基-2-萘甲酸，通過上述制造方法、或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽產(chǎn)生。
附圖概述

圖1顯示攝入乳制飲料后六小時(shí)內(nèi)受試者報(bào)告的腹部膨脹強(qiáng)度，乳制飲料結(jié)合本發(fā)明含高濃度DHNA的組合物。
圖2顯示攝入乳制飲料后六小時(shí)內(nèi)受試者報(bào)告的腹部膨脹頻率，乳制飲料結(jié)合本發(fā)明含高濃度DHNA的組合物。
圖3顯示攝入乳制飲料后六小時(shí)內(nèi)受試者報(bào)告的腹部鼓脹(腹鳴)頻率，乳制飲料結(jié)合本發(fā)明含高濃度DHNA的組合物。
圖4顯示DHNA促進(jìn)造骨細(xì)胞鈣化的效果。
圖5顯示DHNA抑制骨密度減少的效果。
完成發(fā)明的最佳模式本發(fā)明使用能制造1，4-二羥基-2-萘甲酸(DHNA)的細(xì)菌。這種細(xì)菌所屬的種屬例子包括丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢乳桿菌屬(Sporolacbacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。大部分這些微生物常規(guī)用于生成食物和飲料和藥物，因此優(yōu)選使用這種細(xì)菌生成含DHNA的食物和飲料或含DHNA的藥物。丙酸菌的例子包括生成干酪的細(xì)菌，如費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、特氏丙酸桿菌(P.thoenii)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(P.acidipropionici)和詹氏丙酸桿菌(P.jensenii)；貪婪丙酸桿菌(P.avidum)；瘡皰丙酸桿菌(P.acnes)；嗜淋病丙酸桿菌(P.lymphophilum)和顆粒丙酸桿菌(P.granulosam)。屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌例子包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)。本發(fā)明中所用微生物優(yōu)選是費(fèi)氏丙酸桿菌。具體例子包括費(fèi)氏丙酸桿菌IFO 12424(P.freudenreichii IFO 12424)和費(fèi)氏丙酸桿菌ATCC 6207(P.freudenreichii ATCC 6207)。
為通過本發(fā)明方法生成DHNA，首先能產(chǎn)生DHNA的菌株在含營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中有氧或厭氧培養(yǎng)，一般的微生物可生長(zhǎng)在此培養(yǎng)基中。營養(yǎng)物可以是常規(guī)用于培養(yǎng)微生物的已知營養(yǎng)物。含營養(yǎng)物的培養(yǎng)基具體優(yōu)選含脫脂奶粉的培養(yǎng)基；含胰胨、植胨、酵母提取物和葡萄糖的培養(yǎng)基；或培養(yǎng)基主要含乳糖酶-處理的乳清礦物質(zhì)、乳清粉、經(jīng)蛋白酶處理的的乳清粉、乳清蛋白質(zhì)濃縮物或處理濃縮物獲得的產(chǎn)物。在本發(fā)明中，最優(yōu)選的是經(jīng)蛋白酶處理的的脫脂奶粉用作培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)來源。在經(jīng)蛋白酶處理的的乳清粉用于培養(yǎng)基的情況中，當(dāng)至少一種酵母提取物和乳糖在培養(yǎng)方法中用作添加劑時(shí)，所得培養(yǎng)物肉湯中產(chǎn)生的DHNA量可能增加。在培養(yǎng)方法中，葡萄糖或乳糖酶-處理的乳糖可取代乳糖用作添加劑。然而，當(dāng)經(jīng)蛋白酶處理的的脫脂奶粉用作培養(yǎng)基的主要原料，最優(yōu)選的是乳糖用作培養(yǎng)基中的糖。其次描述的是在經(jīng)蛋白酶處理的的脫脂奶粉用作培養(yǎng)基原料的情況中的一種示范培養(yǎng)基制備方法。
脫脂奶粉溶解于水中使脫脂奶粉濃度為10％(w/v)，接著用蛋白酶降解蛋白質(zhì)。待使用的蛋白酶量是全部脫脂奶粉的0.25％(w/v)。蛋白質(zhì)降解在47℃和pH6.8進(jìn)行6小時(shí)，在蛋白質(zhì)降解中碳酸鉀水溶液用于調(diào)節(jié)pH。脫脂奶粉濃度(最終培養(yǎng)基濃度)調(diào)節(jié)到10％(w/v)，最后加入酵母提取物使酵母提取物量為全部脫脂奶粉的1-10％(w/v)，優(yōu)選為3-7％(w/v)。
生成DHNA的菌株可通過任何已知的多種有氧和厭氧培養(yǎng)方法來培養(yǎng)，但從大規(guī)模生成DHNA看，用液體培養(yǎng)基的有氧和厭氧培養(yǎng)方法最優(yōu)選。培養(yǎng)在下列條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度約20到約40℃，培養(yǎng)基pH中性到微酸(優(yōu)選5.5到7.5)。在液體培養(yǎng)的情況中，培養(yǎng)開始后約1到約5天，DHNA積聚在培養(yǎng)基和菌株中。通過在培養(yǎng)方法中加入乳糖來增加產(chǎn)生的DHNA量。這樣生成的DHNA可在培養(yǎng)完成后立即從所得培養(yǎng)物肉湯中收集。然而，優(yōu)選的是培養(yǎng)物肉湯被冷卻(在3-20℃，約10℃最優(yōu)選)并保存(優(yōu)選約2-4周)，從而使DHNA進(jìn)一步在培養(yǎng)物肉湯中積聚。
接著會(huì)描述DHNA收集方法。優(yōu)選的是，上面獲得的培養(yǎng)物肉湯進(jìn)行吸附層析。可使用的吸附劑例子包括用于反相層析的吸附劑，如活性碳和合成吸附劑(如Diaion HP-20，Mitsubishi化學(xué)公司的產(chǎn)品)。首先，柱用吸附劑填充，柱用0.5％(w/v)抗壞血酸鈉水溶液洗滌。隨后，上面獲得的培養(yǎng)物肉湯加入柱(通過柱的流體表示為“通過(pass)”)，用0.5％(w/v)抗壞血酸鈉水溶液將水溶性部分從培養(yǎng)物肉湯中去除。其后，所得培養(yǎng)物肉湯用含0.5％(w/v)抗壞血酸鈉的乙醇洗脫，濃縮乙醇洗脫的部分，從而產(chǎn)生含高濃度DHNA的組合物。當(dāng)含DHNA的組合物被進(jìn)一步純化時(shí)，可生成純DHAN或其鹽。取代乙醇的甲醇可用于從柱中洗脫DHNA。
DHNA鹽的例子包括藥學(xué)或營養(yǎng)學(xué)上可接受鹽類。這些鹽的典型例子包括乙酸鹽、苯磺酸鹽、安息香酸鹽、碳酸氫鹽、乳酸鹽和檸檬酸鹽，它們不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。
DHNA包含于DHNA-生成細(xì)菌(胞內(nèi)和/或胞外)的培養(yǎng)物肉湯中。因此，培養(yǎng)物肉湯本身可用例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器而不是吸附層析濃縮，從而產(chǎn)生含高濃度DHNA的組合物。優(yōu)選的是，細(xì)菌細(xì)胞通過一般使用的離心技術(shù)從培養(yǎng)物肉湯中分離，濃縮所得上清。這樣獲得的組合物外形根據(jù)其使用而變化；例如，組合物可以液體形式使用或可形成粉狀產(chǎn)物。
術(shù)語“牛奶不耐性”指腹部不適的情況如攝入牛奶后發(fā)生的腹部疼痛、腹鳴和腹瀉。大部分這種腹部不適與乳糖不耐性相關(guān)，這是由于攝入牛奶等中所含乳糖引起。在許多情況中，乳糖不耐性由于小腸中乳糖酶活性缺乏或降低引起。本發(fā)明的組合物或DHNA或其鹽(下文中也簡(jiǎn)稱為“組合物等”)表現(xiàn)出攝入牛奶后緩解腹部不適的效果。此外，組合物等表現(xiàn)出促進(jìn)造骨細(xì)胞分化和表達(dá)造骨細(xì)胞功能的效果以及抑制造骨細(xì)胞形成的效果，因此可用于防止或治療代謝性骨疾病如骨質(zhì)疏松癥。組合物等可采取食物和飲料或藥物的形式。例如，通過直接施用藥物形式的組合物等，通過直接攝取有具體用途食物(如具體健康用途的食物)或營養(yǎng)物形式的組合物等，或通過攝取多種含組合物等的食物(如牛奶、發(fā)酵牛奶和酸奶)，可改進(jìn)腸內(nèi)菌群，可緩解例如攝入牛奶產(chǎn)生的腹部不適，可防止或治療代謝性骨疾病。
在本發(fā)明組合物或DHNA或其鹽用作藥物的情況中，組合物等的外形可根據(jù)施用方式來適當(dāng)選擇。外形的例子包括口服形式如片劑、膠囊、顆粒、粉末和糖漿。這種藥物產(chǎn)品可通過常規(guī)方法制備，使用一般用于藥物制備技術(shù)領(lǐng)域的已知佐劑作為主要試劑，如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑、除臭劑、溶解促進(jìn)劑、懸浮劑或涂層劑。
當(dāng)用于人時(shí)，優(yōu)選的是這種藥物產(chǎn)品口頭施用。口頭施用給待治療病人的有效劑量DHNA(即活性成分)根據(jù)病人的年齡和病理情況變化，但一般人的日服DHNA劑量是每千克體重0.03到3μg，優(yōu)選是0.1到1μg。
當(dāng)口頭施用時(shí)，本發(fā)明的組合物或DHNA或其鹽達(dá)到它預(yù)期的目的；即改進(jìn)腸內(nèi)菌群、緩解攝入牛奶引起的腹部不適、防止或治療代謝性骨疾病。因此，組合物等可以食物和飲料形式使用。這種含DHNA的食物和飲料可通過任何多種技術(shù)制備；例如含高濃度DHNA的本發(fā)明組合物或DHNA或其鹽加入到任何多種佐劑或食物和飲料，從而制備不同的食物和飲料(如飲料產(chǎn)品和片劑)；或組合物等直接加入食物和飲料。這樣制備的食物和飲料使DHNA能長(zhǎng)時(shí)間攝取，因此可以一般食物和飲料、具體用途的食物(如具體健康用途的食物)或營養(yǎng)物形式商業(yè)提供。
實(shí)施例接著關(guān)于試驗(yàn)例和實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
試驗(yàn)例1篩選DHNA的細(xì)菌培養(yǎng)條件下述各試驗(yàn)細(xì)菌接種到含脫脂奶粉的培養(yǎng)基中(描述于下面的實(shí)施例1)，細(xì)菌用GasPak方法在37℃厭氧培養(yǎng)18到72小時(shí)。
(A)費(fèi)氏丙酸桿菌IFO 12424(培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí))(B)產(chǎn)丙酸丙酸桿菌IFO 12425(72小時(shí))(C)詹氏丙酸桿菌IFO 12427(72小時(shí))(D)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ATCC 10697(24小時(shí))(E)腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)JCM 9700(24小時(shí))(F)嗜酸性乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4357(18小時(shí))(G)植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)IFO 12006(18小時(shí))(H)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)JCM 1136(18小時(shí))(I)干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469(18小時(shí))(J)長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC 15707(18小時(shí))(K)兩杈乳桿菌ATCC 11146(18小時(shí))(L)青春雙歧桿菌ATCC 15703(18小時(shí))(M)短雙歧桿菌ATCC 15700(18小時(shí))DHNA分析條件(HPLC分析)柱C18，填充顆粒大小3μm，內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)度150mm(C18Cadenza CD-C18，Imtakt公司產(chǎn)品)洗脫液∶乙腈∶甲醇∶水∶乙酸＝10∶20∶200∶0.1(pH7.0(用5％氨水調(diào)節(jié)))流速1.5mL/分鐘進(jìn)樣量20μl檢測(cè)器UV 254nmHPLC樣品制備方法抗壞血酸鈉(0.1％(w/v))加入上面獲得的培養(yǎng)物肉湯(10ml)，所得混合物的pH調(diào)節(jié)到7.0，水加入混合物使所得混合物的總體積為20ml。其后，混合物的等分樣品(3ml)與甲醇混合(3ml)，所得混合物以3,000rpm離心10分鐘。這樣獲得的上清用0.45μm過濾器過濾。
DHNA的定量上面制備的HPLC樣品中所含的DHNA量在下列前面得到的可商業(yè)獲得DHNA標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上計(jì)算(Wako Pure Chemical Industries有限公司產(chǎn)品)保留時(shí)間＝約13分鐘，HPLC峰面積和DHNA濃度間的關(guān)系(校準(zhǔn)曲線)。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌(Propionibacteria)(A)到(C)的各培養(yǎng)物肉湯包含3.0μg/ml或更多量的DHNA。盡管在乳球菌屬(D)或明串珠菌屬(E)的培養(yǎng)物肉湯中發(fā)現(xiàn)痕量DHNA，乳桿菌(Lactobacilli)(F)到(I)和雙歧桿菌(Bifidobacteria)(J)到(M)的各培養(yǎng)物肉湯中沒有檢測(cè)到DHNA。即發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌屬是本發(fā)明中所用的理想DHNA-生成細(xì)菌(表1)。同時(shí)，枯草芽孢桿菌用與上述類似的培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這樣獲得的培養(yǎng)物肉湯包含DHNA。
表1

N.D.沒有檢測(cè)到實(shí)施例1含DHNA的組合物的制造方法啤酒酵母提取物(Asahi釀酒有限公司產(chǎn)品)(0.1％(w/v))加入脫脂乳培養(yǎng)基(含10％重量脫脂奶粉的溶液)，該培養(yǎng)基的制備是通過在水中溶解脫脂奶粉使脫脂奶粉濃度為10％(w/v)。所得培養(yǎng)基以分開的方式(50L)置于20個(gè)錐形燒瓶中(體積每個(gè)5L)，各燒瓶中的培養(yǎng)基用高壓滅菌器在121℃滅菌7分鐘。費(fèi)氏丙酸桿菌IFO12424菌株的活化培養(yǎng)物肉湯(60ml)接種到各所得培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)在氮保護(hù)氣中37℃進(jìn)行72小時(shí)，從而產(chǎn)生含3μg/ml 1，4-二羥基-2-萘甲酸的組合物(50L)。制備上述活化培養(yǎng)物肉湯是通過接種費(fèi)氏丙酸桿菌(2％(w/v))到TPYG培養(yǎng)基(胰胨(BBL)(8g)、植胨(BBL)(3g)、啤酒酵母提取物(5g)、L-半胱氨酸氫氯化物(0.5g)、葡萄糖(20g)、K2HPO4(2g)、KH2PO4(3g)、MgCl2·6H2O(0.5g)、FeSO4·7H2O(10mg)、H2O(1,000ml)，pH6.5)，接著用GasPak方法在37℃厭氧培養(yǎng)72小時(shí)。
實(shí)施例2含高濃度DHNA的組合物的制造方法脫脂奶粉溶解于水中使脫脂奶粉濃度為10到20％(w/w)，蛋白酶[AmanoA](Amano藥物有限公司產(chǎn)品)加入所得溶液使蛋白酶量為全部脫脂奶粉的0.25％(w/w)，接著47℃酶降解所得混合物6小時(shí)。在酶降解方法中，混合物的pH用碳酸鉀水溶液維持在6.8。所得反應(yīng)混合物在85℃加熱5分鐘以滅活酶，隨后水加入反應(yīng)混合物使脫脂奶粉濃度為10％(w/w)。啤酒酵母提取物(Asahi釀酒有限公司產(chǎn)品)加入反應(yīng)混合物后使提取物的量為全部脫脂奶粉的5％(w/w)，混合物(1.5Kg)置于發(fā)酵器中(體積2L)，隨后用高壓滅菌器在121℃滅菌7分鐘。氮?dú)膺M(jìn)入發(fā)酵器使氣體在所得培養(yǎng)基表面上流動(dòng)，培養(yǎng)基以150rpm攪拌，培養(yǎng)基溫度調(diào)節(jié)到33℃。培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定到33℃后，將費(fèi)氏丙酸桿菌ET-3菌株的冷凍濃縮起子(starter)(于2001年8月9日保藏在國際專利生物保藏所，先進(jìn)工業(yè)科學(xué)技術(shù)國立學(xué)院(International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)(中心6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan(郵編305-8566))，保藏號(hào)為FERM BP-8115)接種到培養(yǎng)基中，開始厭氧培養(yǎng)。乳糖(2％(w/w))和乳糖(1.3％(w/w))分別在此培養(yǎng)開始72小時(shí)和96小時(shí)后加入培養(yǎng)物肉湯。此厭氧培養(yǎng)在氮保護(hù)氣中33℃進(jìn)行120小時(shí)，培養(yǎng)物肉湯的pH用40％(w/w)碳酸鉀水溶液維持在6.45，結(jié)果DHNA(30μg/ml)在培養(yǎng)物肉湯中產(chǎn)生。培養(yǎng)120小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物肉湯(1.5kg)中消耗的堿量為131g?？箟难徕c加入所得培養(yǎng)物肉湯使抗壞血酸鈉的量為全部培養(yǎng)物肉湯的0.5％(w/w)，所得混合物的pH用碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)到8.0，接著冷卻到10℃。所得培養(yǎng)物肉湯在10℃保存2周，結(jié)果培養(yǎng)物肉湯的DHNA含量增加到40μg/ml。上面使用的冷凍濃縮起子通過下列方法制備費(fèi)氏丙酸桿菌ET-3菌株的活化培養(yǎng)物肉湯(通過在培養(yǎng)基中33℃厭氧培養(yǎng)菌株48小時(shí)來制備，培養(yǎng)基主要含前述經(jīng)蛋白酶處理的的脫脂奶粉)(2％(w/w))接種到主要含前述經(jīng)蛋白酶處理的的脫脂奶粉的培養(yǎng)基中，接著33℃培養(yǎng)72小時(shí)；培養(yǎng)完成后，收集培養(yǎng)菌株并隨后進(jìn)行離心，從而使細(xì)菌細(xì)胞濃度增加約20倍；適當(dāng)量的所得產(chǎn)物置于滅菌容器，-80℃冷凍或更低，隨后-80℃保存。
實(shí)施例3用柱層析濃縮實(shí)施例1所得組合物柱用Diaion HP-20填充(4L)，用0.5％(w/v)抗壞血酸鈉水溶液洗。隨后，實(shí)施例1中獲得的組合物(40Kg)加入柱。然后，用0.5％(w/v)抗壞血酸鈉水溶液(8L)將水溶性部分從組合物中去除。其后，含0.5％(w/v)抗壞血酸鈉的乙醇洗脫液(12L)加入柱，從而洗脫DHNA。乙醇洗脫的部分用蒸發(fā)器濃縮，從而產(chǎn)生含DHNA(115mg)的本發(fā)明組合物。
實(shí)施例4用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮實(shí)施例1所得組合物抗壞血酸鈉(0.5％(w/v))加入實(shí)施例1中獲得的組合物(5Kg)，所得混合物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮5倍，從而產(chǎn)生含DHNA(15mg)的本發(fā)明組合物(1Kg)。
由于實(shí)施例1到3的各組合物用產(chǎn)生干酪的丙酸細(xì)菌生成，實(shí)施例1到3中獲得的發(fā)明組合物可用于食物和飲料而沒有進(jìn)行任何處理。
實(shí)施例5DHNA的純化實(shí)施例2中獲得的濃縮物(培養(yǎng)物肉湯)溶解于pH調(diào)節(jié)到4.5的0.5％(w/v)抗壞血酸鈉水溶液(1L)，所得溶液用乙酸乙酯(1L)提取三次。這樣獲得的乙酸乙酯層混合在一起，隨后用無水硫酸鈉(200g)脫水，接著在低壓濃縮。所得濃縮物溶解于甲醇(80mL)，所得溶液的等分樣品(4mL)用C18柱純化?？箟难徕c加入所得DHNA洗脫部分(保留時(shí)間21到31分鐘)使抗壞血酸鈉含量為25％(w/v)，隨后所得混合物在低壓濃縮。所得濃縮物(800mL)用乙酸乙酯(300mL)提取兩次，隨后用無水硫酸鈉(50g)脫水，接著在低壓濃縮。通過500-MHz1H-NMR光譜的結(jié)構(gòu)分析鑒定最終的純化產(chǎn)物為DHNA。通過上面的方法，DHNA(115mg)從培養(yǎng)物肉湯(40L)生成。
柱Capcell Pak C18 SG120，φ50×500mm，批號(hào)930210(Shiseido有限公司產(chǎn)品)流動(dòng)相乙腈∶甲醇∶水∶乙酸＝20∶40∶200∶0.1(pH7.0(用5％氨水調(diào)節(jié)))溫度室溫流速100mL/分鐘進(jìn)樣量4mL檢測(cè)器UV 254nm<最終純化產(chǎn)物的NMR數(shù)據(jù)>
1H-NMR(500MHz，MeOH-d4)δ8.39(1H，d，J＝8.3Hz)，8.23(1H，d，J＝8.3Hz)，7.69(1H，dd，J＝8.3，6.9Hz)，7.60(1H，dd，J＝8.3，6.9Hz)，7.23(1H，s)實(shí)施例6急性毒性試驗(yàn)實(shí)施例2中所述含DHNA的組合物用五只小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)(5周齡商業(yè)上可獲得的ICR小鼠，適應(yīng)7天)。組合物連續(xù)5天施用給各小鼠(最大的日服劑量78.3mg/kg(DHNA0.9(≈115×(78.3/(10×1000)))mg/kg))，觀察這樣施用的小鼠14天。結(jié)果沒有小鼠死去，沒有小鼠被證實(shí)表現(xiàn)出體重、行為和解剖器官上的異常。
實(shí)施例7含有本發(fā)明含DHNA的組合物的食物的制備方法(片劑制備)實(shí)施例1中獲得的組合物(10Kg)在50℃凍干24小時(shí)，從而產(chǎn)生凍干的粉末(1Kg)。隨后，粉末(40％(w/w))結(jié)合到片劑基本物質(zhì)中，物質(zhì)含葡萄糖(80％(w/w))、干玉米淀粉(10％(w/w))、palatinit粉末(7％(w/w))和檸檬酸(3％(w/w))，所得物質(zhì)為各重0.5g的片劑。
實(shí)施例8含有本發(fā)明含DHNA的組合物的食物的制備方法(乳制飲料制備1)抗壞血酸鈉(15g)和實(shí)施例2中獲得的DHNA-包含組合物(125mg)加入原料乳，勻漿化所得混合物并隨后在130℃殺菌2秒鐘。每100ml所得產(chǎn)物裝入容器。
實(shí)施例9結(jié)合本發(fā)明DHNA-包含組合物的食物的制備方法(乳制飲料制備2)費(fèi)氏丙酸桿菌ET-3菌株(FERM P-18454)的活化培養(yǎng)物肉湯(60ml)接種到主要含經(jīng)蛋白酶處理的的乳清粉的培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基通過下列方法制備啤酒酵母提取物(Asahi釀酒有限公司產(chǎn)品)(0.1％(w/v))加入用蛋白酶(Amano A，Amano藥物有限公司產(chǎn)品)2小時(shí)蛋白降解(50℃，pH7.0)含10％重量乳清粉的溶液所得的溶液，所得混合物(50L)置于發(fā)酵缸中并隨后在121℃滅菌7分鐘)，接著在35℃ pH6.0厭氧培養(yǎng)90小時(shí)，抗壞血酸鈉(0.5％(w/v))加入所得培養(yǎng)物肉湯，從而產(chǎn)生本發(fā)明的組合物。這樣獲得的組合物(177.5ml)加入原料乳(9822.5ml)，勻漿化所得混合物并隨后在130℃殺菌2秒鐘。每100ml的所得產(chǎn)物裝入容器(DHNA含量11μg/100ml)。
上述活化的培養(yǎng)物肉湯用與實(shí)施例1中所述相同的方法制備，除了培養(yǎng)溫度變?yōu)?5℃。
實(shí)施例10本發(fā)明組合物對(duì)攝入乳制飲料1引起的腹部不適的效果實(shí)施例8中制備的乳制飲料用作測(cè)試飲料，用非發(fā)酵培養(yǎng)基以類似于實(shí)施例8的方法制備乳制飲料，此乳制飲料用作對(duì)照飲料。測(cè)試的受試者選擇在攝入牛奶后測(cè)量呼吸氫濃度時(shí)表現(xiàn)出小腸中低β-半乳糖苷酶活性的人，因而被認(rèn)為患乳糖不耐性。具體的是，受試者是15人(7名男性和8名女性，平均年齡28.07±3.41)，他們用對(duì)照飲料(400ml)進(jìn)行乳糖負(fù)荷測(cè)試，飲料攝取后6小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出呼吸氫濃度增加約20ppm或更多。
指示受試者從測(cè)試前一天22:00到測(cè)試當(dāng)天17:00避免攝取任何食物或飲料(除了水)。在測(cè)試當(dāng)天10:00，對(duì)照飲料(400ml)口頭施用給各受試者。到當(dāng)天17:00，腹部情況的調(diào)查表由受試者填寫(每30分鐘)，呼吸從受試者中取樣(每小時(shí))。一周后，測(cè)試飲料以類似于對(duì)照飲料施用的方式施用給各受試者。前面沒有通知受試者這些飲料的種類。
各受試者的呼吸用有旋塞的Tedlar袋取樣(體積1L)(GL Sciences公司)，用氣相色譜儀(GC-8A，Shimadzu公司)在下列分析條件下進(jìn)行氫氣分析柱分子篩5A(3mm×2m)，烤箱溫度40℃，運(yùn)載氣體氬，探測(cè)器TCD(導(dǎo)熱性探測(cè)器)。
腹部情況的調(diào)查表分發(fā)給各受試者，受試者每30分鐘填寫。腹部膨脹根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)用數(shù)字分級(jí)4與攝取后隨即的狀態(tài)相比顯著的腹部腸胃氣脹3與攝取后隨即的狀態(tài)相比適度的腹部腸胃氣脹2與攝取后隨即的狀態(tài)相比輕微的腹部腸胃氣脹1與攝取后隨即的狀態(tài)相比沒有可察覺的變化。積累攝取后以30分鐘間隔(從30分鐘到6小時(shí))獲得的這些數(shù)字分級(jí)。任何其它腹部情況包括腹瀉、腹部疼痛和腹部鼓脹也描述于調(diào)查表中。
攝取乳制飲料后隨即到攝取后6小時(shí)關(guān)于腹部情況的評(píng)估結(jié)果如下。在攝取對(duì)照飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)腹部膨脹值的累積值為17.93±4.83。相反，在攝取試驗(yàn)飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)累積值為15.83±3.65，顯著低于對(duì)照飲料情況中獲得的值(Wilcoxon試驗(yàn)，p＜0.05)(圖1)。在攝取對(duì)照飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)攝取后6小時(shí)內(nèi)受試者報(bào)告的腹部膨脹頻率為3.47±3.11。相反，在攝取試驗(yàn)飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)腹部膨脹頻率為2.47±2.90，低于攝取對(duì)照飲料情況中獲得的腹部膨脹頻率(p＝0.108)(圖2)。在攝取對(duì)照飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)攝取后6小時(shí)內(nèi)受試者報(bào)告的腹部鼓脹(腹鳴)頻率為2.87±2.75。相反，在攝取試驗(yàn)飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)腹部鼓脹頻率為1.47±2.10，顯著低于攝取對(duì)照飲料情況中獲得的腹部鼓脹頻率(p＜0.05)(圖3)。同時(shí)，在攝取對(duì)照飲料的情況中，兩個(gè)受試者抱怨腹瀉，但攝取試驗(yàn)飲料的情況中，沒有受試者抱怨腹瀉。在攝取對(duì)照飲料的情況中，未患腹部不適的受試者數(shù)量為兩個(gè)，但在攝取試驗(yàn)飲料的情況中，這類受試者的數(shù)量增加到六個(gè)(表2)。
在攝取對(duì)照飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)呼吸氫濃度的最大增加平均值是42.9±13.7ppm。相反，在攝取試驗(yàn)飲料的情況中，發(fā)現(xiàn)呼吸氫濃度的最大增加平均值是34.7±17.6ppm，低于攝取對(duì)照飲料情況中獲得的平均值(Wilcoxon試驗(yàn)，p＜0.051)(表2)。
表2攝取結(jié)合DHNA-包含組合物的乳制飲料對(duì)腹部不適和呼吸氫濃度的效果受試者 攝取對(duì)照飲料 攝取試驗(yàn)飲料號(hào) 年齡 性別 呼吸氫濃度*腹部情況§呼吸氫濃度*腹部情況§127女 30.2B，C 21.8 B225女 50.0N33.9 N328女 19.2B，C 6.7 C424女 32.1B，C 13.6 B526男 N.T.CN.T. C632男 N.T.CN.T. N728男 N.T.CN.T. C827女 54.8A，B，C 46.6 B，C927男 51.0C44.2 N10 32男 41.2N21.5 N11 25女 42.2B38.1 B，C12 23女 30.8B59.1 N13 34女 N.T.A，C N.T. N14 33男 63.2C60.0 C15 30男 57.7C35.7 C平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 42.9±13.7 34.7±17.6*呼吸氫濃度(ppm)的最大增加§A腹瀉，B腹部疼痛，C腹部鼓脹，N沒有直觀癥狀N.T.未測(cè)試實(shí)施例11本發(fā)明組合物對(duì)攝入乳制飲料2引起的腹部不適的效果培養(yǎng)費(fèi)氏丙酸桿菌IFO 12424菌株以類似于實(shí)施例9的方式進(jìn)行。這樣獲得的培養(yǎng)物肉湯(5Kg)用蒸發(fā)器濃縮5倍，從而產(chǎn)生含DHNA(45mg)的組合物(1Kg)。乳制飲料制備自這樣獲得的組合物(35.5g)、原料乳(10kg)和抗壞血酸鈉(15g)，所得乳制飲料以類似于實(shí)施例10的方式測(cè)試。在攝取含本發(fā)明組合物的乳制飲料的情況中，得到了與實(shí)施例10所獲非常相似的效果，發(fā)現(xiàn)乳制飲料攝取引起的腹部不適被緩解。
實(shí)施例12DHNA對(duì)促進(jìn)造骨細(xì)胞鈣化的效果使用收集自20歲男性長(zhǎng)骨膜的人造骨細(xì)胞(SaM-1)，骨膜在骨折手術(shù)中獲得。SaM-1細(xì)胞表現(xiàn)出造骨細(xì)胞的所有特征(Koshihara，Y.等In Vitro Cell.Dev.Biol.，2537-43，1989)。已知SaM-1在存在2mM α-甘油磷酸時(shí)以1α、25(OH)2D3濃度-依賴方式促進(jìn)鈣化(Koshihara，Y.等Biochem.Biophys.Res.commun.，145651-657，1987)。
上面獲得的18PDL的SaM-1細(xì)胞(群體兩倍水平)被接種到12孔板，并培養(yǎng)細(xì)胞直到細(xì)胞達(dá)到鋪滿狀態(tài)。隨后，α-甘油磷酸加入所得培養(yǎng)物肉湯使α-甘油磷酸含量為2mM，它是一種鈣化促進(jìn)劑。DHNA(10-7M到10-5M)加入培養(yǎng)物肉湯，接著培養(yǎng)32天。對(duì)于對(duì)照，DMSO(一種溶劑)加入培養(yǎng)物肉湯使DMSO含量為0.1％。試驗(yàn)培養(yǎng)物肉湯和對(duì)照培養(yǎng)物肉湯的培養(yǎng)基每第二天分別與含DHNA和含DMSO的培養(yǎng)基交換。鈣化的程度由鈣的量表示，鈣組成羥磷灰石。
胞外基質(zhì)的鈣含量用試劑盒(鈣C Test Wako)在o-甲酚酞氨羧絡(luò)合劑方法(OCPC方法)基礎(chǔ)上定量(Gitleman，H.J.Anal.Biochem.，18520-531，1967)。
完成培養(yǎng)后，所得細(xì)胞用Hank溶液洗。冷的5％高氯酸(0.5ml/孔)加入細(xì)胞，接著在4℃振蕩提取15分鐘。所得提取物(25μl)與緩沖液混合(2.5mL)，隨后染色溶液(含OCPC(0.4mg/mL)和8-羥基喹啉)(250μl)加入所得混合物，然后攪拌5分鐘。其后，所得反應(yīng)混合物用吸收儀(570nm)(圖4)測(cè)量。如圖4所示，DHNA以濃度-依賴方式促進(jìn)鈣化。
實(shí)施例13DHNA對(duì)FK-506誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的效果如已知的，將認(rèn)為是免疫抑制劑的FK-506施用給動(dòng)物誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥-類似情況(J.Hard Tissue Biology，103-107，10(2)，2001)。如所表明的，通過RNAKL(造骨細(xì)胞分化因子)高表達(dá)形成造骨細(xì)胞，RNAKL表達(dá)在造骨細(xì)胞上，且骨熔蝕超過骨形成，導(dǎo)致這種骨質(zhì)疏松癥-類似情況。FK-506(1mg/kg)連續(xù)10周腹膜內(nèi)施用給ICR雄性小鼠(8周大)。在10周FK-506施用中，飼料(CRF-1，Oriental Yeast有限公司產(chǎn)品)任意地為小鼠攝取，懸浮于1％DMSO(二甲基亞砜)水溶液的DHNA(75μg/kg)每天口頭施用給各小鼠。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DHNA施用組中的小鼠骨密度顯著高于對(duì)照組的小鼠(FK 506(+))，發(fā)現(xiàn)FK 506施用引起的骨密度降低通過DHNA抑制。
工業(yè)應(yīng)用性通過本發(fā)明DHNA的工業(yè)生產(chǎn)方法產(chǎn)生含DHNA的組合物，該組合物獲得自微生物，因此它表現(xiàn)出極好的安全性。當(dāng)口頭施用時(shí)，含高濃度DHNA的組合物改進(jìn)腸內(nèi)菌群。此外，組合物可用于緩解牛奶攝取引起的腹部不適、防止或治療代謝性骨疾病。由于它的無毒性，組合物可長(zhǎng)時(shí)間攝取。
權(quán)利要求
1.制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，所述方法包括培養(yǎng)能產(chǎn)生1，4-二羥基-2-萘甲酸的微生物，從而使微生物在培養(yǎng)物肉湯中制造1，4-二羥基-2-萘甲酸并收集這樣產(chǎn)生的1，4-二羥基-2-萘甲酸。
2.如權(quán)利要求1所述的制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，培養(yǎng)用主要含經(jīng)蛋白酶處理的脫脂奶粉的培養(yǎng)基或主要含經(jīng)蛋白酶處理的乳清粉的培養(yǎng)基來進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，酵母提取物和乳糖中至少一種被用作培養(yǎng)過程的添加劑。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，完成培養(yǎng)后培養(yǎng)物肉湯被冷卻至3-20℃并保存。
5.如權(quán)利要求1所述的制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，將含有1，4-二羥基-2-萘甲酸的培養(yǎng)物肉湯進(jìn)行吸附層系，接著吸附和洗脫1，4-二羥基-2-萘甲酸以收集1，4-二羥基-2-萘甲酸。
6.如權(quán)利要求5所述的制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，濃縮這樣洗脫的溶液。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，所述能制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的的微生物選自丙酸桿菌屬、腸桿菌屬、芽孢乳桿菌屬和芽孢桿菌屬。
8.如權(quán)利要求7所述的制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，能制造1，4-二羥基-2-萘甲酸的的微生物是費(fèi)氏丙酸桿菌。
9.一種含1，4-二羥基-2-萘甲酸的組合物，其特征在于，所述組合物通過權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的制造方法來產(chǎn)生。
10.用于緩解腹部不適的食物和飲料，其特征在于，所述食物和飲料包括作為活性成分的權(quán)利要求9所述的組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽。
11.一種緩解腹部不適的藥劑，其特征在于，所述藥劑包括權(quán)利要求9所述的組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽作為活性成分。
12.一種腸功能調(diào)節(jié)劑，其特征在于，所述藥劑包括權(quán)利要求9所述的組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽作為活性成分。
13.用于防止或治療代謝性骨疾病的食物和飲料，其特征在于，所述食物和飲料包括權(quán)利要求9所述的組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽作為活性成分。
14.一種防止或治療代謝性骨疾病的藥劑，其特征在于，所述藥劑包括權(quán)利要求9所述的組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽作為活性成分。
15.如權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽在制造用于緩解腹部不適的食物和飲料中的應(yīng)用。
16.如權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽在制造用于緩解腹部不適的藥物中的應(yīng)用。
17.如權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽在制造腸功能調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽在制造用于防止或治療代謝性骨疾病的食物和飲料中的應(yīng)用。
19.如權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽在制造用于防止或治療代謝性骨疾病的藥劑中的應(yīng)用。
20.一種治療腹部不適的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)由此需要的受試者施用有效劑量的權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽。
21.一種調(diào)節(jié)腸功能的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)由此需要的受試者施用有效劑量的權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽。
22.一種治療代謝性骨疾病的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)由此需要的受試者施用有效劑量的權(quán)利要求9所述組合物或1，4-二羥基-2-萘甲酸或其鹽。
全文摘要
通過使用丙酸桿菌屬細(xì)菌在胞內(nèi)和胞外制造1，4－二羥基－2－萘甲酸并收集它以獲得含高濃度1，4－二羥基－2萘甲酸的組合物。所述組合物有助于改進(jìn)腸道菌群、緩解與攝入牛奶相關(guān)的腹部不適并防止代謝性骨疾病。
文檔編號(hào)A23L1/30GK1539019SQ02815580
公開日2004年10月20日 申請(qǐng)日期2002年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月10日
發(fā)明者佐藤吉郎, 牧野圣也, 依田伸生, 伊澤佳久平, 神山智敬, 北條研一, 齊藤瑞惠, 竹友直生, 古市圭介, 池上秀二, 一, 久平, 也, 二, 介, 惠, 敬, 生 申請(qǐng)人:明治乳業(yè)株式會(huì)社