專利名稱：具有編碼多聚-γ-谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表達載體以及利用該載體在微生物 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可在微生物表面有效制備外源性蛋白的新的表達載體，該表達載體利用細胞外膜蛋白(pgsBCA)參與合成源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸。此外，本發(fā)明還涉及在微生物表面表達外源性蛋白的方法，該方法是利用細胞外膜蛋白(pgsBCA)參與合成源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸。
背景技術(shù)：
近來，為了制備新的疫苗、篩選多種抗原和抗體、以及將有用的酶固定在細胞表面，已經(jīng)在噬菌體、細菌、以及酵母中采用了表面表達用來在細胞表面制備有價值的外源性蛋白。
在細胞表面表達外源性蛋白的方法最初用于制備多肽的抗原區(qū)域，尤其用于疫苗的大規(guī)模穩(wěn)定表達。目前，通過致病細菌隨機突變來制備疫苗，并篩選得到具有一致、穩(wěn)定滴度的細菌。然而，當人和動物口服后，酶不可避免地要失活。因此，許多研究都致力于克服這一問題。通常采用戈蘭氏陰性細菌的細胞表面蛋白，其基因與抗原蛋白基因連接，然后將連接后的基因插入適當?shù)乃拗骷毎?，從而在細胞表面可有效制備融合蛋白。通過上述步驟制備的重組蛋白由于在細胞表面突出，因此可作為有效的抗原。特別地，有報道說，由于細胞外膜的脂多糖(LPS)增強了在細胞表面表達的蛋白的抗原性，因此戈蘭氏陰性細菌最適合用于該種制備。
為了在細胞表面表達外源性蛋白，在最初的序列中需要存在分泌信號，它能介導生物合成的細胞蛋白穿過細胞膜。此外，在戈蘭氏陰性細菌中，重組蛋白還必須穿過細胞內(nèi)膜和細胞膜之間的空腔，插入并與細胞外膜相連，最后在細胞膜外側(cè)穩(wěn)定地突出。
實際上，有一些蛋白，例如細胞表面蛋白，特殊的酶，以及毒素蛋白，包含這樣的分泌信號和目標信號，并可在細胞表面穩(wěn)定突出。同樣地，如果這些分泌和目標信號與適當?shù)膯幼酉噙B，則可在細菌表面成功表達外源性蛋白。
用于外源性蛋白表面表達的細胞表面蛋白通常可被大致分成4部分，細胞外膜、脂蛋白、分泌蛋白、以及細胞表面器官蛋白。目前，戈蘭氏陰性細菌中的表面蛋白，例如LamB，PhoE，以及OmpA主要被用于制備有用的外源性蛋白。然而，這些蛋白具有對所插入蛋白大小的結(jié)構(gòu)性限制，這些所插入的蛋白被插入到細胞表面的突出環(huán)(protruded loop)。由于所插入的外源性蛋白的C-和N-末端需要在立體結(jié)構(gòu)上閉合，如果它們距離很遠，可用連接肽連接以減小兩末端之間的距離。
具體地，如果LamB和PhoE用于插入含有多于50～60氨基酸的外源性多肽，則結(jié)構(gòu)性限制將阻止細胞膜穩(wěn)定性蛋白的生成(Charbit，et al.，J.Immunol.，1391658-1664，1987；Agterberg，et al.，Vaccine，885-91，1990)。盡管可使用OmpA將外源性蛋白插入突出環(huán)，但是由于結(jié)構(gòu)限制，實際上只有含有最小目標信號的OmpA的部分片段可被插入。已經(jīng)通過在C-末端與OmpA目標信號連接而在細胞表面表達β-內(nèi)酰胺酶。
近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來源于Pseudomonas sp.的冰晶蛋白(ice-nucleationprotein)可以作為戈蘭氏陰性細菌的細胞外膜并用于表面表達(Jung et al.，Nat.Biotechnol.，16576-560，1998；Jung et al.，Enzyme Microb.Technol.，22(5)348-354，1998；Lee et al.，Nat.Biotechnol.，18645-648，2000)。Jung及其同事使用冰晶蛋白在細胞表面表達了果聚糖蔗糖酶(levansucrase)，其包括N-末端、中間重復區(qū)域、以及C-末端，在C-末端與果聚糖蔗糖酶基因相連，而且還用冰晶蛋白表達了羧甲基纖維素，其包括N-末端、缺失的中間重復區(qū)域、以及C-末端，在C-末端與該基因融合，從而檢測各自酶的活性。此外，Lee及其同事使用冰晶蛋白在Escherichia coli或者Salmonella typhiTy21a菌株細胞表面進行表達，所用冰晶蛋白僅包含N-末端或者N-末段和C-末端、在每一末端與HBV表面抗原和HCV核心抗原連接，研究證明了這些蛋白作為復雜的活疫苗是有效的。
脂蛋白同樣被用作表面表達的表面蛋白。特別地，E.Coli脂蛋白可通過N-末端的分泌蛋白穿過細胞內(nèi)膜，該蛋白與細胞外膜或者內(nèi)膜直接連接的末端含有L-半胱氨酸。一種主要的脂蛋白，Lpp，在N-末端與細胞外膜相連，在C-末端與肽聚糖(PG)相連。因此，如果Lpp與細胞外膜蛋白的OmpA片段相連，則外源性蛋白可被穩(wěn)定地表達在細胞外膜的細胞表面上(Francisco，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713-2717，1992)。該特性還可用于另一脂蛋白，TraT，在細胞表面表達外源性蛋白，諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒的C3抗原決定簇(Felici，et al.，J.Mol.Biol.，222301-310，1991)。而且，對肽聚糖連接性脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein，PAL)來說，盡管其確切功能還未得到闡明，但其已被用于表面表達來制備重組抗原(Fuchs，et al.，Bio/Technology，91369-1372，1991)。在這種情況下，PAL的C-末端與細胞壁相連，N-末端與重組抗體相連，從而在細胞表面表達融合蛋白。
同時，盡管可穿過細胞外膜的分泌蛋白可被用作表面蛋白，但這并未在戈蘭氏陰性細菌中得到應用，并且只有在特定蛋白參與分泌機制時才有幾種分泌蛋白可幫助穿過細胞外膜。例如，當脂蛋白Klebsiella sp.普魯蘭酶(pullulanase)的N-末端被脂類物質(zhì)取代并連接至細胞外膜后，可完全分泌至細胞培養(yǎng)介質(zhì)中。Komacker及其同事使用普魯蘭酶(pullulanase)的N-末端片段將β-內(nèi)酰胺酶表達至細胞表面，但是所得的普魯蘭酶-β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白立刻連接到細胞表面，然后卻在細胞培養(yǎng)介質(zhì)中分離了。此外，還使用該步驟制備了堿性磷酸酶，這是一種胞質(zhì)間間隙蛋白(periplasmic spaceprotein)，但由于其分泌過程至少需要14種蛋白，因此不能穩(wěn)定表達該重組蛋白(Kornacker，et al.，Mol.Microl.，41101-1109，1990)。
此外，來源于致病菌Neisseria sp.的IgA蛋白酶具有一特殊的分泌系統(tǒng)，其C-末端具有一片段信號，可使N-末端的蛋白酶穩(wěn)定地連接到細胞外膜上。當該蛋白酶到達細胞外膜并在細胞表面突出后，根據(jù)其水解能力分泌至細胞培養(yǎng)介質(zhì)中。Klauser及其同事采用IgA蛋白酶片段將分子量約為12kDa的霍亂毒素B亞基不連續(xù)地表達至細胞表面(Klauser，et al.，EMBO J.，91991-1999，1990)。然而，該融合蛋白的分泌被分泌過程中細胞膜空間產(chǎn)生的蛋白折疊所抑制。
另外，對戈蘭氏陰性細菌來說，存在于細胞表面且用于表面表達的細胞亞器官(suborgans)包括鞭毛、菌毛、菌傘毛等。更詳細地，采用含有鞭毛、且與其抗體有強結(jié)合性的鞭毛蛋白作為亞單位已經(jīng)連續(xù)制備了霍亂毒素B亞基和來源于乙型肝炎病毒多肽(Newton，et al.，Science，24470-72，1989)。絲束蛋白(fimbrin)，一種在細胞表面由線狀傘毛構(gòu)成的亞基，已經(jīng)被用于表達外源性多肽，然而只有小的多肽被成功地制備出來(Hedegaard，et al.，Gene，85115-124，1989)。
除了已經(jīng)將戈蘭氏陰性細菌的表面蛋白用于表面表達外，最近，戈蘭氏陽性細菌的表面蛋白也被用于表面表達(Samuelson，et al.，J.Bacteriol.，1771470-1476，1995)。然而，在這種情況下，仍需要用來穿過細胞內(nèi)膜的分泌信號以及用于表面表達和連接到細胞表面的載體。實際上，來源于Staphylococcus hyicus的脂肪酶的分泌信號和來源于Straphylococcus aureus的蛋白A的膜連接載體(membrane attachment carrier)已經(jīng)被用于制備瘧疾血期(malaria blood stage)抗原，其包括80個氨基酸以及來源于Streptococcus蛋白G的白蛋白連接蛋白，并成功地將所得蛋白表達在細胞表面。
如上所述，由于很多研究已經(jīng)集中在利用戈蘭氏陰性細菌和戈蘭氏陽性細菌進行表面表達，已經(jīng)發(fā)展出很多表達系統(tǒng)用于制備有價值的蛋白，并且尤其在美國、歐洲、以及日本提交專利保護。更詳細地，已經(jīng)有5份專利申請公開了戈蘭氏陰性細菌的細胞外膜蛋白(WO 9504069，WO 9324636，WO9310214，EP 603672，US 5356797)，1份專利申請報道了使用鞭毛作為細胞表面器官(WO 9410330)，1份使用細胞表面脂蛋白(WO 9504079)。
如上所述，為了使用細胞外膜蛋白將外源性蛋白表達至細胞表面，必須將適宜的細胞內(nèi)膜和外源性蛋白在基因水平連接，誘導生物合成，當穩(wěn)定穿過細胞內(nèi)膜后持續(xù)存在于細胞外膜。為完成這一過程，應選擇滿足下述要求的細胞內(nèi)膜，然后用于表面表達的載體中首先，穿過細胞內(nèi)膜的分泌信號的存在；其次，與細胞外膜穩(wěn)定連接的目標信號的存在；第三，大量表達至細胞表面；第四，不考慮蛋白大小，蛋白能穩(wěn)定表達。
然而，還沒有發(fā)明出滿足上述所有條件的用于表面表達的載體。目前，僅有下述缺點得到了補救。
基于上述背景，本發(fā)明人對來源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸合成酶基因(pgsBCA)作為表面表達的新載體進行了研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用含有pgsBCA基因的新的表達載體可有效地將外源性蛋白表達至微生物表面，同時發(fā)現(xiàn)了可大范圍地將外源性蛋白成功表達至微生物表面的方法。
本發(fā)明公開本發(fā)明的目的在于提供一種在微生物表面制備外源性蛋白的方法。
詳細地，在本發(fā)明中，從參與合成源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸的細胞外膜蛋白中選擇出可大范圍地將外源蛋白表達至戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌表面的新的表面表達載體。然后，利用該基因，構(gòu)建可在微生物表面表達外源性蛋白或多肽的表面表達載體，并將該載體轉(zhuǎn)化至多種宿主細胞，從而選擇用于表面表達的細胞轉(zhuǎn)化株。
為完成本發(fā)明的目的，提供了選自pgsB、pgsC、以及pgsA的、包含一個或多個編碼多聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的基因的表面表達載體。
詳細地，本發(fā)明提供了用于在微生物表面制備蛋白的表面表達載體，其中pgsB、pgsC以及pgsA基因包含分別與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3具有80％同源性的核苷酸序列。此外，還提供了在微生物表面制備蛋白的表面表達載體，包括編碼目的蛋白的基因以及C-末端的終止密碼子。
此外，還提供了用上述表達載體轉(zhuǎn)化得到的細胞轉(zhuǎn)化株。
最后，本發(fā)明提供了在戈蘭氏陰性或戈蘭氏陽性宿主細胞微生物表面表達目的蛋白的方法，其包括下述步驟(a)通過將編碼目的蛋白的基因插入表面表達載體中構(gòu)建重組表達載體；(b)使用重組載體轉(zhuǎn)化戈蘭氏陰性宿主細胞；以及(c)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，在宿主細胞的表面表達目的蛋白。
附圖詳細描述本發(fā)明的上述以及其他的目的、特性、以及優(yōu)點將通過附圖以及下述詳細描述相結(jié)合得到更好的理解，其中


圖1描述了表面表達載體pGNBCA和重組表達載體pGNBCA-HB168的限制性圖譜，在本發(fā)明中，它們利用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞；圖2描述了在用本發(fā)明的重組表達載體pGNBCA-HB168轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌中HBV表面抗原蛋白的表面表達，其是通過Western印跡法和熒光活化細胞分類試驗(fluorescence-activated cell sorting assays)檢測的；圖3描述了本發(fā)明的表面表達載體pGNCA和重組表達載體pGNCA-HB168的限制性圖譜；圖4描述了在用本發(fā)明的表面表達重組載體pGNCA-HB168A2、pGNCA-HB168A3和pGNHB-AA4轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌中HBV表面抗原蛋白的表面表達，其是通過Western印跡法和熒光活化細胞分類試驗(fluorescence-activated cell sorting assays)檢測的；圖5描述了本發(fā)明的表面表達載體pGNA和重組表達載體pGNA-HB168的限制性圖譜；圖6描述了本發(fā)明的表面表達載體pGNCA2和重組表達載體pGNHB-A的限制性圖譜；圖7描述了本發(fā)明的表面表達載體pGNC和重組表達載體pGNC-PreS1的限制性圖譜；圖8描述了在用本發(fā)明的表面表達重組載體pGNC-PreS1轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌中HBV表面抗原PreS1蛋白的表面表達方式，它是通過Western印跡法檢測的；圖9描述了本發(fā)明的表面表達載體pHCE1LBBCA和重組表達載體pHCE1LBBCA-HB168的限制性圖譜；圖10描述了在用本發(fā)明的表面表達重組載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌中HBV表面抗原決定簇的表面表達方式，其是通過Western印跡法和熒光活化細胞分類試驗(fluorescence-activated cell sortingassays)檢測的；圖11描述了用本發(fā)明的重組表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌的活疫苗的效力；圖12描述了在用本發(fā)明的表面表達重組載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陽性細菌中HBV表面抗原決定簇的表面表達，它是通過Western印跡法和熒光活化細胞分類試驗(fluorescence-activated cell sortingassays)檢測的；圖13描述了用本發(fā)明的重組表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陽性細菌的活疫苗的效力；圖14描述了本發(fā)明的表面表達載體pHCE1LBA和重組表達載體pHCE1LBA-TGEN1以及pHCE1LBA-PEDN的限制性圖譜；圖15描述了用本發(fā)明的表面表達重組載體pHCE1LBA-TGEN1轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性(Escherichia coli)和戈蘭氏陽性細菌制備的TGE病毒N蛋白的表面表達方式，它是通過Western印跡法檢測的；圖16描述了用本發(fā)明的表達重組載體pHCE1LBA-PEDN轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌制備的PED病毒N蛋白的表面表達方式，它是通過Western印跡法檢測的；圖17描述了用本發(fā)明的重組表達載體pHCE1LBA-TGEN1和pHCE1LBA-PEDN轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陽性細菌的活疫苗的效力；圖18描述了本發(fā)明的表面表達載體pHCE1LBA和重組表達載體pHCE1LBA-PreS1以及pHCE1LBA-PreS2的限制性圖譜；圖19描述了本發(fā)明的表面表達載體pHCE1LBA和重組表達載體pHCE1LBA-PreS1PreS2以及pHCE1LBA-L的限制性圖譜；圖20描述了分別用本發(fā)明的表達重組載體pHCE1LBA-PreS1和pHCE1LBA-PreS1PreS2轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌制備的乙型肝炎病毒PreS1和PreS1PreS2的表面表達方式，以及用本發(fā)明的表達重組載體pHCE1LBA-L轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌制備的乙型肝炎病毒L蛋白的表面表達方式，它是通過Western印跡法檢測的；圖21描述了本發(fā)明的表面表達載體pHCE1LBA-TNF-a的限制性圖譜；圖22描述了本發(fā)明的重組表達載體pGNA-脂肪酶的限制性圖譜，以及采用重組表達載體pGNA-脂肪酶轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌細胞表面表達的脂肪酶活性；
圖23描述了本發(fā)明的重組表達載體pGNA-酰胺酶的限制性圖譜，以及采用重組表達載體pGNA-酰胺酶轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌細胞表面表達的酰胺酶活性。
本發(fā)明的最佳實施方式在下文中，將對本發(fā)明進行詳細描述。
由pgsBCA基因編碼的蛋白是一種存在于Bacillus sp.菌株中的細胞外部蛋白，它是一種具有可食用性、可溶解性、帶有陰離子、可生物降解的聚合體物質(zhì)，其參與多聚-γ-谷氨酸的合成，并且是由Bacillus subtilis(IFO3336；Natto.Biochem.Biophys.Research Comm.，263，6-12，199，Bacilluslicheniformis(ATCC 9945；Biotech.Bioeng.，4)，430-437，1998)以及Bacillusanthracis(J.Bacteriol.，171，722-730，1989)等制備出的。
從Natto菌株(Bacillus subtilis IFO 3336)中分離出來的一種細胞膜蛋白(pgsBCA)總共包含922個氨基酸，精確地說，pgsB的393個氨基酸，pgsC的149個氨基酸，以及pgsA的380個氨基酸。Ashiuchi等公開了來源于Bacillus natto菌株的多聚-γ-谷氨酸合成酶基因的克隆、將其轉(zhuǎn)化至Escherichia coli中、以及其合成(Ashiuchi，et al.，Biochem.Biophy.ResearchComm，2636-12，1999)。
然而，包含多聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的pgsBCA蛋白的功能還沒有被詳細闡述。至少，pgsB作為氨基化合物連接系統(tǒng)參與了構(gòu)成酶復合物蛋白，并且在pgsB的N-末端通過特定的氨基酸與細胞膜或者細胞壁相互作用。pgsA在N-末端和C-末端具有特定的親水氨基酸序列，起到與pgsB相關(guān)聯(lián)的分泌信號、目標信號以及結(jié)合信號的作用，進而穿過細胞內(nèi)膜。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白是一種有效的表面表達載體，該載體能根據(jù)外源性蛋白一級氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和特征將其表達至細胞表面。具體地，其有很多優(yōu)點。首先，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白可被大量表達，用于合成多聚-γ-谷氨酸和細胞外分泌；其次，在細胞周期的靜息期，表達至細胞表面的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白可被穩(wěn)定保持；第三，該細胞外膜蛋白在細胞表面呈結(jié)構(gòu)性突出，尤其在pgsA中；第四，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白(pgsBCA)來源于戈蘭氏陽性細菌的細胞表面，其可被表達至戈蘭氏陽性或者戈蘭氏陰性細菌的細胞表面。
本發(fā)明提供了可用于將外源性蛋白表達至細胞表面的重組表達載體，其利用了參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白的性質(zhì)。詳細地說，將本發(fā)明的表面表達載體構(gòu)建為含有分泌信號和目標信號的構(gòu)建體，所述信號存在于參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白(pgsBCA)的一級序列中。
此外，本發(fā)明提供了使用表面表達載體將外源性蛋白表達至戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌表面的方法，其利用了參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白的特性。詳細地說，由于利用了參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白，外源性蛋白表達至細胞表面，因此本發(fā)明的制備外源性蛋白的方法可以省略某些步驟，諸如細胞超聲降解或者蛋白純化等。
因此，本發(fā)明提供了通過表面表達方法制備的外源性蛋白的多種用途。詳細地說，本發(fā)明提供的方法可有效制備抗原和抗體、篩選抗原的多肽庫、結(jié)合蛋白或者吸附蛋白、以及生理活性物質(zhì)等等。
除了細胞外膜蛋白參與來源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸的合成外，所有含有多聚-γ-谷氨酸合成基因的表面表達載體也在本發(fā)明的保護范疇之內(nèi)。
此外，本發(fā)明的使用多聚-γ-谷氨酸合酶基因的表面表達載體可應用于所有表面表達的微生物菌株。優(yōu)選地這些載體可被用于戈蘭氏陰性細菌，尤其是Escherichia coli，Salmonella typhi，Salmonella typhimurium，Vibrio cholera，Mycobacterium bovis，以及Shigella，也可用于戈蘭氏陽性細菌，尤其是Bacillus，Lactobacillus，Lactococcus，Staphylococcus，Lyseria，Monocytogenesis，以及Streptococcus。所有使用這些菌株制備外源性蛋白的方法也在本發(fā)明的保護范疇之內(nèi)。
根據(jù)需要，可將多聚-γ-谷氨酸合成酶基因在N-末端或者C-末端插入所有或某些限制性酶的多個識別位點。因此，包括這些限制性酶識別位點的表面表達載體也在本發(fā)明的保護范疇之內(nèi)。
詳細地，本發(fā)明涵蓋了所有來源于Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸合成酶基因。其中，pgsA基因用于在C-末端插入限制性酶識別位點，它很容易克隆多種外源性蛋白基因，從而構(gòu)建表面表達載體pGNBCA。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pGNBCA-HB168，它能在戈蘭氏陰性細菌的細胞表面表達抗原決定簇，并以融合的形式形成抗S抗原的中和抗體。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物包括pgsB、pgsC、以及pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端與抗原決定簇的N-末端相連接從而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pGNCA-HB168、pGNA-HB168和pGNHB-A，它們能在戈蘭氏陰性細菌的細胞表面表達抗原決定簇，并以融合的形式形成抗S抗原的中和抗體。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物包含pgsC和pgsA蛋白，或者僅有pgsA蛋白，然后，前一種情況的pgsA蛋白基因的C-末端，或后一種情況的N-末端或C-末端與抗原決定簇的N-末端相連接從而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pGNC-PreS1，它能在戈蘭氏陰性細菌的細胞表面表達抗原決定簇，并以融合的形式形成抗S抗原的中和抗體。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物包括pgsC蛋白，然后，pgsC蛋白基因的C-末端與乙型肝炎病毒表面抗原中的Pres1抗原的N-末端相連接。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pHCE1LBBCA和pHCE1LBA，它們是對用在戈蘭氏陰性細菌的表面表達載體pGNBCA進行了修飾，并且這兩種表達載體能用于戈蘭氏陰性和陽性菌。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物包含pgsB、pgsC和pgsA蛋白，或者僅含有pgsA蛋白，然后，pgsA蛋白基因的C-末端與外源蛋白基因連接。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pHCE1LBBCA-HB168，其能用于戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌，表達抗原決定簇，在細胞表面以融合形式形成抗S抗原的中和抗體。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物包括pgsB，pgsC，以及pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端與抗原決定簇的N-末端相聯(lián)接，從而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pHCE1LBA-TGEN1，它能用于戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌，能以融合形式將核蛋白質(zhì)N蛋白表達至細胞表面。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物包括pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端與豬的遺傳性胃病(TGE)病毒的部分核蛋白基因的N-末端相聯(lián)接。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pHCE1LBA-PEDN，其能用于戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌，能以融合形式將核蛋白質(zhì)N蛋白表達至細胞表面。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物包括pgsA蛋白，pgsA蛋白基因的C-末端與豬腹瀉疾病(PED)病毒的核蛋白基因的N-末端相聯(lián)接。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pHCE1LBA-PreS1、pHCE1LBA-PreS2、pHCE1LBA-PreS1PreS2，以及pHCE1LBA-L，它們能用于戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌，以融合形式分別將下述蛋白表達至細胞表面exPreS1、PreS2、PreS1-PreS2或者HBV表面L(PreS1-PreS2-S)蛋白中的全部L蛋白。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物由pgsA蛋白組成，pgsA蛋白基因的C-末端分別與PreS1、PreS2、PreS1-PreS2或者全部L蛋白的N-末端相聯(lián)接。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pHCE1LBA-TNF-α，其能用于戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌，以融合形式將TNF-α蛋白表達至細胞表面。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物由pgsA蛋白組成，pgsA蛋白基因的C-末端與一種細胞因子-腫瘤壞死因子α的N-末端相聯(lián)接。
本發(fā)明還提供了重組表面表達載體pGNA-脂肪酶和pGNA-酰胺酶，其能用于戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌，并將工業(yè)用酶如脂肪酶和酰胺酶，以融合形式至細胞表面。詳細地，參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白復合物由pgsA蛋白組成，pgsA蛋白基因的C-末端與工業(yè)應用酶中的脂肪酶或者酰胺酶的N-末端相聯(lián)接。
實施例下述實施例為本發(fā)明的實用和優(yōu)選的實施例。
然而，在不偏離本發(fā)明實質(zhì)精神的前提下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本發(fā)明所公開的內(nèi)容可對本發(fā)明進行修飾和改進。
實施例1表面表達載體pGNBCA的構(gòu)建利用細胞外膜蛋白基因pgsBCA參與合成源自Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸，并利用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來制備本發(fā)明的表面表達載體，對Bacillus subtilis var.chungkookjang(目錄號KCTC 0697 BP)的總?cè)旧wDNA進行了純化。
基因pgsBCA由DNA片段pgaB、pgaC、以及pgaA組成并具有上述的連續(xù)核苷酸序列，其中DNA片段pgaB含有核苷酸序列SEQ ID NO1，DNA片段pgaC含有核苷酸序列SEQ ID NO2，DNA片段pgaA含有核苷酸序列SEQ ID NO3。
為了獲得參與多聚-γ-谷氨酸生物合成的細胞內(nèi)膜的N-末端和C-末端的編碼基因，采用總?cè)旧w作為模板，以N-末端核苷酸序列為SEQ IDNO4(5-gaa cca tgg gct ggt tac tcc tta tag cct g-3)、C-末端核苷酸序列為SEQID NO5(5-ctc gga tcc ttt aga ttt tag ttt gtc act-3)的寡核苷酸作為引物。然后，利用上述模板和引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)。
對應于N-末端的寡核苷酸引物SEQ ID NO4也可構(gòu)建為含有在表達性載體pHCE19T(II)中出現(xiàn)的限制性酶NcoI的識別位點，而C-末端的寡核苷酸引物SEQ ID NO5也可構(gòu)建為含有在表達性載體pHCE19T(II)中出現(xiàn)的限制性酶BamHI的識別位點。在這種情況下，測定從細胞外膜蛋白基因pgsB的N-末端區(qū)域到pgsA的C-末端區(qū)域的范圍內(nèi)的擴增基因片段的大小為2.8kb。通過PCR擴增的基因片段用限制性酶NcoI和BamHI消化，并插入到用NcoI和BamHI消化的高表達載體pHCE19T(II)中。結(jié)果，含有參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞內(nèi)膜蛋白基因的新的表達載體并不包括翻譯終止密碼子，但它包括一個新的附加限制性酶識別位點，表達載體的大小約為6.5kb，它具有核苷酸序列SEQ ID NO6，并且被命名為表達載體pGNBCA(參考圖1)。
將表面表達載體轉(zhuǎn)化至Escherichia coli，所得細胞轉(zhuǎn)化株于2001年7月26日存放在國際保藏機構(gòu)以及位于Korean Research Institute of Bioscienceand Biotechnology(KRIBB)的Korean Collection for Type Cultures(KCTC52Eoeun-dong，Yusong-gu，Daejon)(目錄號KCTC 10025 BP)。
實施例2表面表達載體pGNBCA-HB168的構(gòu)建重組表達載體pGNBCA-HB168可表達抗原決定簇，該抗原決定簇用于產(chǎn)生抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體，該重組表達載體可利用細胞外膜蛋白基因pgsBCA參與合成源自Bacillus sp.菌株的多聚-γ-谷氨酸，并利用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來構(gòu)建。
為了將乙型肝炎病毒S抗原基因插入至利用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞的表面表達載體pGNBCA中，采用包含在常規(guī)克隆載體pUC8中的1.4kb大小的HBV基因作為模板，以核苷酸序列SEQ ID NO7以及核苷酸序列SEQ ID NO8的寡核苷酸作為引物。然后，利用上述模板和引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)，從而擴增S抗原基因。結(jié)果得到168bp大小的擴增基因片段。
在這種情況下，構(gòu)建的核苷酸序列SEQ ID NO7以及核苷酸序列SEQID NO8的引物也可包含限制性酶BamHI和HindIII識別位點。然后，將擴增后的乙型肝炎病毒S抗原基因用限制性酶BamHI和HindIII消化，并通過調(diào)節(jié)翻譯密碼子與已經(jīng)制備好的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因的C-末端區(qū)域相連接。所得的重組表達載體pGNBCA-HB168如圖1所示。
實施例3利用重組表達載體pGNBCA-HB168表面表達抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇使用重組表達載體pGNBCA-HB168對產(chǎn)生抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇進行表面表達。
將實施例2構(gòu)件的表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli中，在含有50ml的LB培養(yǎng)液(酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨(trypton)10g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0)以及100mg/L抗菌素氨比西林的500ml的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，使之進行表面表達。
抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇進行細菌表達，所述S抗原與參與多聚-γ-谷氨酸合成的C-末端基因進行融合，利用抗S-抗原的抗體進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡法進行鑒定。將在相同細胞濃度下得到的蛋白變性，制備實驗樣品，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對樣品進行分析，將蛋白片段轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將所得的PVDF膜在封閉緩沖液(10ml Tris HCl，5％脫脂乳，pH8.0)中攪拌1小時進行封閉，然后與用封閉液1,000倍稀釋的抗S抗原的羊的多克隆一抗反應12小時。反應完成后，將膜用同樣的緩沖溶液清洗，與用封閉緩沖液稀釋1,000倍的與生物素偶聯(lián)的二抗反應4小時。將反應后的膜再次用緩沖液清洗，浸入抗生物素蛋白-生物素反應液中1小時，然后清洗。在浸沒的膜中加入底物H2O2和DAB試劑作為染料，對膜進行染色，可觀察到與抗S抗原抗體和上述融合蛋白的特異性結(jié)合(參考圖2，A)。在圖2中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2是細胞轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM109。如所述，約48kDa的融合蛋白條帶由表達載體pGNBCA-HB168制備得到。
此外，為直接證實用于產(chǎn)生抗乙型肝炎病毒的S抗原中和抗體的抗原決定簇在E.coli表面的表達，將誘導表面表達的E.coli轉(zhuǎn)化株超聲降解，通過外膜分餾法分成可溶性部分、細胞內(nèi)膜部分、以及細胞外膜部分，然后利用抗S抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡試驗進行鑒別。必要地，收集如上所述的用于在細胞表面誘導融合蛋白表達的E.coli轉(zhuǎn)化株以及未轉(zhuǎn)化的E.coli菌株，調(diào)節(jié)至相同濃度，用緩沖溶液(10mMHEPES，pH 7.4)洗滌幾次。然后，將所得物質(zhì)懸浮在緩沖液(10g/mL溶菌酶，1mM PMSF，1mM EDTA)中，在4℃反應10分鐘，加入DNase(0.5mg/mL)和RNase(0.5mg/mL)，將混合物用超聲儀破裂，在4℃，10,000×g離心20分鐘，分離未反應的E.coli和細胞碎片。然后將分離到的E.coli的細胞碎片在4℃，15,000×g離心20分鐘，收集含有外周胞質(zhì)和細胞質(zhì)蛋白的片段。將所得的細胞沉淀用含有1％月桂?；“彼徕c(N-月桂醇肌氨酸酯，鈉鹽)的PBS緩沖液(pH7.4)溶解，在4℃，15,000×g離心2小時并分離。
在這種情況下，將上清液分為E.coli內(nèi)膜和E.coli外膜蛋白沉淀，利用抗S-抗原的抗體采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡法進行鑒定。在上述的E.coli片段中，在細胞外膜鑒定出可形成抗S-抗原的中和抗體的抗原決定簇(參看圖2，AWestern blotting后E.coli膜部分的結(jié)果)。如圖2所示，泳道1是未轉(zhuǎn)化的E.coli JM 109菌株，泳道2是E.coli轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM109的全細胞，泳道3是E.coli轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM109的可溶性部分，泳道4是E.coli轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM109的細胞內(nèi)膜部分，泳道5是E.coli轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM109的細胞外膜部分。
采用熒光活化細胞分類(FACS)流氏細胞儀檢測法，檢測到S抗原中和抗體的抗原決定簇從多聚-γ-谷氨酸合成酶蛋白的C-末端被表達至E.coli細胞的表面。在免疫熒光著色實驗中，用于誘導表面表達的E.coli被以同樣的細胞濃度收集，用PBS緩沖液(pH 7.4)洗幾次。然后將所得的細胞沉淀用1ml含有1％牛血清白蛋白的緩沖液重懸，與1,000倍稀釋的抗S抗原的羊的多克隆一抗在4℃反應12小時。反應完成后，將所得細胞再洗滌幾次，用1ml含有1％牛血清白蛋白的緩沖液重新懸浮，然后與1,000倍稀釋的抗S抗原的與生物素偶聯(lián)的二抗在4℃反應3小時。完全反應的細胞同樣用緩沖溶液洗滌幾次，用0.1ml含有1％牛血清白蛋白的緩沖液重懸，然后與1,000倍稀釋的對生物素特異的鏈親和素-R-藻紅蛋白(streptoavidin-R-phycoerythrin)染料試劑結(jié)合。
然后，將E.coli細胞重新洗滌幾次，采用熒光活化細胞分類(FACS)流氏計數(shù)檢測法進行測定。結(jié)果證實了可形成抗S抗原中和抗體的抗原決定簇蛋白被表達至細胞表面，與未轉(zhuǎn)化的E.coli區(qū)別明顯(參照圖2，B)。如圖2所示，白色條帶描述了未轉(zhuǎn)化的E.coli JM109菌株，而黑色條帶是由E.coli轉(zhuǎn)化株pGNBCA-HB168/JM109得到的。結(jié)果，可生成抗S抗原中和抗體的抗原決定簇蛋白在未轉(zhuǎn)化的E.coli中未見表達，但在用本發(fā)明的表面表達載體轉(zhuǎn)化的E.coli轉(zhuǎn)化株可見到清楚表達。
實施例4重組表面表達載體pGNCA-HB101的構(gòu)建以及可生成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇的表面表達(1)采用源自Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA，并利用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來構(gòu)建一重組表達載體，該重組表達載體用來表達形成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇。
基因pgsCA具有包含SEQ ID NO2的pgsC DNA和SEQ ID NO3的pgaA DNA的連續(xù)的核苷酸序列。
為了利用參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因獲得編碼pgsC和pgsA蛋白的N-末端和C-末端的基因，利用其總?cè)旧w作為模板，以N-末端核苷酸序列為SEQ ID NO9、C-末端為SEQ ID NO5的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應。
還構(gòu)建了對應于N-末端的引物并包含SEQ ID.NO9的序列，它包括限制性酶NdeI的識別位點。在這種情況下，擴增的基因區(qū)域約為1.6kb，范圍包括從參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsC的N-末端區(qū)域到pgsA的C-末端區(qū)域。
將通過聚合酶鏈式反應擴增的基因用限制性酶NdeI和BamHI消化，插入到已經(jīng)用BamHI和NdeI消化的高表達載體pHCE19T(II)，從而創(chuàng)建一種新的大小約5.3kb的表達載體，該表達載體具有新的限制性酶識別位點，且在細胞外膜蛋白基因的末端沒有終止密碼子，其被稱作表達載體pGNCA(參考圖3)。
(2)采用與上述實施例2描述的相同的步驟構(gòu)建重組表達載體pGNCA-HB168，該表達載體能表達抗原決定簇，從而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體。詳細地，該重組表達載體是采用來源于參與多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因的細胞外膜蛋白基因pgsC和pgsA，并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來制備的。
如上構(gòu)建的重組表達載體在圖3中進行了描述。
(3)利用表面表達載體pGNCA-HB168對形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表達采用下述方法檢測將表面表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli宿主細胞，采用與上述實施例3所述的相同的步驟誘導表達。然后，使用抗S抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡的方法對該抗原決定簇在E.coli轉(zhuǎn)化株中的表達進行鑒別，該抗原決定簇可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體，且與細胞外膜蛋白pgsCA融合(參照圖4)。
如圖4所示，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2是細胞轉(zhuǎn)化株pGNCA-HB168/JM109。結(jié)果，鑒別到約48kDa的重組表達載體pGNCA-HB168表達的融合蛋白條帶。
實施例5重組表面表達載體pGNA-HB168的構(gòu)建和抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表面表達
(1)采用細胞外膜蛋白基因pgsA并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來構(gòu)建重組表達載體，該重組表達載體用來表達形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇，所述細胞外膜蛋白基因來自參與多聚-γ-谷氨酸合成的源于Bacillus sp菌株的pgsBCA基因。
基因pgsA包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
為了利用參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因獲得編碼pgsA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用總?cè)旧w作為模板，以寡核苷酸為引物進行聚合酶鏈式反應，所述寡核苷酸含有在N-末端的SEQ ID NO10和在C-末端的SEQ ID NO5核苷酸序列。
構(gòu)建與N-末端相應并包括SEQ ID NO10序列的引物，其包括限制性酶NdeI識別位點。在這一方面，擴增的基因區(qū)域約為1.1kb，范圍包括從參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsA的N-末端區(qū)域到pgsA的C-末端區(qū)域。
將通過聚合酶鏈式反應擴增得到的基因用限制性酶NdeI和BamHI消化后插入至預先用BamHI和NdeI消化過的高表達載體pHCE19T(II)，從而制備新的被稱作表達載體pGNA的表達載體，其大小約為4.8kb，具有新的限制性酶識別位點，并且在細胞外膜蛋白基因的末端沒有終止密碼子(參考圖5)。
(2)采用與上述實施例2描述的相同的步驟構(gòu)建重組表達載體pGNA-HB168，該表達載體能表達抗原決定簇，從而形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體。詳細地，該重組表達載體是采用細胞外膜蛋白基因pgsA，并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來制備的，所述的細胞外膜蛋白基因pgsA來源于參與多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因。
上述構(gòu)建的重組表達載體pGNA-HB168在圖5中有描述。
(3)利用表面表達載體pGNA-HB168對形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表達采用下述方法檢測將表面表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli宿主細胞，采用與上述實施例3所述的相同的步驟誘導表達。然后，使用抗S抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡的方法對該抗原決定簇在E.coli轉(zhuǎn)化株中的表達進行鑒別，該抗原決定簇可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體，且與細胞外膜蛋白pgsCA融合(參照圖5)。
如圖5所示，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2是細胞轉(zhuǎn)化株pGNA-HB168/JM109。結(jié)果，鑒別到約48kDa的重組表達載體pGNA-HB168表達的融合蛋白條帶。
此外，還通過熒光活化細胞分類(FACS)流式計數(shù)檢測法檢測了所述抗原決定簇從細胞外膜蛋白pgsA到E.coli細胞表面的表達，該抗原決定簇能形成抗S抗原的中和抗體。為了實現(xiàn)這一目的，采用與實施例3相同的步驟，在細胞表面檢測可形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇，其與位轉(zhuǎn)化的E.coli有著明顯的區(qū)別(參照圖4)。如圖4所示，白色條帶是未轉(zhuǎn)化的E.coli JM109，而黑色條帶來源于E.coli轉(zhuǎn)化株pGNA-HB168/JM109。由此可見，未轉(zhuǎn)化的E.coli并未表達能形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇，而采用僅包括pgsA基因的表面表達載體轉(zhuǎn)化的E.coli轉(zhuǎn)化株顯然在細胞表面表達了能形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇。
實施例6重組表面表達載體pGNHB-A的構(gòu)建和可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表面表達(1)采用N-末端pgsA基因并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來構(gòu)建重組表達載體，該重組表達載體用來表達形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇，所述N-末端pgsA基因來自源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因。
基因pgsA包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
為了利用參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因獲得編碼pgsA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用總?cè)旧w作為模板，以寡核苷酸為引物進行聚合酶鏈式反應，所述寡核苷酸包括在N-末端的SEQ ID NO11和在C-末端的SEQ ID NO12核苷酸序列。
構(gòu)建與N-末端相應并包括SEQ ID NO11序列的引物，其包括限制性酶BamHI識別位點。在這一方面，擴增的基因區(qū)域約為1.1kb，它包括從參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsA的N-末端區(qū)域到pgsA的C-末端區(qū)域。將通過聚合酶鏈式反應擴增得到的基因用限制性酶BamHI和HindIII消化后插入至預先用BamHI和HindIII消化過的高表達載體pHCE19T(II)，從而制備新的被稱作表達載體pGNA2的表達載體，其大小約為4.8kb，在pgsA基因的前端具有新的限制性酶識別位點，并且在參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因的末端沒有終止密碼子(參考圖6)。
(2)還構(gòu)建了重組表達載體pGNHB-A，該表達載體能表達抗原決定簇，該抗原決定簇能形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體。詳細地，該重組表達載體是采用細胞外膜蛋白基因pgsA的N-末端，并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來制備的，所述的細胞外膜蛋白基因pgsA來源于參與多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA蛋白基因。
為了將乙型肝炎病毒S抗原基因插入表面表達載體pGNA2，采用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞，將1.4kb的肝炎病毒基因克隆至普通的克隆載體pUC18中用作模板，用帶有SEQ ID NO13和SEQ ID NO14核苷酸序列的寡核苷酸為引物，通過聚合酶鏈式反應來擴增S抗原基因。在這種情況下，擴增的基因區(qū)域的大小約為1.6bp。
帶有SEQ ID NO13和SEQ ID NO14核苷酸序列的引物還可構(gòu)建為在表面表達載體pGNA2中含有限制性酶NdeI和BamHI的識別位點。擴增的乙型肝炎病毒S抗原的基因采用限制性酶NdeI和BamHI消化，并與pgsA基因的N-末端區(qū)域連接，所述pgsA基因來自參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因，該基因存在于已經(jīng)通過調(diào)節(jié)翻譯密碼子的方法制備的表面表達載體pGNA2中。上述構(gòu)建的重組表達載體pGNHB-A在圖6中有描述。
(3)利用表面表達載體pGNHB-A對形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表達采用下述方法檢測將表面表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli宿主細胞，采用與上述實施例3所述的相同的步驟誘導表達。然后，使用抗S抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡的方法對該抗原決定簇在E.coli轉(zhuǎn)化株中的表達進行鑒別，該抗原決定簇可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體，且與細胞外膜蛋白pgsCA融合(參照圖5)。
如圖5所示，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2是細胞轉(zhuǎn)化株pGNHB-A/JM109。結(jié)果，鑒別到約48kDa的由重組表達載體pGNHB-A表達的融合蛋白條帶。
實施例7重組表面表達載體pGNC-PreS1的構(gòu)建和形成抗乙型肝炎病毒PreS1抗原的中和抗體的抗原決定簇的表面表達(1)采用C-末端pgsC基因并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來構(gòu)建重組表達載體，該重組表達載體用來表達可形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇，所述C-末端pgsC基因來自參與多聚-γ-谷氨酸合成的源于Bacillus sp.菌株的pgsBCA基因。
基因pgsC包含核苷酸序列SEQ ID NO2。
為了從參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因中獲得編碼pgsA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用總?cè)旧w作為模板，以寡核苷酸為引物進行聚合酶鏈式反應，所述寡核苷酸包括在N-末端的SEQ ID NO15和在C-末端的SEQ ID NO16核苷酸序列。
構(gòu)建包含SEQ ID NO15序列的N-末端引物，該引物包括存在于表面表達載體pHCE 19T(II)上的限制性酶NdeI識別位點，而所構(gòu)建的包含SEQID NO16序列的引物包括存在于表面表達載體pHCE 19T(II)上的限制性酶BamHI識別位點。在這一方面，擴增的基因區(qū)域約為0.45kb，范圍包括從參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsC的N-末端區(qū)域到pgsC的C-末端區(qū)域。將通過聚合酶鏈式反應擴增得到的基因用限制性酶BamHI和NdeI消化后插入至預先用BamHI和NdeI消化過的高表達載體pHCE19T(II)，從而制備新的被稱作表達載體pGNC的表達載體，其大小約為4.1kb，具有新的限制性酶識別位點，并且在參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因的末端沒有終止密碼子(參考圖7)。
(2)還構(gòu)建了重組表達載體pGNC-PreS1，該表達載體能表達抗原決定簇，該抗原決定簇能形成抗乙型肝炎病毒PreS1表面抗原的中和抗體。詳細地，該重組表達載體是采用細胞外膜蛋白基因pgsC的N-末端序列并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來制備的，所述的細胞外膜蛋白基因pgsC來源于參與多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA蛋白基因。
為了將乙型肝炎病毒PreS1抗原基因插入表面表達載體pGNC，采用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞，以克隆至普通的克隆載體pUC18的約1.5kb的肝炎病毒基因作為模板，以帶有SEQ ID NO17和SEQ ID NO18核苷酸序列的寡核苷酸為引物，通過聚合酶鏈式反應來擴增S抗原基因。在這種情況下，擴增的基因區(qū)域的大小約為356bp。
帶有SEQ ID NO17和SEQ ID NO18核苷酸序列的引物還可構(gòu)建為含有存在于表面表達載體pGNC中的限制性酶HindIII和BamHI的識別位點。擴增的乙型肝炎病毒PreS1抗原的基因采用限制性酶HindIII和BamHI消化，并與pgsC基因的N-末端區(qū)域連接，所述pgsC基因來自參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因，該基因存在于已經(jīng)通過調(diào)節(jié)翻譯密碼子的方法制備的表面表達載體pGNC中。上述構(gòu)建的重組表達載體pGNC-PreS1在圖7中有描述。
(3)利用表面表達載體pGNC-PreS1對形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表達采用下述方法檢測將表面表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli宿主細胞，采用與上述實施例3所述的相同的步驟誘導表達。然后，使用抗PreS1抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡的方法對抗原決定簇在E.coli轉(zhuǎn)化株中的表達進行鑒別，該抗原決定簇可形成抗乙型肝炎病毒PreS1抗原的中和抗體，且與細胞外膜蛋白pgsC融合(參照圖8)。
如圖8所示，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2和3是細胞轉(zhuǎn)化株pGNC-PreS1/JM109。結(jié)果，鑒別到約27kDa的由重組表達載體pGNC-PreS1表達的融合蛋白條帶。
實施例8重組表面表達載體pHCE1LBBCA和pHCE1LBBCA-HB168的構(gòu)建和產(chǎn)生抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表面表達(1)采用C-末端pgsC基因并用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來構(gòu)建重組表達載體pHCE1LBBCA，該重組表達載體用來使形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇表達至細胞表面，所述C-末端pgsC基因來自參與多聚-γ-谷氨酸合成的源于Bacillus sp.菌株的pgsBCA基因。
由于質(zhì)粒pHCE1LB在戈蘭氏陰性和戈蘭氏陽性細菌內(nèi)都能被接收并且能復制，因此采用該質(zhì)粒作為克隆載體。表達載體pHCE1LB由構(gòu)成性高表達HCE啟動子、包括多個限制性酶識別位點的克隆位點、在戈蘭氏陰性細菌中的可復制起點、以及對氨比西林的抗生素抗性標記所組成。此外，表面表達載體pHCE1LB由來源于Lactobacillus sp.的戈蘭氏陽性細菌的可復制起點和對氯霉素(chloroamphenicol)的抗生素抗性標記所組成。
為了獲得編碼pgsBCA蛋白的N-末端和C-末端基因，采用總?cè)旧w作為模板，以寡聚核苷酸為引物進行聚合酶鏈式反應，所述pgsBCA蛋白為參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白中之一，所述寡聚核苷酸包括在N-末端的SEQ ID NO4和在C-末端的SEQ ID NO5核苷酸序列。由此得到的擴增的基因區(qū)域的大小約為2.8kb，范圍包括從參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsB的N-末端區(qū)域到pgsA的C-末端區(qū)域。將通過聚合酶鏈式反應擴增得到的基因用限制性酶NcoI和BamHI消化后插入至預先用BamHI和NcoI消化過的表達載體pHCE1LB，從而制備新的被稱作pHCE1LBBCA的表達載體，其大小約為8kb，具有新的限制性酶識別位點，在參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因的末端沒有終止密碼子，并且可利用戈蘭氏陰性或者戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞(參考圖9)。
(2)還構(gòu)建了重組表達載體pHCE1LBBCA-HB168，該表達載體能表達抗原決定簇，該抗原決定簇能形成抗乙型肝炎病毒S表面抗原的中和抗體。詳細地，采用與上述相同的步驟，即利用參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA，并且用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞來制備重組表達載體。
上述構(gòu)建的重組表達載體pHCE1LBBCA-HB168在圖9中有描述。
(3)利用表面表達載體pHCE1LBBCA-HB168和Salmonella typhiTy21a作為戈蘭氏陰性宿主細胞對形成抗乙型肝炎病毒S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表達采用下述方法檢測將表面表達載體轉(zhuǎn)化至Salmonella typhi Ty21a宿主細胞，采用與上述實施例3所述的相同的步驟誘導表達。然后，利用外膜分類法(outermembrane fractionation)分開可溶性部分、內(nèi)膜部分和外膜部分，并對分離的部分采用抗S抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡的方法對抗原決定簇在Salmonella typhi Ty21a轉(zhuǎn)化株的細胞表面的表達進行鑒別。結(jié)果顯示，產(chǎn)生了大小為48kDa、可與pgsA融合的、可形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇條帶，且該抗原決定簇位于Salmonella typhiTy21a的外膜部分(參照圖10)。如圖10所示，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2是細胞轉(zhuǎn)化株的全細胞，泳道3、4和5分別是細胞轉(zhuǎn)化株的可溶性部分、外膜部分和內(nèi)膜部分。
此外，還通過熒光活化細胞分類(FACS)流式計數(shù)檢測法檢測了能形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇的表面表達。為了實現(xiàn)這一目的，采用與實施例3相同的步驟，在細胞表面檢測抗原決定簇蛋白，其與未轉(zhuǎn)化的Salmonella typhi Ty21a有著明顯的區(qū)別(參照圖10)。如圖10所示，黑色沒有箭頭的是未轉(zhuǎn)化的Salmonella typhi Ty21a，而黑色有箭頭的是轉(zhuǎn)化的Salmonella typhi Ty21a。由此可見，用表面表達載體轉(zhuǎn)化的E.coli轉(zhuǎn)化株很顯然能將形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇表達至細胞表面。
實施例9用于將可形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇表達至細胞表面的微生物中疫苗效力的分析構(gòu)建用于實施例8中表面表達的重組載體pHCE1LBBCA-HB168，將該載體轉(zhuǎn)化至戈蘭氏陰性細菌Salmonella typhi Ty21a中，利用與實施例3相同的步驟誘導在細胞表面的表達。然后，檢測能形成抗S抗原的中和抗體且與參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白融合的抗原決定簇的抗原性。
首先，將用于表面表達的重組載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化至Salmonella typhi Ty21a中，檢測上述抗原的表達。然后，將一部分Samonella菌株通過鼻腔給藥方式給予BALB/C小鼠，幾天以后(1)收集小鼠血清，檢測血清中存在的抗S抗原的IgG抗體，以及(2)收集小鼠各器官，利用酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(ELISA)檢測用于洗滌器官的懸浮溶液中抗S抗原的IgA抗體的存在。
在該測定中，用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌收集的細胞，并調(diào)節(jié)至相同的細胞濃度，然后取表面有抗原表面表達的Salmonella typhi Ty21a細胞2×109個，用鼻腔給藥的方式給予4～6周齡的BALB/C小鼠，共給予兩次，兩次之間的間隔為3天。4周以后，再注射給藥2次，兩次之間的間隔為3天。2周以后收集血清和用于洗滌器官的溶液，利用ELISA的方法檢測抗該抗原的抗體的滴度(參照圖11)。
如圖11所示，框圖A所示為血清中抗S抗原決定簇的IgG抗體的滴度也就是未轉(zhuǎn)化的Salmonella的滴度、用表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Samonella的滴度、以及用表達載體pHCE1LBHB168轉(zhuǎn)化的Samonella的滴度。在圖11中，框圖B所示為組織中抗S抗原決定簇的IgA抗體的滴度也就是未轉(zhuǎn)化的Salmonella的滴度、用表達載體pHCE1LBHB168轉(zhuǎn)化的Samonella的滴度、以及用表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Samonella的滴度。
如圖11所示，用表面表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Salmonella typhi Ty21a轉(zhuǎn)化株的BALB/c小鼠的血清和用于洗滌器官的溶液中有更高滴度的IgG和IgA，且與其他各組的結(jié)果有明顯的差別。
因此，證實了本發(fā)明的微生物可用作有效的活疫苗，所述微生物可將形成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇表達至細胞表面。
實施例10形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗體的抗原決定簇在以表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陽性細菌表面的表達研究了如實施例8所示的可形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗體的抗原決定簇在戈蘭氏陽性細菌Lactobacillus casei表面的表達，所述細菌采用為表面表達所構(gòu)建的重組載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化。
將如上制備的用于表面表達的重組載體轉(zhuǎn)化至Lactobacillus casei并在含有200ml MRS介質(zhì)和50mg/L抗生素氯霉素的500ml培養(yǎng)瓶(flask)的穩(wěn)定狀態(tài)下培養(yǎng)，從而誘導表面表達。
為了對位于Lactobacillus casei細胞表面的抗原決定簇進行定位，利用細胞壁分餾法(cell wall fractionation method)將細胞轉(zhuǎn)化株分離成片段，諸如細胞質(zhì)和細胞壁等，然后利用抗S抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡的方法對上述分離的部分進行分析。利用相同的細胞濃度收集將融合蛋白誘導表達至細胞表面的Lactobacillus轉(zhuǎn)化株和未轉(zhuǎn)化的Lactobacillus，用TES緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，25％蔗糖)洗滌幾次，用含有5mg/ml溶解酶、1mM PMSF、以及1mM EDTA的蒸餾水重懸，然后分別在-60℃和室溫冷凍及溶解幾次。所得的細胞加入0.5mg/ml的DNase和0.5mg/ml的RNase，用超聲儀裂解。然后，將超聲裂解后的細胞溶液在4℃，10,000Xg離心20分鐘分離出Lactobacillus全細胞沉淀(全細胞部分)，即未被超聲的部分以及細胞碎片(上清部分)，然后再在4℃，21,000Xg離心1小時，收集包含Lactobacillus細胞質(zhì)蛋白的上清液以及細胞沉淀。將所得的細胞沉淀用含有1％SDS的TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，pH 7.4)重懸，收集Lactobacillus的細胞壁蛋白(細胞壁片段)。
利用抗S抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡方法對每一部分進行分析，確定細胞壁上可形成抗S抗原中和抗體的抗原決定簇的位點(參照圖12A)。如圖12所示，泳道1、3和5是未轉(zhuǎn)化Lactobacillus casei，泳道2是用表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Lactobacillus casei全細胞，泳道4和6分別是轉(zhuǎn)化細胞的可溶性部分和細胞壁部分。
此外，采用熒光活化細胞分類(FACS)流氏計數(shù)檢測法檢測到形成S抗原中和抗體的抗原決定簇從多聚-γ-谷氨酸合成酶蛋白的C-末端的表達。為了這一目的，采用與實施例3所述的相同的步驟，結(jié)果顯示在細胞表面顯示有抗原決定簇蛋白，這一點與未轉(zhuǎn)化的Lactobacillus有明顯區(qū)別(參照圖12B)。如圖12B所示，白色帶為未轉(zhuǎn)化的Lactobacillus，黑色條帶來自于采用表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Lactobacillus細胞。結(jié)果顯示，用表面表達載體轉(zhuǎn)化的Lactobacillus轉(zhuǎn)化株能明顯將形成抗S抗原的中和抗體的抗原決定簇表達至細胞表面。
實施例11將形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗體的抗原決定簇表達至細胞表面的微生物進行疫苗效力2的分析構(gòu)建用于實施例8中表面表達的重組載體pHCE1LBBCA-HB168，將該載體轉(zhuǎn)化至戈蘭氏陽性細菌Lactobacillus casei中，利用與實施例3相同的步驟誘導在細胞表面的表達。然后，檢測能形成抗乙型肝炎S抗原的中和抗體且與參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白融合的抗原決定簇的抗原性。
首先，將構(gòu)建的用于表面表達的重組載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化至Lactobacillus casei中，收集并使之達到相同的細胞濃度，用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌幾次，然后，取表面表達了抗原的Lactobacillus細胞5×1010個，通過口腔給藥的方式給予4-6周齡的BALB/c小鼠，共給予3次，每次之間的時間間隔為1天，4周以后再給予3次，間隔為1天。此外，取表面表達了抗原的Lactobacillus細胞1×1010個，通過鼻腔給藥的方式給予BALB/c小鼠，共給予2次，每次之間的時間間隔為3天，4周以后再給予2次，間隔為3天?？谇缓捅乔唤o藥2周后(1)收集小鼠血清，檢測血清中存在的抗S抗原的IgG抗體滴度，以及(2)收集小鼠各器官，利用酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(ELISA)檢測用于洗滌器官的懸浮溶液中抗S抗原的IgA抗體的存在(參照圖13)。
如圖13所示，框圖A所示為血清中抗S抗原決定簇的IgG抗體的滴度也就是在鼻腔給藥組中以表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Lactobacillus中的滴度、在口腔給藥組中以表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Lactobacillus中的滴度、在口腔給藥組中以表達載體pHCE1LBHB168(其中pgsBCA基因缺失，使用該載體細胞能表達HB168)轉(zhuǎn)化的Lactobacillus中的滴度、以及口腔給藥組中未轉(zhuǎn)化的Lactobacillus中的滴度。在圖13中，框圖B所示為器官中抗S抗原決定簇的IgA抗體的滴度也就是未轉(zhuǎn)化的Lactobacillus中的滴度、以表達載體pHCE1LBHB168轉(zhuǎn)化的Lactobacillus中的滴度、以及以表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Lactobacillus中的滴度。利用不同的分組進行試驗鼻腔給藥組和口腔給藥組。
如圖11所示，給予以表面表達載體pHCE1LBBCA-HB168轉(zhuǎn)化的Lactobacillus轉(zhuǎn)化株的BALB/c小鼠的血清和用于洗滌器官的溶液中有更高滴度的IgG和IgA，且與其他各組的結(jié)果有明顯的差別。
因此，證實了本發(fā)明的微生物可用作有效的活疫苗，所述微生物可將形成抗乙型肝炎病毒S抗原中和抗體的抗原決定簇表達至細胞表面。
實施例12表面表達載體pHCE1LBA的構(gòu)建僅利用細胞外膜蛋白基因pgsA來構(gòu)建重組表達載體，所述重組表達載體可表達形成抗乙型肝炎S抗原中和抗體的抗原決定簇，所述pgsA基因為來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA即表面表達載體pHCE1LBA，其能利用戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞。
為了獲得參與多聚-γ-谷氨酸生物合成的細胞外膜蛋白中編碼pgsA蛋白的N-末端和C-末端的編碼基因，采用總?cè)旧w作為模板，以N-末端核苷酸序列為SEQ ID NO10、C-末端核苷酸序列為SEQ ID NO5的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應。
在這種情況下，測定擴增基因區(qū)域的大小約為1.1kb，范圍包括從參與多聚-γ-谷氨酸生物合成的外膜蛋白基因pgsA的N-末端區(qū)域到C-末端區(qū)域。通過聚合酶鏈式反應擴增的基因用限制性酶NdeI和BamHI消化，并插入至預先以BamHI和NdeI消化的表達載體pHCE1LB中，從而構(gòu)建新的表達載體pGNCA，該表達載體大小約為6.3kb，具有新的限制性酶識別位點，在細胞外膜蛋白基因的末端不包括翻譯終止密碼子，其能利用戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞(參考圖14)。
實施例13重組表面表達載體pHCE1LBA-TGEN1的構(gòu)建以及TGE N抗原的表面表達利用pgsA基因以及戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞構(gòu)建重組表達載體pHCE1LBA-TGEN1，所述重組表達載體可將誘導豬遺傳性胃病的遺傳性胃腸炎病毒(TGE)的核蛋白(N)抗原表達至細胞表面，所述pgsA基因來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA。
為了將TGE病毒的N抗原基因的主要抗原決定簇區(qū)域引入表面表達載體pHCE1LBA中，如實施例12所述，利用戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞，約1.1kb的TGE病毒基因克隆至通用的克隆載體pUC8中用作模板，以核苷酸序列為SEQ ID NO19和SEQ ID NO20的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增S抗原基因。結(jié)果得到大小為415bp的擴增基因片段。在這種情況下，還可構(gòu)建核苷酸序列為SEQ IDNO19和SEQ ID NO20的寡核苷酸引物使其含有存在于表面表達載體pHCE1LBA的限制性酶BamHI和HindIII的識別位點。
接下來，用限制性酶BamHI和HindIII消化擴增的TGE病毒的N抗原基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至表面表達載體pHCE1LBA中的細胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端區(qū)域。所得的重組表達載體pHCE1LBA-TGEN1如圖1所示。
采用重組表達載體pHCE1LBA-TGEN1在E.coli和Lactobacillus中研究TGE病毒N抗原的表面表達。為實現(xiàn)這一目的，將重組表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli和Lactobacillus中，采用與上述相同的步驟誘導表達。分別利用抗TGEN抗原和pgsA蛋白的抗體，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡的方法證實了與細胞外膜蛋白融合的TGE N抗原在細胞表面的表達(參考圖15)。
如圖15所示，在A中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2和3是細胞轉(zhuǎn)化株pHCE1LBA-TGEN1/JM109，在B中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞Lactobacillus casei，泳道3和4是Lactobacillus casei的轉(zhuǎn)化株pHCE1LB-TGEN1。結(jié)果顯示，鑒別到大小約57kDa的條帶，該條帶對應于從表達載體pHCE1LBA-TGEN1制備的融合蛋白。
實施例14重組表面表達載體pHEC1LBA-PEDN的構(gòu)建以及PED N抗原的表面表達(1)利用pgsA基因以及戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞構(gòu)建重組表達載體pHCE1LBA-PEDN，所述重組表達載體可將誘導豬遺傳性胃病的豬流行性痢疾病毒(PED)的核蛋白(N)抗原表達至細胞表面，所述pgsA基因來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA。
為了將PED病毒的N抗原基因的抗原決定簇區(qū)域引入表面表達載體pHCE1LBA中，如實施例12所述，利用戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞，約1.3kb的PED病毒基因克隆至通用的克隆載體pUC8中用作模板，以核苷酸序列為SEQ ID NO21和SEQ ID NO22的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增S抗原基因。結(jié)果得到大小為1326bp的擴增基因片段。在這種情況下，還可構(gòu)建核苷酸序列為SEQ ID NO21和SEQ ID NO22的核苷酸引物使其含有存在于表面表達載體pHCE1LBA的限制性酶BamHI和HindIII的識別位點。
接下來，用限制性酶BamHI和HindIII消化擴增的PED病毒的N抗原基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至表面表達載體pHCE1LBA中細胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端區(qū)域。所得的重組表達載體pHCE1LBA-PEDN如圖14所示。
(2)采用重組表達載體pHCE1LBA-PEDN在E.coli和Lactobacillus中研究PED病毒N抗原的表面表達。為實現(xiàn)這一目的，將重組表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli和Lactobacillus中，采用與上述相同的步驟誘導表達。分別利用抗PED N抗原和pgsA蛋白的抗體，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡的方法證實了與細胞外膜蛋白融合的PED N抗原在細胞表面的表達(參考圖16)。
如圖16所示，在A中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2和3是細胞轉(zhuǎn)化株pHCE1LBA-TGEN1/JM109，在B中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞Lactobacillus casei，泳道2是Lactobacillus casei的轉(zhuǎn)化株pHCE1LBA，泳道3是Lactobacillus casei的轉(zhuǎn)化株pHCE1LBA-PEDN。
如上圖所述，鑒別到大小約90kDa的條帶，該條帶對應于從表達載體pHCE1LBA-PEDN制備的融合蛋白。
實施例15用于將TGE病毒和PED病毒的N抗原表達至細胞表面的Lactobacillus的疫苗效力2的分析分別構(gòu)建用于實施例13和14中表面表達的重組載體pHCE1LBA-TGEN1和pHCE1LBA-PEDN，將該載體轉(zhuǎn)化至戈蘭氏陽性細菌Lactobacillus casei中，利用與實施例3相同的步驟誘導在細胞表面的表達。然后，檢測與參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白融合的TGE病毒N抗原和PED病毒N抗原的抗原性。
首先，將構(gòu)建的用于表面表達的重組載體pHCE1LBA-TGEN1和pHCE1LBA-PEDN轉(zhuǎn)化至Lactobacillus casei中，收集并使之達到相同的細胞濃度，用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌幾次，然后，取表面表達了N抗原的Lactobacillus細胞5×10個，各自通過口腔給藥的方式給予4-6周齡的BALB/c小鼠，共給予3次，每次之間的時間間隔為1天，1周以后再給予3次，間隔為1天。第一次給藥4周以后(1)收集小鼠血清，利用N抗原通過Western印跡的方法檢測抗N抗原的IgG抗體的存在(參照圖17)。
結(jié)果如圖17所示，給予了用表面表達載體pHCE1LBA-TGEN1(A)或者pHCE1LBA-PEDN(B)轉(zhuǎn)化的Lactobacillus轉(zhuǎn)化株的BALB/c小鼠的血清中含有抗N抗原的抗體。
實施例16重組表達載體pHCE1LBA-PreS1的構(gòu)建以及PreS1抗原的表面表達(1)僅利用來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因的細胞外膜蛋白基因pgsA基因構(gòu)建重組表達載體，該重組表達載體可將來源于乙型肝炎S抗原的PreS1抗原表達至細胞表面，即表面表達載體pHCE1LBA-PreS1，所述pgsA基因可利用戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞。
為了將來源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS1抗原決定簇引入表面表達載體pHCE1LBA中，如實施例12所述，利用戈蘭氏陽性細菌或戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞，約1.5kb的乙型肝炎病毒基因克隆至通用的克隆載體pUC8中作為模板，以包含核苷酸序列SEQ ID NO17和SEQ ID NO18的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應。
接下來，用限制性酶BamHI和HindIII消化擴增的HBV S抗原基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至表達載體pHCE1LBA中細胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端區(qū)域，從而得到如圖18所示的新的被稱作pHCE1LBA-PreS1的重組表達載體。
(2)采用重組表達載體pHCE1LBA-PreS1在E.coli中研究乙型肝炎病毒PreS1抗原的表面表達。為實現(xiàn)這一目的，將重組表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli中，采用與實施例3相同的步驟誘導表達。利用抗PreS1抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡的方法證實了與細胞外膜蛋白pgsA融合的PreS1抗原在細胞表面的表達(參考圖20中A)。
如圖20所示，在A中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2是細胞轉(zhuǎn)化株pHCE1LBA-PreS1/JM109。
如上圖所述，鑒別到大小約55kDa的條帶，該條帶對應于從表達載體pHCE1LBA-TGEN1制備的融合蛋白。
實施例17重組表面表達載體pHCE1LBA-PreS2的構(gòu)建利用來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白pgsBCA基因的pgsA基因，并利用及戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞構(gòu)建重組表達載體pHCE1LBA-PreS2，所述重組表達載體pHCE1LBA-PreS2可將來源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS2抗原表達至細胞表面。
為了將乙型肝炎病毒的PreS2抗原基因的抗原決定簇區(qū)域引入表面表達載體pHCE1LBA中，如實施例12所述，利用戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞，約1.3kb的乙型肝炎病毒基因克隆至通用克隆載體pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列SEQ ID NO23和SEQ ID NO24的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應從而擴增PreS2抗原基因。該擴增得到大小約165bp的擴增基因區(qū)域。構(gòu)建的包含SEQ ID NO23和SEQ IDNO24的引物還進一步含有存在于表面表達載體pHCE1LBA中的包括限制性酶BamHI和HindIII的識別位點。
用限制性酶BamHI和HindIII消化通過聚合酶鏈式反應擴增的HBVPreS2抗原基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至表達載體pHCE1LBA中細胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端區(qū)域，從而得到如圖18所示的新的被稱作pHCE1LBA-PreS2的重組表達載體。
實施例18重組表達載體pHEC1LBA-PreS1PreS2的構(gòu)建以及PreS1抗原的表面表達(1)僅利用來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的pgsBCA基因的細胞外膜蛋白基因pgsA構(gòu)建重組表達載體，所述重組表達載體可將PreS1抗原和PreS2抗原的融合形式表達至細胞表面，所述PreS1抗原和PreS2抗原來源于乙型肝炎病毒表面抗原所述重組表達載體即為pHEC1LBA-PreS1PreS2，其可利用及戈蘭氏陰性細菌或戈蘭氏陽性細菌作為宿主細胞。
為了將來源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS1和PreS2的抗原決定簇引入表面表達載體pHCE1LBA中，如實施例12所述，利用戈蘭氏陽性細菌或戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞，約1.5kb的乙型肝炎病毒基因克隆至通用的克隆載體pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列SEQ ID NO17和SEQ IDNO24的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應。該反應得到大小約522bp的基因擴增區(qū)域。
接下來，用限制性酶BamHI和HindIII消化擴增的HBV PreS1PreS2抗原基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至表達載體pHCE1LBA中細胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端區(qū)域，從而得到如圖19所示的新的被稱作pHCE1LBA-PreS1PreS2的重組表達載體。
(2)采用重組表達載體pHCE1LBA-PreS1PreS2在E.coli中研究HBVPreS1和PreS2抗原的表面表達。為實現(xiàn)這一目的，將重組表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli中，采用與實施例3相同的步驟誘導表達。利用抗PreS1抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡的方法證實了與細胞外膜蛋白pgsA融合的PreS1PreS2抗原在細胞表面的表達(參考圖20中A)。如圖20所示，在A中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道3是細胞轉(zhuǎn)化株pHCE1LBA-PreS1PreS2/JM109。
如上圖所述，鑒別到大小約60kDa的條帶，該條帶對應于從表達載體pHCE1LBA-TGEN1制備的融合蛋白。
實施例19重組表面表達載體pHEC1LBA-L的構(gòu)建以及L抗原的表面表達(1)利用來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA的pgsA基因，并利用戈蘭氏陽性或戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞構(gòu)建重組表達載體pHCE1LBA-L，所述重組表達載體pHCE1LBA-L可將來源于乙型肝炎病毒表面抗原的PreS1和PreS2及S抗原的融合形式表達至細胞表面。構(gòu)建的包含SEQ ID NO25的引物還包括存在于表面表達載體pHCE1LBA中的限制性酶BamHI和HindIII識別位點。
用限制性酶BamHI和HindIII消化擴增的乙型肝炎病毒的L基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至來源于細胞外膜基因的pgsA基因的C-末端區(qū)域。重組表達載體pHCE1LBA-L如圖19所示。
(3)采用重組表達載體pHCE1LBA-L在E.coli中研究L抗原，即包括PreS1、PreS2以及S抗原的融合抗原的表面表達。為實現(xiàn)這一目的，將表面表達載體轉(zhuǎn)化至E.coli宿主細胞中，采用與實施例3相同的步驟誘導表達。利用抗PreS1抗原的抗體通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫印跡的方法證實了與細胞外膜蛋白pgsA融合的L抗原的表達(參考圖20中B)。如圖20所示，在A中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的宿主細胞JM109，泳道2和3是細胞轉(zhuǎn)化株pHCE1LBA/JM109。
如上圖所述，鑒別到大小約86kDa的條帶，該條帶對應于由重組表達載體pHCE1LBA-L表達的融合蛋白。
實施例20重組表面表達載體pHCE1LBA-TNF-α的構(gòu)建利用來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA的pgsA基因，并利用及戈蘭氏陽性或戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞構(gòu)建重組表達載體pHCE1LBA-TNF-α，所述重組表達載體pHCE1LBA-TNF-α可將腫瘤壞死因子α(TNF-α)——一種制藥或者臨床應用的蛋白，的融合形式表達至細胞表面。
為了將TNF-α基因引入表面表達載體pHCE1LBA中，如實施例12所述，利用戈蘭氏陽性或戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞，約0.5kb的TNF-α基因克隆至通用的克隆載體pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列SEQ IDNO26和SEQ ID NO27的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應。該擴增得到大小為482bp的基因擴增區(qū)域。構(gòu)建的包含SEQ ID NO26和SEQID NO27的引物還包含存在于表面表達載體pHCE1LBA中的限制性酶BamHI和HindIII的識別位點。
用限制性酶HindIII和BamHI消化擴增的乙型肝炎病毒L基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜基因的C-末端區(qū)域，從而得到如圖21所示的重組表達載體pHCE1LBA-TNF-α。
實施例21重組表面表達載體pGNA-脂肪酶的構(gòu)建以及脂肪酶的表面表達利用pgsA基因以及戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞構(gòu)建重組表達載體pGNA-脂肪酶，所述重組表達載體可將脂肪酶表達至細胞表面，所述pgsA基因來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA。
為了將脂肪酶基因引入表面表達載體pGNA中，利用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞，約0.5kb的脂肪酶基因克隆至通用的克隆載體pUC8中用作模板，以包含核苷酸序列為SEQ ID NO28和SEQ ID NO29的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應。結(jié)果得到大小為546bp的擴增基因片段。包含SEQ ID NO28和SEQ ID NO29的引物還進一步構(gòu)建為含有表面表達載體pGNA中的限制性酶BamHI和HindIII的識別位點。
用限制性酶BamHI和HindIII消化擴增的乙型肝炎病毒的L基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其連接至參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜基因的C-末端區(qū)域。按上述方法構(gòu)建得到的重組表達載體pGNA-脂肪酶如圖22所示。
(2)采用重組表達載體pGNA-脂肪酶在E.coli中研究脂肪酶基因的表面表達。為實現(xiàn)這一目的，將重組表達載體pGNA-脂肪酶轉(zhuǎn)化至E.coli中，采用與上述實施例3相同的步驟誘導表達。然后，在包含1％的具有油降解活性的三辛酸甘油酯的瓊脂介質(zhì)(1％胰化蛋白胨(trypton)、0.5％酵母提取物、0.619％NaCl、0.5％阿拉伯膠、1mM CaCl、1％三辛酸甘油酯)中檢測表達至細胞表面的脂肪酶的活性。將E.coli轉(zhuǎn)化株涂至含有1％油性底物的瓊脂介質(zhì)表面，然后在37℃穩(wěn)定狀態(tài)下培養(yǎng)9小時。
結(jié)果，油性底物降解變?yōu)榍宄膮^(qū)域(參考圖22)，從而證實了脂肪酶在細胞表面的表達。
實施例22重組表面表達載體pGNA-酰胺酶的構(gòu)建以及酰胺酶的表面表達
(1)利用pgsA基因以及戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞構(gòu)建重組表達載體pGNA-酰胺酶，所述重組表達載體可將酰胺酶表達至細胞表面，所述pgsA基因來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA。
為了將酰胺酶基因引入表面表達載體pGNA中，利用戈蘭氏陰性細菌作為宿主細胞，約0.8kb的酰胺酶基因克隆至E.coli表達載體pGNA中用作模板，以包含核苷酸序列為SEQ ID NO30和SEQ ID NO31的寡核苷酸作為引物，進行聚合酶鏈式反應。結(jié)果得到大小為792bp的擴增基因片段。包含SEQ ID NO30和SEQ ID NO31的引物還進一步被構(gòu)建為含有表面表達載體pGNA中限制性酶BamHI和HindIII的識別位點。
用限制性酶HindIII和BamHI消化擴增的乙型肝炎病毒的L基因，并通過調(diào)整翻譯密碼子的方式將其與參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜基因C-末端區(qū)域的表面表達載體pGNA相連接。按上述方法構(gòu)建得到的重組表達載pGNA-酰胺酶如圖23所示。
(2)采用重組表達載體pGNA-酰胺酶在E.coli中研究酰胺酶基因的表面表達。為實現(xiàn)這一目的，將重組表達載體pGNA-脂肪酶轉(zhuǎn)化至E.coli中，采用與上述實施例3相同的步驟誘導表達。然后，在E.coli中加入100mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0，其中含有10mM的D-alaNH作為底物，并含有0.5mM的CoCl作為輔助因子)，檢測表達至細胞表面的酰胺酶的活性。詳細地，反應幾小時后，利用HPLC(Hypersil ODS；250×4.6mm柱)對表面表達了酰胺酶的E.coli進行檢測，在600nm的OD值為1的細胞生長作為一個單位體積。利用上述方法比較野生型E.coli和包含表面表達載體pGNA的細胞轉(zhuǎn)化株中表達至細胞表面的酰胺酶的酶活性。
如圖23所示，與對照組相比，可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的E.coli轉(zhuǎn)化株的酰胺酶活性升高了100倍。因此，證實了本發(fā)明的表面表達方法可有效地將酰胺酶表達至細胞表面。
工業(yè)實用性如上所示及所證，本發(fā)明的新的表達載體可在微生物表面有效制備外源性蛋白，它是利用來源于Bacillus sp.菌株的參與多聚-γ-谷氨酸合成的細胞外膜蛋白基因pgsBCA作為表面表達的載體從而在微生物表面產(chǎn)生外源蛋白，并且該載體在戈蘭氏陰性細菌及戈蘭氏陽性細菌都能穩(wěn)定應用。采用表面表達載體轉(zhuǎn)化的細胞轉(zhuǎn)化株包括外源性目的蛋白的插入位點，從而制備所連接的編碼外源性蛋白的外源性基因，通過培養(yǎng)使之進行細胞表面表達。
本發(fā)明的表面表達載體可有效用作多種外源性蛋白在細胞表面的穩(wěn)定和易測的表達，該方法不用考慮細胞周期的情況。因此，這種微生物表面表達系統(tǒng)可用于制備多種抗原、重組抗體、重組酶、以及連接或吸附蛋白，可篩選多種抗原和抗體，并能制備用于生物轉(zhuǎn)化的酶類。實際上，這些酶可被表達至細胞表面且其催化活性沒有任何降低，從而可使本發(fā)明工業(yè)應用于生物轉(zhuǎn)化的目的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用本發(fā)明公開的思想以及前述說明書中特定的實施例可以很容易地修改或者設(shè)計出其它的實施例，從而實現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員同樣在不偏離本發(fā)明所附權(quán)利要求書的實質(zhì)精神的情況下可嘗試等效的實施例。
SEQUENCE LISTING<110>生物領(lǐng)先公司M.D.實驗室有限公司<120>具有編碼多聚-γ-谷氨酸合成酶的基因pgsBCA的表面表達載體以及利用該載體在微生物表面表達目的蛋白的方法<130>PC031033C<150>KR2001-48373<151>2001-08-10<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1182<212>DNA<213>Bacillus subtilis<400>1atgggctggt tactcattat agcctgtgct gtcatactgg tcatcggaat attagaaaaa60cgacgacatc agaaaaacat tgatgccctc cctgttcggg tgaatattaa cggcatccgc120ggaaaatcga ctgtgacaag gctgacaacc ggaatattaa tagaagccgg ttacaagact180gttggaaaaa caacaggaac agatgcaaga atgatttact gggacacacc ggaggaaaag240ccgattaaac ggaaacctca ggggccgaat atcggagagc aaaaagaagt catgagagaa300acagtagaaa gaggggctaa cgcgattgtc agtgaatgca tggctgttaa cccagattat360caaatcatct ttcaggaaga acttctgcag gccaatatcg gcgtcattgt gaatgtttta420gaagaccata tggatgtcat ggggccgacg cttgatgaaa ttgcagaagc gtttaccgct480acaattcctt ataatggcca tcttgtcatt acagatagtg aatataccga gttctttaaa540caaaaagcaa aagaacgaaa cacaaaagtc atcattgctg ataactcaaa aattacagat600gagtatttac gtaattttga atacatggta ttccctgata acgcttctct ggcgctgggt660gtggctcaag cactcggcat tgacgaagaa acagcattta agggaatgct gaatgcgccg720
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aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc120atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt attctgacga cgtactctca180gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa240ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca300ggaaactttg aaaacccgtg aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt360catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaattt cacggttctc420aacagcgcca acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga480gaatttgcga agcaaaacct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa540aagaaaattt cgtaccagaa agtcaacggg gtaacgattg caacgcttgg ctttaccgat600gtgtccggga aaggtttcgc ggctaaaaag aatacgccgg gcgtgctgcc cgcagatcct660gaaatcttca tccctatgat ttcagaagcg aaaaaacatg ctgacattgt tgttgtgcag720tcacactggg gccaagagta tgacaatgat ccaaacgacc gccagcgcca gcttgcaaga780gccatgtctg atgcgggagc tgacatcatc gtcggccatc atccgcacgt cttagaaccg840attgaagtat ataacggaac cgtcattttc tacagcctcg gcaactttgt ctttgaccaa900ggctggacga gaacaagaga cagtgcactg gttcagtatc acctgaagaa aaatggaaca960ggccgctttg aagtgacacc gatcgatatc catgaagcga cacctgcacc tgtgaaaaaa1020gacagcctta aacagaaaac cattattcgc gaactgacga aagactctaa tttcgcttgg1080aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa11401140<210>4<211>31<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>PCR primer 3<400>7ctgggatccc aaggtatgtt gcccgtttg 29<210>8<211>30<212>DNA
<213>Artificial Sequence<220>
<223>PCR primer 4<400>8tgaagcttat taggacgatg ggatgggaat 30
權(quán)利要求
1.一種在微生物表面制備蛋白的表達載體，其包含一種或兩種以上編碼多聚-γ-谷氨酸合成酶復合物的、選自pgsB、pgsC或pgsA的基因。
2.權(quán)利要求1所述的在微生物表面制備蛋白的表達載體，其中所述的基因來源于制備聚-γ-谷氨酸合成酶的Bacillus sp.菌株。
3.權(quán)利要求1所述的在微生物表面制備蛋白的表達載體，其中pgsB、pgsC、pgsA基因的核苷酸序列分別與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3的基因同源，具有80％的同源性。
4.權(quán)利要求1所述的在微生物表面制備蛋白的表達載體，其中所述的基因包含編碼目的蛋白的基因并且在3’-末端具有轉(zhuǎn)錄終止密碼子。
5.權(quán)利要求4所述的在微生物表面制備蛋白的表達載體，其中所述的編碼目的蛋白的基因選自編碼酶、抗原、抗體、連接蛋白或者吸附蛋白的基因。
6.權(quán)利要求1-5任意一個所述的在微生物表面制備蛋白的表達載體，其中所述的表達載體用于戈蘭氏陰性細菌。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的被表達載體轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陰性細菌，該表達載體能在微生物表面表達蛋白。
8.權(quán)利要求1-5任意一個所述的在微生物表面制備蛋白的表達載體，其中所述的表達載體用于戈蘭氏陽性細菌。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的被表達載體轉(zhuǎn)化的戈蘭氏陽性細菌，該表達載體能在微生物表面表達蛋白。
10.權(quán)利要求1-5任意一個所述的在微生物表面制備蛋白的表達載體，其中所述的表達載體能用于戈蘭氏陰性及戈蘭氏陽性細菌。
11.一種在戈蘭氏陰性宿主細胞的表面表達目的蛋白的方法，其包括下述步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求6所述通過將編碼目的蛋白的基因插入到表面表達載體來構(gòu)建重組表達載體；(b)用所述的重組載體轉(zhuǎn)化戈蘭氏陰性宿主細胞；以及(c)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細胞，在宿主細胞的表面表達所述的目的蛋白。
12.一種在戈蘭氏陽性宿主細胞的表面表達目的蛋白的方法，其包括下述步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求6所述通過將編碼目的蛋白的基因插入到表面表達載體來構(gòu)建重組表達載體；(b)用所述的重組載體轉(zhuǎn)化戈蘭氏陰性宿主細胞；以及(c)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化的宿主細胞，在宿主細胞的表面表達所述的目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有編碼多聚－γ－谷氨酸合成酶基因pgsBCA的表面表達載體，以及利用該載體在微生物表面表達目的蛋白的方法。將外源性基因插入該載體，轉(zhuǎn)化微生物，使外源性蛋白在微生物表面穩(wěn)定表達。
文檔編號C12R1/01GK1539018SQ02815371
公開日2004年10月20日 申請日期2002年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月10日
發(fā)明者成文喜, 洪承杓, 李宗洙, 鄭昌敏, 金哲仲, 左右田健次, 蘆內(nèi)誠, 健次 申請人:生物領(lǐng)先公司, M.D.實驗室有限公司