專利名稱：具有增強的對真菌疾病的抗性的遺傳修飾過的植物及其生產(chǎn)方法
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1.本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及遺傳修飾過的植物，更具體地講，涉及遺傳修飾過的馬鈴薯植物。在用包括具有兩個或兩個以上殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因，特別是具有兩個殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蕓薹屬殼多糖酶基因和三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶基因的載體轉(zhuǎn)化所述植物之后，所述遺傳修飾過的植物具有增強的對病原體的抗性。本發(fā)明還涉及能轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物，以便賦予所述馬鈴薯植物對病原體的免疫力的重組載體。所述載體包括具有兩個或兩個以上殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶基因；和β-1，3-葡聚糖酶基因。本發(fā)明還涉及通過表達殼多糖酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)生高病原體抗性植物的方法。
2.本發(fā)明背景植物在作為包括人類在內(nèi)的動物的營養(yǎng)物質(zhì)方面，以及用于生產(chǎn)可用作藥品，化妝品等的物質(zhì)方面起著重要作用。世界人口的穩(wěn)定增長，導(dǎo)致了對植物作物的不斷增長的需求。這種增長的需求，必須通過可供農(nóng)業(yè)使用的減少了的土地資源來滿足。通過能夠更好地生長并且對植物病原體的抗性更強的工程生產(chǎn)的植物物種，可以用現(xiàn)有的土地資源，提供較高的作物產(chǎn)量。
植物受到多種病原體的威脅，例如，真菌，細菌，病毒，昆蟲和線蟲。一小部分病原體能成功地侵入植物組織，并因此導(dǎo)致疾病。具體地講，馬鈴薯是高度易受真菌感染的主要糧食作用。應(yīng)對真菌疾病的一種方法包括使用化學(xué)殺真菌劑。不過，殺真菌劑的使用會導(dǎo)致較高的成本和環(huán)境破壞。以前提高植物病原體抗性的方法，包括在易感線蟲的馬鈴薯品系中表達馬鈴薯Mi-1.2抗線蟲基因。所得到的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物在大部分轉(zhuǎn)基因植物中表現(xiàn)出對根瘤線蟲M.javanica株VW4和M.incognita株VW6的抗性，但是不抗M.javanica株VW5，因此與Mi基因在野生型植物中的特異性類似(Milligan等，1998，ThePlant Cell 101307-1319)。
在另一項研究中，通過從能表達Avr9，一種Cf-9誘導(dǎo)物的植物中的編碼Cf-9抗性基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因上的可轉(zhuǎn)座元件，激活失活的編碼Cf-9抗性基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因而誘導(dǎo)植物抗性(WO 95/31564)。另外，植物Prf抗性基因在馬鈴薯植物中的超量表達，導(dǎo)致了對P.s.pathovar tomato株DC3000，X.c.pv.vesicatoria株56，R.solanacearum株82細菌病原體和TMV病毒病原體的抗性的增強(Oldroyd等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9510300-10305)。
在提高植物抗性的另一種嘗試中，在馬鈴薯植物中表達葡萄糖氧化酶，以便產(chǎn)生H2O2，即在植物防御反應(yīng)期間，通過葡萄糖氧化產(chǎn)生的一種試劑。H2O2在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中的增加，被證實增強了對E.carotovora亞種carotovora和P.infestans的抗性(Wu等，1995，The Plant Cell 71357-1368)。生產(chǎn)出了能表達馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因的轉(zhuǎn)基因水稻植物，使得所述植物更抗大螟的粉紅蛀心螟幼蟲(Duan等，1996，Nature Biotechnology 14494-498)。另外，能表達豇豆胰蛋白酶抑制劑的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物對G.pallida的抗性增強了(美國專利號5,494,813)。在美國專利號5,866,777中披露了能破壞植物線蟲病原體的采食結(jié)構(gòu)的蛋白的表達，并且在美國專利號5,824,861中披露了裂解蛋白在蘋果樹植物中的表達。
包括殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶在內(nèi)的與發(fā)病相關(guān)的(PR)蛋白是由植物針對病原體感染的反應(yīng)而產(chǎn)生的。殼多糖酶能水解殼多糖，它是真菌細胞壁的一種主要成分，而β-1，3-葡聚糖酶能水解葡聚糖成分(Boller等，1985，InJ.L.Key等著，Cellular and MolecularBiology of Plant Stress，Alan R.Liss，New York，pp.247-262；Boller，1992，InS.J.Gurr等(著)，Molecular Plant PathologyVolume II，A Practical Approach，IRL press，Oxford，pp.23-30)。Schlumbaum等(1986，Nature 324365-367)業(yè)已證實了純化的植物殼多糖酶在體外具有抗真菌活性，并且具有一個殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶在轉(zhuǎn)基因植物中的表達，增強了它們對真菌病原體的抗性(Broglie等，1991，Science 2541194-1197；Lin等，1995，Bio/Technology 13686-691)。在抗病的歐洲油菜栽培變種中，通過Phoma lingam感染，誘導(dǎo)了具有一種殼多糖結(jié)合蛋白的殼多糖酶ChB4的mRNA，并且通過northern印跡分析，在一天內(nèi)就可以檢測到(Rasmussen等，1992，Plant Mol.Biol.20277-287)。另外，在抑制真菌生長方面，殼多糖酶與β-1，3-葡聚糖酶協(xié)同發(fā)揮作用(Mauch等，1988，Plant Physiol.88936-942；Zhu等，1994，Bio/Technology12807-812；Jach等，1995，Plant J.897-109)。
仍然需要具有較高的對真菌的抗性的植物，如馬鈴薯植物。具體地講，具有增強的對土壤真菌的抗性的馬鈴薯植物。
在本說明書的這一部分或任何部分中對參考文獻的引用，不應(yīng)當(dāng)被理解成承認所述參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
3.本發(fā)明概述本發(fā)明基于本發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)在受到真菌感染時，誘導(dǎo)了編碼具有雙殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的BjCH11的轉(zhuǎn)錄和翻譯。殼多糖酶和β-葡聚糖酶是作用于真菌細胞壁的兩種主要糖類成分殼多糖和β-1，3-葡聚糖的水解酶。本發(fā)明試圖提供植物對真菌的抗性，包括用與分解病原體相關(guān)的糖類成分，特別是真菌細胞壁相關(guān)的酶轉(zhuǎn)化植物，如作物，特別是馬鈴薯植物。在一種具體實施方案中，本發(fā)明提供了具有增強的抗土壤真菌茄屬絲核菌的抗性的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，包括共同表達具有兩個殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的芥菜(Brassia juncea)殼多糖酶和三葉橡膠屬(Hevea)β-1，3-葡聚糖酶。
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物，它具有包括可操作地與包括兩個或兩個以上殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的編碼序列結(jié)合的啟動子和終止子的基因。在具體實施方案中，所述殼多糖酶分別包括兩個，三個，四個或五個殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。包括含有編碼殼多糖酶的核酸序列的基因的植物細胞以及其他植物部分也是本發(fā)明的一個方面，例如，含有本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化植物的種子。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，它具有包括可操作地與芥菜殼多糖酶的編碼序列結(jié)合的啟動子和終止子的基因。含有包括編碼芥菜殼多糖酶的核酸序列的基因的馬鈴薯植物細胞以及其他植物部分也是本發(fā)明的一個方面，例如，含有本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化植物的種子。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，它具有包括可操作地與β-1，3-葡聚糖酶的編碼序列結(jié)合的啟動子和終止子的基因。含有包括編碼β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列的嵌合基因的馬鈴薯植物細胞以及其他植物部分也是本發(fā)明的一個方面，例如，含有本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化植物的種子。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，它具有包括可操作地與三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的編碼序列結(jié)合的啟動子和終止子的基因。含有包括編碼三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列的嵌合基因的馬鈴薯植物細胞以及其他植物部分也是本發(fā)明的一個方面，例如，含有本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)化植物的種子。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明還提供了包括殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物。在一種具體實施方案中，所述殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶是由獨立的載體編碼的。在另一種具體實施方案中，所述殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶是由相同的載體編碼的。在一種具體實施方案中，所述殼多糖酶具有兩個或兩個以上殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一種具體實施方案中，所述殼多糖酶是BjCHI1，而β-1，3-葡聚糖酶是HbGLU。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物，它具有包括可操作地與芥菜殼多糖酶的編碼序列結(jié)合的第一啟動子和終止子，可操作地與三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的編碼序列結(jié)合的第二啟動子和第二終止子的嵌合基因。在一種具體實施方案中，所述遺傳修飾過的植物在通過重組DNA技術(shù)導(dǎo)入芥菜殼多糖酶三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的編碼序列之后，具有增強的真菌抗性。在一種具體實施方案中，利用同時具有BjCHI1和HbGLU cDNAs的pBI121-衍生的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化馬鈴薯(Solanum tuberosum L.cv.Desiree)。
在另一種實施方案中，除了殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的編碼酶之外，可以將編碼植物防御蛋白的其他基因序列導(dǎo)入所述植物。所述基因序列包括，但不局限于編碼核糖體失活蛋白，外源凝集素(lectins)和凝集素(agglutinins)的基因。在一種具體實施方案中，可以使用絲氨酸蛋白抑制劑。在另一種具體實施方案中，可以使用SaPINIIa(XuZ.F..等，2001，Plant Molecular Biology 47727-738)。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明提供了包括嵌合基因的植物細胞。所述嵌合基因包括編碼具有兩個或兩個以上殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的核酸序列和編碼β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列。在一種具體實施方案中，所述嵌合基因包括編碼具有四個殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的核酸序列。在一種具體實施方案中，所述植物細胞能抗昆蟲或細菌或這兩者。在一種具體實施方案中，所述核酸序列編碼芥菜殼多糖酶和三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明還提供了一種增強植物對病原體的抗性的方法，該方法包括以下步驟將編碼包括兩個或兩個以上殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的核酸序列導(dǎo)入所述植物基因組，并且再生具有改變了的基因組的植物。在一種具體實施方案中，所述殼多糖酶是受合適的啟動子和合適的終止子控制的芥菜殼多糖酶。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明還提供了一種增強植物對病原體的抗性的方法，該方法包括以下步驟將編碼受合適的啟動子和合適的終止子控制的三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列導(dǎo)入所述植物基因組，并且再生具有改變了的基因組的植物。在一種具體實施方案中，所述葡聚糖酶是受合適的啟動子和合適的終止子控制的三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明還提供了一種增強植物對病原體的抗性的方法，該方法包括以下步驟將編碼受合適的啟動子和合適的終止子控制的芥菜殼多糖酶和受合適的啟動子和合適的終止子控制的三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的核酸序列導(dǎo)入所述植物基因組，并且再生具有改變了的基因組的植物。
4.


為了更好地理解和更方便地實施本發(fā)明，下面將通過舉例形式提供了以下附圖，其中圖1表示芥菜(B.juncea)BjCHI1的核苷酸序列和BjCHI1的結(jié)構(gòu)。A.BjCHI1的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，在核苷酸序列下面示出了推測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域下面劃線。用點劃線在鉸鏈區(qū)下面劃線。在推測的聚腺苷酸化信號下面加雙線。N-末端信號肽和C-末端液泡導(dǎo)向肽的推測的裂解位點標(biāo)有(↓)。殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有兩個氨基酸差別的串聯(lián)重復(fù)。BjCHI1的25號位置上的氨基酸殘基“S”和30號位置上的“E”在第一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域上，而76號位置上的氨基酸殘基“R”和81號位置上的“A”在第二個結(jié)構(gòu)域上。引物的位置(P1至P4)用方框圈出來；對于P2和P4來說，所述核苷酸相當(dāng)于它們的互補序列。示出了HindIII限制位點。B.BjCHI1的示意圖。N-末端信號肽(黑色方框SP)在兩個殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBDI，22-61號氨基酸；CBD2，73-112號氨基酸)前面，這兩個結(jié)構(gòu)域是由一個間隔區(qū)(灰色方框S)隔離的。CBD2和殼多糖酶催化結(jié)構(gòu)域(146-393號氨基酸)是通過一個鉸鏈區(qū)(加交叉斜線的方框H)連接的。液泡導(dǎo)向序列用加斜線的方框v表示。
圖2是BjCHI1與其他類型的植物殼多糖酶的比較。A.煙草Chia1(Shinshi等，1990，Plant Mol.Biol.14357-368)和Chia2(Payne等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci USA 8798-102)，菜豆Chia4(Margis-Pinheiro等，1991，Plant Mol.Biol.17243-253)，小蕁麻Chia5(Lerner和Raikhel，1992，J.Biol.Chem.26711085-11091)和甜菜Chia6(Berglund等1995，Plant Mol.Biol.27211-216)。加點的空位被用于優(yōu)化比對。星號表示同一性的位置。信號肽和液泡導(dǎo)向序列的推測的裂解位點標(biāo)有(↓)。在BjCHI1的殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域下面劃線。BjCHI1的鉸鏈區(qū)下面加點劃線。所述間隔區(qū)和鉸鏈區(qū)中的PPTP重復(fù)標(biāo)有箭頭。用方框圈出了被用于產(chǎn)生多克隆抗體的合成肽(YKEEIDKSDPHC)，它相當(dāng)于BjCHI1的231-242號氨基酸殘基。用方框圈出了相當(dāng)于BjCHI1的268-272號氨基酸殘基的序列NYNYG。在Chia類型中保守的8個氨基酸殘基標(biāo)有(◆)。在序列的末端示出了與BjCHI1的同一性(％)，在括號中示出了在殼多糖酶催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的比較。B.BjCHI1的示意圖，Chia1和UDA1表示參與二硫鍵(通過條上方的連線表示)形成的半胱氨酸殘基(C)的位置。黑色方框表示信號肽(SP)；灰色方框表示間隔區(qū)(S)；劃交叉線的方框表示鉸鏈區(qū)(H)；而加斜線的方框表示液泡導(dǎo)向序列(V)。
圖3表示BjCHI1，BjCHI2，和BjCHI3的凝集活性分析結(jié)果。BjCHI2和BjCHI3是BjCHI1的衍生物，它們分別包括一個和沒有殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。凝集分析是按照Does等披露的方法，用HPLC-純化的畢赤酵母屬表達的殼多糖酶進行的(1999，Plant Physiol.120421-431)。將來自畢赤酵母屬表達培養(yǎng)物的不同數(shù)量的(0.12，0.25，0.5，2，4，8，16或24μg)的FPLC-純化的蛋白(BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3)添加到微量滴定板上的每一個孔中的30微升胰蛋白酶處理過的兔紅細胞中。加入5倍濃度的磷酸鹽水，使一個孔的最終體積為60微升。在對照孔中(即“con”；每一排的最后一個孔)，用磷酸緩沖的鹽溶液取代蛋白。
圖4是芥菜基因組中BjCHI1-相關(guān)基因的分析。A.Southern印跡分析。用EcoRI(泳道1)，HindII(泳道2)，HindIII(泳道3)和XbaI(泳道4)消化DNA，與32P-標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA雜交，在室溫下用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌。泳道5-8表示在65℃下洗滌的相同的印跡。B.使用引物P1和P2(泳道1)或P2和P3(泳道2)的PCR產(chǎn)物，在2％瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。C.在(b)中示出的瓊脂糖凝膠與32P-標(biāo)記的BjCHII cDNA雜交的Southern印跡。
圖5三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列。A.三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。B.三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的推測的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。C.三葉橡膠屬(Hb)β-1，3-葡聚糖酶的推測的氨基酸序列與N.plumbaginifolia(Np)gnl(De Loose等，1988，Gene 7012-23)，II型(CII)，III型(CIII)和IV型(CIV)β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列的比較。通過點表示相同的位點。三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶上的推測的N-糖基化位點用星號標(biāo)明。分別在三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的預(yù)測的N-末端延伸部分和C-末端延伸部分上面和下面劃線。
圖6表示基因組Southern分析。用BamHI(B)，EcoRI(E)，HindII(H)和Xba I(X)消化三葉橡膠屬基因組DNA(20μg)，通過凝膠電泳分離，吸印到Hybond N(Amersham)膜上，并且與32P-標(biāo)記的三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶cDNA探針雜交。
圖7表示質(zhì)粒pBj17，pHEV43和pBj47和pBj48的構(gòu)建。質(zhì)粒pHEV43是通過將完整長度HbGLU cDNA的1.2kb的SmaI-HindII片段克隆到質(zhì)粒pBI121的SmaI位點上，位于CaMV 35S啟動子下游而制備的。質(zhì)粒pBj17是通過將完整長度的BjCHI1 cDNA的1.3kb SmaI片段克隆到pBI121的SmaI位點上而制備的。在pBj17上，由CaMV 35S啟動子驅(qū)動BjCHI1 cDNA的表達。然后將來自pHEV43的平端處理的2.04kb的HindIII片段克隆到pBj17的SnaBI位點上。由于這種平端片段可以以兩種可能的方向插入，獲得了質(zhì)粒pBj47和pBj48，它們各自包括位于單一質(zhì)粒上的HbGLU cDNA和BjCHI1 cDNA。在pBj47上，殼多糖酶和葡聚糖酶cDNAs分別是沿相反的方向由CaMV 35S啟動子轉(zhuǎn)錄的，而在pBj48上，這兩種DNAs是沿相同方向轉(zhuǎn)錄的。RB，T-DNA的右緣；LB，T-DNA的左緣；nptII，編碼由Nos啟動子轉(zhuǎn)錄的用于卡那霉素選擇的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因；35S pro，CaMV 35S啟動子；GUS；編碼β-葡糖醛酸酶的無啟動子基因；H，HindIII；E，EcoRI；S，SnaBI。在質(zhì)粒pBj47和pBj48的圖譜的HbGLU cDNA上方的箭頭表示該cDNA從它的5’-末端(5’)至它的3’-末端(3’)的轉(zhuǎn)錄方向。附圖不是按比例繪制的。
圖8表示在芥菜受到茄屬絲核菌感染之后誘導(dǎo)了BjCHI1的表達(a)使用32P-標(biāo)記過的總RNA的BjCHI1 cDNA進行的Northern印跡分析，所述總RNA是從在茄屬絲核菌感染的土壤中生長0天(泳道1)，1天(泳道2)，2天(泳道3)，3天(泳道4)，4天(泳道5)，5天(泳道6)，6天(泳道7)，7天(泳道8)，8天(泳道9)和9天(泳道10)之后收獲的芥菜葉片中分離的。在下面示出了用32P-標(biāo)記的18S rDNA探針再次檢測的相同的印跡。箭表示1.3kb BjCHI1 mRNA，而箭頭表示18S rRNA；(b)使用抗-BjCHI1抗體的Western印跡分析?？偟鞍资菑脑谇褜俳z核菌感染的土壤中生長0天(泳道1)，1天(泳道2)，2天(泳道3)，3天(泳道4)，4天(泳道5)，5天(泳道6)，6天(泳道7)，7天(泳道8)，8天(泳道9)和9天(泳道10)之后收獲的芥菜葉片中分離的。用箭頭標(biāo)出了交叉反應(yīng)性37kDa BjCHI1的帶。位于該帶上方的弱的帶很可能是前體蛋白；(c)與(b)加樣相同的考馬斯染色的蛋白凝膠，以表明在每一個孔中加載了相同數(shù)量的蛋白。
圖9表示R0轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的Nothern印跡分析A.用32P-標(biāo)記的HbGLU cDNA探針檢測到的1.2kb雜交HbGLU mRNA(用箭頭表示)在未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道1)和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)和pHEV-P14(泳道5)中的表達；B.用32P-標(biāo)記的BjCHI1 cDNA探針檢測到的1.3kb BjCHI1雜交mRNA(用箭頭表示)在未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道1)和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道5)和pBj17-P6(泳道6)中的表達。
圖10表示R0轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的Southern印跡分析A.用32P-標(biāo)記的HbGLU cDNA探針和來自未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道1)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道2)，和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pHEV43-P14(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)，pBj47-P8(泳道5)，和pBj47-P10(泳道6)的EcoRI消化過的DNA。箭頭表示1.2kb的EcoRI雜交帶；B.用32P-標(biāo)記的BjCHI1 cDNA探針和來自未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道1)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道2)和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)，pBj47-P10(泳道5)和pBj17-P6(泳道6)的HindIII消化過的DNA。箭頭表示0.9kb的HindIII雜交帶；C.用32P-標(biāo)記的BjCHI1cDNA探針和來自未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道1)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道2)和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)和pBj47-P7(泳道5)的EcoRI消化過的DNA。
圖11表示R0轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的Western印跡分析A.使用抗HbGLU抗體對來自轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)，pHEV43-P14(泳道4)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道5)和未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道6)粗制蛋白進行的Western印跡分析。用一個箭頭標(biāo)明相當(dāng)于HbGLU的帶(35kDa)。使用抗-BjCHI1抗體對來自轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)，pHEV43-P14(泳道4)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道5)，未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道6)和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj17-P6(泳道7)的粗制蛋白進行的Western印跡分析。用箭頭標(biāo)明相當(dāng)于BjCHI1的帶(52kDa)。
圖12表示對轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系進行的葡聚糖酶和殼多糖酶分析A.使來自pBI121-轉(zhuǎn)化體和用pBj47轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因R0品系的粗制蛋白，以500nm波長下的光密度測量的葡聚糖酶分析；B.使用pBI121-轉(zhuǎn)化體和用pBj47轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因R0品系的粗制蛋白，以550nm波長下的光密度測量的殼多糖酶分析。誤差線條表示3次獨立實驗的標(biāo)準差。
圖13表示使用T.viride進行的體外菌絲抑制分析A.將每一種馬鈴薯品系的50μg蛋白提取物添加到孔中16小時之后真菌的生長情況。1號孔共表達BjCHI1和HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10；2號孔僅有緩沖液的對照；3號孔野生型馬鈴薯Desiree；4號孔馬鈴薯pBI121轉(zhuǎn)化體；5號孔能表達BjCHI1的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj17-P6；6號孔能表達HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pHEV43-P14；B.在添加50μg蛋白提取物24小時之后，圖13A中所示平板的真菌生長情況。位于左下方的條表示0.9cm。
圖14表示使用茄屬絲核菌進行的體內(nèi)真菌生物測定。將馬鈴薯植物移栽到預(yù)先接種了茄屬絲核菌的土壤中。在移栽2周之后，檢查所述植物，并且照相A.共表達BjCHI1和HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10；B.能表達BjCHI1的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj17-P6；C.能表達HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pHEV43-P14；和D.未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯。
5.本發(fā)明的詳細說明病原體抗性是植物的一個重要特征，并且是植物保護，特別是農(nóng)作物保護的有用工具。本文所使用的術(shù)語“植物”包括完整的植株，植物部分，單個植物細胞，植物細胞團(例如，培養(yǎng)的植物細胞)及其后代。在本文中，當(dāng)術(shù)語“增強”被用于表示植物對病原體的抗性提高時，包括提高對病原體可能沒有抗性，或具有某些抗性或顯著抗性的植物的抗性，以便實現(xiàn)所述抗性的提高。
植物病原體包括，但不局限于細菌，病毒，真菌，線蟲和昆蟲。病原體可以感染植物，并且導(dǎo)致對所述植物的嚴重損傷，包括死亡。在感染時，植物可能啟動對所述病原體的保護性反應(yīng)，例如過敏反應(yīng)，這取決于所述植物是否能識別所述病原體。
各種類型的病原體可能改變，例如，通過誘變改變。另外，可能產(chǎn)生植物物種以前沒有遇到過的新的病原體。例如，當(dāng)一種植物(例如，作物，果樹，蔬菜等)被引入一個國家(例如，通過進口)時，植物物種有可能接觸它以前沒有遇到過的病原體。
5.1編碼芥菜殼多糖酶和三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶基因的多核苷酸的克隆5.1.1.編碼具有兩個殼多糖酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的芥菜殼多糖酶的cDNA的分離在使用通過PCR制備的32P-標(biāo)記過的擬南芥屬堿性殼多糖酶探針(Samac等，1990，Plant Physiol 93907-914)篩選擴增的芥菜cDNA文庫中的殼多糖酶克隆時，獲得了5個推測的陽性克隆。核苷酸序列分析表明，3個克隆具有1.3kb的cDNA，它被命名為BjCHI1，而其他2個是不完整長度的cDNAs。BjCHI1 cDNA由3bp的5’-非翻譯區(qū)，1200bp的翻譯區(qū)，86bp的3’-非翻譯區(qū)和poly(A)+尾組成(圖1a)。具有400個氨基酸的開放讀框，編碼與植物Chia1殼多糖酶具有同源性的推測的Mr42,774(等電點4.7)的蛋白。有趣的是，該cDNA包括兩個120bp的重復(fù)(67-186號核苷酸和220-339號核苷酸，圖1a)，它們編碼通過11個氨基酸的間隔區(qū)連接的兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域；它們存在七個核苷酸的差別，導(dǎo)致了兩個氨基酸的改變。具有33個氨基酸的鉸鏈區(qū)，將第二個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接在所述殼多糖酶催化結(jié)構(gòu)域上(圖1b)。所有其他以前表征過的殼多糖酶僅包括一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是殼多糖結(jié)合所必需的(Iseli等，1993，Plant Physiol.103221-226)，并且細胞凝集需要至少兩個這樣的結(jié)構(gòu)域(Peumans等，1995，Plant Physiol.109347-352)。殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在并不局限于殼多糖酶。該結(jié)構(gòu)域還存在于植物凝集素中，例如，橡膠蛋白(hevein)——來自橡膠乳液中的4.7kDa的蛋白(Van Parijs等，1991，Planta 183258-264)具有一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。BjCHI1是具有兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特殊的殼多糖酶，并且，本發(fā)明利用畢赤酵母屬表達的BjCHI1證實了這兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域賦予了凝集特性(參見下文的5.1.2節(jié))。以前沒有報導(dǎo)過具有凝集特性的殼多糖酶。
5.1.2.BjCHI1與其他殼多糖酶的比較圖2A表示BjCHI1與不同類型的殼多糖酶的代表的比對來自煙草的Chial(Shinshi等，1990，Plant Mol Biol 14357-368)，來自煙草的Chia2(Payne等，1990，Proc Natl Acad Sci USA8798-102)，來自P.vulgaris的Chia4(Margis-Pinheiro等，1991，Plant Mol Biol 17243-253)，來自小蕁麻的Chia5(Lerner等，1992，J Biol Chem 26711085-11091)和來自B.vulgaris的Chia6(Berglund等，1995，Plant Mol Biol 27211-216)。Chia1和Chia2殼多糖酶的代表是來自煙草的與BjCHI1具有最高同一性的殼多糖酶。對86種植物殼多糖酶進行的分析，業(yè)已證實了在Chia類型中有8個氨基酸是保守的(Levorson等，1997，Plant Mol Biol Reptr15122-133)。其中的7個氨基酸在BjCHI1中是保守的(E-201，A-203，T-213，C-230，N-270，P-286和G-377，圖2A)。在BjCHI1中第8個殘基(Q)被M-264所取代(圖2A)。盡管BjCHI1與煙草Chia1(62.0％)和Chia2(54.8％)具有高的同一性，但是它具有兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而Chia1具有一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而Chia2沒有這種結(jié)構(gòu)域。
在與來自其他植物的Chia1殼多糖酶進行比較時，BjCHI1與歐洲油菜具有72.7％的同一性(Hamel等，1993，Plant Physiol1011403)，與擬南芥具有70.2％的同一性(Samac等，1990，PlantPhysiol 93907-914)，與P.vulgaris具有60.9％的同一性(Broglie等，1986，Proc Natl Acad Sci USA 836820-6824)，而與水稻具有51.8％的同一性(Zhu等，1994，BioTechnology 12807-812)。BjCHI1還包括在Chia1殼多糖酶中高度保守的序列“NYNYG”(268-272號氨基酸，圖2)(Verburg等，1992，J Biol Chem 2673886-3893)。對玉米殼多糖酶的催化位點進行的研究業(yè)已證實了該序列“NYNYG”上的第一個Y被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺修飾過，導(dǎo)致了活性的喪失(Verburg等，1992)。
兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在可以識別具有Chia5的BjCHI1，其中只有一種例子，好小蕁麻UDA1凝集素是已知的(Levorson等，1997)。UDA1是小蕁麻(U.dioica)凝集素的具有372個氨基酸的前體(Lerner和Raikhel，1992，J Biol Chem 26711085-11091)，并且表現(xiàn)出昆蟲抗?fàn)I養(yǎng)活性(Chrispeels等，1991，Plant Cell 31-9)。該前體由一個信號肽，兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個殼多糖酶催化結(jié)構(gòu)域組成。8.5kD的成熟的凝集素僅由86個氨基酸組成，具有兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因為所述殼多糖酶結(jié)構(gòu)域通過翻譯后裂解被切除了(Lerner和Raikhel，1992)。盡管BjCHI1和UDA1具有結(jié)構(gòu)相似性，但是它們僅具有36.9％的同一性(圖2A)。按照Beintema(Beintema，1994，F(xiàn)EBS Letters 350159-163)的方法比較殼多糖酶中的二硫鍵，發(fā)現(xiàn)了BjCHI1，Chia1和UDA1之間的相似性(圖2B)；Chia1的C-末端二硫鍵在UDA1中不存在，但存在于BjCHI1中。與UDA1不同，BjCHI1的鉸鏈區(qū)和間隔區(qū)是富含脯氨酸的，分別具有63.6％和54.5％的脯氨酸殘基。Chia6殼多糖酶的唯一成員(Levorson等，1997)B.vulgarisCh1，包括一個具有128個殘基的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，其中，70.3％的殘基是脯氨酸(Berglund等，1995，Plant Mol Biol 27211-216)。BjCHI1和Ch1都含有“PPTP”重復(fù)(圖2A)。相反，Ch1僅具有1/2個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且在它們之間僅存在45.2％的同一性。
兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域在BjCHI1中的存在，促使本發(fā)明人探索BjCHI1具有凝集特性的可能性。因此，按照Does等的方法(1999，PlantPhysiol.120421-431)用FPLC-純化的畢赤酵母屬表達的BjCHJI1進行了凝集分析。作為對照，分別采用了含有一個和不含殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的BjCHI2和BjCHI3。簡單地講，利用酵母表達載體pPIC9K(Invitrogen)在巴斯德畢赤酵母中表達BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3。將BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3框內(nèi)克隆到pPIC9K上的分泌信號肽上，以便所述融合蛋白能夠分泌到生長培養(yǎng)基中。BjCHI1包括存在于天然蛋白的18-393號氨基酸殘基上的兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Zhao和Chye，1999，Plant Mol.Biol.401009-1018)，它與pPIC9K上的分泌信號肽融合；BjCHI2僅包括一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而BjCHI3缺乏這兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。將BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3DNAs克隆到載體pPIC9K的EcoRI和NotI位點上。為此，將以下引物用于PCR中C1(正向)引物5’CTGAATTCTCCTCC GGTGAGCAATGCG 3’(SEQID NO5)；C21(正向)引物5’CTGAATTCGGGGATCTTTCTGGCATC 3’(SEQID NO6)；和C2(反向)引物5’GCGACTGCGGCCGCGTTACTACCTTCATTAAACG 3’(SEQ ID NO7)。將正向引物設(shè)計成具有一個EcoRI位點，而將反向引物設(shè)計成具有一個NotI位點。通過PCR擴增編碼BjCHI1的1.1kb的DNA，在PCR中使用C1和C2引物，并且用pBj17作模板。通過PCR擴增編碼BjCHI2的0.95kb的DNA片段(具有一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，使用C1和C2引物，并且用pBj28作模板。Fung等以前業(yè)已披露了質(zhì)粒pBj28(2002，PlantMolecular Biology 50283-294)。通過PCR獲得編碼BjCHI3(缺乏兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的0.74kb的DNA，使用C21和C2引物，并且用pBj17作模板。用EcoRI和NotI消化PCR擴增的片段，并且克隆到pPIC9K的EcoRI和NotI位點上。在用于酵母轉(zhuǎn)化之前，通過DNA序列分析，分析pPIC9K上的插入片段。畢赤酵母屬表達的蛋白被分泌到生長培養(yǎng)基中，并且按照Invitrogen提供的說明，用65％的硫酸銨沉淀。然后通過FPLC純化粗制提取物，并且使用抗BjCHI1的抗體通過Western印跡分析檢查HPLC-純化的蛋白，然后用于凝集分析。由于用于制備抗BjCHI1的多克隆抗體的肽保留在BjCHI2和BjCHI3肽內(nèi)，所述BjCHI1衍生物能夠與所述抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。
在凝集分析中，將來自畢赤酵母屬表達培養(yǎng)物的不同用量的(0.12，0.25，0.5，2，4，8，16或24μg)的FPLC-純化的蛋白(BjCHI1，BjCHI2和BjCHI3)添加到微量滴定板上的每一個孔中的30μl胰蛋白酶處理過的兔紅細胞中(參見圖3)。將五倍濃度的磷酸鹽水添加到每一個孔中，使最終體積為60μl。在對照孔中，用磷酸緩沖的鹽溶液取代了所述蛋白。
所述結(jié)果表明BjCHI1的凝集特性與包括至少兩個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殺昆蟲蛋白，包括小麥胚乳凝集素，小蕁麻凝集素和來自番茄，水稻和曼佗羅屬的凝集素的特性相似(Chrispeels等，1991，同上)。由于業(yè)已證實了具有兩個或兩個以上殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的植物凝集素，能夠通過結(jié)合細菌和真菌表面上的以及食草性昆蟲的外骨骼和腸腔上的糖綴合物而凝集細胞(Peumans等，1995，同上)，BjCHI1的抗微生物和抗昆蟲作用提供了作進一步研究的前景和理由。
5.1.3.芥菜中的BjCHI1的基因組組構(gòu)利用Southern印跡分析，研究芥菜中與BjCHI1-相關(guān)的基因的存在。用EcoRI，HindII，HindIII和XbaI消化過的基因組DNA與BjCHI1cDNA雜交。只有HindIII能在所述cDNA的內(nèi)部進行裂解(圖1A)。檢查6-9個雜交帶(圖4A，泳道1-4)，發(fā)現(xiàn)了存在于B.nigra和蕓薹的雜交種——異源四倍體芥菜中的相關(guān)基因；這些帶可能是由于編碼殼多糖酶或具有殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白的基因產(chǎn)生的。在65℃下進一步洗滌所述印跡，發(fā)現(xiàn)了較少的帶；泳道6-8中的帶(圖4A)可能是BjCHI1-特異性的。為了研究具有一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的存在，利用策略定位的引物進行PCR分析。引物P1靠近編碼第一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的區(qū)，而P2位于編碼表現(xiàn)出與其他殼多糖酶的同源性的殼多糖酶結(jié)構(gòu)域的區(qū)域內(nèi)(圖1A，圖2)。如果在它們之間不存在內(nèi)含子的話，用這些引物對BjCHI1進行PCR擴增，能得到0.5kb的產(chǎn)物；擬南芥屬殼多糖酶基因的第一個內(nèi)含子(Samac等，1990)位于P2后面的相應(yīng)區(qū)。在瓊脂糖凝膠電泳上的預(yù)期的0.5kb的產(chǎn)物(圖4B)能與Southern印跡分析上的BjCHI1 cDNA雜交，同時能與一個較弱的0.35kb的帶雜交(圖4C)。這種較小的帶，暗示了具有一個殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相關(guān)殼多糖酶的存在，并且由于所述引物對BjCHI1的特異性而顯得較弱。相反，用引物P2和P3對BjCHI1進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)了一條0.35kb的帶(圖4B和C，泳道2)。位于編碼間隔區(qū)的區(qū)域內(nèi)的P3(圖1A)是BjCHI1-特異性的，并且被認為適合測定在RT-PCR中表達的BjCHI1-特異性mRNA。
5.1.4.三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶基因的分離將編碼β-1，3-葡聚糖酶的N.plumbaginifolia cDNA，gnlcDNA(De Loose等，1988，Gene 7012-23)用作異源雜交的探針，從三葉橡膠屬中分離相應(yīng)的cDNA克隆。通過在42℃下，在含有30％的甲酰胺的溶液中進行原位噬斑雜交，篩選用三葉橡膠屬乳液制備的cDNA文庫。分離了編碼β-1，3-葡聚糖酶的若干推測的三葉橡膠屬cDNA克隆。對1.2和1.1kb的兩個最長的克隆進行的核苷酸序列分析，證實了它們屬于相同的類型。完整長度的1.2kb的cDNA由一個40bp的5’-非翻譯區(qū)，一個1125bp的編碼區(qū)，一個76bp 3’-非翻譯區(qū)，和一個poly(A)尾組成。所述編碼區(qū)編碼一種具有374個氨基酸的堿性蛋白，推測的Mr為41,305。
三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸序列與N.plumbaginifolia gnl cDNA的核苷酸序列具有68％的核苷酸序列同一性。比較三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的推測的氨基酸序列和由gnl編碼的I型β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了66％的氨基酸同源性(圖5C)。三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶與II型(煙草PR-N(Linthorst等，1990，Proc Natl Acad Sci USA 878756-8760))，III型(煙草ec321391(Payne等，1990，Plant Mol Biol 15797-808))和IV型(煙草sp41a(Ori等，EMBO J，1990，93429-3436))β-1，3-葡聚糖酶分別具有54％，60％和51％的氨基酸同一性(圖5C)。
5.1.5三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶I型β-1，3-葡聚糖酶是作為蛋白前體合成的，并且在該蛋白轉(zhuǎn)運到液泡期間或之后裂解它的N-末端延伸部分和C-末端延伸部分(Shinshi等，1988，Proc Natl Acad Sci USA 855541-5545)。N-末端延伸部分(1-36號氨基酸殘基)和C-末端延伸部分(353-374號氨基酸殘基)在三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的推測的氨基酸序列上的存在進一步表明，它屬于I型β-1，3-葡聚糖酶(圖5C)。三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的N-末端延伸部分，包括富含絲氨酸和蘇氨酸殘基的區(qū)(4-19號氨基酸殘基)，隨后是一個疏水區(qū)(22-29號氨基酸殘基)(圖5C)。盡管在三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的N-末端和gnl-編碼的β-1，3-葡聚糖酶之間不存在顯著的氨基酸序列同源性，但是它們都包括信號肽所特有的疏水區(qū)(Von Heijne等，1985，J.Mol.Biol.18499-105)，并且被認為與蛋白向液泡中的導(dǎo)向相關(guān)。有趣的是，業(yè)已被證實負責(zé)將所述蛋白導(dǎo)向液泡的大麥aleurain的前肽的N-末端序列同樣富含絲氨酸殘基(Holwerda等，1992，Plant Cell 4307-318)。比較三葉橡膠屬的C-末端延伸部分和N.plumbaginifolia的C-末端延伸部分發(fā)現(xiàn)了在氨基酸序列和推測的N-糖基化位點上(三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶中的364號氨基酸)上存在某些保守性。C-末端延伸部分，特別是三葉橡膠屬中的365-370號氨基酸殘基富含疏水性氨基酸。業(yè)已表明，是疏水性/酸性基序結(jié)構(gòu)，而不是特殊的氨基酸序列形成了羧基延伸前肽的分選信號(Nakamura等，1993，PlantPhysiol 1011-5)。業(yè)已證實了β-1，3-葡聚糖酶的I型同I型的C-末端延伸部分和N-聚糖在加工期間被去掉(Shinshi等，1988)。
5.1.6.三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的基因組組構(gòu)將本發(fā)明人分離的乳汁器特異性cDNA用于基因組Southern印跡分析，以便研究三葉橡膠屬中β-1，3-葡聚糖酶基因家族的存在。按照Dellaporta等，1983，Plant Mol Biol Rep 119-21的方法，從幼小葉片中獲得基因組DNA。用BamHI，EcoRI，HindII和XbaI限制總基因組DNA，電泳并且印跡。用1.2kb的三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶探針進行的Southern印跡分析，發(fā)現(xiàn)了每一種消化產(chǎn)物具有2-4條雜交帶(圖6)。以上結(jié)果表明，在三葉橡膠屬中存在β-1，3-葡聚糖酶的低拷貝基因家族。
可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離并且表征其他殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶。可以克隆芥菜殼多糖酶和三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶蛋白或核酸所特有的cDNA或基因組DNA，并且用多種方法進行測序，例如雙脫氧鏈終止測序方法，例如，參見Sambrook等，同上。
可用于本發(fā)明中的多核苷酸包括具有本發(fā)明提供的DNA序列的多核苷酸，并且還包括編碼能在高嚴格條件下與本文所提供的DNA序列的互補體雜交的連續(xù)的和功能性殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶編碼開放讀框(ORF)的任何核苷酸序列。例如，而不是限定，高嚴格雜交條件可以定義如下濾膜結(jié)合的DNA在含有50％去離子化甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt’s，1％SDS，100μg/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中，在42℃下雜交過夜(大約4-16小時)，并且在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌(Ausubel F.M.等著，1989，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.I，Green Publishing Associates，Inc.，and JohnWiley & Sons，Inc.，New York)，并且編碼一種功能等同的基因產(chǎn)物。
對于寡核苷酸探針來說，例如，而不是限定，高嚴格條件可以表示，例如，在6×SSC/0.05％焦磷酸鈉中，在37℃(用于14-堿基的寡聚體)，48℃(用于17-堿基的寡聚體)，55℃(用于20-堿基的寡聚體)，和60℃(用于23-堿基的寡聚體)下洗滌。
可用于本發(fā)明中其他相關(guān)的多核苷酸，包括能夠在中等嚴格條件下與編碼殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶的DNA序列的互補體雜交的任何核苷酸序列。例如，而不是限定，所述中等嚴格條件可以包括，例如，在0.2×SSC/0.1％SDS中，在42℃下洗滌(Ausubel等，1989，同上)。
可用于本發(fā)明中的其他考慮的多核苷酸包括能夠在低嚴格條件下與編碼殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶的DNA序列雜交的任何核苷酸序列。例如，而不是限定，使用所述低嚴格條件性條件的方法披露于以下文獻中Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792。
另外，還可以將殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的變體用于本發(fā)明中。與野生型酶相比，變體可以包括所述酶的氨基酸序列上的一個或多個變化，例如，通過添加、取代或缺失一個或多個氨基酸所產(chǎn)生的變化。任何改變都不應(yīng)當(dāng)破壞所述酶發(fā)揮其功能的能力。不過，它可能根據(jù)所述改變的性質(zhì)，增強或減弱這種能力。所述氨基酸改變優(yōu)選是保守性的。
在各種實施方案中，所述殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶，片段，變體，類似物，或衍生物可以作為融合體或嵌合蛋白產(chǎn)物表達(包括酶，片段，類似物，或通過肽鍵與異源(不同蛋白的)蛋白序列連接的衍生物)。所述嵌合基因產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域已知方法，以正確的編碼讀框?qū)⒕幋a需要的氨基酸序列的合適的核酸序列彼此連接，并且通過本領(lǐng)域公知的方法表達所述嵌合產(chǎn)物而制備的。另外，所述嵌合產(chǎn)物可以通過蛋白合成技術(shù)制備，例如，通過使用肽合成儀而制備。所述融合蛋白中的所述酶的片段，類似物和衍生物優(yōu)選保留了發(fā)揮所述酶的功能的能力。
可以通過篩選cDNA或基因組DNA文庫，克隆對植物殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶特異的cDNA或基因組DNA。例如，所述文庫可以用來自所述植物的mRNA或基因組DNA制備。有關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的一般背景以及如何制備cDNA文庫或基因組文庫，可以參見，例如，AusubelF.M.等，同上；Sambrook等，1989，同上；和美國專利號5,650,148。
所述文庫可以用對芥菜殼多糖酶和三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶的一部分特異的核苷酸片段篩選。例如，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)確定殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的蛋白序列，如通過Edman降解技術(shù)(例如，參見Creighton，1983，“ProteinsStructures andMolecular Principles”，W.H.Freeman & Co.，New York，pp.34-49)。所獲得的氨基酸序列可以被用作制備可用于篩選編碼殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的cDNA序列的cDNA文庫的寡核苷酸混合物的指導(dǎo)。
或者，舉例來說，可以確定對殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶特異的兩段蛋白序列。制備了對每一段特異的一套簡并寡核苷酸，并且將所述寡核苷酸用于聚合酶鏈式反應(yīng)(“PCR”)擴增。寡核苷酸的長度至少為大約6個核苷酸，更優(yōu)選至少大約10個，更優(yōu)選至少大約15個，更優(yōu)選至少大約20個，更優(yōu)選至少大約30個，更優(yōu)選至少大約40個核苷酸。例如，所述PCR反應(yīng)中的模板，可以是已知含有或推測含有對感興趣的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶特異的DNA多核苷酸的cDNA或基因組DNA混合物。可以用多種方法獲得cDNA模板，例如，從cDNA文庫中分離不同類型cDNA的混合物，或者例如，逆轉(zhuǎn)錄來自已知(或推測)能表達殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的細胞或生物的總mRNA。例如，有關(guān)PCR的背景可以參見Ausubel，同上，和PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications，1990，Innis，M.等著，AcademicPress，Inc.，New York。
為了克隆來自任何物種的完整長度的cDNA或基因組DNA序列，或克隆殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的變體或異源形式，可以用相當(dāng)于本文所披露的任何多核苷酸的核酸片段制備或用本發(fā)明的方法制備的標(biāo)記過的DNA探針篩選cDNA文庫或基因組DNA文庫(例如，噬菌體文庫)，正如在以下文獻中所披露的例如Ausubel F.M.等，同上；Sambrook等，1989，同上。
5.2抗體的生產(chǎn)為了生產(chǎn)抗體，可以通過注射殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶(例如，相當(dāng)于殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的功能結(jié)構(gòu)域)，截短的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶多肽(業(yè)已去掉了其中的一個或多個結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶)，殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的功能性等同物，殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的突變體，或殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的短肽(或片段)，對各種宿主動物進行免疫。所述宿主動物可以包括，但不局限于兔、小鼠、山羊、和大鼠等等。根據(jù)宿主的物種，可以用各種佐劑增強免疫學(xué)反應(yīng)，所述佐劑包括，但不局限于弗氏(完全和不完全)佐劑，礦物凝膠，如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂，多元醇，聚陰離子，肽，油類乳化液，匙孔血藍蛋白，二硝基苯酚，以及潛在有用的人類佐劑，如BCG(bacille Calmette-Guerin)和小棒桿菌。多克隆抗體，是來自所述免疫動物血清的抗體分子的異源群體。
可用于本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體(例如，參見Kohler等，1975，Nature 256495-497；和美國專利號4,376,110)，嵌合抗體(例如，參見Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature，312604-608；Takeda等，1985，Nature，314452-454)，單鏈抗體(例如，參見美國專利4,946,778；Bird，1988，Science 242423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；和Ward等，1989，Nature 341544-546)，抗體片段(例如，參見Huse等，1989，Science，2461275-1281)，抗獨特型抗體或所述抗獨特型抗體的Fab片段(例如，參見Greenspan & Bona，1993，F(xiàn)ASEB J 7(5)437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)2429-2438)。
5.3利用重組DNA技術(shù)表達殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶，它們的片段或它們的融合蛋白有利地是采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的?？梢岳盟龇椒?gòu)建含有殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶的核苷酸和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的嵌合基因或表達載體。例如，所述方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)，和體內(nèi)遺傳重組。例如，參見披露于以下文獻中的技術(shù)Sambrook等，1989，同上，和Ausubel等，1989，同上。在本文中，術(shù)語嵌合基因表示所述嵌合基因的每一部分的核酸序列的組合，業(yè)已通過重組DNA技術(shù)將所述序列功能改造成相關(guān)的，所述序列還處于對于要導(dǎo)入所述嵌合基因的植物來說的內(nèi)源或外源獨立部分。
另外，舉例來說，可以利用合成儀化學(xué)合成相當(dāng)于由殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶核苷酸序列編碼的轉(zhuǎn)錄物的全部或一部分的RNA。例如，參見披露于以下文獻中的技術(shù)“Oligonucleotide Synthesis”，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford，該文獻以它的全文形式被收作本文參考。
生物技術(shù)領(lǐng)域已知的宿主表達載體系統(tǒng)都可用于表達殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶核苷酸序列，包括，但不局限于在細菌，酵母，昆蟲細胞，哺乳動物細胞，真核細胞和植物細胞中表達。在所述表達系統(tǒng)中，可以使用任何篩選系統(tǒng)。所述篩選系統(tǒng)可以包括在選擇培養(yǎng)基上生長(例如抗生素，基本培養(yǎng)基等)，或使用一種指示劑(例如染料，熒光試劑等)。
在使用植物表達載體時，殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶編碼序列的表達，可以通過多種調(diào)控元件中的任意一種驅(qū)動。例如，可以使用病毒啟動子，如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動子(Brisson等，1984，Nature 310511-514)，或TMV的外被蛋白啟動子(Takamatsu等，1987，EMBO J.6307-311)；另外，可以使用植物啟動子，如RUBISCO的小亞基(Coruzzi等，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie等，1984，Science 224838-843)；或熱激啟動子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)?？梢酝ㄟ^使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，定向DNA轉(zhuǎn)化，biolistics/粒子轟擊，顯微注射，電穿孔等將所述構(gòu)建體導(dǎo)入植物細胞。有關(guān)所述技術(shù)的綜述可以參見，例如，Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，Section VIII，pp.421-463；和Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。在本文中，調(diào)控元件包括，但不局限于誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動子，增強子，操縱子和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能驅(qū)動并且調(diào)控表達的其他元件。
所述啟動子優(yōu)選能夠指導(dǎo)在植物的特定組織和/或植物發(fā)育的特定階段的表達。所述啟動子對所述植物來說可以是異源的或同源的。所述啟動子優(yōu)選指導(dǎo)在植物種子的胚乳或植物的根或塊莖中的表達。優(yōu)選的啟動子是小麥的高分子量麥谷蛋白(HMWG)啟動子。其他合適的啟動子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，如麥醇溶蛋白，分支酶，ADPG焦磷酸化酶，淀粉合成酶和肌動蛋白的啟動子。
5.4表達殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物可以通過用包括編碼植物殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的序列的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，工程生產(chǎn)具有能表達植物殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶多肽的轉(zhuǎn)基因植物。在一種實施方案中，植物啟動子可操作地與編碼需要的植物殼多糖酶或β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的序列結(jié)合。在本文中，術(shù)語“可操作地結(jié)合”或“可操作地連接”表示這樣一種結(jié)合，其中，調(diào)控區(qū)(例如啟動子，增強子)和要表達的核酸序列是共價連接的，并且是以允許在合適的條件下轉(zhuǎn)錄，翻譯的方式定位的。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，所述結(jié)合的啟動子是強效的和非組織或發(fā)育特異性植物啟動子(例如，能夠在很多或所有植物組織類型中強表達的啟動子)。所述強效“組成型”啟動子的例子包括，但不局限于CaMV 35S啟動子(Odell等，1985，Nature313810-812)，T-DNA甘露堿合成酶啟動子，和它們的各種衍生物。在另一種優(yōu)選實施方案中，將一種誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子用于在植物中表達感興趣的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶，例如，披露于Weinmann等，1994，The Plant Journal 5559-569中的操縱基因啟動子；或披露于McNellis等，1998，The Plant Journal 14247-257中的糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)型啟動子；或披露于Caddick等，1998，NatureBiotechnology 16177-180中的乙醇誘導(dǎo)型啟動子。還可參見Gatz，1995，Methods In Cell Biology 50411-424，該文獻披露了用于植物的誘導(dǎo)型和阻抑型基因表達系統(tǒng)。
在本發(fā)明的一種實施方案中，在植物中表達殼多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶，以便所述殼多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶多肽定位于質(zhì)外體間隙中。當(dāng)在植物中表達時，可以將殼多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶導(dǎo)向質(zhì)外體間隙，包括以與起著信號或轉(zhuǎn)運蛋白作用的肽形成的融合蛋白形式，表達殼多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶多肽，以便將殼多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶定位于轉(zhuǎn)基因植物的質(zhì)外體間隙中。可以使用多種信號或轉(zhuǎn)運肽，例如，Lund等，1992，Plant MolecularBiology 1847-53所披露的PR1b信號序列；或Pfitzner等，1987，Nucleic Acids Research 154449-4465中所披露的PR-1a，b和c信號序列。通過彼此連接對每一種成分特異的多核苷酸(例如，框內(nèi)連接多核苷酸)，可以構(gòu)建包括信號或轉(zhuǎn)運肽和殼多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶多肽的融合蛋白，以便當(dāng)所述融合多核苷酸在轉(zhuǎn)基因植物中表達時，產(chǎn)生需要的融合蛋白。本領(lǐng)域人員了解如何構(gòu)建可用于在轉(zhuǎn)基因植物的質(zhì)外體間隙中表達殼多糖酶和/或β-1，3-葡聚糖酶的多核苷酸。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，通過工程方法制備一種具有這樣一種基因構(gòu)建體的植物可能是有利的，所述基因構(gòu)建體包括可操作地與組織或發(fā)育特異性啟動子結(jié)合的編碼植物殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的序列，所述啟動子例如，但不局限于CHS啟動子，PATATIN啟動子等。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，用包括可操作地與一種修飾過的或人工啟動子結(jié)合的編碼植物殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶蛋白或多肽的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物可能是有利的。通常，通過重組不同啟動子的結(jié)構(gòu)元件構(gòu)建的所述啟動子，具有在天然啟動子中不存在的獨特的表達模式和/或水平。例如，參見Salina等，1992，Plant Cell41485-1493，例如，通過組合順式調(diào)控元件和啟動子核心構(gòu)建的人工啟動子。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，可以通過工程方法實現(xiàn)殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶多核苷酸的表達，包括利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)增加編碼需要的蛋白或多肽的基因的拷貝數(shù)量。
5.5植物和植物細胞的轉(zhuǎn)化可以用本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)化植物和植物細胞。在本發(fā)明的一種實施方案中，利用農(nóng)桿菌屬將所述基因構(gòu)建體導(dǎo)入植物。所述轉(zhuǎn)化優(yōu)選使用二元農(nóng)桿菌屬T-DNA載體(Bevan，1984，Nuc.Acid Res.128711-8721)，和共培養(yǎng)方法(Horsch等，1985，Science2271229-1231)。一般，利用農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對雙子葉植物進行工程改造(Bevan等，1982，Ann.Rev.Genet 16357-384；Rogers等，1986，Methods Enzymol.118627-641)。還可以利用農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移到單子葉植物和植物細胞中(參見Hernalsteen等，1984，EMBO J 33039-3041；Hooykass-VanSlogteren等，1984，Nature 311763-764；Grimsley等，1987，Nature 3251677-179；Boulton等，1989，Plant Mol.Biol.1231-40.；和Gould等，1991，Plant Physiol.95426-434)。
在其它實施方案中，可以采用各種其他方法將重組核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物和植物細胞。當(dāng)目標(biāo)是單子葉植物或植物細胞時，所述其他方法是特別適用的。其他基因轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化方法包括，但不局限于粒子槍轟擊(biolistics)，通過鈣-，聚乙二醇(PEG)-或電穿孔-介導(dǎo)的裸露DNA攝取而實現(xiàn)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見Paszkowski等，1984，EMBO J32717-2722，Potrykus等1985，Molec.Gen.Genet.199169-177；Fromm等，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 825824-5828；和Shimamoto，1989，Nature 338274-276)以及植物組織的電穿孔(D’Halluin等，1992，Plant Cell 41495-1505)。用于植物細胞轉(zhuǎn)化的其他方法包括顯微注射，碳化硅介導(dǎo)的DNA攝取(Kaeppler等，1990，Plant Cell Reporter 9415-418)，和顯微粒子轟擊(參見Klein等，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 854305-4309；和Gordon-Kamm等，1990，Plant Cell 2603-618)。在任何一種方法中，可以使用可選擇標(biāo)記，至少在開始使用這種標(biāo)記，以便確定是否確實發(fā)生了轉(zhuǎn)化。有用的可選擇標(biāo)記包括能賦予對一種抗生素的抗性的酶，如對慶大霉素，潮霉素，卡那霉素等的抗性。另外，可以使用具有通過顏色改變識別的化合物的標(biāo)記，如GUS，或通過發(fā)光識別，如熒光素酶。
在所述嵌合基因中還可以包括一個基因開關(guān)機制，由它決定在何種條件下或在何時表達所述編碼序列。例如，所述基因開關(guān)可以是化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子或溫度控制的啟動子。
根據(jù)本發(fā)明，可以利用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體和上面所提到的各種轉(zhuǎn)化方法，工程制備具有本文所披露的需要的生理學(xué)和農(nóng)學(xué)特性的多種植物和植物細胞系統(tǒng)。在優(yōu)選實施方案中，用于工程改造的目標(biāo)植物和植物細胞包括，但不局限于單子葉植物和雙子葉植物，如農(nóng)作物，包括谷類作物(例如，小麥，玉米，水稻，小米，大麥)，果實類作物(例如，番茄，蘋果，梨，草莓，橙子)，飼料類作物(例如苜蓿)，根類蔬菜作物(例如胡蘿卜，馬鈴薯，甜菜，山藥)，葉類蔬菜作物(例如，萵苣，菠菜)；開花植物(例如，矮牽牛，玫瑰，菊花)，針葉樹和松樹(例如，松樹，冷杉，云杉)；用于植物補救(phytoremediation)的植物(例如，重金屬積累植物)；油類作物(例如向日葵，油菜籽)和用于實驗?zāi)康牡闹参?例如，擬南芥屬)。
5.6轉(zhuǎn)化過的植物和植物細胞的篩選根據(jù)本發(fā)明，可以通過以下方法獲得需要的植物通過工程方法將能表達殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的一種或多種基因構(gòu)建體導(dǎo)入多種植物細胞類型，包括，但不局限于原生質(zhì)體，組織培養(yǎng)細胞，組織和器官外植體，花粉，胚胎，以及完整植株。在本發(fā)明的一種實施方案中，按照下文所披露的途徑和方法從工程改造的植物材料中選擇或篩選轉(zhuǎn)化體(業(yè)已導(dǎo)入或整合了所導(dǎo)入的基因構(gòu)建體的植物)。然后，可以將分離的轉(zhuǎn)化體再生成植株。另外，可以先將工程改造的植物材料再生成植株，然后再選擇或篩選所產(chǎn)生植株的標(biāo)記基因性狀。在選擇或篩選標(biāo)記基因之前或之后，由植物細胞，組織或器官再生植株的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
可以通過選擇或篩選所述工程改造的植物材料的由存在于轉(zhuǎn)化DNA上的標(biāo)記基因編碼的性狀，可以鑒定并且分離轉(zhuǎn)化過的植物細胞，愈傷組織，組織或植物。例如，選擇可以通過在含有抑制量的抗生素或除草劑的培養(yǎng)基上生長工程改造的植物材料而進行，轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體能產(chǎn)生對所述抗生素或除草劑的抗性。另外，還可以通過篩選可能存在于本發(fā)明重組核酸構(gòu)建體上的任何可見標(biāo)記基因(例如，β-葡糖醛酸酶，熒光素酶，B或C1基因)的活性，鑒定轉(zhuǎn)化過的植物和植物細胞。所述選擇和篩選方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
還可以用物理和生物化學(xué)方法鑒定含有本發(fā)明基因構(gòu)建體的植物或植物細胞轉(zhuǎn)化體。所述方法包括，但不局限于1)用于檢測和確定重組DNA插入片段結(jié)構(gòu)的Southern分析或PCR擴增；2)用于檢測和檢查所述基因構(gòu)建體的RNA轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡，S1 RNase保護，引物-延伸或逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR擴增；3)用于檢測酶活性的酶促分析，其中，所述基因產(chǎn)物是由所述基因構(gòu)建體編碼的；4)蛋白凝膠電泳(PAGE)，Western印跡技術(shù)，免疫沉淀，或酶聯(lián)免疫測定，其中的基因構(gòu)建體產(chǎn)物是蛋白。還可以使用諸如原位雜交，酶染色，和免疫染色的其他技術(shù)，檢測所述重組構(gòu)建體在特定植物器官和組織中的存在或表達。用于完成所有上述測定的方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
5.7能表達工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物制備了能表達工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的轉(zhuǎn)基因植物。能表達殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物不太容易受感興趣的病原體的致病作用。轉(zhuǎn)基因植物可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備，例如用于上文所披露的能表達植物殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)。
能表達一個或多個殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，能夠使得所述植物對感興趣的病原體的抗性更高，所述轉(zhuǎn)基因植物可以來自植物界的任何植物種，植物屬，植物科，植物目，植物綱，植物門。例如，參見美國專利號5,889,189；5,869,720；5,850,015；5,824,842；PP10,742；PP10,704；PP10,682，它引用了其中可以使用殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的植物種、屬、科、目、綱和門。
植物的例子有單子葉植物，雙子葉植物，作物類植物(即用于包括人類在內(nèi)的動物的農(nóng)業(yè)，食品生產(chǎn)目的而種植的任何植物物種，通常以超過大約10個植株的群體形式種植的植物，以便由于任何原因收獲所述植物的完整植株或一部分，例如，水果，花卉或作物，例如所述植物所長出的谷粒等)，樹木(即果樹，為了生產(chǎn)木材而種植的樹木，為了裝飾而種植的樹木等)，任何類型的花卉(即為了裝飾而種植的植物，例如，在它們收獲之后種植)，仙人掌等。
可以在其中表達殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的植物的其他例子包括Viridiplantae，Streptophyta，Embryophyta，Tracheophyta，Euphyllophytes，Spermatophyta，Magnoliophyta，Liliopsida，Commelinidae，Poales，Poaceae，稻屬，水稻，玉米屬，玉米，大麥屬，大麥，小麥屬，小麥，Eudicotyledons，Coreeudicots，Asteridae，Euasterids，Rosidae，Eurosids II，Brassicales，Brassicaceae，擬南芥屬，Magnoliopsida，Solananae，Solanales，茄科，茄屬，煙草屬。
例如，所述植物還包括特別感興趣的作物，包括茄科作物，包括加工過的和新上市的番茄，辣椒和茄子；葉類植物，包括萵苣和菠菜；蕓薹屬，包括花椰菜，抱子甘藍，花莖甘藍，羽衣甘藍，花椰菜，紅甘藍和白甘藍；葫蘆科，包括黃瓜，甜瓜，西瓜，zucchini和南瓜；大型有籽植物，包括豌豆，菜豆和甜玉米；根類植物，包括胡蘿卜和洋蔥；營養(yǎng)繁殖的植物，包括草莓，葡萄，香蕉，菠蘿和薔薇科果實和堅果類作物；以及熱帶作物，包括芒果和番木瓜。
因此，本發(fā)明業(yè)已利用了多種植物，包括，但不局限于來自下列屬的種腰果屬，落花生屬，天門冬屬，顛茄屬，燕麥屬，蕓薹屬，柑橘屬，西瓜屬，辣椒屬，紅藍花屬，椰子屬，咖啡屬，甜瓜屬，南瓜屬，Daucus，油棕屬，草莓屬，大豆屬，棉屬，向日葵屬，Heterocallis，大麥屬，天仙子屬，萵苣屬，亞麻屬，黑麥草屬，羽扇豆屬，番茄屬，蘋果屬，木薯屬，Majorana，苜蓿屬，煙草屬，木犀欖屬，稻屬，Panieum，Panneserum，鱷梨屬，菜豆屬，Pistachia，豌豆屬，梨屬，李屬，蘿卜屬，蓖麻屬，黑麥屬，千里光屬，白芥屬，茄屬，高粱屬，可可樹屬，胡盧巴屬，小麥屬，野豌豆屬，葡萄屬，豇豆屬和玉米屬。
5.8用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達工程改造過的基因的多核苷酸構(gòu)建體用生物技術(shù)領(lǐng)域已知的普通重組DNA和克隆技術(shù)，構(gòu)建能夠指導(dǎo)工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物在感興趣的轉(zhuǎn)基因植物中表達的多核苷酸構(gòu)建體，例如，參見Sambrook等，同上；Ausubel等，同上。所述多核苷酸構(gòu)建體通常包括編碼工程改造的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物的多核苷酸序列和一個或多個調(diào)控多核苷酸序列?？捎糜诒景l(fā)明多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)控序列包括，但不局限于啟動子，增強子，內(nèi)含子，剪接供體，剪接受體，聚腺苷化序列，RNA穩(wěn)定性調(diào)控序列或上述任意一種的元件(例如，啟動子元件，包括，但不局限于TATA盒)。
多核苷酸構(gòu)建體包括一個或多個調(diào)控元件，所述元件能夠指導(dǎo)本發(fā)明工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物的表達。在一個優(yōu)選方面，所述調(diào)控元件能夠指導(dǎo)在植物物種中的表達，其中，工程改造的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物的表達是需要的。在另一個優(yōu)選方面，所述調(diào)控元件能夠指導(dǎo)在一種細胞類型中的表達，其中，工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物在感興趣的植物物種中的表達是需要的。
可用于本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)控元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，已知能夠在感興趣的細胞類型和植物物種中表達的基因的啟動子和增強子元件。還可以通過常規(guī)實驗，分離可用于在感興趣的植物物種的細胞類型中表達工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物的啟動子，例如，通過分離已知能夠以需要的方式表達的基因的啟動子區(qū)。例如，人們可以利用對已知能在感興趣的植物物種的感興趣的細胞類型中表達的mRNA的5’末端特異的cDNA探針篩選基因組文庫。所述5’末端cDNA探針優(yōu)選僅為大約100個-大約300個堿基對，以便在所述基因組文庫中鑒定的克隆有可能包括所述基因的5’末端，它可能包括對所述探針特異的基因的啟動子區(qū)。所述啟動子區(qū)通常包括位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的大約1000-大約2000個堿基對。因此，可用于表達本發(fā)明工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的啟動子，是從已知能夠在感興趣植物物種的感興趣細胞類型中表達的基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游大約2000個堿基對到下游的大約50個堿基對的多核苷酸，或者是所述多核苷酸的一部分。
為了有利于工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物的正確加工，可能需要包括編碼所述加工所必須的肽序列的核苷酸片段。例如，可能需要例如能夠由轉(zhuǎn)基因宿主植物識別并且能在所述植物中起作用的肽序列，即信號序列，以便促進殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
5.9用于檢測工程產(chǎn)生的抗性植物品系的分析與不能表達工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物的相同物種的植物品系(即野生型植物)相比，用本發(fā)明方法制備的能表達工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因產(chǎn)物的植物品系對感興趣的病原體的致病作用的抗性更大。用本發(fā)明方法制備的植物品系的較高的抗性，可以用本發(fā)明領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)分析。例如，人們可以用感興趣的病原體感染所制備的植物品系的植物，和野生型植物品系的植物。在進行所述感染之后，所制備的植物品系的植物與野生型植物相比具有高出至少大約20％的從感染中存活下來的可能性，這種可能性更優(yōu)選至少大約40％，更優(yōu)選至少大約60％，最優(yōu)選至少大約80％。
測試用本發(fā)明方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物的另一種方法，是測試壞死誘導(dǎo)活性，例如，在以下文獻中所披露的Mahe等，1998，J.PeptideRes.52482-494。因此，人們可以在轉(zhuǎn)基因植物中表達工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因，并且用感興趣的病原體感染所述轉(zhuǎn)基因植物。例如，當(dāng)將一種病原體涂在能表達所述工程改造過的殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的轉(zhuǎn)基因植物上時，人們能夠在野生型植物上看到明確的壞死或嚴重擴散的壞死，但是在產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物的植物品系的轉(zhuǎn)基因植物上看不到這種壞死。
除了肉眼檢查之外，通過組織化學(xué)染色反應(yīng)還可以觀察到壞死性的細胞死亡。
提供以下實施例是為了進一步說明本發(fā)明，而不是要以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
6.實施例6.1材料和方法植物材料讓芥菜植物在22-24℃下，在12小時光照/12小時黑暗周期的生長箱中生長。
從芥菜cDNA文庫中篩選殼多糖酶克隆合成了一對寡核苷酸引物，5’GGTGGATGGGCTACAGCACCAGAC 3’和5’GCCACGTCCACACTCCAA 3’，用于PCR擴增擬南芥屬殼多糖酶基因的414bp片段(1625-2038號核苷酸)(Samac等，1990，Plant Physiol93907-914)。在用于篩選芥菜cDNA文庫之前(Pua等，1992，PlantMol Biol 19541-544)，通過在42℃下，在含有30％去離子化甲酰胺的溶液中進行原位噬斑雜交，證實相當(dāng)于保守殼多糖酶結(jié)構(gòu)域的該片段的核苷酸序列(Sambrook等，1989，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)。在室溫下，在0.1×SSC，0.1％SDS中洗滌印跡。
DNA序列分析使用DNA測序試劑盒，采用Sequenase Version 2.0(UBS，Amersham Life Science)和GCG序列分析程序(Genetics ComputerGroup)分析M13mp18中含有感興趣的序列的DNA片段(Yanisch-Perron等，1985，Gene 33103-119)。
基因組DNA分離和Southern印跡分析為了進行Southern印跡分析，用各種限制性內(nèi)切酶消化從芥菜中分離的20μg DNA(Dellaporta等，1983，Plant Mol Biol Reptr119-21)，通過在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳進行分離，并且吸印到Hybond-N(Amersham)上(Sambrook等，1989)。在42℃下，在含有30％去離子化甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt’s，1％SDS和500μg/ml變性的超聲處理過的鮭魚精子DNA的溶液中，讓所述印跡與32P-標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA探針雜交過夜。在室溫下以及在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌所述印跡。
Northern印跡分析在50℃下，在存在乙二醛的條件下，使20μg從幼苗的葉片中提取的RNA變性(Nagy等，1988，Plant Molecular Biology Manual p.B41-29.Kluwer Academic Publisher，Dordrecht)，通過在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳進行分離，并且吸印到Hybond-N(Amersham)膜上。在42℃下，在50％甲酰胺，1×Denhardt’s，6×SSPE，1％SDS，100μg/ml變性的超聲處理過的鮭魚精子DNA和10％硫酸葡聚糖中，讓印跡與32P-標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA一起培養(yǎng)過夜。在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌所述印跡。
聚合酶鏈式反應(yīng)利用GeneAmp PCR Reagent試劑盒(Perkin Elmer)，用引物P1和P2或P2和P3進行PCR。圖1A表示所述引物的定位P1(5’CCTCCGGTGAGCAATGCG3’)相當(dāng)于56-73號核苷酸，P2(5’TTAGCGGCGGTGATGAAGG3’)互補于554-5 36號核苷酸，而P3(5’TCCTCCAACCCCGCAGTGT3’)相當(dāng)于2 07-225號核苷酸。用引物使在94℃下變性5分鐘的芥菜DNA進行35輪PCR94℃1分鐘，68℃1分鐘，和72℃3分鐘。最終的延伸是在72℃下進行7分鐘。將在2％瓊脂糖凝膠中電泳的PCR產(chǎn)物吸印到Hybond-N(Amersham)膜上，以便與32P標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA雜交。
按照Lasserre等，1996，Mol Gen Genet 25181-90的方法(Nagy等，1988)，使用利用硫氰酸胍從幼苗的葉片中提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)。讓引物P4，5’CCACTCGAGGTTGTTGC3’(互補于750-734號核苷酸；圖1A)與50μg總RNA退火。在使用引物P2和P3的PCR中，用第一條cDNA鏈作模板(圖1A)。所有RT-PCR反應(yīng)都重復(fù)進行三次。
抗HbGLU和BjCHI1的多克隆抗體的制備相當(dāng)于HbGLU(SEQ ID NO4)的94-107號氨基酸的合成肽(SDLQSLTNPSNAKS)(Chye和Cheung，1995，Plant Mol.Biol.29397-402)是從Chiron Technologies(Australia)購買的，并且用于按照Sambrook等，1989中披露的方法，在兔子體內(nèi)制備多克隆抗體。將相當(dāng)于BjCHI1(SEQ ID NO1)的231-242號氨基酸的合成肽(YKEEIDKSDPHC)(Zhao和Chye，1999，同上)用于對兔進行免疫，以便制備多克隆抗體，并且所述抗-BjCHI1抗體是從ChironTechnologies(Australia)購買的。將每一種肽與匙孔血藍蛋白(KLH)結(jié)合，并且與弗氏完全佐劑混合，用于制備抗體。采集血液，并且利用蛋白A Sepharose CL-4B(Pharmacia)和CNBr-激活的Sepharose4B(Pharmacia)柱純化抗HbGLU的抗體，而抗BjCHI1的抗體是利用Thiopropyl-Sepharose 6B(Pharmacia)柱純化的。
用茄屬絲核菌感染芥菜將芥菜種子播種到高壓滅菌的土壤中，并且在24℃的生長箱中培養(yǎng)，采用12小時光照(08:00-20:00)和12小時黑暗(20:00-08:00)的晝夜循環(huán)。將兩周齡的幼苗小心移栽到用1周齡的茄屬絲核菌培養(yǎng)物接種過的土壤中。讓所述真菌在室溫下在馬鈴薯葡萄糖營養(yǎng)液中生長1周時間，并且在移栽所述幼苗之前3天添加到所述土壤中。在移栽到感染過的土壤中之后，從第0天到第9天，每天從幼苗上采集葉片。從所述葉片中提取總RNA和總蛋白，分別進行northern印跡分析和western印跡分析。
同時具有三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶和蕓薹屬殼多糖酶BjCHI1的質(zhì)粒構(gòu)建體將被命名為HbGLU的完整長度的H.brasiliensis β-1，3-葡聚糖酶cDNA的1.2kb的SmaI-HindII片段(Chye和Cheung，1995，Plant Mol.Biol.29397-402)克隆到二元質(zhì)粒載體pBI121(Clontech)的CaMV 35S啟動子下游的SmaI位點上，以便制備質(zhì)粒pHEV43(圖7)。而將編碼芥菜殼多糖酶的完整長度cDNA的1.3kb SmaI片段BjCHI1(Zhao和Chye，同上)克隆到pBI121(Clontech)的CaMV 35S啟動子下游的SmaI位點上，以便制備質(zhì)粒pBj17。然后將來自pHEV43的一個含有CaMV 35S啟動子和HbGLU cDNA的2.04kbHindIII片段用Klenow平端化，并且連接到pBj17的GUS基因內(nèi)的SnaBI位點上，制備兩種質(zhì)粒pBj47和pBj48(圖7)。pBj47中的CaMV35S啟動子是顛倒的，而pBj48中的該啟動子是串聯(lián)，并且質(zhì)粒pBj47和pBj48中的每一個都攜帶有位于單一質(zhì)粒上的HbGLU cDNA和BjCHI1cDNA(圖7)。將質(zhì)粒pBj17，pBj47和pHEV43用于馬鈴薯轉(zhuǎn)化。
6.2制備具有三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶和蕓薹屬殼多糖酶BjCHI1構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物植物轉(zhuǎn)化通過利用輔助菌株HB101(pRK2013)進行三親交配，將每一種質(zhì)粒pHEV43，pBj17，pBj47和pBI121從大腸桿菌菌株DH5α轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。通過攜帶所述質(zhì)粒之一的根癌農(nóng)桿菌衍生物進行的馬鈴薯植物品種Desiree(Solanum tuberosum L.)的轉(zhuǎn)化是按照以下文獻中的方法進行的Dietze等，1995，In Potrykus I，Sprangenberg G(eds)，Gene Transfer to Plants，New York，ColdSpring Harbor Laboratory，p.24-29。在補充了卡那霉素(100μg/ml)的Murashige和Skoog培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體。在20-25℃的溫度和16小時光照/18小時黑暗方案下，將馬鈴薯組織培養(yǎng)物保持在生長箱中。在24℃下讓轉(zhuǎn)基因R0馬鈴薯植物生長在生長箱中的土壤里，采用12小時光照/12小時黑暗的晝/夜方案。
6.3測定三葉橡膠屬β-1，3-葡聚糖酶和蕓薹屬殼多糖酶BjCHI1產(chǎn)物在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物中的功能Northern印跡分析按照以下文獻中所披露的方法從完整植株中提取總RNANagy等，1988，InSV Gelvin，RA Schilperoort，(eds)，Plant MolecularBiology Manual，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，p.B41-29)。在存在乙二醇的條件下，在50℃下讓20μg RNA變性30分鐘。通過在1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳進行分離，并且轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜(Amersham)上。讓印跡預(yù)雜交4-6小時，然后與通過隨機引發(fā)標(biāo)記而制備的32P-標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA或HbGLU cDNA在42℃下，在含有50％甲酰胺，1×Denhardt′s，6×SSPE，0.1％SDS，100μg/ml變性的鮭魚精子DNA和10％硫酸葡聚糖溶液中雜交過夜。在65℃下，用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌印跡。
Southern印跡分析為了進行Southern印跡分析，用限制性內(nèi)切酶消化按照Dellaporta等，1983，Plant Mol Biol Rep.119-21中所披露的方法分離的20μg基因組DNA，通過在0.7％的瓊脂糖凝膠中電泳進行分離，并且吸印到Hybond-N(Amersham)膜上(Sambrook等，1989)。在42℃下讓所述膜在含有50％去離子化甲酰胺，6×SSC，5×Denhardt′s，1％SDS，100μg/ml變性的鮭魚精子DNA的溶液中預(yù)雜交4-6小時，添加32P-標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA探針或32P-標(biāo)記過的HbGLUcDNA探針，并且雜交過夜。在65℃下用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌膜。
Western印跡分析按照以下文獻中所披露的方法制備總植物蛋白Kush等，1990，Proc Natl Acad Sci USA 871787-1790。通過SDS-PAGE分離20μg的總蛋白，并且按照Sambrook等，1989所披露的方法轉(zhuǎn)移到Hybond-C(Amersham)膜上。在western印跡分析中，按照擴增的堿性磷酸酶山羊抗兔免疫印跡分析試劑盒(BioRad)中披露的方法，使用抗BjCHI1的多克隆抗體或抗HbGLU的多克隆抗體檢測交叉反應(yīng)帶。
制備用于酶分析的植物蛋白提取物按照Boller等，1983，Planta 15722-31中所披露的方法制備植物蛋白提取物。在液氮中將植物研磨成細粉，轉(zhuǎn)移到含有1％(v/v)β-巰基乙醇的0.1M檸檬酸鈉(pH5.0)的緩沖液中，并且渦旋攪拌。在離心(14,000rpm，5分鐘，4℃)之后將上清液轉(zhuǎn)移到另一個試管中，在50℃下培養(yǎng)10分鐘，并且在冰上冷卻10分鐘。然后對所述樣品進行離心(14,000rpm，4分鐘，4℃)，并且將所述上清液用作粗制蛋白用于分析殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。按照Bradford的方法測定蛋白濃度(1976，Anal.Biochem，72248-254)。
β-1，3-葡聚糖酶分析按照以下文獻中所披露的方法進行β-1，3-葡聚糖酶的比色分析Abeles和Forrence，1970，Plant Physiol 45395-400。在50℃下，將100μl(25μg)植物蛋白提取物和100μl的2％(w/v)昆布多糖(Sigma)的反應(yīng)混合物溫育2小時。通過添加600μl的二硝基水楊酸試劑，并且在100℃下加熱5分鐘，終止該反應(yīng)。在冷卻到室溫之后，以1∶20的比例用水稀釋內(nèi)含物，并且在500nm下測定吸光度。
殼多糖酶分析按照以下文獻中所披露的方法進行比色殼多糖酶分析Wirth和Wolf，1990，J.Microbiol Meth 12197-205。在37℃下，將150μl的底物羧甲基/殼多糖/Remazol亮紫(Loewe Biochemica；2mg/ml母液)，150μl的0.2M乙酸鈉(pH5.0)和300μl(15μg)植物蛋白提取物反應(yīng)混合物培養(yǎng)0.5小時。通過添加150μl的1N HCl終止反應(yīng)，然后在冰上培養(yǎng)5-10分鐘，然后離心(14,000rpm，3分鐘，4℃)。將上清液用于在550nm下讀取吸光度。作為空白對照，用300μl的0.1M乙酸鈉，pH5.0緩沖液取代蛋白樣品。
利用Tricoderma viride進行的體外真菌生物分析在馬鈴薯葡萄糖(Difco)瓊脂(PDA)平板上培養(yǎng)T.viridePersoon(ATCC 12582)。按照以下文獻中披露的方法用它進行體外菌絲抑制測試Schlumbaum等，1986，Nature 324365-367。將PDA上的生長中的T.viride培養(yǎng)物的一個栓轉(zhuǎn)移到一個新的PDA平板的中央。在25℃下培養(yǎng)24小時，在此期間，菌絲從所述中央向外生長。然后在PDA外表面上鉆孔，與所述栓的距離相等。將植物蛋白提取物(50μg)添加到每一個孔中，并且在25℃下，在黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)所述平板，然后觀察T.viride的生長抑制作用。在16小時和24小時拍照。
使用茄屬絲核菌的體內(nèi)生物分析在以前的northern印跡分析中證實了BjCHI1 mRNA是通過創(chuàng)傷或MeJA處理誘導(dǎo)的(Zhao等，1999，同上)。隨后還證實了通過黑曲霉感染和毛蟲采食也能誘導(dǎo)BjCHI1(Fung等，2002，同上)。在這里，體內(nèi)生物分析是按照以下文獻中披露的方法用幼小的馬鈴薯植物進行的Jach等，1995，Plant J.897-109。將在25℃下，在固體PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-6天的茄屬絲核菌接種到100ml馬鈴薯葡萄糖營養(yǎng)液(PDB)中，并且在室溫下振蕩培養(yǎng)(100rpm)1-2周。然后將該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到裝有500ml新鮮PDB的錐形燒瓶中，并且再培養(yǎng)3-4天。然后在裝有消毒的8升無菌土壤的植物生長盤中，將該培養(yǎng)物與6L無菌土壤(Bio-Mix Super，The Netherlands)充分混合，10天之后，對該土壤進行均勻混合，然后將來自組織培養(yǎng)物的在無菌土壤中事先生長了2周的馬鈴薯植物移栽到感染過的土壤中，并且在24℃下，在生長箱中再進行培養(yǎng)，采用12小時光照/12小時黑暗的方案。在移栽到感染過的土壤中2周之后，對馬鈴薯植物進行拍照。將在沒有真菌的無菌土壤中生長的植物用作對照。
6.4結(jié)果BjCHI1表達是受茄屬絲核菌感染誘導(dǎo)的為了研究真菌誘導(dǎo)對BjCHI1表達的影響，讓芥菜幼苗在預(yù)先接種了土壤真菌——茄屬絲核菌的土壤中生長。在圖8a上的我們的結(jié)果，證實了在感染過的土壤中生長1天之后，1.3kb BjCHI1 mRNA的表達增強。圖8b表示具有37kDa的表觀分子量的交叉反應(yīng)帶，它是從在感染過的土壤中生長3天之后開始積累的預(yù)期的成熟BjCHI1蛋白。位于該帶上面的42-kDa的微弱的帶有可能是前體蛋白(圖8b)。計算分子量為42,774kDa的BjCHI1前體進行了翻譯后裂解，以便除去N-末端信號肽和C-末端液泡導(dǎo)向肽(Zhao和Chye，同上)。我們的結(jié)果表明，BjCHI1 mRNA及其相應(yīng)的蛋白在茄屬絲核菌感染之后積累，暗示了它在真菌防御方面的作用。
BjCHI1和HbGLU在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中的表達
BjCHI1表達是通過茄屬絲核菌誘導(dǎo)的這一發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致我們研究了它們在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中的異源表達是否能賦予對茄屬絲核菌的保護作用。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將含有BjCHI1 cDNA的質(zhì)粒pBj17和pBj47分別導(dǎo)入馬鈴薯品種Desiree。質(zhì)粒pBj47還含有HbGLU cDNA，有利于我們研究HbGLU在增強BjCHI1作用方面的功能(如果有這種功能的話)。同樣將僅含有HbGLU cDNA的質(zhì)粒pHEV43和載體對照pBI121用于馬鈴薯轉(zhuǎn)化。通過northern，Southern和western印跡分析，檢查了來自每一種轉(zhuǎn)化的大約20個獨立的卡那霉素抗性推測的轉(zhuǎn)基因植物。在圖9，10和11中，示出了來自被最終選擇用于茄屬絲核菌感染實驗的每一種轉(zhuǎn)化的代表性品系的分析結(jié)果。圖9A表示共表達HbGLU和BjCHI1的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)和僅表達HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pHEV-P14(泳道5)的northern印跡分析中，用32P-標(biāo)記過的HbGLU cDNA檢測的1.2kb雜交HbGLU mRNA的存在。這條帶不存在于未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯中(圖9A，泳道1)。圖9B表示用32P-標(biāo)記的BjCHI1cDNA探針檢測的1.3kb BjCHI1雜交mRNA在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10(泳道2)，pBj47-P8(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)和pBj17-P6(泳道6)中的表達。這條帶在未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(圖9B，泳道1)和pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(圖9B，泳道5)中不存在。
轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的Southern印跡分析然后，將來自所述轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的DNA用于利用由BjCHI1或HbGLU cDNA制備的32P-標(biāo)記過的探針進行Southern印跡分析。圖10A中的結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pHEV43-P14(泳道3)，pBj47-P7(泳道4)，pBj47-P8(泳道5)和pBj47-P10(泳道6)中存在1.2kb HbGLUEcoRI-雜交帶，而在未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道1)和pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道2)中不存在。所述1.2kb的EcoRI-雜交帶相當(dāng)于在pHEV43的圖譜中所示出的帶(圖7)，并且包括完整長度的HbGLU cDNA。在Southern印跡分析中使用32P-標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA探針和HindIII-消化過的DNA(圖10B)，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)，pBj47-P10(泳道5)和pBj17-P6(泳道6)中，檢測到了一個0.9kb的HindIII-雜交帶。該0.9kb的帶相當(dāng)于在pBj17的圖譜中所示出的位于BjCHI1內(nèi)第二和第三個內(nèi)部HindIII位點之間的片段(圖7)。在未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(圖10B，泳道1)和pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道2)中不存在所述0.9kb的雜交帶。在Southern印跡分析中，當(dāng)用32P-標(biāo)記過的BjCHI1 cDNA探針檢測EcoRI-消化過的DNA時(圖10C)，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10(泳道3)，pBj47-P8(泳道4)和pBj47-P7(泳道5)中出現(xiàn)了各種大小的雜交帶，這表明它們是獨立的轉(zhuǎn)基因品系。在未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道1)和pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道2)中不存在所述雜交帶。
轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中BjCHI1和HbGLU的蛋白檢測使用抗-HbGLU抗體和抗-BjCHI1抗體，通過Western印跡分析進一步分析轉(zhuǎn)基因植物。使用抗-HbGLU抗體對來自轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)和pHEV43-P14(泳道4)的粗制蛋白進行的Western印跡分析(圖11A)，發(fā)現(xiàn)了一個表觀分子量為35kDa的相當(dāng)于HbGLU的交叉反應(yīng)帶。在pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(圖11A，泳道5)和未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道6)中不存在這條帶。使用抗-BjCHI1抗體對來自轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)和pHEV43-P14(泳道4)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道5)，未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(泳道6)和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj17-P6(泳道7)的粗制蛋白進行的Western印跡分析，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7(泳道1)，pBj47-P8(泳道2)，pBj47-P10(泳道3)和pBj17-P6(泳道7)中發(fā)現(xiàn)了表觀分子量為52kDa的交叉反應(yīng)BjCHI1帶。在只能表達HbGLU的轉(zhuǎn)基因品系pHEV43-P14(圖11B，泳道4)，pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(圖11B，泳道5)和未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(圖11B，泳道6)中不存在這條帶。馬鈴薯表達的BjCHI1的表觀分子量(52kDa)，類似于觀察到的煙草表達的BjCHI1的分子量(Fung等，2002，同上)，并且大于天然BjCHI1的分子量(37kDa)，這有可能是由于在異源宿主煙草和馬鈴薯中不能進行正確的翻譯后加工。
殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶活性分析將進行殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶分析的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系與pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯進行比較(圖12)。利用來自pBI121-轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7，pBj47-P8和pBj47-P10的粗制蛋白進行的葡聚糖酶分析(圖12A)表明，轉(zhuǎn)基因品系比pBI121轉(zhuǎn)化體具有更高的β-1，3-葡聚糖酶活性水平。利用粗制蛋白進行的殼多糖酶分析(圖12B)表明，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P7，pBj47-P8和pBj47-P10具有比pBI121轉(zhuǎn)化體更高的殼多糖酶活性。在pBI121轉(zhuǎn)化體中檢測到的活性是由于內(nèi)源馬鈴薯β-1，3-葡聚糖酶和殼多糖酶的存在。
用T.viride進行體外生物分析然后，對來自轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的粗制提取物進行體外T.viride生長抑制實驗。在所述生物分析中，用來自未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯和用pBI121轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因品系的提取物作對照，用緩沖液作空白對照。在添加蛋白提取物16小時(圖13A)和24小時(圖13B)之后拍攝的照片表明，T.viride的生長受到了來自能共表達BjCHI1和HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10的提取物的抑制，而在僅有緩沖液的對照(2號孔)，來自野生型馬鈴薯的提取物(3號孔)和pBI121轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯(4號孔)中缺乏抑制作用。僅表達BjCHI1的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj17-P6(5號孔)，和僅表達β-1，3-葡聚糖酶的pHEV43-P14(6號孔)表現(xiàn)出比pBj47-P10(1號孔)弱的抑制作用。
用茄屬絲核菌進行的體內(nèi)生物分析體內(nèi)生物分析是用在用茄屬絲核菌預(yù)先接種的土壤上生長的幼小植物進行的。在轉(zhuǎn)移到受感染的土壤中之后兩周所獲得的結(jié)果表明，能共表達BjCHI1和HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10(圖14A)具有比只能表達BjCHI1的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj17-P6(圖14B)略好一些的生長。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pBj47-P10和pBj17-P6的根發(fā)育要比只能表達HbGLU的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系pHEV43-P14(圖14C)好的多。然而轉(zhuǎn)基因品系pHEV43-P14的根發(fā)育比未轉(zhuǎn)化過的馬鈴薯好(圖14D)，這表明HbGLU本身的表達產(chǎn)生了某種保護作用。在無菌土壤(未用茄屬絲核菌接種)中生長的對照植物，表現(xiàn)出類似于pBj47-P10轉(zhuǎn)基因植物的根發(fā)育(數(shù)據(jù)未示出)。用茄屬絲核菌進行的這種體內(nèi)生物分析重復(fù)產(chǎn)生了一致的結(jié)果。
本發(fā)明的范圍并不局限于所披露的具體實施方案，這些實施方案只是作為對本發(fā)明某一方面的具體說明，并且功能等同方案和要素都屬于本發(fā)明的范圍。實際上，除了在本文中所示出的和所披露的之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以上說明和附圖，可以理解本發(fā)明的各種改進。這些改進被認為屬于所附權(quán)利要求書的范圍。在本文中引用了多份參考文獻，這些文獻的內(nèi)容被以它的全文形式收作本文參考。
序列表<110>Chye，Mee LenZhao，Kai Jun<120>具有增強的對真菌疾病的抗性的遺傳修飾過的植物及其生產(chǎn)方法<130>9661-025-999<140>
<141>
<150>60/331,749<151>2001-11-20<160>7<170> FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1297<212>DNA<213>芥菜(B.juncea)<220>
<223>芥菜殼多糖酶(BjCHI1)<400>1aacatgaaga cttatctcct tctccttctc atcttctcac ttctcttatc attttcctcc 60ggtgagcaat gcggtagtca atccataccc gagggagcac tctgccccaa cggtctatgc 120tgcagcgagg ctggatggtg cggcaccacc gaagcttact gcgggcatgg ttgtcaaagc 180cagtgcaatc ctggtcccta tcctcctcct ccaaccccgc agtgtggtcg tcaatccata 240cccgcgggag ccctctgccc caacggtcta tgctgtagcg aggctggatg gtgcggcacc 300accgaagctt actgcgggca tggttgccaa agccagtgca ctcccattcc cactcctcct 360gctcccactc ccactcctcc tactcccact cctcctagtc ctacccctcc tggtcccact 420cctcctggtc ccagcgggga tctttctggc atcatttcaa gagatcagtt ctataaaatg 480cttaagcaca tgaacgacaa tgattgtcat gctgttggtt tcttcactta cgacgccttc 540atcaccgccg ctaagtcttt cccaagtttc gggaacaccg gagaccttgc catgaggaag 600
aaggagatag cagccttctt cggccagact tcccacgaaa ccaccggtgg gtggtcgggt 660gcacccgatg gagcaaatac atggggctac tgttacaagg aagaaattga caaaagcgat 720ccccactgtg atagcaacaa cctcgagtgg ccatgcgcac caggcaaatt ttactacgga 780cgaggaccaa tgatgctgtc ttggaactat aattacggac cgtgcgggag agacctagga 840ctcgagttac tcaagaaccc agatgttgcg tccagcgacc cagtgatagc tttcaaaacc 900gccatttggt tctggatgac tcctcaagct cctaaaccct cgtgccacga cgtgatcacc 960gaccagtggg agccgtcggc tgccgacatt tctgccggaa ggttaccagg ttatggagtg 1020attaccaata tcatcaacgg tggattagag tgtgctggtc gcgacgtcgc aaaggtccaa 1080gatcggatat cgttttatac aaggtactgt ggcatgtttg gtgttgatcc tggaagtaat 1140attgactgtg acaatcaaag gccgtttaat gaaggtagta acgttttctt ggatgctgca 1200atttaataag tactgttaat gaagctttgt tgtatccaag caataagaga gtatcaaatt 1260aaattaaata aaactccttt ttattaagta aaaaaaa 1297<210>2<211>400<212>PRT<213>芥菜<220>
<223>芥菜殼多糖酶推測的氨基酸序列(BjCHI1)<400>2Met Lys Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Phe Ser Ser Gly Glu Gln Cys Gly Ser Gln Ser Ile Pro Glu Gly Ala20 25 30Leu Cys Pro Asn Gly Leu Cys Cys Ser Glu Ala Gly Trp Cys Gly Thr35 40 45Thr Glu Ala Tyr Cys Gly His Gly Cys Gln Ser Gln Cys Asn Pro Gly50 55 60Pro Tyr Pro Pro Pro Pro Thr Pro Gln Cys Gly Arg Gln Ser Ile Pro65 70 75 80Ala Gly Ala Leu Cys Pro Asn Gly Leu Cys Cys Ser Glu Ala Gly Trp85 90 95
Cys Gly Thr Thr Glu Ala Tyr Cys Gly His Gly Cys Gln Ser Gln Cys100 105 110Thr Pro Ile Pro Thr Pro Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro Pro Thr Pro115 120 125Thr Pro Pro Ser Pro Thr Pro Pro Gly Pro Thr Pro Pro Gly Pro Ser130 135 140Gly Asp Leu Ser Gly Ile Ile Ser Arg Asp Gln Phe Tyr Lys Met Leu145 150 155 160Lys His Met Asn Asp Asn Asp Cys His Ala Val Gly Phe Phe Thr Tyr165 170 175Asp Ala Phe Ile Thr Ala Ala Lys Ser Phe Pro Ser Phe Gly Asn Thr180 185 190Gly Asp Leu Ala Met Arg Lys Lys Glu Ile Ala Ala Phe Phe Gly Gln195 200 205Thr Ser His Glu Thr Thr Gly Gly Trp Ser Gly Ala Pro Asp Gly Ala210 215 220Asn Thr Trp Gly Tyr Cys Tyr Lys Glu Glu Ile Asp Lys Ser Asp Pro225 230 235 240His Cys Asp Ser Asn Asn Leu Glu Trp Pro Cys Ala Pro Gly Lys Phe245 250 255Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Met Met Leu Ser Trp Asn Tyr Asn Tyr Gly260 265 270Pro Cys Gly Arg Asp Leu Gly Leu Glu Leu Leu Lys Asn Pro Asp Val275 280 285Ala Ser Ser Asp Pro Val Ile Ala Phe Lys Thr Ala Ile Trp Phe Trp290 295 300Met Thr Pro Gln Ala Pro Lys Pro Ser Cys His Asp Val Ile Thr Asp305 310 315 320Gln Trp Glu Pro Ser Ala Ala Asp Ile Ser Ala Gly Arg Leu Pro Gly325 330 335Tyr Gly Val Ile Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Leu Glu Cys Ala Gly340 345 350
Arg Asp Val Ala Lys Val Gln Asp Arg Ile Ser Phe Tyr Thr Arg Tyr355 360 365Cys Gly Met Phe Gly Val Asp Pro Gly Ser Asn Ile Asp Cys Asp Asn370 375 380Glu Arg Pro Phe Asn Glu Gly Ser Asn Val Phe Leu Asp Ala Ala Ile385 390 395 400<210>3<211>1242<212>DNA<213>三葉橡膠屬(Hevea)<220>
<223>三葉橡膠屬1，3-葡聚糖酶(HbGLU)<400>3aaattataag caactttctt ctaatttccc cccttcttaa tggctatctc ctcttcaact 60tcaggaacta gtagttcctt cccctcaaga actactgtca tgcttcttct gtttttcttt 120gcagcaagcg ttggtataac agatgcccag gtaggtgttt gctatggaat gcaaggcaac 180aaccttccac ctgtttcaga ggtcatagct ctctataaaa aatctaacat cacgagaatg 240agaatttatg atccaaatcg agcagtattg gaagccctta gaggctcaaa cattgaactc 300atactaggtg ttccaaactc agatctccaa agccttacca atccttccaa tgcaaaatca 360tgggtacaaa aaaatgttcg tggcttctgg tcaagtgtcc tgttcagata tatagcagtt 420ggcaacgaaa ttagtcctgt caatagaggc acagcttggt tggctcaatt tgttttgcct 480gccatgagaa atatacatga tgctataaga tcagctggtc ttcaagatca aatcaaggtc 540tccactgcaa ttgacttgac cctggtagga aattcctacc ctccttctgc aggtgctttc 600agggatgatg ttagatcata cttggaccca attattggat ttctatcctc tatcaggtca 660cctttacttg ccaatattta tccttacttt acttatgctt ataatccaag ggatatttcc 720cttccctatg ctttgttcac ttcaccatca gttgttgtgt gggatggtca gcgaggttat 780aagaaccttt ttgatgcaac gttggatgca ttgtactctg ctcttgagag ggctagtggt 840ggttctctgg aggtggttgt ttcggaaagt ggctggccgt ctgccggagc atttgctgcc 900acatttgaca atgggcgtac ttatctctca aatttgatcc aacatgttaa aggaggtact 960cctaagaggc ctaacagagc tatagagact tacttatttg ccatgtttga tgaaaataag 1020aagcaaccag aggttgagaa acactttgga cttttctttc ctgataaacg gccaaaatat 1080
aatctcaatt ttggtgcaga aaagaactgg gatatttcta ctgaacacaa tgcaacaata 1140cttttcctta agagtgatat gtgagattgt gagaatttaa gtactatata tatttccaat 1200gtatgcatgt atccatgtat taaataagag aaccttttct ca1242<210>4<211>374<212>PRT<213>三葉橡膠屬<220>
<223>三葉橡膠屬1，3-葡聚糖酶的推測的氨基酸序列(HbGLU)<400>4Met Ala Ile Ser Ser Ser Thr Ser Gly Thr Ser Ser Ser Phe Pro Ser1 5 10 15Arg Thr Thr Val Met Leu Leu Leu Phe Phe Phe Ala Ala Ser Val Gly20 25 30Ile Thr Asp Ala Gln Val Gly Val Cys Tyr Gly Met Gln Gly Asn Asn35 40 45Leu Pro Pro Val Ser Glu Val Ile Ala Leu Tyr Lys Lys Ser Asn Ile50 55 60Thr Arg Met Arg Ile Tyr Asp Pro Asn Arg Ala Val Leu Glu Ala Leu65 70 75 80Arg Gly Ser Asn Ile Glu Leu Ile Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu85 90 95Gln Ser Leu Thr Asn Pro Ser Asn Ala Lys Ser Trp Val Gln Lys Asn100 105 110Val Arg Gly Phe Trp Ser Ser Val Leu Phe Arg Tyr Ile Ala Val Gly115 120 125Asn Glu Ile Ser Pro Val Asn Arg Gly Thr Ala Trp Leu Ala Gln Phe130 135 140Val Leu Pro Ala Met Arg Asn Ile His Asp Ala Ile Arg Ser Ala Gly145 150 155 160Leu Gln Asp Gln Ile Lys Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Thr Leu Val
165 170 175Gly Asn Ser Tyr Pro Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Asp Asp Val Arg180 185 190Ser Tyr Leu Asp Pro Ile Ile Gly Phe Leu Ser Ser Ile Arg Ser Pro195 200 205Leu Leu Ala Asn Ile Tyr Pro Tyr Phe Thr Tyr Ala Tyr Asn Pro Arg210 215 220Asp Ile Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ser Pro Ser Val Val Val225 230 235 240Trp Asp Gly Gln Arg Gly Tyr Lys Asn Leu Phe Asp Ala Thr Leu Asp245 250 255Ala Leu Tyr Ser Ala Leu Glu Arg Ala Ser Gly Gly Ser Leu Glu Val260 265 270Val Val Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Ala Gly Ala Phe Ala Ala Thr275 280 285Phe Asp Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Ser Asn Leu Ile Gln His Val Lys290 295 300Gly Gly Thr Pro Lys Arg Pro Asn Arg Ala Ile Glu Thr Tyr Leu Phe305 310 315 320Ala Met Phe Asp Glu Asn Lys Lys Gln Pro Glu Val Glu Lys His Phe325 330 335Gly Leu Phe Phe Pro Asp Lys Arg Pro Lys Tyr Asn Leu Asn Phe Gly340 345 350Ala Glu Lys Asn Trp Asp Ile Ser Thr Glu His Asn Ala Thr Ile Leu355 360 365Phe Leu Lys Ser Asp Met370<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工序列說明C1(正向)引物<400>5ctgaattctc ctccggtgag caatgcg 27<210>6<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列說明C21(正向)引物<400>6ctgaattcgg ggatctttct ggcatc 26<210>7<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列說明C2(反向)引物<400>7gcgactgcgg ccgcgttact accttcatta aacg 3權(quán)利要求
1.一種重組載體，包括(a)SEQ ID NO1的核苷酸序列或編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸；和(b)SEQ ID NO3的核苷酸序列或編碼SEQ ID NO4的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.一種重組載體，包括(a)能在嚴格條件下與SEQ ID NO1的核苷酸序列的互補體雜交的第一核苷酸序列；和(b)能在嚴格條件下與SEQ ID NO3的核苷酸序列的互補體雜交的第二核苷酸序列；其中，所述嚴格條件包括在42℃下，在50％去離子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，100μg/ml變性的50％去離子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，100μg/ml變性的鮭魚精子DNA中雜交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗滌；并且，其中，所述第一核苷酸序列編碼功能性殼多糖酶；而所述第二核苷酸序列編碼功能性β-1，3-葡聚糖酶。
3.一種重組載體，包括(a)編碼包括一個以上殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的第一核苷酸序列；和(b)編碼β-1，3-葡聚糖酶的第二核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1，2或3的重組載體，還包括可操作地與所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列連接的一個或多個調(diào)控核酸。
5.如權(quán)利要求4的重組載體，其中，所述調(diào)控核酸是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。
6.包括權(quán)利要求1，2或3的載體的重組細胞。
7.包括權(quán)利要求4的載體的重組細胞。
8.如權(quán)利要求6的重組細胞，其中，所述細胞是植物細胞。
9.如權(quán)利要求7的重組細胞，其中，所述細胞是植物細胞。
10.如權(quán)利要求8的重組細胞，其中，所述植物選自下組小麥，玉米，水稻，大麥，番茄，蘋果，梨，草莓，胡蘿卜，馬鈴薯，甜菜，山藥，萵苣和菠菜。
11.如權(quán)利要求9的重組細胞，其中，所述植物選自下組小麥，玉米，水稻，大麥，番茄，蘋果，梨，草莓，胡蘿卜，馬鈴薯，甜菜，山藥，萵苣和菠菜。
12.如權(quán)利要求10的重組細胞，其中，所述植物是馬鈴薯。
13.如權(quán)利要求11的重組細胞，其中，所述植物是馬鈴薯。
14.一種重組細胞，包括(a)包括編碼包括一個以上殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的殼多糖酶的第一核苷酸序列的第一重組載體；和(b)包括編碼β-1，3-葡聚糖酶的第二核苷酸序列的第二重組載體。
15.一種重組細胞，包括(a)包括能在嚴格條件下與SEQ ID NO1的核苷酸序列的互補體雜交的第一核苷酸序列的第一重組載體；和(b)包括能在嚴格條件下與SEQ ID NO3的核苷酸序列的互補體雜交的第二核苷酸序列的第二重組載體；其中，所述嚴格條件包括在42℃下，在50％去離子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，100μg/ml變性的鮭魚精子DNA中雜交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗滌；并且，其中，所述第一核苷酸序列編碼功能性殼多糖酶，而所述第二核苷酸序列編碼功能性β-1，3-葡聚糖酶。
16.一種生產(chǎn)抗病原體的轉(zhuǎn)化過的植物的方法，包括(a)用一種重組載體轉(zhuǎn)化植物，該載體包括(i)能在嚴格條件下與SEQ ID NO1的核苷酸序列的互補體雜交的第一核苷酸序列；和(ii)能在嚴格條件下與SEQ ID NO3的核苷酸序列的互補體雜交的第二核苷酸序列，其中，所述嚴格條件包括在42℃下，在50％去離子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，100μg/ml變性的鮭魚精子DNA中雜交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗滌；并且，其中，所述第一核苷酸序列編碼功能性殼多糖酶，而所述第二核苷酸序列編碼功能性β-1，3-葡聚糖酶；和(b)選擇其中表達了第一和第二核苷酸序列的轉(zhuǎn)化過的植物。
17.一種用于生產(chǎn)抗病原體的轉(zhuǎn)化過的植物的方法，包括(a)用第一種重組載體轉(zhuǎn)化植物，該載體包括能在嚴格條件下SEQ ID NO1的核苷酸序列的互補體雜交的第一核苷酸序列；(b)用第二種重組載體轉(zhuǎn)化植物，該載體包括能在嚴格條件下與SEQ ID NO3的核苷酸序列的互補體雜交的第二核苷酸序列；其中，所述嚴格條件包括在42℃下，在50％去離子化甲酰胺，6xSSC，5xDenhardt’s，1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，100μg/ml變性的鮭魚精子DNA中雜交，并且在65℃下用0.1xSSC/0.1％SDS洗滌；并且，其中，所述第一核苷酸序列編碼功能性殼多糖酶，而所述第二核苷酸序列編碼功能性β-1，3-葡聚糖酶；和(c)選擇其中表達了第一和第二核苷酸序列的轉(zhuǎn)化過的植物。
18.如權(quán)利要求16或17的方法，其中，所述病原體是真菌。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中，所述真菌是茄屬絲核菌。
全文摘要
本發(fā)明披露了遺傳修飾過的植物，如馬鈴薯植物。在用包括殼多糖酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細胞之后，所述植物對感興趣的病原體的抗性更高。本發(fā)明還提供了一種提高植物對病原體抗性的方法，該方法包括導(dǎo)入編碼兩種或兩種以上殼多糖－結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蕓薹屬殼多糖酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因，并且表達所述殼多糖酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因。
文檔編號C12N15/56GK1589326SQ02822987
公開日2005年3月2日 申請日期2002年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月20日
發(fā)明者蔡美蓮, 趙開軍 申請人:香港大學(xué)