專利名稱：B組鏈球菌的分子分型的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及B組鏈球菌分型的分子學方法，以及該方法中使用的多核苷酸。
背景技術：
B組鏈球菌(Group B streptococcus，GBS)——無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)——是新生兒及產婦膿毒血癥最常見病因，而且是中老年及免疫缺陷患者敗血癥越來越重要的病因。近年來，由于在分娩期預防性使用抗生素，所以新生兒膿毒癥的發(fā)病已呈下降趨勢，但是該方法帶來了許多問題。將來接種可能是優(yōu)選的手段，而且綴合型多糖GBS疫苗已取得明顯進展。
在引入綴合疫苗前，都需要進行大量的流行病學及其他相關研究，這不僅是評估疾病負荷，也是評估GBS型(包括莢膜多糖基因血清型、血清亞型；蛋白抗原基因亞型；可移動遺傳元件(mobile genetic element)亞型)的分布，以確定疫苗抗原的最佳制劑。根據一個地理學區(qū)域或少數患者進行分型通常是不可行的。需要連續(xù)監(jiān)測，評定GBS疫苗抗原組合對于不同地理區(qū)域不同目標人群的適合度。
現已報道了9種莢膜多糖GBS血清型(Harrison等，1998；Hickman等，1999)。各種分型方法都已被使用，包括免疫沉淀(Wilkinson和Moody，1969)，酶免疫測定(Holm和Hakansson，1988)，共凝集(Hakansson等，1992)，反向免疫電泳，以及毛細管沉淀(Triscott和Davies，1979)，乳膠凝集(Zuerlein等，1991)，熒光顯微鏡(Cropp等，1974)以及抑制ELISA(Arakere等，1999)。這些方法勞動強度大而且需要高滴度的血清型特異性抗血清，這些方法花費大，難以操作，而且只有6個血清型-(Ia到V)實現了商業(yè)化(Arakere等，1999)。分子基因分型方法，例如脈沖場凝膠電泳(Rolland等，1999)，限制性內切酶分析(Nagano等，1991)都可用于流行病學研究，但是通常不能用于鑒定血清型。因此，需要一種可靠的分子學方法用來鑒定GBS血清型。

發(fā)明內容
我們已經從B組鏈球菌的基因組中鑒定出了具有型間序列異質性(inter-type sequence heterogeneity)的特異性區(qū)域，該區(qū)域能夠被用于區(qū)分不同的型(包括莢膜多糖基因血清型、血清亞型；蛋白抗原基因亞型；可移動遺傳元件亞型)。我們已經查明檢測這些序列異質性的方法能夠將B組鏈球菌準確地區(qū)別及分型。
因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種分型B組鏈球菌的方法，該方法包括對所述細菌的cpsD、cpsE、cpsF、cpsG、cpsI/M基因中的一個或多個區(qū)域進行核苷酸序列分析，所述區(qū)域包括一或多個核苷酸，其序列在型與型之間各不相同。
具體而言，所述核苷酸序列可以用于對對應于下列位點的一或多個位點進行分析圖1所示的第62，78-86，138，139，144，198，204，211，281，240，249，300，321，419，429，437，457，466，486，602，606，627，636，645，803，971，1026，1044，1173，1194，1251，1278，1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196位。
優(yōu)選地，至少一個區(qū)域位于下述序列內即所述B組鏈球菌cpsE-cpsF-cspG基因簇中從cpsE基因的3’端第136位堿基與cpsG基因5′端第218位堿基之間的序列。具體而言，所述核苷酸序列可以用于對對應于下列位點的一或多個位點進行分析圖1所示的第1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187以及和2196位。
在一個實施方案中，至少一個區(qū)域位于所述B組鏈球菌cpsI/M基因內。
我們還已查明大量表面抗原基因，包括rib，alp2或alp3基因，以及5個可移動遺傳元件可以用于確定GBS的分子亞型。因此，本發(fā)明還提供了一種對B組鏈球菌進行分型的方法，該方法包括測定所述細菌中是否存在有一個或多個選自rib、alp2或alp3的表面抗原基因，和/或一個或多個選自IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1的可移動遺傳元件。優(yōu)選地，例如將該方法與本發(fā)明上述方法聯用。
核苷酸序列分析步驟可以包括對所述的一個或多個區(qū)域測序?？苫蛘?，或者除此之外，核苷酸序列分析步驟可以包括測定獲自所述細菌的多核苷酸是否與含一個或多個所述區(qū)域的多核苷酸選擇性雜交，優(yōu)選地，測定是否與對應于一個或多個所述區(qū)域的一系列多核苷酸探針選擇性雜交。
一個優(yōu)選實施方案中，將與一系列探針雜交用作分析手段，所述系列多核苷酸探針以微陣列形式存在。
另一實施方案中，核苷酸序列分析步驟包括用一對或多對引物擴增的步驟，這些引物中的至少有一對能與在各型之間有變化的序列特異性雜交。通常，使用的引物對中，至少有一對能與在各型之間有變化的序列特異性雜交。優(yōu)選地，所述引物對選自表2和/或表6和/或表10所示的引物。
第二方面，本發(fā)明提供了一基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，這些核苷酸對應于B組鏈球菌cpsD-cpsE-cpsF-cpsG基因中一區(qū)域，所述多核苷酸中包含一或多個在各型GBS型之間有變化的核苷酸。
優(yōu)選地，所述的在各型GBS型之間有變化的核苷酸對應于下列位點中的一個或多個如圖1所示的第62，78-86，138，139，144，198，204，211，281，240，249，300，321，419，429，437，457，466，486，602，606，627，636，645，803，971，1026，1044，1173，1194，1251，1278，1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196位。
本發(fā)明還提供了一基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，這些核苷酸對應于B組鏈球菌cpsE-cpsF-cspG基因簇中從cpsE基因的3’端第136位堿基到cpsG基因5′端第218位堿基限定的序列中的一區(qū)域，所述多核苷酸中包含一或多個在各型GBS型之間有變化的核苷酸。
優(yōu)選地，上述在各型GBS型之間有變化的核苷酸對應于下列如圖1所示位置中的一個或多個1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196。
本發(fā)明還提供了一基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，這些核苷酸對應于B組鏈球菌cpsI/M基因中的區(qū)域，所述多核苷酸中包含一或多個在各型GBS型之間有變化的核苷酸。
優(yōu)選地，所述多核苷酸選自表2所列的核酸序列。
本發(fā)明進一步提供了一種基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，這些核苷酸對應于B組鏈球菌rib，alp2或alp3基因中的區(qū)域，所述多核苷酸中包含一或多個在各型GBS亞型之間有變化的核苷酸。
優(yōu)選地，所述多核苷酸選自表6所列的核酸序列。
本發(fā)明進一步提供了一種基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，這些核苷酸對應于B組鏈球菌IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和/或GBSi1中的區(qū)域，所述多核苷酸中包含一或多個在各型GBS可移動遺傳元件亞型之間有變化的核苷酸。
優(yōu)選地，所述多核苷酸選自表10所列的核酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸可用于B組鏈球菌的分型方法，例如血清分型和/或亞分型。
第三個方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明第二個方面所述一系列多核苷酸的組合物。該組合物可用于B組鏈球菌的分型方法，例如血清分型和/或亞分型。
第四個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明提供了包含本發(fā)明第二個方面所述一系列多核苷酸的微陣列。該微陣列可用于B組鏈球菌的分型方法，例如血清分型和/或亞分型。
發(fā)明詳述除非另有說明，本發(fā)明所有技術和科學術語都與本領域普通技術人員通常理解的含義相同(如細胞培養(yǎng)，分子遺傳學，核酸化學，雜交技術及生物化學)。常規(guī)技術用于分子、遺傳學和生物化學方法(通常參見，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd ed.(2001)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4thEd，John Wiley&Sons，Inc.-以及名稱為Current Protocols in Molecular Biology的全部版本，在此引入作為參考)以及化學方法。
本發(fā)明的分子分型方法的基礎是檢測樣本中是否含有特異性多核苷酸序列，這些序列存在于已經我們鑒定的型與型之間各不相同的B組鏈球菌(GBS)基因組區(qū)域中。
更具體地說，所檢測的特異性多核苷酸序列存在于GBS的cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，cpsI，cpsM，rib，alp2和/或alp3基因以及可移動遺傳元件IS861，IS1548和IS1381，ISSa4和GBSi1，優(yōu)選為cpsD，cpsE，cpsF，cpsG和/或cpsI/M基因。
上述那些基因中的目的區(qū)域是那些其序列在兩個或多個型之間各不相同的區(qū)域，即異質性的。異質性是由于不同型的相應區(qū)域之間的插入、缺失和/或取代。就rib，alp2和alp3而言，異質性通常是全基因存在或缺乏的形式。類似地，元件IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1的異質性通常也是全序列存在或缺乏的形式。
異質性的特異性區(qū)域包括下列位置cpsD基因-62和78-86；cpsD-cpsE基因間隔區(qū)-138，139和144；cpsE基因-198，204，211，281，240，249，300，321，419，429，437，457，466，486，602，606，627，636，645，803，971，1026，1044，1173，1194，1251，1278，1413，1495，1500，1501，1512，1518和1527；cpsF基因-1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892和1971；以及cpsG基因-2026，2088，2134，2187和2196(編號對應于圖1中的編號)。
具體優(yōu)選的目的位點位于cpsE-cps-F-cpsG的790bp片段(該片段由大約cpsE的3’端第136位堿基至cpsG的5′端第218位堿基組成)，即圖1中所示的位點1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196。
另一個異質性區(qū)域是cpsD的第62位以及GBS的某些而非全部血清型中從第78至第86位的一段重復序列(TTACGGCGA)。
異質性的特異性區(qū)域還包括圖3描繪的序列比對中所示的cpsI/M基因中的眾多位置。
這些異質性區(qū)域可以用多種不同方法分析，包括測序、PCR和標記探針的結合就為鑒定血清型而進行的測序而言，選擇的測序引物是那些能與位于存在異質性區(qū)域內或附近的區(qū)域特異性雜交的引物。由于用于測定分子血清型的測序過程中獲得的實際序列信息，所述引物無需特異性針對具體的血清型。因此該引物能特異性雜交所有GBS血清型(至少是血清型Ia至VII)，或者特定的血清型。
優(yōu)選引物在圖1所示的cpsE-cpsF-cpsG的790bp區(qū)域中長度為100、50或20個連續(xù)核苷酸的異質性位置處退火。合適的測序引物的實例見表2(cpsES3，cpsFA，cpsFS，cpsGA和cpsGA1)。
PCR和其他以特異性雜交為基礎的分型方法通常包括使用核苷酸引物/探針，該引物/探針能特異性結合GBS血清型基因組的區(qū)域，該區(qū)域中包含在兩個或多個血清型間不同的核苷酸。因此，所述引物/探針可以包含與所述區(qū)域之一互補的序列。當異質性位置靠在一起時(例如，cpsE中的第198、204、211和218位)，可以使用能與含兩個或多個異質性位置的GBS基因組區(qū)域特異性雜交的引物/探針。因此，例如可以設計出與cpsE中第195至220位核苷酸互補的引物/探針。所述引物/探針具有更高的特異性并減小了錯配的可能。
基于PCR的檢測方法離不開引物對的使用，其中至少一個引物對能特異性結合一個或多個血清型，而非所有血清型。除非兩引物均能結合，否則無法得到PCR產物。因此，特異性PCR產物的存在與否可以用于測定特定GBS血清型標記性序列的存在。但是，如上所述，只需要一個引物對應于目的基因(例如，cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，cpsI和/或cpsM基因)中的異質性區(qū)域。另一引物可以結合到所述基因的保守區(qū)域或異質性區(qū)域或者甚至GBS基因組另一部分異質性區(qū)域，例如cpsH基因，所述區(qū)域在血清型之間既可以是保守的也可以是異質性的。因此，例如，可以下述兩引物的組合來區(qū)別血清型(Ia和III)一引物(cpsGS)結合cpsG基因中包含2172～2210位的區(qū)域，一引物結合cpsH基因中的異質性區(qū)域(lacpsHA1，IIIcpsHA)。
另外，可以將結合cpsI異質性區(qū)域的引物與結合cpsG保守區(qū)域的引物聯用。這樣的引物的實例有引物對VIcpsIA和cpsGS1，它們擴增出一長度為1517bp的PCR產物且為GBS血清型VI特異性。
或者，也可使用能與GBS基因組中位于長度在各血清型之間有變化的區(qū)域兩側的保守區(qū)域結合的引物。這種情況下，GBS細菌存在就能得到PCR產物，而該PCR產物大小在各血清型之間有變化。
另外，可以將單個或兩個都特異性結合的引物與PCR引物長度變化結合用作鑒定具體分子血清型的手段。
以cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，cpsI或cpsM基因為靶標的特異性引物/探針的實例包括下列引物cpsDS GCA AAA GAA CAG ATG GAA CAA AGT GGcpsES CTT TTG GAG TCG TGG CTA TCT TGcpsEA1 GA/T/GA AAA AAG GAA AGT CGT GTC G/ATT GcpsES1 CTT GGA C/TTC CTC TGA AAA GGA TTGcpsEA2 AAA A/CGC TTG ATC AAC AGT TAA GCA GGcpsES2 GAT GGT/C GGA CCG GCT ATC TTT TCT CcpsEA3 CTT AAT TTG TTC TGC ATC TAC TCG CcpsES3 GTT AGA TGT TCA ATA TAT CAA TGA ATG GTC TAT TTG GTCAGcpsEFA CCT TTC AAA CCT TAC CTT TAC TTA GCcpsFS CAT CTG GTG CCG CTG TAG CAG TAC CAT TcpsFA GTC GAAcpsGS1 GAA CTC TTA CATGAA AGA AGC TGA GAT TGT TAT CAC ACIbcpsIA CTA TCA ATGAAT GAG TCT GTT GTA GGA CGG ATT GCA CGIbcpsIS GATAAT AGT GGAGAA ATT TGT GATAAT TTA TCTCAA AAAGAC GIbcpsIA1 CCT GAT TCA TTG CAGAAG TCT TTA CGA TGC GAT AGGTGIVcpsMA GGG TCA ATT GTA TCG TCG CTG TCA ACA AAA CCA ATCAAATCVcpsMA CCC CCC ATA AGT ATAAAT AAT ATCCAA TCT TGC ATA GTCAGVlcpsIA GAA GCAAAG ATT CTA CAC AGT TCTCAA TCA CTA ACT
CCGcpsIA GTATAA CTT CTA TCA ATG GAT GAG TCT GTT GTA GTA CGG這些引物的命名與表2中所列引物相對應。
涉及alp2，alp3和rib表面蛋白抗原基因，異質性和蛋白抗原基因亞型更多在B組鏈球菌是否含有所述基因的水平上進行測試。我們的結果表明GBS基因組中出現表面蛋白基因的特異性結合是血清型/血清亞型的標記(見表9)。因此，適于本發(fā)明方法的引物/探針是特異性針對具體基因的。因此，優(yōu)選特異性針對alp2或alp3或rib的探針/引物。圖4給出的是用于設計alp2特異性或alp3特異性引物的alp2與alp3的對齊。
以alp2，alp3和rib基因為靶標的特異性引物/探針的實例包括下列引物bcaS1 GGTAAT CTTAAT ATT TTTGAA GAG TCA ATA GTT GCT GCATCTACbcaS2 CCAGGGA GTG CAG CGA CCTTAA ATACAA GCA TCbalS GAT CCTCAA AAC CTC ATT GTA TTAAAT CCA TCA AGC TATTCbbalA CCA GTTAAG ACT TCA TCA CGA CTC CCA TCA Cbal23S1 CAG ACT GTT AAA GTG GATGAA GAT ATT ACC TTT ACG Gbal23S2 CTT AAA GCTAAG TATGAA AAT GAT ATC ATT GGA GCT CGTGbal2S CTT CCG CCA GAT AAA ATTAAGbal2A CTG TTG ACT TAT CTG GAT AGG TCbal2A1 CGT GTT GTTCAA CAG TCC TAT GCT TAG CCT CTG GTGbal2A2 GGT ATC TGG TTT ATG ACC ATT TTT CCA GTT ATA CGbal3S GTT CTT CCG CTTAAG GAT AGbal3A GAC CGT TTG GTC CTT ACC TTT TGG TTC GTT GCT ATC C
ribS2 GAAGTAATTTCAG GAA GTG CTG TTA CGTTAA ACACAA ATATGribA1 GAA GGT TGT GTG AAATAA TTG CCG CCT TGC CTA ATGribA2 AAT ACT AGC TGC ACCAAC AGT AGTCAA TTC AGA AGG這些引物的命名與表6中所列引物相對應。
涉及IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1時，異質性和亞型更多在B組鏈球菌是否含有所述元件的水平上進行測試。也可對元件的數目進行測定。我們的結果表明GBS基因組中出現的可移動元件結合是血清型/血清亞型的標記(見表12)。因此，適于本發(fā)明方法的引物/探針是特異性針對具體可移動遺傳元件的。因此，優(yōu)選特異性針對IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1的探針/引物。
以IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1基因為靶標的特異性引物/探針的實例包括下列引物IS861S GAG AAA ACA AGA GGG AGA CCG AGT AAA ATG GGACGIS861A1 CAC GAT TTC GCA GTT CTAAAT AAA TCC GAC GAT AGC CIS861A2 CAA ACT CCG TCA CAT CGG TAT AGC ACT TCT CAT AGGIS1548S CTA TTG ATG ATT GCG CAG TTGAAT TGG ATA GTC GTCIS1548S1 GTT TGG GAC AGG TAG CGG TTG AGG AGA AAA GTA ATGIS1548A1 CAT TAC TTT TCT CCTCAA CCG CTA CCT GTC CCAAACIS1548A2 CCCAAT ACC ACGTAA CTT ATG CCA TTT GIS1548A3 CGT GTT ACG AGT CAT CCC AAT ACC ACG TAA CTT ATGCCIS1381S1 CTT ATG AAC AAA TTG CGG CTG ATT TTG GCA TTC ACGIS1381S2 GGC TCA GGC GAT TGT CAC AAG CCA AGG GAGIS1381A CTA AAA TCC TAG TTC ACG GTT GAT CAT TCC AGCISSa4S CGT ATC TGT CAC TTA TTT CCC TGC GGG TGT CTC CISSa4A1 GCC GAT GTC ACA ACA TAG TTC AGG ATA TAG CCA G
ISSa4A2 CGT AAA GGA GTC CAA AGA TGA TAG CCT TTT TGA ACCGBSi1S1 CAT CTC GGA ACA ATA TGC TCG AAG CTT ACA AGC AAGTGGBSi1S2 GGG GTC ACT ATC GAG CAG ATG GAT GAC TAT CTT CACGBSi1A1 AAT GGC TGT TTC GCA GGA GCG ATT GGG TCT GAA CCGBSi1A2 CCA GGG ACA TCA ATC TGT CTT GCG GAA CAG TAT CG優(yōu)選地，所述引物/探針包括至少10、15或20個核苷酸。通常，引物/探針由少于100，50或30個的核苷酸組成。引物/探針通常是包括脫氧核苷酸的多核苷酸。它們也可以是其中含有合成或修飾核苷酸的多核苷酸。不同類型的寡核苷酸修飾方法已為本領域已知。這些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯骨架，在分子3′和/或5′末端附加吖啶鏈或聚賴氨酸鏈。就本發(fā)明的目的而言，應當理解的是本申請所述的多核苷酸可以用本領域任一已知方法修飾。引物/探針可用任一合適的可檢測標記物標記，例如放射性原子、熒光素分子或生物素。
一個實施方案中，引物/探針的解鏈溫度＞70℃所以可用于快速PCR循環(huán)。
含有用于分析cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，或cpsI/M中一個或多個區(qū)域的眾多核苷酸的組合物還可進一步包括用于分析cpsH基因中一個或多個區(qū)域的核苷酸。實施例中描述了合適的核苷酸，盡管本領域技術人員可以根據圖3所示的序列對齊設計出其他合適序列。
另外，含有用于分析alp2，alp3或rib中一個或多個區(qū)域的眾多核苷酸的組合物還可進一步包括用于分析Cα(bca)和Cβ(bac)基因(Cβ基因又稱bag)中一個或多個區(qū)域的核苷酸。
大量的技術手段都可用于分析目的細菌基因組中的一個或多個區(qū)域。通常，對疑似含有GBS細菌的目的樣本進行處理，用常規(guī)技術從樣本中存在的任一微生物獲得基因組DNA。期望使用核酸制備技術使基因組DNA基本片段化用于眾多后續(xù)檢測步驟。樣本可以出自細菌培養(yǎng)物或患者的臨床樣本，典型的為人類患者?？梢詫⑴R床樣本培養(yǎng)制備細菌培養(yǎng)物。但是，也可以用培養(yǎng)步驟直接測試臨床樣本。
然后，將基因組DNA應用到一個或多個分析步驟，包括測序、酶促、擴增和/或雜交。這些DNA分析的常規(guī)技術為本領域已知，詳細描述見Sambrook等2001和Ausubel等1999同上。
血清分型包括一個或多個步驟。例如，執(zhí)行初始步驟測定樣本中是否存在有這樣的核苷酸序列，即保守存在于GBS血清型但未發(fā)現于任一其他生物體的核苷酸序列。這可通過使用檢測任一(但只檢測)GBS細菌的PCR引物來實現(例如，使用引物對Sag59/Sag190和/或DSF2/DSR1-參見表2和3)。
然后通過下述操作對特定GBS血清型進行分子血清分型用以上述引物/探針為基礎的任一合適技術例如測序、酶促、擴增和/或雜交，檢測目的區(qū)域中一個或多個異質性區(qū)域的存在。
具體優(yōu)選的檢測技術為PCR，例如快速循環(huán)PCR(Kong等，2000)。
圖2給出了多步驟血清分型策略的一個實例(算法)。但是，可以設想出多種其他策略，并且本領域技術人員使用本申請中提供的序列異質性信息能夠設計出來。具體而言，優(yōu)選血清學分型方法包括至少一個以分析cpsD，cpsE，cpsF，cpsG和/或cpsI/M基因一個或多個區(qū)域為基礎的分析步驟。該分析可以任選與對cpsH基因一個或多個區(qū)域的分析結合。類似的技術可用于分析cpsH基因區(qū)域，方法在實施例中也有描述。
alp2，alp3和/或rib基因存在與否的分析可任選與Cα(bca基因)，Cβ(bac)基因序列存在與否的分析結合，描述見實施例。類似技術可用于分析這些區(qū)域，合適引物序列及PCR方法在實施例中也有描述。
此外，alp2，alp3和/或rib基因(以及任選bca和bac基因)存在與否的分析可與可移動遺傳元件存在與否的分析結合進行。
因此，一種分型策略涉及以不同組合分析cps基因、表面蛋白基因和/或可移動遺傳元件提供更多分型及亞分型信息。
使用上述技術對GBS基因組序列的分析可以在用凝膠電泳等方法常規(guī)判定后于溶液中進行。但是，在本發(fā)明一優(yōu)選方面，所述引物/探針被固定于固相支持物上形成陣列。
通常，所述多核苷酸固定于固相支持物上或者固相支持物的離散區(qū)域(discrete regions)內。所述支持物可以是多孔性從而固定于支持物內部，或者也可是非多孔性的，這種情況下探針通常固定于支持物表面。合適固相支持物的實例包括玻璃平面(例如硼硅酸鹽玻璃(borosilicateglass))，硅晶片，云母，陶磁及塑料等有機聚合物，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯。還可使用半透膜如來源廣泛的硝酸纖維素或尼龍膜。可以將所述半透膜糊表在一更堅固的固相表面如玻璃上。所述表面可任選包被一層金屬，例如金、鉑或其他過渡金屬。
優(yōu)選地，所述固相支持物通常為一具有剛性或半剛性表面的材料。優(yōu)選實施方案中，所述支持物的至少一個表面基本上是平的，盡管在一些實施方案中，希望不同聚合物上具有物理學上分隔的合成區(qū)域，例如突起區(qū)域或蝕刻的凹槽。另外優(yōu)選固相支持物適于將DNA序列高密度應用于通常為50～100μm的離散區(qū)域，密度為10000～40000cm-2。
所述固相支持物要便于分隔成區(qū)。這可用光刻等技術，或者用疏水墨水如特氟綸墨水(Cel-line，USA)。每一不同探針位于其中的離散位置可為任一便利性狀，例如，圓形、矩形、橢圓形、楔形等。
可將文庫序列以共價或非共價方式附加于支持物。所述文庫序列借助與其結合的一層分子附加于支持物。例如，所述探針可用生物素標記，底物用親和素和/或鏈霉親和素標記。使用生物素標記探針的便利特點是偶聯于支持物的效率可以很容易地測定出來。由于所述多核苷酸探針與一些支持物只是微弱結合，所以往往需要在固相支持物(例如玻璃)和探針之間提供一中間面。因此，支持物表面可通過下述操作，例如，用增強或減弱疏水度的化合物包被，或者用可共價連接多核苷酸探針的化合物包被。一些化學包被層可同時既改變疏水度又實現共價連接。固相支持物疏水度可通過硅烷處理或本領域已知的其他處理方法很容易地實現。合適的化學包被物的實例包括聚賴氨酸及聚(乙烯亞胺)。附加方法的其他細節(jié)見美國專利No.6,248,521。通過向分子引入不同官能團來固定核酸的方法描述還可見Bischoff等，1987(Anal.Biochem.，164336-3440和Kremsky等，1987(Nucl.Acids Res.152891-2910)。
用于制備固定的核酸分子陣列的技術在本領域已有描述。Schenaetal.，1998，Tib Tech 16301-306，提供了有用的綜述，該文中還提供了其中所述技術的參考文獻。
微陣列制備技術分為兩大類——合成和分配。合成方法中，微陣列是通過核酸原位合成從生化組成部件逐步制備而成。隨著每一輪的合成，核苷酸被添加到延長著的鏈上直至達到期望的長度。大量現有技術方法描述了如何原位合成單鏈核酸分子文庫，例如用掩蔽技術(影印石版術)在固相支持物各個離散位置建立不同的序列排列。美國專利No.5,837,832描述了一種制備DNA陣列的改進方法，該方法根據極大規(guī)模積集化技術將DNA陣列固定在硅支持物上。具體而言，美國專利No.5,837,832描述了一種稱之為″蓋板″的技術在支持物空間特定位置處合成成套特異性探針，可用該技術制備本發(fā)明所述的固定的DNA文庫。美國專利No.5,837,832還提供了還可使用的早期技術的參考文獻。
相反，分配技術利用制備好的生化物質的外源沉積作用制備芯片結構。例如，可將DNA直接噴涂到支持物上，例如使用裝有大頭針的機器人裝置(機械微量點樣)或者使用壓電裝置(噴墨)。在機械微量點樣中，生化樣本通過毛細管作用裝入點樣大頭針，通過大頭針和固相支持物間的物理接觸微小體積被轉移到固相表面上。在第一個點樣循環(huán)后，清洗大頭針，裝入第二樣本，點積于鄰近地址。機器人控制系統(tǒng)和多元墨頭使得自動微陣列結構得以實現。噴墨涉及將生化樣本上樣，如將多核苷酸加入一裝有壓電裝置的微型噴嘴，然后用電流將精確量的液體從噴嘴噴射到支持物上。第一個噴涂步驟后，清洗噴嘴，然后加入第二樣本并點積到鄰近地址。多個噴嘴的重復系列循環(huán)使得微陣列能夠快速制成。
在一個實施方案中，所述微陣列是一種高密度陣列，其中包括多于約50，優(yōu)選多于約100-200個不同核酸探針。所述高密度探針包括的探針密度大于約50，優(yōu)選大于約500，更優(yōu)選大于約1,000，最優(yōu)選大于約2,000個不同核苷酸探針/cm2。所述陣列可進一步包括錯配對照探針和/或標準探針(如陽性對照)。
本發(fā)明的微陣列通常包括眾多上述引物/探針。所述引物/探針以任一秩序組合于陣列。但是，希望根據型(莢膜多糖基因血清型、血清亞型；蛋白抗原基因亞型；可移動遺傳元件亞型)，或者型的組(莢膜多糖基因血清型、血清亞型；蛋白抗原基因亞型；可移動遺傳元件亞型)，將特異性針對其的引物/探針分組。所述分組的排列要使得到的模式是易于被電腦軟件是別的模式。
陣列中的元件可以包括一種類型的探針/引物或多種不同類型的引物/探針。
GBS基因組DNA與固定的引物/探針結合的檢測可用多種技術來完成。例如，可以用特異性針對多種型(莢膜多糖基因血清型、血清亞型；蛋白抗原基因亞型；可移動遺傳元件亞型)的固定探針作為俘獲探針。在基因組DNA與陣列結合后，洗滌陣列并用一種或多種標記可檢測探針孵育，該探針能與GBS基因組中的保守區(qū)域特異性雜交。然后可以通過檢測標記物的存在來測定這些檢測探針的結合情況。例如，所述標記物可以是熒光標記物，所述陣列可置于電荷耦合器件(CCD)攝像機的X-Y閱讀器下。
其它技術包括在與陣列接觸前標記基因組DNA(例如用切口翻譯(nick-translation)及標記的dNTPs)。然后可以直接檢測基因組DNA的結合情況。
還可以使用標記的dNTPs進行一步PCR擴增。該實施方案中，基因組DNA與陣列中的第一引物結合。聚合酶、dNTPs包括一些標記的dNTPs以及第二引物的加入導致合成出PCR產物中摻入了標記核苷酸。然后檢測俘獲到平板上的標記PCR片段。
大量現有的檢測技術無需標記物而是依賴于配體結合時的質量變化(例如，表面等離子體激光共振(surface plasmon resonance，SPR))。SPR的原理和SPR所需使用的固相支持物的類型(例如BIACore芯片)描述見Ausubel等，1999，同上。
C.用途如上所述，B組鏈球菌(GBS)——無乳鏈球菌——是新生兒及產婦膿毒血癥最常見病因，而且是中老年及免疫缺陷患者敗血癥越來越重要的病因。因此，本發(fā)明所述的檢測方法、探針/引物及微陣列可用于診斷孕婦、老年人和/或免疫缺陷患者的GBS感染。本發(fā)明的PCR和微陣列技術可具體用于孕婦的妊娠前常規(guī)檢查以及孕婦感染的診斷，并且與傳統(tǒng)鑒定和分型方法相比精確度和靈敏度都有提高。由于不需要培養(yǎng)臨床樣本獲得足量材料所有這些方法還可得到更為快速的結果。另外，所述分子技術可用于大多數實驗室無需專家的專門意見和試劑。
本發(fā)明的分子分型方法有助于用于流行病學調查及需要在引入GBS偶聯疫苗前后監(jiān)測GBS分離株其它研究的全面菌株鑒定。
現在結合下列實施例對本發(fā)明做更為詳細的描述，這些實施例只是為了說明而無任何限制。這些實施例中涉及附圖。


圖1.根據cpsD-cpsE-cpsF 3′-末端和cpsG 5′-末端的異質性序列而進行的分子血清型鑒定(相關引物如圖所示)。
圖2.通過PCR和測序進行GBS分子血清型(MS)鑒定的算法。
圖3.血清型Ia，Ib，II，III，IV，V和VI的cpsG-cpscpsI/M基因序列的多序列對齊(起始和終止密碼子用粗體突出顯示)。
圖4.alp2(AF208158，上面一行)和alp3(AF291065，下面一行)之間用于區(qū)別二者的兩個序列異質性位點(*)(相關引物如圖所示)。
圖5.194株(或56個基因型)侵襲性澳大利亞GBS株的遺傳親緣關系。
題頭為“GBS基因型的遺傳標記”一欄的注解蛋白抗原基因譜的代號為″A″bca的5′末端陽性；″a″或″as″bca重復單元或bca重復單元樣區(qū)域陽性，分別帶有多個或單個擴增子條帶；″B″bac陽性；″R″rib陽性；″alp2″alp2陽性；″alp3″alp3陽性；″None″不含有上述蛋白基因的分離株。
粗體字顯示的分子標記表明每一簇的共同特征。
題頭為“菌株序號”一欄的注解″+″后是CSF分離株的數目，其余為血液分離株題頭為“基因分型”一欄的注解每一基因型的特征在于cps基因、蛋白基因譜及可移動遺傳元件的獨一無二組合。每一血清型中的主導基因型命名為該血清型的“1”基因型。
樹狀圖的注解在距離約16處，56個基因型分成為8個簇(1-8)；在距離約22.5處，這56個基因型分為3個簇組(A，B，C)。
實施例材料和方法GBS參照株和臨床分離株一組9個GBS血清型(從Ia到VIII)由Channing Laboratory，BostonUSA的Lawrence Paoletti博士友情惠贈(標準組1)。StreptococcusReference Laboratory，at ESR，Wellington，New Zealand的Diana Martin博士提供了另一組9個國際標準GBS型株包括從血清型Ia到VI(標準組2)(表1)。此外，我們測試了205個臨床病例的分離株，其中146個已由新西蘭不同實驗室血清分型，另59株來自悉尼一診斷實驗室正常情況下10年多無菌位點。然后混合為一個培養(yǎng)物，對206個不同分離株進行測試。傳統(tǒng)血清分型(CS)在Streptococcus Reference Laboratory，at ESR，Wellington，New Zealand中進行，MS在Centre for Infectious Diseases andMicrobiology Laboratory Services，ICPMR，Sydney，Australia中進行。
對這兩組GBS參照株和選取的63個臨床分離株進行更詳細的研究，對每一株測序＞2200堿基對(bp)鑒定出用于MS的合適序列。然后，用這些及剩余臨床分離株評價MS方法，并與CS進行結果比較。起初在互不知道結果的情況下用兩種方法分型。
通過血瓊脂平板(ColumbiaII基礎瓊脂添加5％馬血)亞培養(yǎng)從保存物中回收細菌分離株，然后37℃下孵育過夜。
侵襲性GBS臨床分離株可移動遺傳元件試驗中使用的所有194個分離株都回收自191個患者的血液(177)或CSF(17)(107個女性，80個男性，4個未記錄性別；三個培養(yǎng)物每一含有兩個GBS血清型的混合生長)。108分離株出自1996-2001期間提交到Centre for Infectious Diseases and MicrobiologyLaboratory Services，ICPMR，Sydney，Australia的培養(yǎng)物標本，83來自Institute of Environmental Science and Research(ESR)，Porirua，Wellington，New Zealand for serotyping，來源于1994-2000期間新西蘭不同診斷實驗室。
患者按下列年齡段分組進行基因型分布分析新生兒早期(0-6天)；新生兒晚期(7天～3月)；嬰兒和兒童(4月-14歲)；青少年(15-45歲)；中年(46-60歲)；老年(＞60歲)。
這些分離株大部分是上述分離組的一部分，但是參照株和非侵襲性分離株除外。
傳統(tǒng)血清分型(CS).
CS用常規(guī)方法進行(Wilkinson和Moody，1969)。簡而言之，從每一分離株制備酸-熱(56℃)提取物，在瓊脂糖中用型特異性抗血清免疫沉淀測定血清型。當沉淀發(fā)生時形成與對照株特征性的沉淀線時則可認為該分離株是特定血清型特異性的。用兔ESR制備所使用的抗血清型Ia，Ib，Ic，II，III，IV，V和R蛋白抗原的抗血清。選擇14株分離株，其中六株用抗血清型I-V的抗血清無法分型，六株在最初在CS和MS間出現矛盾結果，另外兩個是來自混合培養(yǎng)物的獨立分離株，這些分離株都由Central Public Health Laboratory，Colindale，London，UK的AbbieWeisner和Androulla Efstratiou博士友情用抗全部血清型的抗血清進行了測試。
分子血清型鑒定(MS)；方法的建立。
寡核苷酸引物本實驗使用的寡核苷酸引物、及其靶標位點和解鏈溫度顯示于表2、6和10。其特異性和擴增子的預期長度顯示于表3、7和11。所述引物按照我們的說明由Sigma-Aldrich(Castle Hill NSW，Australia)合成。用4個此前已公開的寡核苷酸引物和我們新設計的一系列引物對名稱為16S/23S rRNA基因間區(qū)和部分cps基因簇的目的基因測序，或者擴增GBS血清型的獨一無二序列。用6個此前已公開的寡核苷酸引物和我們新設計的一系列引物對GBS表面蛋白的編碼基因進行測序和/或特異性擴增。我們還設計了一系列引物對已知的GBS可移動遺傳元件進行測序和/或特異性擴增。將一些引物設計為高解鏈溫度(＞70℃)用于快速循環(huán)PCR。
DNA制備及聚合酶鏈反應(PCR)用接種環(huán)從5個單個GBS克隆或一系列培養(yǎng)物取樣，并重懸于裝有1ml消化緩沖液(10mM Tris-HCI，pH8.0，0.45％ Triton X-100和0.45％Tween 20)的2ml Eppendorf管。然后將裝有GBS懸液的管100℃加熱10分鐘(dry block heater或水浴)后冰上驟冷，然后14,000rpm離心2分鐘得到細胞碎片沉淀。含提取DNA的每一上清各取5μl用作PCR模板(Mawn等，1993)。
使用此前描述的PCR系統(tǒng)(25μl只檢測用，50μl用于檢測和測序)(Kong etal.，1999)。使用的變性、退火和延伸溫度及時間分別為96℃1秒，55-72℃(根據引物的Tm值或按此前描述)1秒以及74℃1-30(根據擴增子的長度而定)，共35個循環(huán)。
取10μl PCR產物，在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，凝膠用0.5μg溴化乙錠/mL染色。對于檢測和/或血清型鑒定而言，當紫外線透視顯示出預期長度PCR擴增子則可判定為陽性。就測序而言，取PCR產物40μl用聚乙二醇沉淀法進一步純化(Ahmet等，1999)。
測序PCR產物的測序使用Applied Biosystems(ABI)Taq DyeDeoxy終止子循環(huán)，測序試劑盒按常規(guī)操作進行。用相應的擴增引物或內引物作為測序引物。
多序列對齊及序列比對多序列對齊用Pileup和Pretty程序在Multiple Sequence Analysisprogram group中完成。序列比對使用Comparison program group中的Bestfit程序。所有程序由WebANGIS，ANGIS(Australian NationalGenomic Information Service)提供，第3版。
表面蛋白基因譜代號根據使用不同引物對得到的陽性PCR結果給每一分離株一個蛋白基因譜代號，如表7所示。
核苷酸序列的等記號公開的新序列數據已經提交給GenBank核苷酸序列數據庫，并分配給了下列等記號AF291411-AF291419(來自標準組1中從Ia到VIII的血清型的16S/23SrRNA基因間區(qū))；AF332893-AF332917，AF363032-AF363060，AF367973，AF381030和AF381031(兩組參照株的部分cps基因簇(表)以及選擇的有代表性的臨床分離株)；AF367974(部分bac基因序列，帶有來自分離株的插入序列IS1381)，AF362685-AF362704(所有bac陽性分離株的部分bac基因序列)以及AF373214(參照株Prague25/60的部分rib樣基因，一種R蛋白參照株)。
本申請中提到的此前報道的序列數據出現于GenBank核苷酸序列數據庫，具有下列等記號AB023574(16S rRNA基因)；U39765，L31412(16S/23S rRNA基因間區(qū))；X68427(口腔鏈球菌23S rRNA基因)；X72754(cfb基因)；AB028896(血清型Ia的cps基因)；AB050723(血清型Ib的部分cps基因)；AF163833(血清型III的cps基因簇)；AF355776(血清型IV的cps基因)；AF349539(血清型V的cps基因簇)；AF337958(血清型VI的cps基因簇)；M97256(bca基因)；X58470，X59771(bac基因)；U58333(rib基因)；AF208158(alp2基因)″AF291065-AF291072(alp3基因)；AF064785(IS1381)；M22449(IS861)；Y14270(IS1548)；AF064785(IS1381)；AF165983(ISSa4)；和AJ292930(GBSi1)。
統(tǒng)計學分析及系統(tǒng)樹圖.
使用SSPS版本11軟件進行統(tǒng)計學分析。用SSPS版本11軟件中的Average Linkage(組與組之間)及Hierarchical簇分析制成系統(tǒng)樹圖。每一標記物的存在與否-MS Ia，Ib，II，IV-VI；sst III-1-4；pgp″A″，″R″，″a″，″as″，″alp2″，alp3″；bac亞組1，1a，2，3，3a，3b，3c，4，4b，5a，7，7a，8，9，9a，10，n1，n2；以及mge IS1381，IS861，IS1548，ISSa4，GBSi1——都被包括在分析之中。每一基因型的特征在于分子血清型(MS)或sst、pgp及mge的獨一無二結合。
實施例1.GBS基因組中特定區(qū)域血清型/血清亞型間或內序列異質性研究以及分子血清分型/血清亞分型穩(wěn)定性的評估聚合酶鏈反應除兩個外，所有GBS特異性引物對從所有參照株及所測試臨床分離株都產生了預期大小的擴增子(表3)。例外的兩個引物對是Sag59/Sag190和CFBS/CFBA。這兩個引物對都是以cfb基因為目標，盡管進行了多次重復嘗試，但是都沒有從一臨床分離株中擴增出擴增子。我們認為要么是該分離株不含有cfb基因，要么是該基因以變體的形式存在。此前已有教導以cfb基因為靶標的PCR不能鑒定全部GBS分離株(Hassan等，2000)，而且另一以16SrRNA基因為基礎的引物對，DSF2/DSR1(Ahmet等，1999)并不是完全特異性的。因此，在該研究中，我們使用這兩個引物對(DSF2/DSR1和Sag59/Sag190)證實所有分離株都是GBS。16S/23S rRNA基因間區(qū)的序列異質性對標準組1中血清型Ia到VIII的16S/23S rRNA基因間區(qū)測序。多個序列對齊表明血清型間只有兩個位點不同207(血清型V是T或C[T/C]，血清型VII和VIII是C，其他為T)和272(血清型III是T，其他為G)。因此這些區(qū)域適于MS。
cpsD-cpsE-cpsF 3′末端和cpsG 5′末端的序列異質性使用以cpsD-cpsE-cpsF 3′末端和cpsG 5′末端為目標的一系列引物，我們對從兩標準菌組株(血清型Ia到VII)以及選取的63個臨床分離株擴增出2226或2217bp——這取決于一段9堿基重復序列出現與否，并測序。將有代表性序列提交GenBank。標準組菌株的GenBank登記號見表1。
重復序列我們在大多數MS Ia和II，一些MS III，所有MS IV、V和VII的cpsD3′末端區(qū)域發(fā)現了一段9堿基重復序列(TTA CGG CGA)，但是檢測的MSIb或VI無一株出現該序列(表4)。該重復序列出現與否可以被用來進一步亞分型MSIa，II和III(參見下文)。
血清型內的異質性通常，血清型內的異質性很低——在除MSIII外所有血清型一些分離株中有著極少量隨機變異，MSIII的血清型內異質性較為復雜。根據22個位置處——第62，139，144，204，300，321，429，437，457，486，602，636，971，1026，1194，1413，1501，1512，1518，1527，1629，和2134位——的異質性以及上述重復序列出現與否(在第78-86位)，MSIII可分為4個序列亞型(表4)。
在60個MSIII分離株(58個臨床分離株和2個參照株)中，主要為血清亞型III-1(30個分離株)和III-2(22個分離株)。所述重復序列出現于血清亞型III-1但不出現于III-2；在其他7個位點(139，144，204，300，321，636，和1629)有差異。
有5個分離株屬于血清亞型III-3，其中含有所述重復序列，在3個可變位點處(139，144，和300)與血清亞型III-1相同，在4個位點處(204，321，626和1629)與血清亞型III-2相同。血清亞型III-3在7個位點處(486，1026，1413，1512，1518，1527，和2134)不同于血清亞型III-1和III-2.血清亞型III-3中的這7個位點與MS Ia中相應位點相同。
有3株血清亞型III-4分離株，其序列與MSII相應序列幾乎相同。唯一的區(qū)別是第437位，在該處血清亞型III-4的核苷酸是T(MSVII也是如此)，而MS II中是C。該區(qū)別可用于(結合PCR，見下文)區(qū)分血清亞型III-4和MSII。血清亞型III-4分離株中有兩株含有所述重復序列，另一株沒有。由于血清亞型III-4分離株的數目很少，我們沒有使用重復序列對其進一步亞分型。
血清型間的異質性在8個MS之間有56個異質性位點(表4)。PCR/測序進行MS最適用的位點是最靠近3′末端區(qū)域的一組23個位點(表4，圖1)。首先，它們在兩組參照株及大多數臨床分離株中是一致的(只有少數血清亞型III-3和III-4分離株例外，見下文)。其次，它們相對集中于790bp區(qū)域，其長度便于單次反應測序。第三，除極少數外它們含有足夠的異質性位點從而可區(qū)分MS Ia-VII。僅根據這個790bp區(qū)域，沒法區(qū)分血清亞型III-3與MS Ia，也不能區(qū)分血清亞型III-4和MS II。但是，它們可以通過MS III特異性PCR鑒定(參見下文)。
血清型VIII用以790bp區(qū)域為目標的引物對沒有得到擴增子，但是可以通過GBS PCR鑒定后排除來鑒定。該試驗中，鑒定出1株MSVIII分離株，擴增2226bp區(qū)域的引物對中沒有一對從中擴增出(另加擴增790bp區(qū)域的那些引物對)擴增子。這一結果已用VIII特異性抗血清確證。
單一分離株中的混合血清型特異性根據MS特異性PCR和全序列(2226/2217bp節(jié)段內)有11個分離株被鑒定為一個MS，但是其序列在一些位點上不同與同一MS的分離株，并且彼此間具有位點特異性特征。它們包括5個血清亞型III-3分離株和3個血清亞型III-4(見上文)。一株無法血清分型的參照株(Prague25/60)被鑒定為MS II，其在5′末端區(qū)域中的5個位點上不同于其他MS II分離株，而這些位點中3個卻與MS III相同。Prague 25/60 MS III特異性PCR為陰性。一個鑒定為CSII的臨床分離株根據其全序列鑒定為MSII，其在5′-末端區(qū)域的9個位點具有血清型Ib特性的堿基；MSIb特異性PCR為陰性。最后，1個CSV參照株(Prague10/84)測序結果與GenBank相應序列(AF349539)相同，但是二者在5′末端區(qū)域3個位點與我們研究的其他MSV菌株都不同。
除與血清亞型III-3和III-4相關的外，所有這些混合血清型特異性都發(fā)生在2226/2217片段的5′末端區(qū)域。這一點支持了我們選擇790bp 3′末端作為MS測序目標的觀點。用這一目標，所有MS都能被正確鑒定，除了MS III屬于血清亞型III-3和III-4外，它們可通過MS III特異性PCR(參見實施例2)。
實施例2.根據以cpsG-cpsH-cpsI/cpsM的3′末端為靶標的MS特異性PCR進行分子血清型鑒定(MS)。
我們的序列對齊結果顯示在cpsG-cpsH-cpsI/cpsM的3′末端存在明顯的序列異質性(圖3)，這就使得其適合用于設計PCR直接區(qū)分Ia，Ib，III，IV，V，和VI所用的特異性引物對。為了滿足將來其他可能的要求，例如，設計多重PCR和/或進一步評估序列分型方法，我們針對每一血清型都設計了幾個引物對(表2和3)。使用兩組參照株和特定條件，所有引物對只從相應的血清型中擴增出DNA。當我們對臨床分離株測試時，得到了與兩套MS特異性引物對近似的結果。通常，用可以用更嚴謹條件(較低的引物濃度，較高的退火溫度)得到較小的擴增子。MS選用的引物對見表3和圖2。
206個臨床分離株中的179個(86.9％)用PCR確定的MS如下MS Ia40個；MSIb 35個；MSIII 58個(其中包括此前鑒定為血清亞型III-3和III-4的分離株)；MS IV 7個；MS V 36個；MSVI 3個。
實施例3.對MS與CS血清型鑒定結果進行比較在完成CS和MS后，對結果進行了比較。最初結果中有15個分離株的結果不一致，但是，除了其中的5個以外，其余都(見下文)通過重新測試和/或校正筆誤而得到解決。
CS和MS/序列亞分型結果見表5。通過PCR和/或測序所有分離株都確定了MS，與之相比206個分離株中只有188個(91.3％)確定了CS。目前還沒有針對MSII和VIII的特異性PCR，所以所有MSII分離株只能通過測序測定，一個假定的MS VIII分離株是通過排除法確定的(見實施例1)。對于所有其他分離株而言，除上述的血清亞型III-3和III-4及其他極少序列差異外，PCR與測序的結果都是一致的(實施例1)。CS結果與PCR結果完全相關。
用CS和MS兩個方法都能得到結果的所有188分離株其最終的CS和MS結果是相同的(100％)。18個CS不能分型的臨床分離株用MS分型結果如下Ia，2個；Ib，5個；II，1個；血清亞型III-1，3個；血清亞型III-2，1個；V，5個；以及VI，1個。
我們鑒定為MS VI的那3個臨床分離株的序列(2217bp)與血清型VI參照株序列及GenBank中的相應序列(AF337958)相同。
混合培養(yǎng).
4個臨床分離株用MS III特異性PCR得到陽性結果，但是通過測序手段暫定為MS II。與血清型III抗血清交叉反應其中3個為CS III，1個為CS II。這些分離株每株亞培養(yǎng)12個單菌落進一步研究。所有亞培養(yǎng)物用MS III特異性PCR測試。那3個CS III分離株的12個菌落亞培養(yǎng)物MS III特異性PCR的結果全部為陽性，因此分離株分類為血清亞型III-4(見上文)。但是，第4個分離株的12個菌落亞培養(yǎng)物其中11個為MSIII特異性PCR陰性；另一個為MS III特異性PCR。因此，可以判定為一混合培養(yǎng)物，MS/CS II占主導地位。那個MS III特異性PCR陽性的菌落隨后鑒定為血清亞型III-2，并且作為另加臨床分離株被包括在內(總共206個)。
實施例4.通過PCR和測序確定血清型的算法作為如何將PCR及測序方法用于臨床進行GBS血清型的鑒定的一個實例，我們設計了一個臨床用的算法。使用的所有引物(除內測序引物外)都具有高的解鏈溫度(＞70℃)，所以可使用快速循環(huán)PCR(圖2)(引物序列見表2)。
實施例5.alp2，alp3和rib基因中適合蛋白抗原基因特異性分型區(qū)域的鑒定聚合酶鏈反應除極少數外，所有引物從陽性結果分離株中都擴增出預期大小的擴增子(表7)。例外的菌株包括這樣一個菌株用引物對GBS1360S/GBS1937A和GBS1717S/GBS1937A(二者都以bac基因為靶標)PCR擴增結果為陽性，但是生成的擴增子明顯長于其它bac基因陽性分離株。測序結果表明該擴增子中包含內含子IS1381，該內含子與公開的序列(Tamura等，2000)相比差別甚微。用引物對IgAagGBS/RlgAagGBS和IgAS1/1gM1(也以bac基因為靶標)得到的擴增子的長度不同(Berner等，1999)，測序進一步亞分型(見下文和表8)。
擴增子的測序結果為了證實我們設計或修飾的選用引物對的特異性，我們對用bcaS1/bcaA(以bca基因5′-末端為靶標)從兩組參照株和31個隨機選取的臨床分離株擴增出的23個擴增子中的10個以及用ribS1/ribA3(以rib基因為靶標)和GBS1360S/GBS1937A(以bca基因為靶標)從中擴增出的全部擴增子進行了測序。引物對bcaS1/bcaA擴增到全部10個擴增子以及引物ribS1/ribA3擴增的13個中12個擴增子與GenBank中的相應基因序列(分別為M97256，bca基因和U58333，rib基因)。另一個標準組2中名為Prague 25/60的分離株(用其來制備R抗血清)，用引物對ribS1/ribA3只是在較低退火溫度(55℃)下才能得到擴增子而用ribS2/ribA1和ribS2/ribA2則不能得到。因此可以認為不含有rib基因，盡管該擴增子的序列與rib基因之間表現出一定的同源性(根據引物序列有無包括在內為71.4％或66.6％)(圖3)。該分離株是224個測試株中唯一一個用ribS2/ribA1和ribS2/ribA2 PCR擴增陰性而用ribS1/ribA3擴增陽性的菌株。后一引物對被認為是非完全特異于rib基因，因此只用于測序。
引物對GBS1360S/GBS1937A(以bac基因為目標)10個擴增子中的4個與GenBank中的相應序列(X58470，X59771)相同。包括含有插入序列IS1381那個擴增子(見上文和AF367974)在內的其余6個擴增子中發(fā)現了單位點突變(X59771中的第1441位的A變?yōu)镚)。
對用引物對bcaS1/balA(以alp2/alp3基因為靶標)、bal23S1/bal2A2(以alp2為目標)和IgAagGBS/RlgAagGBS(以bac為目標)得到PCR陽性結果的所有224個分離株的擴增子進行了測序。
用引物對bcaS1/balA從50個分離株中得到擴增子。其中9個的序列與公開的alp2基因序列的相應部分(AF208158)等同，而另41個與alp3基因(AF291065)相同。bcaS1/balA擴增子中，alp2和alp3基因之間有兩個穩(wěn)定的異質性位點(圖4)，除alp2和alp3基因特異性PCR外，可用其來區(qū)分這兩個基因。引物對bal23S1/bal2A2的全部9個擴增子都與GenBank中alp2基因序列相應部分(AF208158)等同。
引物對IgAagGBS/RlgAagGBS從52分離株中鑒定到bac基因。其中存在一定的序列變異，這可將bac基因陽性分離株根據擴增子長度和序列異質性分別分為11個組和20個亞組(表8)。除B1(20個分離株，2個亞組)和B4(11個分離株，3個亞組)外，這些組都含有較少數目(1～5個)的分離株。擴增子長度的差異通常是因有無短重復序列存在造成的。
表面蛋白基因特異性引物對特異性的進一步確證為了證實引物特異性，我們將用為bac基因PCR設計和修飾的引物序列得到的PCR結果與用此前公開引物得到的PCR結果進行了比較，發(fā)現相關度為100％。
此前報道的公開的引物對bcaRUS/bcaRUA(以bca基因的重復單元為目標)的非特異性得到了證實。使用這些引物對，9個alp2基因陽性的(bcaS1/bcaA陰性)分離株以及53個使用引物bcaSI/bcaA，bcaS2/bcaA(以bca基因的5′末端為靶標)，bal23S1/bal2A2和bal23S2/bal2A1(以alp2基因的5′末端為靶標)PCR擴增陰性的分離株都得到了擴增子。我們測序顯示在bcaRUS/bcaRUA的靶標區(qū)域bca基因和alp2基因之間有著顯著的同源性因而使得從alp2基因陽性菌株中獲得擴增子。這些錯誤的陽性結果可能是由于其他Cα樣蛋白存在的原因，該蛋白含有與bca基因重復單元同源的區(qū)域(bca基因重復單元樣序列)。
我們還查明使用我們?yōu)閱蝹€基因(rib，alp2，和alp3基因)設計的兩個或多個引物對PCR擴增的結果完全相關，這證實了每套引物的特異性。唯一例外的是ribS1/ribA3，如上所述，從測試的224分離株中的一株中得到一非特異性擴增子。
實施例6.表面蛋白抗原基因譜與cps血清型/血清亞型間的相互關系表面蛋白基因譜對于每一基因(除bca基因重復單元或bca基因重復單元樣區(qū)域)，我們都選取兩個引物對通過PCR方法鑒定和定性GBS表面蛋白。每一分離株都根據PCR結果給定一蛋白基因譜″A″用bcaS1/bcaA和bcaS2/bcaA擴增的bca基因5′末端；″a″或″as″用bcaRUS/bcaRUA擴增的bca基因重復單元或bca基因重復單元樣區(qū)域，分別有多個或單個擴增子條帶；″B″用GBS1360S/GBS1937A和IgAagGBS/RlgAagGBS擴增的bac基因(＞20亞組根據序列異質性)。
″R″用ribS2/ribA1和ribS2/ribA2擴增的rib基因；″alp2″用bal23S1/bal2A2和bal23S2/bal2A1擴增的alp2基因；以及″alp3″用bal23S1/bal3A和bal23S2/bal3A擴增的alp3基因(表7)。
4個常見基因譜占到了224個分離株中的203個(90.6％)″R″(62個分離株)，″AaB″(51個分離株)，″a″(49個分離株)以及″alp3″(41個分離株)(見表4)。只有2個分離株不含有任何表面蛋白基因標記。除1個含有bac基因的(″B″)分離株外的所有分離株都還含有bca基因，帶有其重復單元(″Aa″)；1個分離株含有rib基因。所有″alp2″分離株都含有單個bca重復單元樣序列(″as″).″A″、″R″、″alp2″及″alp3″都相互間排斥。63個含rib基因的分離株(″R″)中的62個以及41個含alp3基因能的分離株中的41個都不含有任何其他蛋白抗原標記。
表面蛋白抗原基因譜與cps血清型/血清亞型間的相互關系根據實施例1至4所述方法，所有分離株都被確定了cps分子血清型(MS)，其結果與傳統(tǒng)血清分型(CS)結果相關，224個分離株中的19株用抗血清無法分型。表面蛋白基因譜與cps MS間相互關系概括于表9。
已證實或顯示下列兩兩之間存在強相關MS Ia與bca基因重復單元或bca基因重復單元樣序列(大多數含有譜″a″)；MS血清亞型III-1和III-2與rib基因；MS血清亞型III-3與alp2基因；MSIb與bca/bac基因以及MS V與alp3基因。MS II表現出最大變化的表面蛋白基因譜。但是，所述相互關系并非絕對的，就bac基因(″B″)亞組而言，cps血清型與基因譜之間的不同組合得到31個不同的血清變體。
實施例7.表面蛋白抗原與蛋白基因譜間的相互關系根據傳統(tǒng)血清學分型，33個分離株(屬于CS Ia/c，Ib/c，IIc，IIb，IIIc或IIIb)與C抗血清反應。所有這些分離株的表面蛋白基因譜都含有bca基因(″A″)或bca基因重復單元相關標記(″a″或″as″)Aa，3個；AaB，18個；a，11個；alp2as，1個。29個分離株與R抗血清反應，這些分離株中的22個含有rib基因，6個含有alp3基因。用來制備R蛋白抗血清的那一株(Prague 25/60)含有一假定的rib樣基因(見上文和圖3)。
實施例8.適于分子分型的可移動遺傳元件的鑒定我們制備了一系列PCR引物篩查5個可移動元件在GBS血清型中的存在情況。
引物對的特異性所有引物對從一些參照株和/或一些臨床分離株(表12)中都得到了預期長度的擴增子(表11)。為了評價我們引物對的特異性，我們對用引物IS1548S/1S1548A3和ISSa4S/ISSa4A2擴增出的所有擴增子以及選擇，分離株，用IS861S/IS861A2(12個分離株)、IS1381 S1/1S1381A(24個分離株)和GBSi1 S1/GBSi1A2(11個分離株)擴增時選自參照株和臨床分離株都得到的擴增子進行了測序。
所有41個IS1548和15個ISSa4擴增子序列都與GenBank中的相應序列(分別為Y14270和AF165983)相同。12個IS861擴增子中的5個與GenBank中相應的IS861序列(M22449)等同。另7個在第732位上不同于公開序列(由G變?yōu)榱薃)，參照株Prague 25/60另外還有兩處不同——M22449中的第576位和830位分別由G變?yōu)锳，T變?yōu)锳。
此前，我們在一臨床分離株Cβ抗原基因中發(fā)現一全長的插入序列IS1381(AF367974)，該序列與最初公開的序列(AF064785)相比有幾處不同末端插入重復序列含有15個，而不是20個堿基對(bp)；缺失了3個bp，推定的轉座酶假基因中第419-429位之間(最初的GenBank序列)有4個單個bp不同-GGG ATC CGA TT(AF064785)vs CAG A---GG TA(AF367974；我們的序列)。引物對IS1381S1/1S1381A從12個參照株和12個選擇的臨床分離株中得到的擴增子相互間等同，并且與GenBank中我們的IS 1381序列(AF367974)也相同，但是與最初報道的IS1381序列(AF064785)不同。
對用引物對GBSi1S1/GBSi1A2從所有4個GBSi1陽性參照株及7個選擇的臨床分離株中得到的擴增子進行了測序。6個擴增子(包括3個參照株的擴增子)與GenBank中相應的GBSi1序列(AJ292930)相同。4個臨床分離株的擴增子顯示有3個位點變異(AJ292930 s序列中的第767位C變?yōu)門，第846位A變?yōu)镃，以及第923位T變?yōu)镃)。參照株Prague 25/60顯示只有這些位點變異中的前兩個。
除測序外，我們還通過用每一靶標的兩個或多個引物對比較PCR結果來評價我們引物對的特異性(表11)。所有情況下，當用靶向同一可移動遺傳元件的PCR測試時，同一套分離株得到了陽性結果，因而證實了我們引物對的特異性。
用所有5種可移動遺傳元件的特異性引物對的PCR結果分離株中鑒定出的IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1分別占55％，18％，85％，7％和19％。有10個(4％)分離株沒有檢測到任何可移動元件。此前實施例中測試了用PCR在224個GBS分離株中測試鑒定得到的5種可移動元件的分布情況，見表12。79個分離株中只檢測到IS1381，1個分離株中只檢測GBSi1。46個分離株含有兩種不同的插入序列(IS861和IS1381，42個分離株；IS 1548和IS1381，3個分離株；ISSa4和IS1381，1個分離株)。44個分離株含3種(IS861、IS1548和IS1381 34個；IS861、ISSa4和IS1381，10個)，另一個含有全部4種插入序列。41個分離株含GBSi1與一種(IS861，22個；IS1381，1個分離株)、兩種(IS861和IS1381，11個；ISSa4和IS1381，3個分離株)或三種(IS861，IS1548和IS1381，4個分離株)插入序列的組合。
用所有5種可移動遺傳元件特異性引物對194個侵襲性分離株PCR擴增結果含有不同可移動遺傳元件(mge)組合(每個分離株中從無到4種)分離株的數目見表13。鑒定出的IS1381、IS861、IS1548、ISSa4和GBSi1分別為87％、52％、17％、6％和18％。6個(3％)分離株中不含任何mge。
實施例9.cps血清型、血清亞型、表面蛋白基因譜與可移動遺傳元件之間的相互關系5種可移動遺傳元件中的每一種在不同cps血清型、血清型III的血清亞型和表面蛋白基因譜中的分布見表12和13。每一血清/血清亞型的最一致結果是1)血清型Ia——大多數(＞80％)表達與Cα蛋白緊密相關的蛋白，且含有IS1381；2)血清型Ib——大多數(＞90％)表達Cα及Cβ蛋白，且含有IS861和IS1381；3)血清型II——顯示兩種常見模式a)＞50％分離株表達Cα蛋白和表達量(往往還有Cβ)，且含有IS861、IS1381以及有時還有其他可移動元件，尤其是ISSa4，或者b)＞25％分離株表達Rib蛋白，且含有IS861、IS1381和GBSi1；
4)血清亞型III-1——全部表達Rib蛋白，且含有IS861、IS1548和IS1381但不含GBSi1。
5)血清亞型III-2——全部表達Rib蛋白且含有IS861和GBSi1，但不含IS1548和IS1381。
6)血清亞型III-3——全部表達Cα樣蛋白2，且不含任何可移動遺傳元件。
7)血清亞型III-4——表達不同蛋白；都含有GBSi1.
8)血清型IV——大多數表達與Cα蛋白緊密相關的蛋白，且含有IS13819)血清型V——大多數表達Cα樣蛋白3含有IS138110)GBSi1和IS1548在血清型III中相互排斥(III-1，III-2和III-4)但在血清型II不相互排斥。
11)表達Cα樣蛋白2的所有分離株都不含任何插入序列。
MS/sst、pgp和mge之間的主要相互關系圖5顯示了不同遺傳標記間的相互關系。IS1381出現在近乎全部的MS Ia、Ib、IV，V和VI分離株，但不出現于任一sstIII-2或III-3分離株。在血清型II或III中無一例外的發(fā)現了IS1548，大多數發(fā)現了GBSi1；3個分離株(都為MS II)中含有GBSi1和IS1548。IS861發(fā)現于所有sstIII-1和III-2以及大部分MS II和Ib分離株，但是其他MS的分離株中僅14％出現。ISSa4只出現于6％的分離株，其中半數以上為MSII；其還出現于1996以前(1994)獲得的一分離株。IS1381發(fā)現于除簇8、pgp″alp2″中分離株外的大多數分離株，簇8、pgp″alp2″中分離株中無任何插入序列。IS861出現于帶有pgp″AaB″(簇3和4)的基因型大多數和帶有pgp″R″(簇6和7)的基因型全部分離株中。
根據MS/sst、pgp、bac亞型及mge的基因型MS/sst，pgp，bac亞型(對于帶有pgp″B″的分離株而言)以及mge不同組合的出現提供了一種以PCR/測序為基礎的基因分型系統(tǒng)。該試驗中的194個侵襲性分離株根據pgp和mge的分布分為7個血清型、10個MS/sst、41個亞型或56個基因型當bac亞型(主要出現于MS Ib)包括在內時(圖5)。
理論上的GBS克隆群結構理論上，存在有13種可能的GBS MS/sst(8個MS-Ia，Ib，II，IV-VIII，4個sst III 1-4以及cps基因簇不存在)以及至少10種pgp(無、″Aa″，″AaB″，″a″，″as″，″R″，″RB″，″alp2as″，″alp3″或″alp4a″)。如果將迄今為止鑒定到的22種bac亞組包括在內，共有31種pgp。如果所述5種mge是獨立的、隨機分布的以及出現與否，那么將會有13×31×25＝12，896種不同組合的分子標記。但是只發(fā)現了56種不同組合(圖5)，這一事實說明標記并非是隨機分布的，或者換句話說，這些侵襲性澳大利亞GBS分離株具有一種克隆群結構。有可能是這些分離株僅代表了有限數目的GBS基因型，但是這種可能性不存在。
澳大利亞侵襲性GBS的系統(tǒng)發(fā)育相互關系56種基因型形成了8個簇，以約～16的遺傳距離間隔(或者是以約～22.5的遺傳距離間隔的3個簇)。pgp是簇分隔的主要決定因素(圖5)。分離株中的94％屬于5種MS(Ia，Ib，II，III和V)，62％屬于5種(9％)基因型(Ia-1，Ib-1，III-1，III-2，V-1)以及92％屬于5種最長的簇(1，2，4，6和7)。簇組A最大，包括139個(72％)分離株和48種(86％)基因型，其中45種的分離株少于5個，而簇組B含有49個(25％)分離株和5種(9％)基因型。
每一簇的主要特征如下簇1.″alp3″，IS1381(39個分離株，4種MS，11種基因型；主要為基因型V-1)。
簇2″a″或″as″、IS1381(55個分離株，4種MS，12種基因型；主要為基因型Ia-1)。
簇3″Aa″或″AaB″，MS II，IS1381，IS 861(10個分離株，6種基因型)。
簇4″AaB″，IS1381，IS861(35個分離株，兩種MSVI或Ib；18種基因型；主要為Ib-1)。
簇5″AaB″，IS861，GBSi1，基因型III-4-1(1個分離株)。
簇6″R″，IS861和GBSi1(22個分離株，3種MS/基因型；主要為基因型III-2)。
簇7″R″，IS1381和IS861(27個分離株；兩種MS/基因型；主要為III-1)。
簇8″alp2as″，無IS(6個分離株；3種MS/基因型；1含有GBSi1)。
系統(tǒng)發(fā)育研究表明用SSPS構建的樹形圖很粗壯。
基因型與GBS疾病模式間的相互關系患侵襲性GBS疾病患者不同年齡組中MS和基因型的分布見表14。所有常見MS反復出現于1個以上患者組。但是，(當比較所有其他年齡組時)sstIII-2與新生兒晚期感染之間(p＝0.0005)以及MS V和晚年感染之間(p＝0.001)存在極顯著相關。
17個分離株分離自腦脊髓液樣本，其中9個(53％)為MS III(來自3種不同的sst/基因型，每一種都存在于不同的簇)。其余8個分離株分布于5種MS、7種基因型和4種簇。腦膜炎發(fā)生在所有年齡組，但是包括與所有其他組的5％相比晚期新生兒組為23％。
討論GBS中莢膜的生成受莢膜多糖合成(cps)基因簇控制，在我們開始我們的研究之前，血清型Ia和血清型III的該基因簇已經測序。最近當該項目接近完成時，血清型Ib(Miyake et aL，2001提交到GenBank，GenBank登記號為AB050723)，血清型V，V，和VI(McKinnon等，2001提交到GenBank，GenBank登記號分別為AF355776，AF349539，AF337958)的相應序列已被釋放，但是其他3種血清型(II，VII和VIII)的相應序列，cps基因簇序列，此前還未公開。
血清型Ia和III的cps基因簇序列在cpsD-cpsE-cpsF的3′末端和cpsG.的5′末端表現出顯著的同源性。我們設計了一系列引物擴增該區(qū)域中的2226/2217bp節(jié)段，發(fā)現除VIII外的所有血清型都得到了擴增子。這證實了此前的說法，即在該區(qū)域VIII明顯不同于其他血清型。
使用8種血清型(Ia～VII)的參照株，我們發(fā)現在血清型之間存在50個以上的異質性位點(圖1，表4)。使用選擇的已用傳統(tǒng)方法分型后的63個臨床分離株，我們發(fā)現這些血清型內的差異通常是恒定且特異性的，尤其是成簇于該區(qū)域3’末端的23個位點。我們利用這些差異確定其余本研究收集臨床分離株的血清型，在不知道常規(guī)方法得到的血清型情況下。
對血清型Ia、III、Ib，IV，V和VI的cpsG-cpsH-cpsI/cpsM 3′末端進行了測序，結果表明該區(qū)域為高度可變區(qū)(圖3)，因此該區(qū)域是用PCR直接鑒定血清型的合適靶標。我們設計了幾對針對MS Ia，Ib，III，IV，V和VI的MS特異性引物，用它們對兩CS標準組進行了測試。選擇的引物對用于對我們206個臨床分離株中的86.9％單獨用PCRMS。使用快速循環(huán)MS特異性PCR，1個工作日內即可得到結果。將來，該方法可能會推廣至所有MS，當血清型II、VII和VIII該區(qū)域中cps基因簇序列可以獲得時。同時，MSII和VII也可以對cpsE-cpsF3′末端-cpsG 5′末端790bp的PCR擴增子測序來鑒定(圖1，表4)。陽性GBS-特異性PCR和利用用于擴增790bp的所有引物得到的陰性PCR結果，通過排除鑒定MSVIII。
將來，在目前的一些實驗室中，對所有分離株的cpsE-cpsF3′末端-cpsG 5′末端790bp PCR擴增子的測序將更為方便，因為只需要一種方法和極少數引物。但是，如果測序不能在局部進行，那么完成實驗的時間就更長，而且會有一小部分血清型被錯誤定型(血清亞型III-3和III-4分別定為MSIa和II)。這一點可以通過首先使用MS III特異性PCR篩查來避免。對790bp PCR擴增子測序可使得根據序列異質性將MS III亞分型。
此前研究表明在美國和其他幾個國家血清型Ia，Ib，II，III和V是從通常無菌部位分離的最常見的分離株。血清型VI和VIII在日本是從患者分離到的主要血清型，但是在其他地方卻不常見。盡管我們的分離株是選取的，但是它們是澳大利亞引發(fā)疾病的代表性菌株；Ia，Ib，II，III，和V是最常見的鑒定到的血清型，盡管還有少數的血清型IV，VI和VIII。
13％的GBS分離株無法血清分型，在我們研究中使用現有的抗血清這一比例為8.7％(18/206)。這可能是由于型特異性抗原合成的減少；無莢膜期變異；或者cps基因簇中基因的插入或突變。我們研究中一個無法血清分型的GBS菌株在cpsG基因中T堿基缺失，這導致cpsG基因閱讀框的改變。
我們還建立了以PCR為基礎的方法鑒定GBS表面蛋白基因，并進一步定性這些分離株。使用公開的bac基因序列，我們對bac基因特異性引物進行了修飾，并設計了新引物，這些引物具有高的解鏈溫度(＞70℃)適于以所有主要表面蛋白基因為靶標的快速循環(huán)PCR。
如此前報道，一個以bca基因重復單元(在bca基因的3’末端)為靶標的公開PCR引物對，并非完全特異于bca基因。我們設計了兩個以bca基因5′末端為靶標的引物對，以提高特異性。但是，使用這些引物血清型Ia極少菌株得到陽性結果，而使用以bca基因重復單元為靶標的引物對所有菌株都是PCR陽性。這些結果與此前報道一致，以bca基因5′末端為靶標的探針只與血清型Ia 9株中的1株雜交，但是包括串聯重復區(qū)的較長bca基因探針卻與所有9株都能雜交。
特異性針對rib，alp2和alp3基因的PCR此前還無描述。我們設計的引物對主要是以該基因的5′末端為靶標，并且是與相關基因序列比較基因異質性后選擇的。我們?yōu)槊恳换蚨荚O計了兩種或多種引物對，通過對以同一基因為靶標的PCR的結果進行比較驗證引物特異性。蛋白基因譜″alp2″和″alp3″是根據alp2及alp3基因特異性PCR和/或bcaS1/balA或bcaS2/balA的擴增子中兩個序列異質性位點區(qū)分的。
為了證實我們引物的特異性，我們用其對兩標準組及選取的GBS分離株進行了測試。對每一基因用PCR擴增到的最大擴增子進行測序，提供最大的序列信息，確保不位于菌株的異質性位點。我們的測序結果證實了引物的特異性。每一基因的兩對引物，具有近似的結果。最后，使用6個基因/區(qū)域特異性引物對(其中包括那一個以bca基因重復單元為靶標的引物對)定義了所有224個分離株的蛋白抗原基因譜。
研究表明含有重復序列的表面蛋白基因家族——rib，bca，alp2，和alp3基因——中只有1個成員能出現于任一單個分離株。但是，含有不是表面蛋白基因家族的bac基因的分離株都還含有bca基因(51/52)或rib基因(1/52)。
Bac基因出現于23％的分離株，與此前報道的比例(19-22％)近似。與其他基因一樣，我們在bac基因中發(fā)現了由于可變的小的內部重復序列導致的變異。這些bac基因重復序列是無規(guī)律的(不同于bca-rib基因家族的成員)。他們的作用不清楚，但是它們是可用于流行病學研究的潛在的分子標記。
我們的數據表明一些血清型III分離株(我們的MS血清亞型III-1和III-2)與rib基因緊密相關，其他(我們的MS血清亞型III-3)則與alp2基因緊密相關。血清型Ib與bca和bac基因相關，血清型V與alp3基因相關。但是，由于這種相關不是絕對的，不同組合的cps血清型-血清亞型/蛋白基因譜鑒定出許多血清變體，它們可用于流行病學研究和偶聯疫苗制劑。僅通過PCR手段，我們可根據bac基因(B)組將我們的224分離株分為31種血清變體，或者根據亞組分為51種血清變體。理論上講，有可能存在著其他血清變體。
我們發(fā)現抗″c″和″R″蛋白抗原的抗血清并不完全特異于任一具體蛋白基因。但是，與″c″抗血清的反應通常反映有編碼Cα(bca基因)和相關蛋白基因(至少包括alp2基因)的存在，與″R″抗血清的反應反映有編碼Rib(rib基因)及相關蛋白基因(至少包括alp3基因及罕見的推定的rib樣基因)。
我們還研究了大量可移動元件在GBS的不同血清型中的存在情況。此前已從GBS中鑒定出4種不同插入序列。一些血清型III分離株中的多拷貝IS861與莢膜基因表達升高相關。我們在血清亞型III-1和III-2所有分離株以及血清型II和Ib的大部分分離株中發(fā)現了IS861但是其他血清型和亞型中極少。所有含IS861的分離株都包含至少1種其他可移動元件。
多拷貝IS1381已經發(fā)現于大部分GBS及其他鏈球菌種，包括肺炎鏈球菌，被用作GBS流行病學研究中限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析的探針(Tamura等，2000)。我們在占總數85％的分離株中發(fā)現了IS1381。它們出現于血清亞型III-1的全部分離株，但血清亞型III-2或III-3無一株出現。我們從24個分離株得到的IS1381序列相互等同，但是在幾個位點上不同于此前報道的序列(AF064785)。這些差異的重要性還未可知，但是這突出了要對來自盡可能多的不同分離株的序列確證的重要性。
ISSa4首次鑒定于非溶血性GBS分離株，其中它導致基因cylB插入失活，cylB是參與溶血素生成的ABC轉運蛋白的一部分。只有一小部分(主要為溶血性的)GBS分離株(4％)含有ISSa4，它們都是自1996以來分離到的，可以推斷ISSa4是GBS新近獲得的。我們還在一小部分(7％)臨床分離株中發(fā)現了ISSa4，但是它以近似比例存在于1996年前獲得的分離株(4/44)和1996年或以后的分離株(11/162)。
IS1548首次發(fā)現于一些透明質酸酶陰性的GBS血清型III分離株，其中它導致基因hylB(負責生成透明質酸酶的基因簇的一個成員，透明質酸酶是一種重要的GBS毒力因子)失活(Granlund等，1998)。在含有它的分離株中，C5a肽酶基因(也與毒力相關)的下游還發(fā)現了一個拷貝的IS 1548。含IS 1548的分離株中大多數分離自心內膜炎患者，因此可推斷透明質酸酶產生的失活與和/或對C5a肽酶的一些影響可使得GBS分離株能吸附并存活于心血管上。
我們發(fā)現在血清亞型III-1的所有分離株中都發(fā)現了IS1548，III-1分離株占到了我們從表面(8/12)和正常無菌(22/46)樣本中收集的58個血清型III分離株中的52％。后者來自新生兒(7/20)、成人(3/6)和年齡段不明患者(12/20)(數據未顯示)。盡管未得到專門的臨床數據，但是GBS心內膜炎是不常見的，可能存在于這些患者中的極少數，如果有的話。需要進一步研究來闡明插入序列與特定毒力因子及臨床癥狀之間的相關性。
我們在我們的全部224個分離株中的19％分離株中發(fā)現了GBSi1，GBSi1是一種II組內含子；通常它與IS861相關，分布在各血清型/血清亞型之間有變化。它極少見于除II和III外的血清型中。它出現于血清型II中50％以上分離株，其中4株還含有IS1548。它發(fā)現于所有血清亞型III-2和III-4分離株，其中未發(fā)現IS1548，但是沒有發(fā)現于任何一株含IS1548的血清亞型III-1分離株或者任何一株不含IS1548的血清亞型III-3分離株。
我們根據cps基因簇內的差異將GBS血清型III進一步分為4種血清亞型，這一點得到了本研究所述的表面蛋白基因譜中相應差異及5種可移動元件分布情況的支持。盡管我們沒有對分離株透明質酸酶活性進行測試，但是我們的表達Rib蛋白且含有IS1548，IS861和IS1381的血清亞型III-1可能與Bohnsack等，2001中的透明質酸酶陰性亞型III-2相對應。我們的血清亞型III-2還表達Rib蛋白且含有IS861和GBSi1，可能與Bohnsack等，2001中的血清型III-3的相對應。血清亞型III-3和III-4只有相對少的分離株。前者(與一些血清型Ia分離株一樣)表達Cα-樣蛋白2且不含任何可移動元件(一個另外的不尋常發(fā)現)。后者與血清型II密切相關，二者在部分cps基因簇及各種表面蛋白譜和可移動元件上同源。
總結我們目標是建立了一種針對B組鏈球菌(GBS)的全面的基因分型系統(tǒng)。理想中，與其他分型方法相比，所述系統(tǒng)應該是可重復的，客觀的且可在實驗室間轉移的，且與其他分型方法互補，并能引入已知的毒力標記。根據這些標準，我們首先建立了一種根據cps基因簇的分子分型(MS)方法。該方法便與傳統(tǒng)方法(CS)比較，但是更敏感，使得我們能夠鑒定出血清型(sst)III的幾種亞型，如其他人所述。我們還根據編碼可變表面蛋白抗原的基因家族(bca/rib/alp2/alp3/alp4)建立了第二種分子亞分型方法，IgA結合蛋白Cβ(bac)，比傳統(tǒng)蛋白分型更敏感更客觀，傳統(tǒng)蛋白分型不能將分離株全部分型，且有時會誤導。我們的方法還能鑒定出可變抗原基因家族的更多成員，且能區(qū)分大量的bac亞組。第三種亞分型方法使用5種可移動遺傳元件(mge)，包括4種不同插入序列(IS)及一種II型內含子，這些可移動遺傳元件已在GBS中被鑒定到。這第三種方法的應用進一步提高了我們基因分型系統(tǒng)的區(qū)分能力。
然后，我們使用我們的分型系統(tǒng)對194個侵襲性GBS分離株的群遺傳結構和年齡相關疾病分布進行了測定。
我們主要使用侵襲性GBS分離株顯示我們基因分型系統(tǒng)的實際價值，證實理論上的群結構，測定不同患者群的基因型分布。分離株源自GBS膿毒癥所有年齡段的患者。其中約半數是來自血液或CSF的連續(xù)性的GBS分離株，這些血液或CSF取自設有產科的全科成人醫(yī)院的大型診斷實驗室(即，沒有一個分離株是來自除新生兒外的兒童)。其余為來自新西蘭全境用于血清分型的連續(xù)分離株。因此，全部年齡段的分布說明GBS疾病能感染除兒童外的人群，早期新生兒以上的兒童可能不具有代表性。但是，每一年齡組內基因型的分布應該是有代表性的。
在我們的194個澳大利亞侵襲性GBS分離株中，我們鑒定出56種基因型，其中5種(Ia-1，Ib-1，III-1，III-2和V-1)占到了全部分離株的62％。
我們試驗結果制備的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了cps血清型與蛋白基因譜(pgp)間的相關性。我們的結果還表明某些已知的毒力標記——Cβ，Cα變體以及透明質酸酶的生成(間接)——與獨特的克隆代系相關。
我們的基因分型系統(tǒng)，根據3套遺傳標記，是高分辨力的。因為它提供了有用的表型數據，包括抗原性組合物，可用于GBS的流行病學調查，尤其是與潛在的GBS疫苗用途相關。高毒力基因型與患者特征(年齡和/或潛在危險因素)間的推定關系，CSF分離株(或基因型)與其他侵襲性或定居性菌株之間是否存在著顯著差異，這些研究都會因我們的基因分型系統(tǒng)而被推進。使用本系統(tǒng)，我們闡明了存在于侵襲性澳大利亞GBS分離株中克隆群體結構。本系統(tǒng)可用于克隆GBS分離株，鑒定毒力標記。
因此，我們已經建立一種GBS傳統(tǒng)血清學分型方法的替代方法，該方法精確且可重復性強，任一能夠開展PCR/CEXUDE實驗室均可實施，而且更重要的是，該方法無需日益難以保持的成套的血清型特異性抗血清。所有分離株都可以血清分型，并且對相對有限的790bp區(qū)域的測序可以為MSIII亞分型提供額外的信息。我們描述的用于血清型鑒定的分子非法，與蛋白譜(或者蛋白抗原亞分型)及可移動遺傳元件的鑒定(或可移動遺傳元件亞分型)為進一步研究GBS系統(tǒng)發(fā)育及流行病學以及菌株的全面鑒定提供了提供了潛在的有用標記，菌株的全面鑒定可用于流行病學以及在GBS偶聯疫苗引入前后均需對GBS分離株分離株進行檢測的其他相關研究。
本發(fā)明單個章節(jié)中提到的各種特征及實施方案如果合適也可作必要變動后應用與其他章節(jié)。因此某一章節(jié)中詳細闡明的特征可與其他章節(jié)中詳細闡述的特征結合，如果合適。
本申請說明書中提到的所有公開出版物在此引入作為參考。對本發(fā)明所述方法及系統(tǒng)進行各種修飾及變動而不脫離本發(fā)明的范圍和實質，對于本領域技術人員來說是顯而易見的。盡管本發(fā)明是結合具體優(yōu)選的實施方案描述的，但是應該理解的是所請求的本發(fā)明不應該不合理地限制到這些具體實施方案。實際上，對所述實施本發(fā)明模式進行各種對于分子生物學及相關領域技術人員來說顯而易見的改動是在下列權利要求的范圍之內的。
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表1 該研究中使用的GBS參照組Lab菌株編號 來源血清型 MS/血清亞型 GenBank登記號參照組11090ChanningIa IaAF332893H36B ChanningIb IbAF33290318RS21 ChanningII IIAF332905M781 ChanningIIIIII-23AF3328963139 ChanningIV IVAF332908CJB 111ChanningV V AF332910SS1214 ChanningVI VIAF3329017271 ChanningVIIVII AF332913JM9 130013 ChanningVIII VIII參照組22NZRM908ESR Ia IaAF332894(NCDC SS615)NZRM 909 ESR Ib IbAF332904(NCDC SS618)NZRM 910 ESR Ic IaAF332914(NCDC SS700)NZRM 911 ESR II IIAF332906(NCDC SS619)NZRM 912 ESR IIIIII-33AF332897(NCDC SS620)NZRM 2217 ESR 無法分型 IIAF332907(Prague 25/60)(R)NZRM 2832 ESR IV IVAF332909(Prague 1/82)NZRM 2833 ESR V V AF332911(Prague 10/84)NZRM 2834 ESR VI VIAF332902(Prague 118754)
注1.參照組1由Channing Iaboratory，Boston，USA的Lawrence Paoletti博士提供。
2.參照組2由ESR.Porirua，Wellington，New Zealand提供的New ZealandReference Mdeical Culture Collection的菌株。
3.根據序列異質性的MS III血清亞型；更詳細內容參見文章。
表2 本研究使用的寡核苷酸引物引物 靶基因 Tm℃1GenBank登記號 序列2-4CFBS cfb 56.7 X72754 328GAT GTA TCT ATC TGG AAC TCT AGT G352Sag595cfb 77.4 X72754 350GTGGCTGGTGCATTGTTATTTT CAC CAG CTG TATTAG AAG TA391Sag1905cfb 76.8 X72754 545CATTAACCGGTTTTTCATAATCTGTT CCC TGA ACATTA TCT TTG AT500CFBA cfb 63.2 X72754 568TTT TTC CAC GCT AGT AAT AGC CTC54516SS 16S rRNA 69.3 AB023574 1441GCC GCC TAA GGT GGG ATA GAT G146223SA 23S rRNA 65.7 X68427 70CGT CGT TTG TCA CGT CCT TC51DSF2616S rRNA 75.9 AB023574 975CATCCTTCTGACCGGC CTA GAG ATA GGC TTTCT1007DSR1616S rRNA 81.5 AB023574 1250CGTCACCGGCTT GCG ACT CGT TGT ACCAA1222cpsDS cpsD 69.1 AB028896(Ia)， 4892/4593GCA AAA GAA CAG ATG GAA CAA AGTAF163833(III)GG5007/4618cpsES cpsE 65.7 AB028896(Ia)， 5300/4910CTT TTG GAG TCG TGG CTA TCTAF163833(III)TG5322/4932cpsEA1 cpsE 65.4 AB028896(Ia)， 5431/5041 GA/T/GA AAA AAG GAA AGT CGT GTC G/ATTAF163833(III)G5612/5017
cpsES1cpsE 65.9 AB028896(Ia)，5612/5222CTT GGA C/TTC CTC TGA AAA GGAAF163833(III)TTG5635/5245cpsEA2cpsE 66.8 AB028896(Ia)，5723/5333AAA A/CGC TTG ATC AAC AGT TAA GCAAF163833(III) GG5698/5308cpsES2cpsE 70.2 AB028896(Ia)，6012/5622GAT GGT/C GGA CCG GCT ATC TTT TCTAF163833(III) C6036/5646cpsEA3cpsE 63.7 AB028896(Ia)，6116/5726CTT AAT TTG TTC TGC ATC TAC TCGAF163833(III) C6092/5702cpsES3cpsE 71.5 AB028896(Ia)，6410/6020GTT AGA TGT TCA ATA TAT CAA TGA ATGAF163833(III) GTC TAT TTG GTC AG6450/6060cpsEFAcpsE/F62.1 AB028896(Ia)，6526/6136CCT TTC AAA CCT TAC CTT TAC TTAspacer AF163833(III) GC6501/6111cpsFS cpsF 75.0 AB028896(Ia)，6777/6387CAT CTG GTG CCG CTG TAG CAG TAC CATAF163833(III) T6804/6414cpsFA cpsF 73.2 AB028896(Ia)，6859/6469GTC GAA AAC CTC TAT A/GT A AAC/T GGTAF163833(III) CTT ACA A/GCC AAA TAA CTT ACC6819/6425cpsGA cpsG 54.7 AB028896(Ia)，7162/6772AAG/C AGT TCA TAT CAT CAT ATG AGA GAF163833(III) 7138/6748cpsGA1cpsG 74.5 AB028896(Ia)，7199/6809CCG CCA/G TGT GTG ATA ACA ATC TCA GCTAF163833(III) TC7171/6781cpsGS cpsG 72.24 AB028896(Ia)，7145/6755ATG ATG ATA TGA ACT CTT ACA TGA AAGAF163833(III) AAG CTG AGA TTG 7183/6793cpsGS1cpsG 71.62 AB028896(Ia)，7155/6765GAA CTC TTA CAT GAA AGA AGC TGA GATAF163833(III) TGT TAT CAC AC 7192/6802
IacpsHS cpsH73.6AB028896(Ia)7698CAT TCT TTG TTT AAA AA/CT CCT GAT TTT GATAGA ATT TTA GCA GC7741IacpsHA cpsH75.2AB028896(Ia)7993GAA TAT TCA AAA AAT CCC ATT GCT CTT TGAGTA TGC ATA CC7953IacpsHA1cpsH66.4AB028896(Ia)8271GTA AGT TAT CAA AAT ATA ACA TCA TTA CTATTA CTA GTA GAA ACG G8226IacpsHS1cpsH77.9AB028896(Ia)8463GGC CTG CTG GGA TTA ATG AAT ATA GTT CCAGGT TTG C8499IacpsHA2cpsH58.5AB028896(Ia)8499GCA AAC CTG GAA CTA TAT TCA T8478IbcpsHS0cpsH58.6AB050723(Ib)3013ATT GCT GCA TTC AAT TCA C3031IbcpsHS cpsH81.9AB050723(Ib)3016GCT GCA TTC AAT TCA CTG GCA GTA GGG GTTGTG TCC3051IbcpsHA cpsH67.7AB050723(Ib)3297GAT AGT TAA GGG TAT TAT AAG ATT TGA ATATTC AAA GAA AGC3256IbcpsHS1cpsH74.1AB050723(Ib)3546TTT GGT GAG CAT ATA TAA TAG AAT AAT CAATTT GCG GTC G3585IbcpsHS2cpsH73.7AB050723(Ib)3740CTG GCC TAT TTG GAC TAA TAA ATG TGA TTTTAG GTT TGT TTC3781IbcpsHA01 cpsH57.7AB050723(Ib)3781GAA ACA AAC CTA AAA TCA CAT TTA3758
IbcpsHA1cpsH78.5AB050723(Ib) 3894GGC GCC ATC AAT ATC TTC AAG TGC AAA AAATGA AAA TAG G3855IbcpsIA cpsI78.2AB050723(Ib) 4086CTA TCA ATG AAT GAG TCT GTT GTA GGA CGGATT GCA CG4049IbcpsIS cpsI71.1AB050723(Ib) 4116GAT AAT AGT GGA GAA ATT TGT GAT AAT TTATCT CAA AAA GAC G4158IbcpsIA1cpsI78.6AB050723(Ib) 4638CCT GAT TCA TTG CAG AAG TCT TTA CGA TGCGAT AGG TG4601IIIVIcpsHS cpsH75.3AF163833(III)，7275/7120CAA GAG GAT ATA ACG TTT CAG CGA TTTAF337958(VI) ATT GCT GAG C7311/7156IIIcpsHScpsH72.1AF163833(III) 7672GAA TAC TAT TGG TCT GTA TGT TGG TTT TATTAG CAT CGC7710IIIcpsHAcpsH71.0AF163833(III) 7817GTT ATA AGA AAA ACA AGC GGT GAT AAA TAAGAA AGT CAT ACC7776IVcpsHS cpsH74.1AF355776(IV) 7552CCG TAC ATA CAA CTG TTC TTG TTA GCA TTTACT TTT CTT TGC7593IVcpsHS1cpsH71.2AF355776(IV) 7887CCC AAG TAT AGT TAT GAA TAT TAG TTG GATGGT TTT TGG7925IVcpsHA cpsH77.3AF355776(IV) 7951 CAT CTA CAC CCC CAC AAA ATA TTT TCC CAAAAA CCA TC7914IVcpsHA1cpsH58.7AF355776(IV) 7958TGT AAA TCA TCT ACA CCC CC 7939
IVcpsMA cpsM80.7AF355776(IV)8265GGG TCA ATT GTA TCG TCG CTG TCA ACA AAACCA ATC AAA TC8225VcpsHS cpsH76.3AF349539(V) 6943GGG TTT AGG CGA GGG AAA CTC AGC TTA CAAAAT AGT G6979VcpsHS1 cpsH72.2AF349539(V) 7258CAA TTT TTA TAG GGA TGG ACA ATT TAT TCTGAG AAG TGA C7297VcpsHA cpsH71.1AF349539(V) 7291TCT CAG AAT AAA TTG TCC ATC CCT ATA AAAATT GAC ATA C7252VcpsHS02cpsH59.0AF349539(V) 7616GAT GTT CTT TTA ACA GGT AGA TTA CAC7642VcpsHA1 cpsH66.8AF349539(V) 7658GTT GTA AAT GAG CAT AGT GTA ATC TAC CTGTTA AAA GAA C7619VcpsHS2 cpsH74.0AF349539(V) 7871CCC AGT GTG GTA ATG AAT ATT AGT TGG CTAGTT TTT GG7908VcpsHA2 cpsH58.6AF349539(V) 7945CTT TTT TAT AGG TTC GAT ACC ATC7922VcpsMA cpsM73.1AF349539(V) 8244CCC CCC ATA AGT ATA AAT AAT ATC CAA TCTTGC ATA GTC AG8204VIcpsHS cpsH76.7AF337958(VI)7478CAC TAT TCC TAG TTT TTT GTG CAT ATT TGACAG GGG CAA G7517VIcpsHA cpsH76.7AF337958(VI)7517CTT GCC CCT GTC AAA TAT GCA CAA AAA ACTAGG AAT AGT G7478
VIcpsHS1cpsH 77.2AF337958(VI) 7767CCT TAT TGG GCA AGG TAT AAG AGT TCC CTCCAG TGT G7803VIcpsHA1cpsH 77.2AF337958(VI) 7804CCA CAC TGG AGG GAA CTC TTA TAC CTT GCCCAA TAA G7768VIcpsIA cpsI 74.5AF337958(VI) 8126GAA GCA AAG ATT CTA CAC AGT TCT CAA TCACTA ACT CCG8088cpsIA cpsI 70.3AB028896(Ia)，8816/8312GTA TAA CTT CTA TCA ATG GAT GAG TCTAF163833(III) GTT GTA GTA CGG8778/8274注1.引物的Tm值是由引物合成者(sigma-Aldrich)提供的。
2.數字代表著引物序列起始和終止的堿基位置的編號(編號起始點“1”代表相應基因GenBank登記號的起始點“1”。
3.下劃線序列標出的是對此前公開引物修飾而添加的堿基。
4.“/”后面的字母表示在不同血清型替換的核苷酸。
5.Ke et al.，2000.
6.Ahmet et al.，1999.
表3 使用不同寡核苷酸引物對得到擴增子的特異性和預期長度引物對 特異性 擴增子的長度(堿基對)Sag59/Sag190aGBS(無乳鏈球菌) 196CFBS/CFBA GBS(無乳鏈球菌) 24116SS/23SA GBS(無乳鏈球菌) 433DSF2/DSR1aGBS(無乳鏈球菌) 276cpsDS/cpsEA1血清型Ia to VII 449/458cpsES/cpsEA2血清型Ia to VII 424cpsES1/cpsEA3 血清型Ia to VII 505cpsES2/cpsEFA 血清型Ia to VII 515cpsES3/cpsFAb血清型Ia to VII 450cpsFS/cpsGA1b血清型Ia to VII 423cpsES3/cpsGA1b血清型Ia to VII 790cpsGS/cpsIA 血清型Ia and III 1672/1558cpsGS1/cpsIA血清型Ia and III 1662/1548cpsGS/IacpsHA1 血清型Ia 1127cpsGS1/IacpsHA1 血清型Ia 1117IacpsHS/IacpsHA 血清型Ia 296IacpsHS/IacpsHA1血清型Ia 574IacpsHS1/cpsIAc血清型Ia 354cpsGS/IbcpsHA1 血清型Ib 1468cpsGS1/IbcpsHA1 血清型Ib 1458cpsGS/IbcpsIA 血清型Ib 1660cpsGS1/IbcpsIA 血清型Ib 1650IbcpsHS/IbcpsHA 血清型Ib 282IbcpsHS1/IbcpsHA1 血清型Ib 349IbcpsHS2/IbcpsIA血清型Ib 347IbcpsIS/IbcpsIA1c血清型Ib 523cpsGS/IIIcpsHA 血清型III 1063cpsGS1/IIIcpsHA 血清型III 1053IIIVIcpsHS/IIIcpsHA 血清型III 543IIIcpsHS/cpsIAc血清型III 641cpsGS/IVcpsHA 血清型IV 1372cpsGS1/IVcpsHA 血清型IV 1362cpsGS/IVcpsMA 血清型IV 1686
cpsGS1/IVcpsMA 血清型IV 1676IVcpsHS/IVcpsHA血清型IV 400IVcpsHS1/IVcpsMAc血清型IV 379cpsGS/VcpsHA1 血清型V 1096cpsGS1/VcpsHA1 血清型V 1086cpsGS/VcpsMA 血清型V 1682CpsGS1/VcpsMA 血清型V 1672VcpsHS/VcpsHA 血清型V 349VcpsHS1/VcpsHA1血清型V 401VcpsHS2/VcpsMAc血清型V 374IIIVIcpsHS1/VIcpsHA血清型VI 398cpsGS/VIcpsHA1 血清型VI 1205cpsGS1/VIcpsHA1血清型VI 1195cpsGS/VIcpsIA 血清型VI 1527cpsGS1/VIcpsIA 血清型VI 1517VIcpsHS/VIcpsHA1c血清型VI 327VIcpsHS1/VIcpsIA 血清型VI 360注*引物序列參見表2，引物位點參見圖1分子血清型鑒定算法中使用的引物-圖2a.鑒定GBS，b.測序，c.MS-特異性PCR
表4 8個GBS血清型在cpsD-cpsF-3’末端和cpsG5’末端區(qū)域中的異質性位點 Ia Ib II/III-4III IVV VIVII特異性cpsD基因62 G A G4A A A A G Ia，III VII78-86 -Ia-21； - -II-22，4； -III-23； + + - + 見文中重復序列 +Ia-11+II-12+III-13，-TTACGGCGA III-33cpsD/cpsE基因間隔區(qū)spacer138G G G G G A5G G V139G G G A III-2； G G G G III-2G III-1，III-3144T T T G III-2； T T T T III-2T III-1，III-3cpsE基因198A C A4A C C5A A Ib，IV，V204G G G A III-2，III-3； G G G G III-2，III-3G III-1211T T T T T T G T VI218C C C C C C T C VI240T T T T T T C T VI
249TCT4T CC5TTIb，IV，V300CCC T III-2； CCCCIII-2C III-1，III-3321CCC T III-1； CCCCIII-1C III-2，III-3419TCT4T TTTTIb429ATA4T TTTAIa，II，VII437CCC；C CCCTVII，III-4T III-4457TAC4A AAACIa，II，VII466GGG G AGGAIV486GAA G III-3； AAAAIa，III-3A III-2，III-1602GGA4G GGGAII，VII606TTT T TTCTVI627TCC C CCCCIa636CTT C III-1； TTTTIa，III-1T III-2，III-3645CTC4C TTCCIb，IV，V803AAA A AATAVI971CTT C CCTTIa，III，IV，V1026 AGG G III-2，III-1； AAGGIa，III-3，IV，VA III-31044 TTT T TTCTVI
1173AGAA AAAAIb1194CCCA ACACIII，IV，VI1251GGGG GGAGVI1278AAAA AGAAV1413CTTC III-3； TTTTIa，III-3T III-2，III-11495CCCC CCACVI1500AGAA AAAAIb1501CCTC CCCTII，VII1512CTCT III-2，III-1；CTTCIa，II，III-3，IV，VIIC III-31518TCTC III-2，III-1；TCCTIa，II，III-3，IV，VIIT III-31527TAAT III-3； TAAAIa，III-3，IVA III-2，III-1cpsF基因1595TCTT TTCTIb，VI1611CCCC CCCTVII1620CCCC CCCTVII1627GGGG TGGGIV1629GGGA III-1； GGGGIII-1G III-2，III-31655CTCC CCCCIb1832CCCC TCCCIV
1856TCTT TTTTIb1866GGGG GGGAVII1871TTTT TCTTV1892AAAA AGAAV1971GGGG GGAGVIcpsG基因2026GAGG GGGGIb2088GGGG AGGGIV2134TTTC III-2，III-1；TTTTIII-2，III-1T III-32187CCCC CCCGVII2196AAAA AAAGVII注解1.重復序列血清亞型Ia-1存在(+)；血清亞型Ia-2缺乏(-)(參見文中)。
2.重復序列血清亞型II-1存在(+)；血清亞型II-2缺乏(-)(參見文中)。
3.重復序列血清亞型III-1和III-3存在(+)；血清亞型III-2缺乏(-)；血清亞型III-4可變(-)(參見文中)。
4.一個CSII株在9個位點處有突變(參見文中)。
5.在第138、198和249位，一個CSV參照株(Prague 10/84)與GenBank中相應序列相同(GenBank登記號AF349539)，序列分別為G，A和T；另一個參照株與其他所有測序的CSV株相同，序列分別為A，C和C。
表5 比較206個臨床GBS分離株的傳統(tǒng)血清學分型(CS)和分子血清型鑒定(MS)亞分型結果比較MS/血清亞型CS Ia Ib II III-11III-21III-31III-41IVVVIVIIIIa 38Ib 30II 25III 27 20 4 3IV 7V31VI2VIII1NT12513 1 51總數(206)240 35 26230 2124 3 736 3 1注1.MSIII血清亞型詳細內容參見文中。
2.一種包括兩種獨立分離株(一種為血清型II，一種為亞型III-2)的混合培養(yǎng)物。
表6 本研究中使用的寡核苷酸引物引物靶序列Tm℃1GenBank登記號序列2，3IgAagGBS5 bac 73.8X59771 2663GCGATTAAACAACAA ACT ATT TTT GAT A TTGACA ATG CAA2702IgAS14bac 72.8X59771 2765GCT AAA TTT CAA AAA GGT CTA GAG ACA AATACG CCA G2801IgAA14bac 78.9X59771 3157CCC ATC TGG TAA CTT CGG TGC ATC TGG AAGC3127RigAagGBS5bac 76.3X59771 3284CAGCCAACTCTTTCGTC GTT ACT TCC TTG AGATGTAAC3247GBS1360S6bac 72.3X59771 1325GTGAAATTGTATAAG GCT ATG AGT GAG AGC TTGGAG1360GBS1717S4bac 75.0X59771 1685ACA GTC ACA GCT AAA AGT GAT TCG AAG ACGACG1717GBS1937A6bac 75.9X59771 1976CCGTTTTAGAATCTTTCTG CTC TGG TGT TTT AGGAAC TTG1937BcaRUS7bca 73.5M97256 769GATAAATATGATCCAACAG GAG GGG AAA CAA CAGTAC805BcaRUA7bca重復單元 77.2M97256 1003CTGGTTTTGGTGTCACATGAA CCG TTA CTT CTACTG TAT CC963
bcaS14bca/alp2/alp371.7M97256和208/533GGT AAT CTT AAT ATT TTT GAA GAG TCA ATAAF291065GTT GCT GCA TCT AC251/576bcaS24bca/alp2/alp378.0M97256和256/581CCAGGGA GTG CAG CGA CCT TAA ATA CAAAF291065GCA TC288/613bcaS4bca 58.9M97256 370GTT TTA GAA CAA GGT TTT ACA GC392balS4alp2/alp373.8AF291065677GAT CCT CAA AAC CTC ATT GTA TTA AAT CCA TCAAGC TAT TC717bcaA4bca 74.2M97256 597CGTTCTAACTT CTT CAA TCT TAT CCC TCA AGGTTG TTG560balA4alp2/alp373.6AF291065978CCA GTT AAG ACT TCA TCA CGA CTC CCA TCAC948bal23S14alp2/alp370.9AF208158和 1093/1373CAG ACT GTT AAA GTG GAT GAA GAT ATTAF291065ACC TTT ACG G1129/1409bal23S24alp2/alp372.9AF208158和 1174/1454CTT AAA GCT AAG TAT GAA AAT GAT ATCAF291065ATT GGA GCT CGT G1213/1493bal2S4alp2 59.2AF2081581363GTT CTT CCG CCA GAT AAA ATT AAG1386bal2A4alp2 58.3AF2081581576CTG TTG ACT TAT CTG GAT AGG TC1554bal2A14alp2 78.3AF2081581426CGT GTT GTT CAA CAG TCC TAT GCT TAG CCTCTG GTG1391bal2A24alp2 70.8AF2081581518GGT ATC TGG TTT ATG ACC ATT TTT CCA GTT ATACG1484
bal3S4alp357.1AF2910651643GTT CTT CCG CTT AAG GAT AGC A1664bal3A4alp379.2AF2910651693GAC CGT TTG GTC CTT ACC TTT TGG TTC GTTGCT ATC C1657#ribS14rib 65.2U58333 216TAC AGA TAC TGT GTT TGC AGC TGA AG241ribS24rib 73.0U58333 238GAAGTAATTTCAG GAA GTG CTG TTA CGT TAA ACACAA ATA TG279ribA14rib 78.8U58333 431GAA GGT TGT GTG AAA TAA TTG CCG CCT TGCCTA ATG396ribA24rib 72.6U58333 462AAT ACT AGC TGC ACC AAC AGT AGT CAA TTC AGAAGG427#ribA34rib 61.3U58333 570CAT CTA TTT TAT CTC TCA AAG CTG AAG554注#只用于測序，不完全特異于rid基因。
1.引物Tm值由引物合成者(Sigma-Aldrich)提供。
2.數字代表引物序列起始和終止的堿基位置的編號(編號起始點“1”代表相應基因GenBank等記號的起始點“1”)。
3.下劃線序列標出的是對此前公開引物修飾而添加的堿基。
4.我們設計用于研究的引物。
5.Mawn et al.，1993.
6.Maeland et al.，1997.
7.Maeland et al.，2000.
表7 使用不同引物對得到擴增子的特異性和預期長度引物對* 特異性 擴增子長度 蛋白譜代號(堿基對)IgAagGBS/ bac532-838BRIgAagGBSIgAS1/IgAA1 bac303-591BGBS1360S/ bac652BGBS1937AGBS1717S/ bac292BGBS1937AbcaS1/bcaA bca的5′末端 390AbcaS2/bcaA bca的5′末端 342ABcaRUS/bcaRUA bca重復單元/ 235a/asbca重復單元樣區(qū)域bcaS1/balA alp2/alp3 446alp2或alp3bcaS2/balA alp2/alp3 398alp2或alp3balS/balA alp2/alp3 302alp2或alp3bal23S1/bal2A1 alp2 334alp2bal23S2/bal2A1 alp2 253alp2bal23S1/bal2A2 alp2 426alp2bal23S2/bal2A2 alp2 345alp2bal23S1/bal3A alp3 321alp3bal23S2/bal3A alp3 240alp3#ribS1/ribA3rib/rib-樣 355R/rribS2/ribA1 rib194RribS2/ribA2 rib225RribS2/ribA3 rib333R注*引物序列參見表6#只用于測序，不完全特異于rib基因(更詳細內容參見文中)
表8 根據擴增子長度(使用引物IgAagGBS/RIgAagGBS)和序列異質性而定的基因的組和基因亞組組或亞組N＝擴增子長度 GenBank 與(c.f.)主要組分子血清型登記號相比不同位點的編號 /血清亞型B1 19532 X5847017＝Ib；2＝IIB1a 1 532 AF362686 1(c.f.B1) IbB2 3 550 AF362687 Ib，II，III-4B3 2 586 AF362688 2＝IbB3a 1 586 AF362689 4(c.f.B3) VB3b 1 586 AF362690 21(c.f.B3) VIB3c 1 586 AF362691 24(c.f.B3) IbB4 8 604 AF362692 4＝Ib；4＝IIB4a 1 604 AF362693 1(c.f.B4) IIB4b 2 604 AF362694 2(c.f.B4) 2＝IbB5 2 622 AF362695 Ia，VIB5a 1 622 AF362696 2(c.f.B5) IaB6 1 640 AF362697 IbB7 1 658 AF362698 IbB7a 1 658 AF362699 34(c.f.B7) VIB8 1 712 AF362700 IbB9 2 748 AF362701 2＝IIB9a 1 748 AF362702 13(c.f.B9) IbB10 2 820 AF362703 2＝IbB11 1 838 AF362704 Ib注*血清型/血清亞型與蛋白抗原間相互關系的詳細內容見表9。
表9 GBS蛋白基因譜與莢膜多糖(cps)分子血清型/血清亞型間的相互關系血清型/N＝無 Aa AaBRalpa as alp2as RBR血清亞型 3 a*Ia 43 - - 2 - - 353 3 - -Ib 37 - 1 35- 1 - - - - -II 29 - 3 108 2 5 - - - 1III-130 - - - 30- - - - - -III-222 - - - 22- - - - - -III-35 - - - - - - - 5 - -III-43 - - 1 - 1 - - 1 - -IV 9 - - - 1 - 8 - - - -V38 1 - - 1 35- - - 1 -VI 5 - 1 3 - - 1 - - - -VII 1 - - - - 1 - - - - -VIII 2 1 - - - 1 - - - - -總數 2242 5 516241493 9 1 1注解*cps血清亞型的說明見文中，蛋白抗原基因譜代號見表7。
表10 本研究使用的寡核苷酸引物引物靶 Tm℃1GenBank 序列2登記號IS861S IS861 77.4M22449 445GAG AAA ACA AGA GGGAGA CCG AGT AAA ATG GGACG479IS861A1 IS861 77.3M22449 831CAC GAT TTC GCA GTTCTA AAT AAA TCC GAC GATAGC C795IS861A2 IS861 76.1M22449 1020CAA ACT CCG TCA CATCGG TAT AGC ACT TCT CATAGG985IS1548S IS1548 76.5Y14270 143CTA TTG ATG ATT GCGCAG TTG AAT TGG ATA GTCGTC178IS1548S1IS1548 77.0Y14270 539GTT TGG GAC AGG TAGCGG TTG AGG AGA AAA GTAATG574IS1548A1IS1548 77.0Y14270 574CAT TAC TTT TCT CCTCAA CCG CTA CCT GTC CCAAAC539IS1548A2IS1548 70.3Y14270 915CCC AAT ACC ACG TAACTT ATG CCA TTT G888IS1548A3IS1548 78.0Y14270 930CGT GTT ACG AGT CATCCC AAT ACC ACG TAA CTTATG CC893IS1381S1IS1381 80.1AF064785/ 272/818CTT ATG AAC AAAAF367974 TTG CGG CTG ATT TTG GCATTC ACG307/853IS1381S2IS1381 81.7AF064785/ 497/1040GGC TCA GGC GATAF367974 TGT CAC AAG CCA AGGGAG526/1069
IS1381AIS1381 73.1AF064785/ 881/1424CTA AAA TCC TAGAF367974TTC ACG GTT GAT CAT TCCAGC849/1392ISSa4S ISSa4 78.5AF165983326CGT ATC TGT CAC TTATTT CCC TGC GGG TGT CTCC359ISSa4A1ISSa4 75.2AF165983639GCC GAT GTC ACA ACATAG TTC AGG ATA TAG CCAG606ISSa4A2ISSa4 74.5AF165983780CGT AAA GGA GTC CAAAGA TGA TAG CCT TTT TGAACC745GBSi1S1GBSi1 78.6AJ292930721CAT CTC GGA ACA ATATGC TCG AAG CTT ACA AGCAAG TG758GBSi1S2GBSi1 77.3AJ292930789GGG GTC ACT ATC GAGCAG ATG GAT GAC TAT CTTCAC824GBSi1A1GBSi1 83.9AJ2929301058AAT GGC TGT TTC GCAGGA GCG ATT GGG TCT GAACC1024GBSi1A2GBSi1 80.5AJ2929301161CCA GGG ACA TCA ATCTGT CTT GCG GAA CAG TATCG1127注1.引物Tm值由引物合成者(Sigma-Aldrich)提供。
2.數字代表引物起始和終止堿基位置的編號(編號“1”的起始位點代表相應基因GenBank登記號的起始位點“1”)。
表11 使用不同寡核苷酸引物對得到擴增子的特異性和預期長度引物對*特異性 擴增子長度(堿基對)IS861S/IS861A1 IS861 387IS861S/IS861A2 IS861 576IS1548S/IS1548A1 IS1548 432IS1548S/IS1548A2 IS1548 773IS1548S/IS1548A3 IS1548 788IS1548S1/IS1548A2IS1548 377IS154BS1/IS1548A3IS1548 392IS1381S1/IS1381A IS1381 610/607#IS1381S2/IS1381A IS1381 385ISSa4S/ISSa4A1 ISSa4 314ISSa4S/ISSa4A2 ISSa4 455GBSi1S1/GBSi1A1 GBSi1 338GBSi1S1/GBSi1A2 GBSi1 441GBSi1S2/GBSi1A1 GBSi1 270GBSi1S2/GBSi1A2 GBSi1 373注*引物序列見表10。
#我們的測序結果(GenBank登記號AF367974)比此前Tamura et al 2000中描述的序列(GenBank登記號AF064785)短3個bp。
表12 可移動遺傳元件與莢膜多糖血清型，血清型III亞型及表面蛋白基因譜之間的相互關系血清型/蛋白基因譜 N＝ IS861 IS1548 IS1381 ISSa GBSi1 無任何可血清亞型 4移動元件Ia AaB 2 2 - 2 - - -Ia alp2as3 - - - - - 3Ia a 35 3 1 35 1 - -Ia as3 - - 3 - - -小計 43 5 1 40 1 - 3Ib Aa1 - - - - - 1Ib AaB 35 30 - 35 1 - -Ib alp3 1 - - 1 - - -小計 37 30 - 36 1 - 1II Aa3 3 1 3 2 1 -II AaB 10 10 5 10 5 1 -II alp3 2 1 1 2 - - -II R 8 8 - 8 - 8 -II Ra1 1 - - - 1 -II a 5 2 2 5 3 5 -小計 29 25 9 28 10 16 -III-1 R 30 30 30 30 1 - -III-2 R 22 22 - - - 22 -III-3 alp2as5 - - - - - 5III-4 AaB 1 1 - 1 - 1 -III-4 alp2as1 - - - - 1 -III-4 alp3 1 - - 1 1 -小計 60 53 30 32 1 25 5IV R 1 1 - 1 - 1 -IV a 8 2 - 8 - - -小計 9 3 - 9 - 1 -V alp3 35 3 1 35 1 1 -V R 1 1 - 1 1 - -V RB1 1 - 1 - - -V 無1 - - - - - 1小計 38 5 1 37 1 1 2
VI Aa 1 - - 1 - - -AaB 3 3 - 3 - - -a 1 - - 1 - - -小計 5 3 - 5 - - -VII alp31 - - 1 - - -VIII alp31 - - 1 - - -無 1 - - 1 - - -小計 2 - - 2 - - -總數 22412441(18) 19015(7) 43(19) 10(4)(55) (85)注Abca基因的5′末端(Cα蛋白)abca基因重復單元或bca基因重復單元樣序列(多個條帶擴增子)。
asbca基因重復單元或bca基因重復單元樣序列(單一條帶擴增子)。
BCβ/IgA結合蛋白(bca)基因；RRib蛋白(rib)基因；alp2Cα樣蛋白2(αlp2)基因；alp3Cα樣蛋白3(αlp2)基因；r假定的Rib樣蛋白基因。
表13 可移動遺傳元件在194個侵襲性GBS分離株中的分布情況可移動遺傳元件出現情況總共 N＝ IS1381 IS861IS1548 ISSa4GBSi1 無6- - - --678 78 - - ---2- - - -2-37 37 37- ---11 - 1 ---33 - - 3--29 29 2929---66 6 - 6--88 8 - -8-18 - 18- -18 -11 - - -1-11 - - 1-122 2 2 -2-22 - - 22-總數 168(87％) 100(52％) 33(17％) 11(6％) 34(18％) 6(3％)(n＝194)注數據為含不同mge組合的分離株的數目。
表14 GBS基因型與侵襲性疾病年齡間的相互關系血清型年齡-組/疾病1基因型0-6d 7-3m 4m-14yr15-45yr46-60yr＞60yr 總計Ia-1 14 4+1 1 7 3 635+1(19％)Ia-(2-8) 4 2- 1 - 310Ia總數 18(34％)6+1(21％)1(10％)8(28％)3(18％)9(17％) 45+1(24％)Ib-1 2 1+1 - 3 2 5+1 13+2Ib-(2-16) 3 4+2 - 3 1 516+2Ib總數 5(9.4％)5+3(24％)- 6(21％)3 10+1 29+4(17％)II 8(15％) 1(3％) - 4+1(17％) 1 4(7％) 18+1(10％)III-1 6+1(13％) 4(12％) 1+1(20％) 1+1(7％) 6+1(41％) 422+4(13％)III-2 5(9％) 5+4(39％)3 1(10％)2 - -13+4(9％)III-(3-4) 1+1 1- 1 1 15+1III總數12+2(26％) 10+4(41％) 2+1(30％) 4+1(17％) 7+1(44％) 5(9％) 40+9(25％)IV總數 3 -- - - 47(4％)V-13 32 4 2 13+1 27+1(14％)V-(2-7)1 1- 1 - 47V總數 4(8％) 4(12％) 2(20％)5(17％)2(11％)17+1(33％)4 34+1(18％)VI總數 1 -- - +1 34+1(3％)總數 51+2＝5326+8＝34 5+2＝7 27+1＝29 16+2＝18 52+2＝54 177+17＝194注1.“+”后的數字是指CSF分離株；其他全部來自血液。
2. 5個病例為4m-1yr齡，1個病例為3yr齡。
3.晚發(fā)新生兒感染中的SstIII-2與所有其他組相比P＝0.0005，優(yōu)勢率(OR)6.8；95％置信區(qū)間(CI)2.4-19.4。
老個人感染中的MS-V與所有其他年齡組相比P＝0.001，OR 0.28；95％CI 0.13-0.59。
權利要求
1.一種B組鏈球菌分型方法，該方法包括對所述細菌的cpsD、cpsE、cpsF、cpsG和/或cpsI/M基因中的一個或多個區(qū)域的核苷酸序列進行分析，所述一個或多個區(qū)域包含一或多個其序列在各型之間有變化的核苷酸。
2.權利要求1的方法，其中對所述核苷酸序列在與下列位置對應的一或多個位置上進行分析即圖1所示的第62、78-86、138、139、144、198、204、211、281、240、249、300、321、419、429、437、457、466、486、602、606、627、636、645、803、971、1026、1044、1173、1194、1251、1278、1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
3.權利要求1中的方法，其中至少1個區(qū)域位于由所述鏈球菌的cpsE-cpsF-cpsG基因簇的從cpsE基因的3’端第136位堿基到cpsG基因的5′端第218位堿基所限定的序列內。
4.權利要求3中的方法，其中對所述核苷酸序列在與下列位置對應的一或多個位置上進行分析圖1所示的第1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中至少1個區(qū)域位于所述細菌的cpsI/M基因中。
6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步驟包括對所述的一或多個區(qū)域進行測序。
7.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步驟包括確定獲自所述細菌的多核苷酸是否與含有一或多個所述區(qū)域的多核苷酸探針選擇性雜交。
8.權利要求7中的方法，該方法包括確定獲自所述細菌的多核苷酸是否與對應于一或多個所述區(qū)域的一系列多核苷酸探針中的一或多個雜交。
9.權利要求8中的方法，其中所述的一系列多核苷酸探針是以微陣列形式存在。
10.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步驟包括使用一種或多種引物進行擴增的步驟，所述引物中的至少1種能與一段在各型之間有變化的序列特異性雜交。
11.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步驟包括使用引物對進行擴增的步驟，所述引物對中的至少1對能與一段在各型之間有變化的序列特異性雜交。
12.權利要求10或11中的方法，其中所述引物選自表2所列出的引物。
13.一種B組鏈球菌分型方法，該方法包括確定所述細菌基因組有無存在一種或多種選自rib、alp2或alp3基因的表面蛋白基因。
14.權利要求13中的方法，其中所述的確定有無存在所述表面蛋白基因包括確定獲自所述細菌的多核苷酸能否與相應于所述表面蛋白基因的一個區(qū)域的多核苷酸探針選擇性雜交。
15.權利要求13中的方法，其中所述的確定有無存在所述表面蛋白基因包括使用一種或多種引物進行擴增的步驟，該引物特異性擴增所述表面蛋白基因的一個區(qū)域。
16.權利要求15中的方法，其中所述的引物選自表6列出的引物。
17.權利要求1-12中任一項所述的方法，該方法進一步包括確定所述細菌基因組有無存在一種或多種選自rib、alp2或alp3基因的表面蛋白基因。
18.一種B組鏈球菌分型方法，該方法包括確定所述細菌基因組有無存在一種或多種選自IS861、IS1548、IS1381、ISSa4或GBSi1的可移動遺傳元件。
19.權利要求18中的方法，其中所述的確定有無存在所述可移動遺傳元件包括確定獲自所述細菌的多核苷酸能否與相應于所述可移動遺傳元件的一個區(qū)域的多核苷酸探針選擇性雜交。
20.權利要求18中的方法，其中所述的確定有無存在所述可移動遺傳元件包括使用一種或多種引物進行擴增的步驟，該引物特異性擴增所述可移動遺傳元件的一個區(qū)域。
21.權利要求20中的方法，其中所述的引物選自表10列出的引物。
22.權利要求13-17中任一項所述的方法，該方法進一步包括確定所述細菌基因組有無存在一種或多種選自IS861、IS1548、IS1381、ISSa4或GBSi1的可移動遺傳元件。
23.一種基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，所述至少10個連續(xù)核苷酸對應于B組鏈球菌cpsD-cpsE-cpsF-cpsG基因中的一個區(qū)域，所述多核苷酸包含一或多個在各型B組鏈球菌血清型之間有變化的核苷酸。
24.權利要求23中的多核苷酸，其中所述的在各型B組鏈球菌血清型之間有變化的核苷酸對應于下列位置中的一或多個位置即圖1所示的第62、78-86、138、139、144、198、204、211、281、240、249、300、321、419、429、437、457、466、486、602、606、627、636、645、803、971、1026、1044、1173、1194、1251、1278、1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
25.一種基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，所述至少10個連續(xù)核苷酸對應于由B組鏈球菌的cpsE-cpsF-cpsG基因簇的從cpsE基因的3’端第136位堿基對到cpsG基因的5′端第218位堿基對所限定的序列中的一個區(qū)域，所述多核苷酸中包含一或多個在各型B組鏈球菌型之間有變化的核苷酸。
26.權利要求25中的多核苷酸，其中所述的在各型B組鏈球菌型之間有變化的核苷酸對應于下列位置中的一或多個位置即圖1中所示的第1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
27.一種基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，所述至少10個連續(xù)核苷酸對應于B組鏈球菌的cpsI/M基因中的一個區(qū)域，所述多核苷酸包含一或多個在各型鏈球菌血清型之間有變化的核苷酸。
28.權利要求27中的多核苷酸，其中所述的多核苷酸選自表2所示的核苷酸序列。
29.一種基本上由至少10個連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，所述至少10個連續(xù)核苷酸對應于B組鏈球菌的rib、alp2或alp3基因中的一個區(qū)域，所述多核苷酸包含一或多個在各型B組鏈球菌亞型之間有變化的核苷酸。
30.權利要求29中的多核苷酸，其中所述的多核苷酸選自表6所示的核苷酸序列。
31.權利要求23-30中任一項所述的多核苷酸在B組鏈球菌血清分型和/或亞分型方法中的用途。
32.一種組合物，其包含一系列如權利要求23-30中任一項所述的多核苷酸。
33.權利要求32所述的組合物在B組鏈球菌血清分型和/或亞分型方法中的用途。
34.一種微陣列，其包含一系列如權利要求23-30中任一項所述的多核苷酸。
35.權利要求34所述的微陣列在B組鏈球菌血清分型和/或亞分型方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于B組鏈球菌分型的分子方法，以及用于該方法的多核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK1610756SQ02822915
公開日2005年4月27日 申請日期2002年9月18日 優(yōu)先權日2001年9月19日
發(fā)明者孔繁榮, 格溫德琳·吉爾伯特 申請人:西悉尼地區(qū)健康服務中心