專利名稱：用于提高核黃素產(chǎn)量的遺傳菌株的優(yōu)化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組產(chǎn)生核黃素的方法。由于對阿舒囊霉屬(Ashbya)生物的核黃素合成基因或基因的組合以及它們的表達進行了特別選擇，核黃素在這些生物中的產(chǎn)量得到了提高。
維生素B2，也稱作核黃素，所有的植物和許多微生物都能夠產(chǎn)生這種物質(zhì)。由于人類和動物不能合成核黃素，因此核黃素是必需的。核黃素在新陳代謝中起著重要的作用。例如它參與碳水化合物的利用。維生素B2的缺乏會導致口和咽粘膜的炎癥、皮膚襞搔癢、炎癥及類似的皮膚損傷、結膜炎、視覺靈敏度下降及角膜渾濁。嬰幼兒體內(nèi)缺乏B2會導致生長延緩和體重下降。因此維生素B2具有重要的經(jīng)濟意義，例如它可在維生素缺乏的時候作為維生素補充物并且可以作為飼料添加劑。它也可以添加到許多食品中去。此外，維生素B2還可用作如蛋黃醬、冰淇淋和牛奶凍等食品的著色劑。
維生素B2可化學制備或用微生物來產(chǎn)生(參見如B.Kurth等，1996，見Ullmann’s Encyclopedia of industrial chemistry，VCH Weinheim一書中的核黃素)。在化學合成核黃素的方法中，通常要經(jīng)過多步驟并且必須使用價格較高的起始物質(zhì)如D-核糖才能獲得高純度的產(chǎn)物。
使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素B2是化學合成核黃素的一種備選方法。這一方法的起始物質(zhì)是可再生的原材料，如糖或植物油。用來產(chǎn)生核黃素的發(fā)酵用真菌已知的有如阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)或棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)(The Merck Index，Windholz等編輯，Merck& Co.，1183頁，1983)，但是酵母如假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬(Saccharomyces)，或細菌如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀細菌屬(Coryne bacteria)等也描述為核黃素的生產(chǎn)者。EP-A-0405370和EP-A-0821063描述了使用重組細菌菌株來進行核黃素的生產(chǎn)，該重組菌株是用核黃素生物合成基因轉化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)得到的。
WO 95/26406和WO 94/11515描述了如何將核黃素生物合成特異的基因從真核生物棉阿舒囊霉和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆的過程，還描述了已用這些基因轉化的微生物以及此類微生物用于合成核黃素的用途。
WO 99/61623描述了核黃素生物合成基因(rib3、rib4、rib5)的選擇是如何用來提高核黃素產(chǎn)量的。
在上述的生物中，從鳥苷三磷酸(GTP)和5-磷酸核酮糖開始共有6種酶催化核黃素的產(chǎn)生。其中，GTP環(huán)化水解酶-II(rib1基因產(chǎn)物)將GTP轉化為2，5-二氨基-6-核糖基氨基-4-(3H)-嘧啶酮-5-磷酸。2，5-二氨基-6-核糖基氨基-4-(3H)-嘧啶酮-5-磷酸還原酶(rib7基因產(chǎn)物)接下來將2，5-二氨基-6-核糖基氨基-4-(3H)-嘧啶酮-5-磷酸還原生成2，5-二氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮-5-磷酸，隨后2，5-二氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮-5-磷酸被特異的脫氨酶(rib2基因產(chǎn)物)脫去氨基生成5-氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮-5-磷酸。這種磷酸酯再被非特異的磷酸酶去磷酸化。
5-磷酸核酮糖是在核黃素生物合成最后的酶促步驟中除GTP以外的另一起始物質(zhì)，5-磷酸核酮糖被3，4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸合酶(rib3基因產(chǎn)物)轉化為3，4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸(DBP)。
DBP和5-氨基-6-核糖基氨基-2，4-(1H，3H)-嘧啶酮都是酶促合成6，7-二甲基-8-核糖基-2，4-二氧四氫蝶啶的起始材料。這個反應由rib4基因產(chǎn)物(DMRL合酶)催化。DMRL接著被核黃素合酶(rib5基因產(chǎn)物)轉化為核黃素(Bacher等(1993)，Bioorg.Chem.Front.3卷，SpringerVerlag)。
盡管在核黃素產(chǎn)生上已經(jīng)取得了這些進展，仍然有必要改進和提高核黃素的生產(chǎn)率以適應需求的增長，并提升核黃素產(chǎn)生的效率。
本發(fā)明的一個目的是進一步提高維生素B2的生產(chǎn)率。通過微生物產(chǎn)生核黃素的方法，本發(fā)明人實現(xiàn)了這一目的，該方法通過培養(yǎng)一種能夠產(chǎn)生核黃素的阿舒囊霉屬的微生物，隨后從培養(yǎng)基分離所產(chǎn)生的核黃素，所述阿舒囊霉屬的微生物在選自rib1、rib2、rib4和rib7的至少兩種基因的產(chǎn)物與野生型ATCC 10895相比顯示出更高的活性。
這種提高核黃素產(chǎn)量的方法，優(yōu)選地用能夠合成核黃素并且其中具有例如以下rib基因產(chǎn)物的結合顯示出活性提高的生物(數(shù)字在每一情況下均表示所討論的rib基因產(chǎn)物)1+2，1+4，1+7，2+4，2+7，4+7。
特別優(yōu)選的是這樣的生物，其中以下rib基因產(chǎn)物的組合顯示出活性的提高(數(shù)字在每一情況下均表示所討論的rib基因產(chǎn)物)1+2+4，1+2+7，1+4+7，2+4+7。
對這些rib基因產(chǎn)物提高的活性進行了評估，這是通過與用作參考生物的棉阿舒囊霉菌株ATCC 10895相比較而實施的。測定rib基因產(chǎn)物活性亦即酶活性的相關方法為本領域技術人員所公知，并在文獻中有所描述。
對于提高維生素B2的生產(chǎn)率，更為有益的方法是將自然酶活性的提高和上述基因組合的導入相結合來提高基因表達。
本發(fā)明方法的合適生物或宿主生物原則上可以是阿舒囊霉屬中所有能夠合成核黃素的生物。
術語rib基因產(chǎn)物不僅指序列表中SEQ ID NO2、4、6、8所描述的多肽序列，也指那些可以通過對這些序列進行氨基酸密碼子的替換、插入或刪除而獲得的多肽序列，其中替換、插入或刪除在氨基酸密碼子中為不超過5％，優(yōu)選地不超過3％，特別優(yōu)選地不超過2％的多肽序列。例如自然等位基因的變異可以產(chǎn)生上述序列，它們也可通過對原始菌株進行誘變處理(例如誘變劑或者電磁輻射)并隨后進行核黃素生產(chǎn)率提高的篩選來獲得。
根據(jù)本發(fā)明rib1、rib2、rib4和rib7基因的結合和/或這些基因和它們的基因產(chǎn)物提高的活性使核黃素生產(chǎn)率顯著提高。上述的基因原則上可以通過所有目前本領域技術人員公知的方法導入到生物中；有利地，用基因槍或顯微注射等現(xiàn)有技術將這些基因轉化、轉染、電穿孔導入生物或它們的細胞中。就微生物來說，本領域技術人員可從下列教科書中找到合適的方法Sambrook J.等，(1989)分子克隆實驗室手冊，Cold SpringHarbor Laboratory Press；F.M.Ausubel等，(1994)現(xiàn)代分子生物學技術(Current protocols in molecular biology)，John Wiley and Sons；D.M.Glover等，DNA克隆(DNA Cloning)卷1，(1995)，IRL Press(ISBN019-963476-9)；Kaiser等(1994)酵母遺傳學方法(Methods in YeastGenetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press或Guthrie等，酵母遺傳學和分子生物學指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶學方法，1994，Academic Press?？梢蕴岬降挠幸娣椒ǖ膶嵗抢缭趗ra-3基因特別是阿舒囊霉屬ura-3基因的協(xié)助下，通過同源或異源重組導入DNA，德國申請DE 19801120.2和/或下述的REMI法(＝“限制性酶介導的整合”)對此進行了描述。
REMI技術是以兩端用相同限制性內(nèi)切酶酶切的線性DNA構建體及用于限制性切割該DNA構建體的限制性內(nèi)切酶的共轉化為基礎的。因此，該限制性內(nèi)切酶剪切下述生物的基因組DNA，其中所述生物為已導入上述DNA構建體和限制性酶的生物。這導致同源修復機制被激活。這些修復機制修復基因組DNA上由內(nèi)切酶造成的鏈斷裂，與此同時，也會以一定的頻率將共轉化的DNA構建體摻入基因組。通常，DNA兩端的限制性酶切位點得到保留。
Blker等在真菌的插入誘變中描述了這種技術(Mol Gen Genet，248，1995547-552)。為了闡明酵母中異源重組的存在，Schiestl和Petes(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，19917585-7589)使用過這種方法。Brown等(Mol.Gen.Genet.251，199675-80)描述了這種方法用于誘導型報告基因的穩(wěn)定轉化和可調(diào)節(jié)的表達。迄今為止，這種系統(tǒng)還沒有作為優(yōu)化代謝途徑或蛋白的商業(yè)過量表達的遺傳工程工具使用過。
有關核黃素的生物合成，已顯示生物合成基因可以通過REMI法整合入上述生物的基因組中，并且可以優(yōu)化初級和次級代謝所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生過程，特別是生物合成途徑，其中所述代謝產(chǎn)物例如氨基酸(如賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸或色氨酸)、維生素(如維生素A、B2、B6、B12、C、D、E、F、S-腺苷甲硫氨酸、生物素、泛酸或葉酸)、類胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素、菌脂色素(lycopin)、角黃素、蝦青素或玉米黃質(zhì))、或蛋白質(zhì)如水解酶(諸如脂肪酶、酯酶、酰胺酶、腈水解酶、蛋白酶)、介質(zhì)如細胞因子，例如淋巴因子(如MIF、MAF、TNF)、白細胞介素如白細胞介素1、干擾素(如γ-干擾素)、tPA、激素(如蛋白激素、糖激素)、寡肽激素或多肽激素(如抗利尿激素、內(nèi)啡肽、內(nèi)皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)、生長因子促紅細胞生成素、轉錄因子、整合蛋白(如GPIIb/IIIa或αvβ以及III)、受體(如多種谷氨酸受體)或血管發(fā)生因子如血管緊張素。
利用REMI法可將本發(fā)明的核酸片段或上述基因的核酸片段置于基因組中的轉錄活性位點。
將核酸與至少一個報告基因一起克隆至DNA構建體上是有益的，而此DNA構建體將導入基因組內(nèi)。這種報告基因應當易于通過生長分析、熒光分析、化學發(fā)光分析、生物發(fā)光分析或通過光度測定進行檢測。可提及的報告基因的實例有抗生素抗性基因、水解酶基因、熒光蛋白基因、生物發(fā)光基因、葡萄糖苷酶基因、過氧化物酶基因或者生物合成基因(如核黃素基因、螢光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、gfp基因、脂肪酶基因、酯酶基因、過氧化物酶基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、乙酰轉移酶基因、磷酸轉移酶基因或腺苷酰轉移酶基因)。這些基因使得轉錄活性的檢測和定量易于進行，因此對基因的表達檢測和定量也易于進行。因此，在基因組上的定位即可得到確定，而其顯示生產(chǎn)率的差異不超過2倍(見

圖1)。圖1顯示通過整合得到的克隆LU21#1和LU21#2，以及它們不同的維生素B2(＝核黃素)生產(chǎn)率。
而如果生物合成基因本身易于檢測，比如本申請中核黃素這樣的情況，也可以不用額外的報告基因。
如果導入生物體內(nèi)的基因不止一個，所有的這些基因可以與一個報告基因克隆入一個載體中共同導入生物體，每個基因也可以分別與一個報告基因克隆入分別的載體上，將這些分別的載體同時或依次導入生物體。編碼所討論活性的基因片段也可使用REMI技術進行操作。
原則上，所有已知的限制性酶都適用于本發(fā)明方法的將生物合成基因整合入生物基因組中。但是只識別4個堿基對酶切位點的限制性酶由于它們在欲整合的基因組或載體中剪切過頻而不被優(yōu)選；優(yōu)選的是識別6、7、8或者更多堿基對作為酶切位點的限制性酶，比如BamHI、EcoRI、BglII、SphI、SpeI、XbaI、XhoI、NcoI、SalI、ClaI、KpnI、HindIII、SacI、PstI、BpnI、NotI、SrfI或SfiI，以及其它未提到的可能的限制性酶。當所用限制性酶在欲導入的DNA上不再有酶切位點是有利的，這樣可提高整合效率。通常在REMI混合物中，限制性酶用量為5-500U，優(yōu)選10-250U，特別優(yōu)選10-100U。限制性酶有利地用于包含滲透穩(wěn)定物質(zhì)的水溶液中，其中所述滲透穩(wěn)定物質(zhì)如糖類(諸如蔗糖、海藻糖或葡萄糖)、多羥基化合物(如甘油或聚乙二醇)，具有有利緩沖范圍pH5-9的緩沖劑，優(yōu)選緩沖范圍pH6-8，特別優(yōu)選pH7-8，其中所述緩沖劑如Tris，MOPS，HEPES，MES或PIPES和/或穩(wěn)定核酸的物質(zhì)，如Mg、Cu、Co、Fe、Mn或Mo的無機鹽或有機鹽。根據(jù)需要，還可存在其它物質(zhì)如EDTA、EDDA、DTT、β-巰基乙醇或核酸酶抑制劑。但是，REMI技術也可以在沒有這些添加物時進行。
本發(fā)明的方法在5-80℃的溫度范圍內(nèi)進行，優(yōu)選10-60℃，特別優(yōu)選20-40℃。所有已知的使細胞膜不穩(wěn)定的方法都適用于本發(fā)明的方法，例如電穿孔、與運載囊泡融合或者用多種堿金屬鹽或堿土金屬鹽如鋰鹽、銣鹽或鈣鹽去穩(wěn)定，其中優(yōu)選鋰鹽。
核酸在分離后可以直接用于或純化后用于本發(fā)明的反應。
原則上，可用本領域技術人員公知的所有方法將rib基因的本發(fā)明提及的組合導入植物。
將外源基因轉移入植物基因組稱作轉化。在本申請中，所描述的轉化和從植物組織或植物細胞再生植物的方法可用于進行瞬時或穩(wěn)定的轉化。合適的方法有通過聚乙二醇誘導DNA攝入的原生質(zhì)體轉化、使用基因槍、電穿孔、在含DNA的溶液中干燥胚的培養(yǎng)、顯微注射以及農(nóng)桿菌介導的基因轉移。上述方法在例如B.Jenes等，基因轉移技術(Techniques forGene Transfer)，見轉基因植物，卷1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press(1993)128-143以及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225中有描述。優(yōu)選地，將待表達的構建體克隆入適于轉化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的載體，如pBin19(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。用根癌農(nóng)桿菌轉化植物在例如Hfgen和Willmitzer，Nucl.Acid Res.(1988)16，9877一文中有描述。
根據(jù)本發(fā)明，攜帶表達載體的農(nóng)桿菌也可通過已知的方法，例如通過將切割的葉及葉片浸入農(nóng)桿菌溶液中，隨后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來轉化植物，特別是作物植物，如谷物、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、蕓苔、向日葵、亞麻、大麻、馬鈴薯、煙草、西紅柿、油菜、紫花苜蓿、萵苣、多種樹木、堅果、葡萄樹以及豆類。
經(jīng)遺傳修飾的植物細胞可通過所有本領域技術人員公知的方法進行再生。合適的方法在上述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hfgen和Willmitzer發(fā)表的論文中找到。
有很多可能性可以提高細胞中rib基因產(chǎn)物的酶活性。
一種可能性是通過某種方法修飾內(nèi)源的rib1、2、4、7基因以至于它們編碼的酶的1、2、4或7的活性表現(xiàn)出比起始酶更高的活性。通過例如催化中心的改變來提高底物的轉化，或者通過中和酶抑制劑的作用，可以對酶活性產(chǎn)生不同方面的提高，亦即它們的特異活性被提高或者它們的活性沒有被抑制。在一個更為有利的實施例中，酶活性的提高也可能通過細胞中酶合成的提高來實現(xiàn)，例如通過去除抑制酶合成的因子，或者提高促進酶合成的因子或調(diào)節(jié)元件的活性，或者優(yōu)選地，通過導入更多的基因拷貝。這些措施提高細胞中基因產(chǎn)物的整體活性而不改變其特異活性。這些方法也可以結合使用，亦即特異活性和整體活性都得以提高?；旧?，可通過本領域技術人員公知的方法對這些基因、調(diào)控元件或其啟動子的核酸序列進行修飾。為此目的，序列可以進行例如誘變，比如進行定點誘變，D.M.Glover等，DNA Cloning，卷1，(1995)，IRL Press(ISBN 019-963476-9)，第6章，193頁對此有描述。
Spee等(Nucleic Acids Research，21卷，3期，1993777-778)描述了利用dITP進行隨機誘變的PCR法。
Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91卷，199410747-10751)描述了利用體外重組技術進行分子進化的研究。
Moore等(Nature Biotechnology，14卷，1996458-467)描述了PCR方法和重組方法的結合。
修飾后的核酸序列隨后通過載體返回生物體內(nèi)。
為了提高酶活性，也可將修飾后的啟動子區(qū)置于天然基因的上游以提高基因的表達水平，并且因此提高酶活性。也可在3′端導入例如提高mRNA穩(wěn)定性從而提高翻譯水平的序列。這也可以帶來酶活性的提高。
優(yōu)選地，將額外的rib1、2、7和4基因拷貝聯(lián)合導入細胞內(nèi)。對這些基因拷貝可以進行天然調(diào)節(jié)，可以進行在天然調(diào)節(jié)區(qū)被修飾以至于它們可提高基因表達的經(jīng)修飾調(diào)節(jié)，或可采用異源基因或?qū)嶋H為不同物種基因的調(diào)節(jié)序列。
將上述方法結合起來尤其有利。
在本發(fā)明方法中，將序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7或者它們的功能等同物進行結合是有利的。
為了實現(xiàn)異源基因在生物中的最佳表達，按照生物特定的密碼子使用對核酸序列進行修飾是有利的。密碼子使用易于通過計算機對所討論生物的其他已知基因進行計算評估來確定。
增加rib1、2、7和4的基因拷貝數(shù)和/或增強rib1、2、7、4基因表達的正調(diào)節(jié)因子都將有利地提高rib1、2、7、4基因的表達。因此，通過使用強轉錄信號如啟動子和增強子在轉錄水平上提高調(diào)節(jié)元件是優(yōu)選的。但是除此之外，例如通過提高rib1、2、7、4 mRNA的穩(wěn)定性或通過提高核糖體上此mRNA的讀碼效率，也可能實現(xiàn)翻譯水平的提高。
為了提高基因拷貝數(shù)，例如可將rib基因1、2、7、4或同源基因摻入核酸片段或載體，其中所述核酸片段或載體優(yōu)選包含rib基因的調(diào)節(jié)基因序列或者具有類似效果的啟動子活性。
所使用的調(diào)節(jié)序列尤其為那些提高基因表達的序列。但是，備選地，可將每個上述基因?qū)氇毩⑤d體并轉化到所討論的生產(chǎn)用生物中。
本發(fā)明的核酸片段理解為可操作地與一個或多個調(diào)節(jié)信號連接的rib基因序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7或者它們的功能等同物，其中所述調(diào)節(jié)信號優(yōu)選可提高基因表達的調(diào)節(jié)信號。這些調(diào)節(jié)序列是，例如與誘導子或阻遏子結合的序列，因此可以調(diào)節(jié)核酸的表達。除了這些新的調(diào)節(jié)序列外，或者說并非這些序列，還有這些序列的天然調(diào)節(jié)仍可存在于實際的結構基因的上游，并且根據(jù)需要，可對它們進行遺傳修飾，從而去除天然調(diào)節(jié)，提高基因表達。但是，基因構建體也可在結構上更簡單，也就是說沒有額外的調(diào)節(jié)信號被插入到SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7或它們的功能等同物的序列上游，并且天然的啟動子及它的調(diào)節(jié)并沒有被去除。取而代之的是，天然調(diào)節(jié)序列被突變，從而使得調(diào)節(jié)不再發(fā)生并提高基因表達。這些修飾過的啟動子也可插入到它們自己的天然基因上游以提高活性。此外，基因構建體可以有利地包含一個或多個與啟動子可操作地連接的已知增強子序列，這樣有可能會提高核酸序列的表達。額外的有利序列如其它調(diào)節(jié)元件或終止子可以插入DNA序列的3’端。一個或多個rib基因拷貝可以出現(xiàn)在基因構建體中。
用于本發(fā)明方法的有利調(diào)節(jié)序列的例子為例如啟動子cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL啟動子，這些序列在革蘭氏陰性細菌中有利地使用。而更為有利的調(diào)節(jié)序列為例如革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2，酵母或真菌啟動子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH，或植物啟動子CaMV 35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos，或者在泛素或菜豆球蛋白啟動子上。本申請中，例如來自漢森酵母屬中的丙酮酸脫羧酶和甲醇氧化酶啟動子也是有利的。而更為有利的植物啟動子有例如苯磺酰氨誘導的啟動子(EP 388186)、四環(huán)素誘導的啟動子(Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404))、脫落酸誘導的啟動子(EP 335528)或是乙醇或環(huán)己酮誘導的啟動子(WO 9321334)。那些確保在嘌呤或其前體生物合成發(fā)生部位的組織或植物部分中表達的植物啟動子尤其有利。確保葉特異性表達的啟動子必須特別提及。特別提及馬鈴薯胞質(zhì)FBPase啟動子或馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445 245)。甘氨酸max磷酸核糖焦磷酸酰胺轉移酶啟動子(也見Genbank登錄號U87999)或另一個在EP 249676中提到的結節(jié)特異啟動子也可有利地得到利用。
基本上，所有的天然啟動子和其調(diào)節(jié)序列，例如上面提到的那些，都可以用于本發(fā)明的方法。除此之外，合成的啟動子也可有利地得到利用。
導入生物內(nèi)的其它基因可以像上述描述的那樣額外地置于核酸片段上(＝基因構建體)。這些基因可以受到獨立的調(diào)節(jié)或置于與rib基因相同的調(diào)節(jié)區(qū)下。這些基因可以是例如可能提高合成的其它生物合成基因。
對于在上述宿主生物中的表達，核酸片段有利地插入可使宿主菌中的基因表達優(yōu)化的載體上，例如質(zhì)粒、噬菌體或其他DNA。合適質(zhì)粒的實例有，例如大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，鏈霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽胞桿菌中的pUB110、pC194或pBD214，棒狀桿菌中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51，或是上述質(zhì)粒的衍生物。上述提到的質(zhì)粒只構成可供選擇的較少的質(zhì)粒。其它質(zhì)粒為本領域技術人員所公知，并且可在例如克隆載體(Cloning Vectors)(Pouwels P.H等編輯，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)一書中找到。合適的植物載體尤其在“植物分子生物學及生物技術方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)”(CRC Press)6/7章，71-119頁中得以描述。
為了表達其它存在的基因，該核酸片段另外優(yōu)選還包括用于提高表達的3’-和/或5’-末端調(diào)節(jié)序列，對該序列進行選擇以優(yōu)化被選中的宿主生物和基因與表達的關系。
這些調(diào)節(jié)序列用于使得有控制的基因和蛋白質(zhì)表達成為可能。這意味著，取決于宿主生物，例如，基因僅在誘導后表達和/或過表達，或是立即表達和/或過表達。
本申請中，調(diào)節(jié)序列或因子可以優(yōu)選具有正向調(diào)節(jié)效果，并且因此提高導入基因的基因表達。因而，優(yōu)選地，通過使用強轉錄信號如啟動子和/或增強子在轉錄水平來實現(xiàn)調(diào)節(jié)元件的增強。但是，除此之外，翻譯的增強也可能通過例如提高mRNA的穩(wěn)定性來實現(xiàn)。
在載體的另一個實施方案中，本發(fā)明的基因構建體有利地以線性DNA的形式導入微生物體內(nèi)并且通過異源或同源重組整合入宿主生物的基因組。這個線性DNA可由線性化的質(zhì)?；蛘邇H僅由作為載體的核酸片段組成。
任何能在細胞中自主復制的質(zhì)粒(但是特別是攜帶釀酒酵母2μm質(zhì)粒復制起點的質(zhì)粒)，都同樣可以用作載體，但是同樣如前所述，可整合到宿主染色體內(nèi)的線性DNA片段也是可以用作載體的。這種整合可以通過異源或同源重組實現(xiàn)，但是優(yōu)選如所提及的那樣通過同源重組整合(Steiner等，Genetics，140卷，1995973-987)。本申請中，基因rib1、rib2、rib4和rib7可以分別存在于基因組的不同位置或存在于不同的載體上或可以共同地位于基因組或一個載體上。
用于本發(fā)明方法中的包含rib基因1、2、7和4或它們的功能等同物的組合的生物顯示出核黃素產(chǎn)量的提高。
在本發(fā)明方法中，用于產(chǎn)生核黃素的生物培養(yǎng)在允許其生長的培養(yǎng)基中。這些培養(yǎng)基可以是合成的培養(yǎng)基或天然的培養(yǎng)基?？墒褂貌⑦x擇適合該生物生長的本領域技術人員公知的培養(yǎng)基。所用培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機鹽和根據(jù)需要包含少量維生素及微量元素以支持微生物生長。
有利的碳源實例為糖(如單糖、二糖或多糖(如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素)、復合糖源(如糖蜜)、糖磷酸鹽(如1，6-二磷酸果糖)、糖醇(如甘露醇)、多羥基化合物(如甘油)、醇類(如甲醇或乙醇)、羧酸(如檸檬酸、乳酸或乙酸)、脂肪(大豆油或油菜油)、氨基酸如氨基酸混合物(如水解酪蛋白氨基酸)或單個氨基酸(如甘氨酸或天冬氨酸)或者氨基糖，后面提及的這些也可以同時作為氮源。
有利的氮源為有機或者無機含氮化合物或包含這些化合物的材料。實例有銨鹽如NH4Cl或(NH4)2SO4、硝酸鹽、尿素，或者復合氮源，如玉米漿、啤酒酵母自溶物、大豆粉、面筋、酵母提取物、肉膏、酪蛋白水解物、酵母或馬鈴薯蛋白，所有這些都可以經(jīng)常同時作為氮源。
無機鹽的實例有鈣鹽、鎂鹽、鈉鹽、鈷鹽、鉬鹽、錳鹽、鉀鹽、鋅鹽、銅鹽和鐵鹽。而作為這些鹽的陰離子，氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽應當特別提及。本發(fā)明方法中提高生產(chǎn)率的一個重要因素是對生產(chǎn)培養(yǎng)基中Fe2+或Fe3+離子濃度的控制。
根據(jù)需要，營養(yǎng)培養(yǎng)基中應再補充一些生長因子如維生素或生長促進劑(如生物素、核黃素、維生素B1、葉酸、煙酸、泛酸鹽或維生素B6、氨基酸(如丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸或纈氨酸)、羧酸(如檸檬酸、蟻酸、庚二酸或乳酸)，或如二硫蘇糖醇這樣的物質(zhì)。
上述營養(yǎng)物質(zhì)的混合比例根據(jù)發(fā)酵類型不同而定，并且要根據(jù)個案來調(diào)整。所有的培養(yǎng)基成分可在發(fā)酵開始時準備好，此前根據(jù)需要進行單獨或共同滅菌，也可以根據(jù)需要在發(fā)酵過程中連續(xù)加入或分批加入。
生長條件設定為使得所述生物的生長良好，從而盡量獲得最高的產(chǎn)量。優(yōu)選的生長溫度是15-40℃，特別優(yōu)選25-37℃。pH值范圍優(yōu)選3-9，特別優(yōu)選5-8。通常，培養(yǎng)時間可以從若干小時到若干天，優(yōu)選8小時到21天，特別優(yōu)選4小時到14天，所述生長時間通常是足夠的。在此時期，培養(yǎng)基中的產(chǎn)物可以最大程度地積累。
本領域技術人員可以從例如下列教科書中找到培養(yǎng)基的優(yōu)化應用微生物生理學，“實用方法”(Applied Microbial Physiology，“A PracticalApproach”)(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury編輯，IRL Press，1997，53-73頁，ISBN 0 19 963577 3)。而有益于芽孢桿菌和其他生物的培養(yǎng)基和生長條件可在專利EP A 0405370的公開文本特別是其實施例9中獲知，適用于假絲酵母生長的培養(yǎng)基和生長條件可在專利WO 88/09822的公開文本特別是其表3中獲知，適用于阿舒囊霉屬生長的培養(yǎng)基和生長條件可在Schmidt等(Microbiology，142，1996419-426)發(fā)表的論文中獲知。
本發(fā)明的方法可以連續(xù)地或不連續(xù)地以分批培養(yǎng)或補料分批培養(yǎng)實施。
取決于所用生物初始的生產(chǎn)率，通過本發(fā)明的方法核黃素生產(chǎn)率能夠得到或多或少的提高。一般來說生產(chǎn)率會比原始菌株有利地提高至少5％，優(yōu)選至少10％，特別優(yōu)選20％，尤其特別優(yōu)選較原始菌株生產(chǎn)率至少提高100％。
實施例從棉阿舒囊霉和釀酒酵母中分離rib基因1，2，3，4，5和7在專利WO 95/26406和WO 93/03183且尤其是在實施例中有所描述，并且其操作相似。這些公開文本在此處特別提及。
序列1顯示了包含轉化所需的選擇性標記之外還攜帶有rib1、rib2、rib4和rib7基因片段的DNA構建體。
常規(guī)方法例如克隆、限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的連接、微生物轉化、細菌培養(yǎng)和重組DNA的序列分析，這些方法除非特別指出，都可以參照Sambrook等(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory PressISBN 0-87969-309-6)描述的方法實施。
重組DNA分子按照Sanger法(Sanger等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)采用ABI激光熒光DNA測序儀測序。聚合酶鏈反應的片段被測序并進行修正以避免待表達的構建體中聚合酶導致的錯誤。
實施例1包含rib1，rib2，rib4和rib7基因拷貝的DNA構建體的克隆(載體Tef-G418-Tef rib1，2，7，4)。
rib基因的表達構建體載體TefG418Tefrib3，4，5在WO 99/61623中描述。該載體用KpnI酶切，沉淀，重新溶解并隨后用NheI部分消化。將用NheI和KpnI酶切一次的較大片段從瓊脂糖凝膠中分離出來。rib7基因從pJR765載體中(在WO 95/26406中描述)用PCR(引物TCGAGGTACCGGGCCCCCCCTCGA；TCGAACTAGTAGACCAGTCAT)克隆出來。該特異性PCR產(chǎn)物用KpnI/SpeI酶切并且與上述KpnI/NheI酶切載體連接。由此產(chǎn)生TefG418Tefrib7，4載體。
rib2基因從載體pJR758(WO 95/26406)通過PCR擴增，并且產(chǎn)物用SpeI和NheI酶切(引物CCCAACTAGTCTGCAGGACAATTTAAA；AGTGCTAGCCTACAATTCGCAGCAAAAT)。該DNA片段與NheI酶切并經(jīng)磷酸酶處理過的載體TefG418Tefrib7，4連接。由此產(chǎn)生TefG418Tefrib7，4，2.載體。
Rib1基因通過PCR從載體pJR765(WO 95/26406)擴增(引物GTAGTCTAGAACTAGCTCGAAACGTG；GATTCTAGAACTAGAACTAGTGGATCCG)并且用XbaI酶切。該DNA片段與NheI酶切并經(jīng)磷酸酶處理過的載體TefG418Tefrib7，4，2連接。
獲得的DNA構建體構成了Tef-G418-rib1，2，7，4載體。
實施例2將DNA構建體轉化入真菌棉阿舒囊霉。
用限制性酶XbaI徹底酶切實施例1中所述DNA構建體(載體Tef-G418-rib1，2，4，7)，攜帶rib基因序列的插入片段通過瓊脂糖凝膠分離進行純化。
將MA2培養(yǎng)基(10g/l細菌用蛋白胨，1g/l酵母提取物、0.3g/l肌醇以及10g/l D-葡萄糖)與阿舒囊霉孢子一起培養(yǎng)。培養(yǎng)物于4℃下培養(yǎng)12小時，隨后于28℃下?lián)u晃培養(yǎng)13小時。細胞懸液離心沉淀，細胞沉淀以5ml pH7.5的50mM磷酸鉀緩沖液(含25mM DTT)重懸。在28℃下熱處理30分鐘后，細胞再次離心沉淀，于25ml STM緩沖液(270mM蔗糖，10mM TRIS-HCl pH7.5，1mM MgCl2)重懸。0.5ml的這種懸液用大約3μg的上述純化插入片段和40U SpeI酶處理，并用Biorad基因脈沖發(fā)生器進行電穿孔(100Ω，20μF，1.5kV)。電穿孔后，這些細胞用1ml的MA2培養(yǎng)基處理并且涂布到MA2瓊脂培養(yǎng)平板上。為了使用抗生素篩選，這些平板在28℃下培養(yǎng)5小時后用一層包含抗生素G418(200μg/ml)的5ml低熔點瓊脂糖覆蓋。轉化株通過顯微操作技術進行克隆純化(Steiner和Philipsen(1995)Genetics，140；973-987)。
通過對轉化體基因DNA進行PCR分析來證實構建體的成功整合?；蚪MDNA通過Carle和Olson(Proc.Natl.Acad.Sci，1985，82，3756-3760)以及Wright和Philipsen(Gene，1991，109，99-105)所述的方法進行分離。PCR用R.Saiki(PCR方法，1990，Academic Press，13-20)的方法以構建體特異的引物進行。PCR片段的分析通過在瓊脂糖凝膠中分離進行。
對所有的轉化株來說，對基因組的成功整合都可通過PCR方法驗證。
實施例3重組棉阿舒囊霉克隆中核黃素的測定將棉阿舒囊霉LU21(野生型菌株，ATCC 10895)和實施例1中所述構建體經(jīng)轉化得到的菌株LU21#1和#2在瓊脂培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)4天。用3個包含10ml培養(yǎng)基(27.5g/l酵母提取物，0.5g/l硫酸鎂，50ml/l豆油，pH7.0)的100ml三角瓶從此平板上接種培養(yǎng)。在搖床上以28℃和180轉/分培養(yǎng)40小時后，將1ml培養(yǎng)液轉移至包含20mlYPD培養(yǎng)基(10g/l酵母提取物，20g/l細菌用蛋白胨，20g/l葡萄糖)的250ml三角瓶中。在28℃和300轉/分下培養(yǎng)。190小時后，從每個瓶子中取1ml樣品，并用1ml的1M高氯酸處理。樣品經(jīng)過濾，用HPLC分析測定核黃素含量。以核黃素標準品(10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l)校準。
測定核黃素所用HPLC法的參數(shù)柱 ODS Hypersil 5mm 200×2.1mm(HP)洗脫液A將340ml H3PO4(89％)加至水中至pH2.3洗脫液B100％乙腈梯度停留時間 0-6分鐘.2％B-50％B6-6.5分鐘50％B-2％B流速 0.5ml/分鐘檢測 280nm溫度 40℃進樣 2-10ml與起始菌株比較，包含有額外rib基因1，2，4和7拷貝的克隆#1和#2批次顯示核黃素生產(chǎn)率得到顯著提高(圖1)。
圖1顯示不同克隆的核黃素產(chǎn)量。與未修飾的菌株比較，通過導入rib1、2、4和7基因，核黃素產(chǎn)量可提高到135％。
序 列 表<110>巴斯福股份公司<120>用于提高核黃素產(chǎn)量的遺傳菌株的優(yōu)化<130>NAE 176/01<140>
<141>
<160>8<170>PatentIn版本2.0<210>1<211>1052<212>DNA<213>棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)<220>
<221>CDS<222>(137)..(1042)<400>1aaaggctttt ccgtaggtgc tttgtcattc aacaatccac gtcggaattg gcgactatat 60agtgtagggc ccataaagca gtagtcggtg ttgatagctg tgtcagacca actctttgtt 120aattactgaa gctgat atg act gaa tac aca gtg cca gaa gtg acc tgt gtc 172Met Thr Glu Tyr Thr Val Pro Glu Val Thr Cys Val1 5 10gca cgc gcg cgc ata ccg acg gta cag ggc acc gat gtc ttc ctc cat 220Ala Arg Ala Arg Ile Pro Thr Val Gln Gly Thr Asp Val Phe Leu His15 20 25cta tac cac aac tcg atc gac agc aag gaa cac cta gcg att gtc ttc 268Leu Tyr His Asn Ser Ile Asp Ser Lys Glu His Leu Ala Ile Val Phe30 35 40ggc gag aac ata cgc tcg cgg agt ctg ttc cgg tac cgg aaa gac gac 316Gly Glu Asn Ile Arg Ser Arg Ser Leu Phe Arg Tyr Arg Lys Asp Asp
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<212>DNA<213>棉阿舒囊霉<220>
<221>CDS<222>(209)..(2038)<400>3agacgtcaca gatatactac tgatgttgtt ctccagagta tactacgccc ctaccatatt 60cgatcttgtg gtattgacga tattcctctg tttggtttta ctggcactat tccgtttgac 120ggtatagcgc tattcgttca tagtgacaca tgcggcacta gctattcagc gaatccttta 180taaactgcta cttaacgttc gtaacacc atg ctc aaa ggc gtt cct ggc ctt232Met Leu Lys Gly Val Pro Gly Leu1 5ctt ttt aag gag acg caa cgt cat ctg aaa ccc agg ctg gtt agg att 280Leu Phe Lys Glu Thr Gln Arg His Leu Lys Pro Arg Leu Val Arg Ile10 15 20atg gaa aac aca tcg cag gat gag agt cgc aaa aga cag gtc gct tcg 328Met Glu Asn Thr Ser Gln Asp Glu Ser Arg Lys Arg Gln Val Ala Ser25 30 35 40aac ttg agc agc gat gcc gat gag ggc tcg ccg gca gtt acg agg ccg 376Asn Leu Ser Ser Asp Ala Asp Glu Gly Ser Pro Ala Val Thr Arg Pro45 50 55gtt aaa atc acc aaa cgc ctc agg aag aag aac ctc ggg aca ggc gag 424Val Lys Ile Thr Lys Arg Leu Arg Lys Lys Asn Leu Gly Thr Gly Glu60 65 70cta cgg gac aaa gca gga ttc aag ttg aag gtg caa gac gtg agc aaa 472Leu Arg Asp Lys Ala Gly Phe Lys Leu Lys Val Gln Asp Val Ser Lys75 80 85aac cgt cac aga cag gtc gat ccg gaa tac gaa gtc gtg gta gat ggc 520Asn Arg His Arg Gln Val Asp Pro Glu Tyr Glu Val Val Val Asp Gly90 95 100ccg atg cgc aag atc aaa ccg tat ttc ttc aca tac aag act ttc tgc 568Pro Met Arg Lys Ile Lys Pro Tyr Phe Phe Thr Tyr Lys Thr Phe Cys
105 110 115 120aag gag cgc tgg aga gat cgg aag ttg ctt gat gtg ttt gtg gat gaa 616Lys Glu Arg Trp Arg Asp Arg Lys Leu Leu Asp Val Phe Val Asp Glu125 130 135ttt cgg gac cgc gat agg cct tac tac gag aaa gtc atc ggt tcg ggt 664Phe Arg Asp Arg Asp Arg Pro Tyr Tyr Glu Lys Val Ile Gly Ser Gly140 145 150ggt gtg ctc ctg aac ggt aag tca tcg acg tta gat agc gta ttg cgt 712Gly Val Leu Leu Ash Gly Lys Ser Ser Thr Leu Asp Ser Val Leu Arg155 160 165aat gga gac ctc att tcg cac gag ctg cac cgt cat gag cca ccg gtc 760Ash Gly Asp Leu Ile Ser His Glu Leu His Arg His Glu Pro Pro Val170 175 180tcc tct agg ccg att agg acg gtg tac gaa gat gat gac atc ctg gtg 808Ser Ser Arg Pro Ile Arg Thr Val Tyr Glu Asp Asp Asp Ile Leu Val185 190 195 200att gac aag ccc agc ggg att cca gcc cat ccc acc ggg cgt tac cgc 856Ile Asp Lys Pro Ser Gly Ile Pro Ala His Pro Thr Gly Arg Tyr Arg205 210 215ttc aac tcc att acg aaa ata ctt gaa aaa cag ctt gga tac act gtt 904Phe Asn Ser Ile Thr Lys Ile Leu Glu Lys Gln Leu Gly Tyr Thr Val220 225 230cat cca tgt aac cga ctg gac cgc cta acc agt ggc cta atg ttc ttg 952His Pro Cys Asn Arg Leu Asp Arg Leu Thr Ser Gly Leu Met Phe Leu235 240 245gca aaa act cca aag gga gcc gat gag atg ggt gat cag atg aag gcg 1000Ala Lys Thr Pro Lys Gly Ala Asp Glu Met Gly Asp Gln Met Lys Ala250 255 260cgc gaa gtg aag aaa gaa tat gtt gcc cgg gtt gtt ggg gaa ttt cct 1048Arg Glu Val Lys Lys Glu Tyr Val Ala Arg Val Val Gly Glu Phe Pro265 270 275 280ata ggt gag ata gtt gtg gat atg cca ctg aag act ata gag ccg aag 1096Ile Gly Glu Ile Val Val Asp Met Pro Leu Lys Thr Ile Glu Pro Lys
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460 465 470gct aag aaa tgc cca ccc gcg aag aca tca ttt agc gtt ggt gcc gtg 1672Ala Lys Lys Cys Pro Pro Ala Lys Thr Ser Phe Ser Val Gly Ala Val475 480 485tta gtt aat ggg acc gag att ttg gcc act ggt tac tca cgg gag ctg 1720Leu Val Asn Gly Thr Glu Ile Leu Ala Thr Gly Tyr Ser Arg Glu Leu490 495 500gaa ggc aac acg cac gct gaa caa tgt gca ctt caa aaa tat ttt gaa 1768Glu Gly Asn Thr His Ala Glu Gln Cys Ala Leu Gln Lys Tyr Phe Glu505 510 515 520caa cat aaa acc gac aag gtt cct att ggt aca gta ata tac acg act 1816Gln His Lys Thr Asp Lys Val Pro Ile Gly Thr Val Ile Tyr Thr Thr525 530 535atg gag cct tgt tct ctc cgt ctc agt ggt aat aaa ccg tgt gtt gag 1864Met Glu Pro Cys Ser Leu Arg Leu Ser Gly Asn Lys Pro Cys Val Glu540 545 550cgt ata atc tgc cag cag ggt aat att act gct gtt ttt gtt ggc gta 1912Arg Ile Ile Cys Gln Gln Gly Asn Ile Thr Ala Val Phe Val Gly Val555 560 565ctt gag cca gac aac ttc gtg aag aac aat aca agt cgt gcg cta ttg 1960Leu Glu Pro Asp Asn Phe Val Lys Asn Asn Thr Ser Arg Ala Leu Leu570 575 580gaa caa cat ggt ata gac tat att ctt gtc cct ggg ttt caa gaa gaa 2008Glu Gln His Gly Ile Asp Tyr Ile Leu Val Pro Gly Phe Gln Glu Glu585 590 595 600tgt act gaa gcc gca ttg aag ggt cat tga ttttgctgcg aa 2050Cys Thr Glu Ala Ala Leu Lys Gly His605 610<210>4<211>609<212>PRT<213>棉阿舒囊霉
<400>4Met Leu Lys Gly Val Pro Gly Leu Leu Phe Lys Glu Thr Gln Arg His1 5 10 15Leu Lys Pro Arg Leu Val Arg Ile Met Glu Asn Thr Ser Gln Asp Glu20 25 30Ser Arg Lys Arg Gln Val Ala Ser Asn Leu Ser Ser Asp Ala Asp Glu35 40 45Gly Ser Pro Ala Val Thr Arg Pro Val Lys Ile Thr Lys Arg Leu Arg50 55 60Lys Lys Asn Leu Gly Thr Gly Glu Leu Arg Asp Lys Ala Gly Phe Lys65 70 75 80Leu Lys Val Gln Asp Val Ser Lys Ash Arg His Arg Gln Val Asp Pro85 90 95Glu Tyr Glu Val Val Val Asp Gly Pro Met Arg Lys Ile Lys Pro Tyr100 105 110Phe Phe Thr Tyr Lys Thr Phe Cys Lys Glu Arg Trp Arg Asp Arg Lys115 120 125Leu Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Phe Arg Asp Arg Asp Arg Pro Tyr130 135 140Tyr Glu Lys Val Ile Gly Ser Gly Gly Val Leu Leu Asn Gly Lys Ser145 150 155 160Ser Thr Leu Asp Ser Val Leu Arg Ash Gly Asp Leu Ile Ser His Glu165 170 175Leu His Arg His Glu Pro Pro Val Ser Ser Arg Pro Ile Arg Thr Val180 185 190Tyr Glu Asp Asp Asp Ile Leu Val Ile Asp Lys Pro Ser Gly Ile Pro195 200 205Ala His Pro Thr Gly Arg Tyr Arg Phe Asn Ser Ile Thr Lys Ile Leu210 215 220Glu Lys Gln Leu Gly Tyr Thr Val His Pro Cys Asn Arg Leu Asp Arg
225 230 235 240Leu Thr Ser Gly Leu Met Phe Leu Ala Lys Thr Pro Lys Gly Ala Asp245 250 255Glu Met Gly Asp Gln Met Lys Ala Arg Glu Val Lys Lys Glu Tyr Val260 265 270Ala Arg Val Val Gly Glu Phe Pro Ile Gly Glu Ile Val Val Asp Met275 280 285Pro Leu Lys Thr Ile Glu Pro Lys Leu Ala Leu Asn Met Val Cys Asp290 295 300Pro Glu Asp Glu Ala Gly Lys Gly Ala Lys Thr Gln Phe Lys Arg Ile305 310 315 320Ser Tyr Asp Gly Gln Thr Ser Ile Val Lys Cys Gln Pro Tyr Thr Gly325 330 335Arg Thr His Gln Ile Arg Val His Leu Gln Tyr Leu Gly Phe Pro Ile340 345 350Ala Asn Asp Pro Ile Tyr Ser Asn Pro His Ile Trp Gly Pro Ser Leu355 360 365Gly Lys Glu Cys Lys Ala Asp Tyr Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Asn370 375 380Glu Ile Gly Lys Thr Lys Ser Ala Glu Ser Trp Tyr His Ser Asp Ser385 390 395 400Gln Gly Glu Val Leu Lys Gly Glu Gln Cys Asp Glu Cys Gly Thr Glu405 410 415Leu Tyr Thr Asp Pro Gly Pro Asn Asp Leu Asp Leu Trp Leu His Ala420 425 430Tyr Arg Tyr Glu Ser Thr Glu Leu Asp Glu Asn Gly Ala Lys Lys Trp435 440 445Ser Tyr Ser Thr Ala Phe Pro Glu Trp Ala Leu Glu Gln His Gly Asp450 455 460
Phe Met Arg Leu Ala Ile Glu Gln Ala Lys Lys Cys Pro Pro Ala Lys465 470 475 480Thr Ser Phe Ser Val Gly Ala Val Leu Val Asn Gly Thr Glu Ile Leu485 490 495Ala Thr Gly Tyr Ser Arg Glu Leu Glu Gly Asn Thr His Ala Glu Gln500 505 510Cys Ala Leu Gln Lys Tyr Phe Glu Gln His Lys Thr Asp Lys Val Pro515 520 525Ile Gly Thr Val Ile Tyr Thr Thr Met Glu Pro Cys Ser Leu Arg Leu530 535 540Ser Gly Asn Lys Pro Cys Val Glu Arg Ile Ile Cys Gln Gln Gly Asn545 550 555 560Ile Thr Ala Val Phe Val Gly Val Leu Glu Pro Asp Asn Phe Val Lys565 570 575Asn Asn Thr Ser Arg Ala Leu Leu Glu Gln His Gly Ile Asp Tyr Ile580 585 590Leu Val Pro Gly Phe Gln Glu Glu Cys Thr Glu Ala Ala Leu Lys Gly595 600 605His<210>5<211>730<212>DNA<213>乙棉阿舒囊霉<220>
<221>CDS<222>(195)..(713)<400>5ttgagctata tgtaagtcta ttaattgatt actaatagca atttatggta tcctctgttc 60tgcatatcga cggttactca cgtgatgatc agcttgaggc ttcgcggata aagttccatc 120
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160 165 170tga atattaaaaa atcacta 730<210>6<211>172<212>PRT<213>棉阿舒囊霉<400>6Met Ile Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Thr Tyr Asp Ala Ser Ser1 5 10 15Val Lys Val Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Val Ile Asp20 25 30Ala Leu Val Gln Gly Ala Ile Glu Lys Leu Leu Ala Met Gly Val Lys35 40 45Glu Lys Asn Ile Thr Val Ser Thr Val Pro Gly Ala Phe 6lu Leu Pro50 55 60Phe Gly Thr Gln Arg Phe Ala Glu Leu Thr Lys Ala Ser Gly Lys His65 70 75 80Leu Asp Val Val Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Asp Ser Met85 90 95His Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ser Val Thr His Ala Leu Met Asn Leu100 105 110Gln Lys Lys Ile Arg Leu Pro Val Ile Phe Gly Leu Leu Thr Cys Leu115 120 125Thr Glu Glu Gln Ala Leu Thr Arg Ala Gly Leu Gly Glu Ser Glu Gly130 135 140Lys His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala145 150 155 160Val Lys Phe Gly Pro Arg Ala Glu Gln Met Lys Lys165 170
<210>7<211>1109<212>DNA<213>棉阿舒囊霉<220>
<221>CDS<222>(352)..(1092)<400>7gaagaagcgc aggcgccagt ccgagctgga ggagaacgag gcggcgcggt tgacgaacag 60cgcgctgccc atggacgatg cgggtataca gacggcgggt atacagacgg cgggtggtgc 120cgagagaggc accaggccgg cttcctccag cgatgcaagg aagagaaggg gaccagaggc 180gaagttcaag ccatctaagg tacagaagcc ccaattgaag cgaactgcat cgtcccgggc 240ggatgagaac gagttctcga tattatagag gcccccgttt cgagtgattg gcgtcaaaaa 300cggctatctg ccttcgtccg cccccaccac cctcgggaac actggcaaac c atg gcg 357Met Ala1cta ata cca ctt tct caa gat ctg gct gat ata cta gca ccg tac tta 405Leu Ile Pro Leu Ser Gln Asp Leu Ala Asp Ile Leu Ala Pro Tyr Leu5 10 15ccg aca cca ccg gac tca tcc gca cgc ctg ccg ttt gtc acg ctg acg 453Pro Thr Pro Pro Asp Ser Ser Ala Arg Leu Pro Phe Val Thr Leu Thr20 25 30tat gcg cag tcc cta gat gct cgt atc gcg aag caa aag ggt gaa agg 501Tyr Ala Gln Ser Leu Asp Ala Arg Ile Ala Lys Gln Lys Gly Glu Arg35 40 45 50acg gtt att tcg cat gag gag acc aag aca atg acg cat tat cta cgc 549Thr Val Ile Ser His Glu Glu Thr Lys Thr Met Thr His Tyr Leu Arg55 60 65tac cat cat agc ggc atc ctg att ggc tcg ggc aca gcc ctt gcg gac 597Tyr His His Ser Gly Ile Leu Ile Gly Ser Gly Thr Ala Leu Ala Asp
70 75 80gac ccg gat ctc aat tgc cgg tgg aca cct gca gcg gac ggg gcg gat 645Asp Pro Asp Leu Asn Cys Arg Trp Thr Pro Ala Ala Asp Gly Ala Asp85 90 95tgc acc gaa cag tct tca cca cga ccc att atc ttg gat gtt cgg ggc 693Cys Thr Glu Gln Ser Ser Pro Arg Pro Ile Ile Leu Asp Val Arg Gly100 105 110aga tgg aga tac cgc ggg tcc aaa ata gag tat ctg cat aac ctt ggc 741Arg Trp Arg Tyr Arg Gly Ser Lys Ile Glu Tyr Leu His Asn Leu Gly115 120 125 130aag ggg aag gcg ccc ata gtg gtc acg ggg ggt gag ccg gag gtc cgc 789Lys Gly Lys Ala Pro Ile Val Val Thr Gly Gly Glu Pro Glu Val Arg135 140 145gaa cta ggc gtc agt tac ctg cag ctg ggt gtc gac gag ggt ggc cgc 837Glu Leu Gly Val Ser Tyr Leu Gln Leu Gly Val Asp Glu Gly Gly Arg150 155 160ttg aat tgg ggc gag ttg ttt gag cga ctc tat tct gag cac cac ctg 885Leu Asn Trp Gly Glu Leu Phe Glu Arg Leu Tyr Ser Glu His His Leu165 170 175gaa agt gtc atg gtc gaa ggc ggc gcg gag gtg ctc aac cag ctg ctg 933Glu Ser Val Met Val Glu Gly Gly Ala Glu Val Leu Asn Gln Leu Leu180 185 190ctg cgc cca gat att gtg gac agt ctg gtg atc acg ata gga tcc aag 981Leu Arg Pro Asp Ile Val Asp Ser Leu Val Ile Thr Ile Gly Ser Lys195 200 205 210ttc ctg ggc tca cta ggt gtt gcg gtc tca cca gct gag gag gtg aac 1029Phe Leu Gly Ser Leu Gly Val Ala Val Ser Pro Ala Glu Glu Val Asn215 220 225cta gag cat gtg aac tgg tgg cac gga aca agt gac agt gtt ttg tgc 1077Leu Glu His Val Asn Trp Trp His Gly Thr Ser Asp Ser Val Leu Cys230 235 240ggc cgg ctc gca tag cggttatgac tggtcta1109Gly Arg Leu Ala
245<210>8<211>246<212>PRT<213>棉阿舒囊霉<400>8Met Ala Leu Ile Pro Leu Ser Gln Asp Leu Ala Asp Ile Leu Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Thr Pro Pro Asp Ser Ser Ala Arg Leu Pro Phe Val Thr20 25 30Leu Thr Tyr Ala Gln Ser Leu Asp Ala Arg Ile Ala Lys Gln Lys Gly35 40 45Glu Arg Thr Val Ile Ser His Glu Glu Thr Lys Thr Met Thr His Tyr50 55 60Leu Arg Tyr His His Ser Gly Ile Leu Ile Gly Ser Gly Thr Ala Leu65 70 75 80Ala Asp Asp Pro Asp Leu Asn Cys Arg Trp Thr Pro Ala Ala Asp Gly85 90 95Ala Asp Cys Thr Glu Gln Ser Ser Pro Arg Pro Ile Ile Leu Asp Val100 105 110Arg Gly Arg Trp Arg Tyr Arg Gly Ser Lys Ile Glu Tyr Leu His Asn115 120 125Leu Gly Lys Gly Lys Ala Pro Ile Val Val Thr Gly Gly Glu Pro Glu130 135 140Val Arg Glu Leu Gly Val Ser Tyr Leu Gln Leu Gly Val Asp Glu Gly145 150 155 160Gly Arg Leu Asn Trp Gly Glu Leu Phe Glu Arg Leu Tyr Ser Glu His165 170 175His Leu Glu Ser Val Met Val Glu Gly Gly Ala Glu Val Leu Asn Gln180 185 190
Leu Leu Leu Arg Pro Asp Ile Val Asp Ser Leu Val Ile Thr Ile Gly195 200 205Ser Lys Phe Leu Gly Ser Leu Gly Val Ala Val Ser Pro Ala Glu Glu210 215 220Val Asn Leu Glu His Val Asn Trp Trp His Gly Thr Ser Asp Ser Val225 230 235 240Leu Cys Gly Arg Leu Ala24權利要求
1.用于微生物產(chǎn)生核黃素的方法，所述方法通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生核黃素且在選自rib1、rib2、rib4和rib7的至少兩種基因產(chǎn)物與野生型ATCC 10895相比顯示出更高活性的阿舒囊霉屬(Ashbya)微生物，隨后從培養(yǎng)基分離所產(chǎn)生的核黃素。
2.如權利要求1所述的方法，其中選自rib1、rib2、rib4和rib7的三種基因產(chǎn)物顯示出更高的活性。
3.如權利要求1所述的方法，其中選自rib1、rib2、rib4和rib7的四種基因產(chǎn)物顯示出更高的活性。
4.如權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中rib基因產(chǎn)物的較高基因活性是由基因表達的提高所引起。
5.如權利要求4所述的方法， 其中所述基因表達的提高是由基因拷貝數(shù)的增加所引起。
6.如前述權利要求中任意一項所述的方法，其中rib基因產(chǎn)物具有如SEQ ID NO2、4、6、8所示的多肽序列，或由這些序列通過替換、插入或刪除至多5％氨基酸密碼子而獲得的多肽序列。
全文摘要
用于微生物產(chǎn)生核黃素的方法，所述方法通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生核黃素且在選自rib1、rib2、rib4和rib7的至少兩種基因產(chǎn)物與野生型ATCC 10895相比顯示出更高活性的阿舒囊霉屬微生物，隨后從培養(yǎng)基分離所產(chǎn)生的核黃素。
文檔編號C12N15/80GK1599796SQ02824270
公開日2005年3月23日 申請日期2002年12月3日 優(yōu)先權日2001年12月4日
發(fā)明者H·阿爾特費赫, J·L·雷韋爾塔, 多瓦爾 申請人:巴斯福股份公司