專利名稱：輔酶q的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下式(I)表示的還原型輔酶Q10和下式(II)表示的氧化型輔酶Q10的制備方法。
更具體地，本發(fā)明涉及下述還原型輔酶Q10的制備方法，該方法中，通過培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，得到還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上的微生物細(xì)胞，根據(jù)需要將該微生物細(xì)胞破碎，回收所產(chǎn)生的還原型輔酶Q10。
另外，本發(fā)明還涉及氧化型輔酶Q10的制備方法，該方法中，將上述微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物進(jìn)行氧化處理后回收氧化型輔酶Q10，或者，從上述微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物回收還原型輔酶Q10后進(jìn)行氧化處理。
背景技術(shù)：
還原型輔酶Q10(I)和氧化型輔酶Q10(II)是人機(jī)體內(nèi)細(xì)胞中的線粒體的電子傳遞系統(tǒng)的構(gòu)成因子，在氧化磷酸化反應(yīng)中起電子搬運(yùn)子的作用，由此參與ATP的生成。
以前氧化型輔酶Q10的用途一直很廣泛，其作為對各種疾病表現(xiàn)出優(yōu)良藥理和生理效果的物質(zhì)，除藥物外，還用于營養(yǎng)輔助食品或化妝品等。
另一方面，迄今為止，還原型輔酶Q10沒有受到多少關(guān)注，但近年來有報(bào)告指出其在多種用途中甚至比氧化型輔酶Q10更有效。
例如，特開平10-330251號公報(bào)中公開了以還原型輔酶Q10作為有效成分、具有優(yōu)良的降膽固醇作用的抗高膽固醇血癥劑、抗高脂血癥劑以及動脈硬化癥治療和預(yù)防劑。特開平10-109933號公報(bào)公開了以含有還原型輔酶Q10的輔酶Q10作為有效成分、口服吸收性優(yōu)良的藥物組合物。
進(jìn)一步地，還原型輔酶Q10作為抗氧劑、自由基清除劑也有效。R.Stocker等的報(bào)告指出，還原型輔酶Q10比α-生育酚、番茄紅素或β-胡蘿卜素更有效地防止人LDL的過氧化(Proceedings of the National Academy of Science of theUnited States of America，88卷，1646-1650頁，1991年)。
已知在機(jī)體內(nèi)氧化型輔酶Q10與還原型輔酶Q10處于某種平衡關(guān)系，吸收到機(jī)體內(nèi)的氧化型輔酶Q10/還原型輔酶Q10相互還原/氧化。
與氧化型輔酶Q10的制備方法一樣，還原型輔酶Q10的制備方法有化學(xué)合成法，但該合成過程煩雜、危險(xiǎn)，預(yù)計(jì)成本很高。另外，采用化學(xué)合成法時(shí)，有安全性隱患的(Z)-異構(gòu)體作為副產(chǎn)物的產(chǎn)生、混入(Biomedical andclinical aspects of coenzyme Q，3卷，19項(xiàng)-30項(xiàng)，1981)可能必須最小化。歐洲藥典規(guī)定氧化型輔酶Q10中(Z)-異構(gòu)體的含量必須小于或等于0.1％。
還原型輔酶Q10的其它制備方法還有利用微生物細(xì)胞的方法，即，從產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物分離、回收還原型輔酶Q10的方法。但由上述微生物細(xì)胞產(chǎn)生的還原型輔酶Q10含有大量的氧化型輔酶Q10，而采用已知方法分離、回收還原型輔酶Q10的成本高。
微生物細(xì)胞中，記載存在還原型輔酶Q10的微生物已知有例如以下的細(xì)菌例1)在光合細(xì)菌的培養(yǎng)菌體中，還原型輔酶Q10在全部輔酶Q10中的存在比例少則為5～10重量％，多則為30～60重量％(特開昭57-70834號公報(bào))。
2)在氫氧化鈉和焦棓酚的存在下，將假單胞菌屬菌體用有機(jī)溶劑加熱提取，然后用5％的亞硫酸氫鈉水處理，進(jìn)一步脫水濃縮收集丙酮可溶部分，由此獲得含有還原型輔酶Q10的油狀物(特開昭60-75294號公報(bào))。
上述1)和2)的目的都是將所得的還原型輔酶Q10和氧化型輔酶Q10的混合物或還原型輔酶Q10進(jìn)一步氧化成氧化型輔酶Q10，頂多只是將還原型輔酶Q10作為制備氧化型輔酶Q10的中間物質(zhì)而進(jìn)行記載。
上述1)中使用光合細(xì)菌，培養(yǎng)煩雜，并且，在上述微生物細(xì)胞中，以制備還原型輔酶Q10為目的時(shí)，全部輔酶Q10中的還原型輔酶Q10比率不夠。
上述2)包括將己烷相中所含的氧化型輔酶Q10用作為還原劑的亞硫酸氫鈉還原成還原型輔酶Q10的操作(參照特開昭60-75294號公報(bào)的實(shí)施例3)，微生物細(xì)胞中還原型輔酶Q10在全部輔酶Q10中的比率不明確。
另外，上述1)和2)中沒有記載培養(yǎng)過程中輔酶Q的產(chǎn)量。
如上所述，至今沒有報(bào)告指出以高比率含有還原型輔酶Q10的微生物細(xì)胞，也不知道工業(yè)規(guī)模地發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶Q10的例子，即，將微生物進(jìn)行培養(yǎng)，得到全部輔酶Q10中還原型輔酶Q10的含量比率高的微生物細(xì)胞，然后回收還原型輔酶Q10，由此獲得高純度的還原型輔酶Q10。
鑒于上述狀況，如果能找到培養(yǎng)微生物，并獲得大量還原型輔酶Q10比率高的輔酶Q10的方法，則可能成為極為有利的還原型輔酶Q10的制備方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供通過培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，獲得還原型輔酶Q10含量比率高的微生物細(xì)胞，從該微生物細(xì)胞適當(dāng)回收還原型輔酶Q10，由此穩(wěn)定并且高效地工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)還原型輔酶Q10的方法。
另外，本發(fā)明的目的是提供通過培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，獲得還原型輔酶Q10含量比率高的微生物細(xì)胞，將從該微生物細(xì)胞得到的還原型輔酶Q10作為制備氧化型輔酶Q10的中間物質(zhì)，然后將其氧化，由此用簡便的操作制備氧化型輔酶Q10的方法。
即，本發(fā)明是還原型輔酶Q10的制備方法，該方法是下式(I)所示的還原型輔酶Q10的制備方法
其特征在于，通過在含有碳源、氮源、磷源和微量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，獲得還原型輔酶Q10在全部輔酶Q10中的含量比率為70摩爾％或70摩爾％以上的微生物細(xì)胞，根據(jù)需要將該微生物細(xì)胞破碎，用有機(jī)溶劑提取所產(chǎn)生的還原型輔酶Q10。
另外，本發(fā)明也是氧化型輔酶Q10的制備方法，該方法是下式(II)所示的氧化型輔酶Q10的制備方法 其特征在于，通過在含有碳源、氮源、磷源和微量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，獲得還原型輔酶Q10在全部輔酶Q10中的含量比率為70摩爾％或70摩爾％以上的微生物細(xì)胞，根據(jù)需要將該微生物細(xì)胞破碎，將所產(chǎn)生的還原型輔酶Q10氧化而轉(zhuǎn)變成氧化型輔酶Q10后用有機(jī)溶劑將其提取，或者，用有機(jī)溶劑提取所產(chǎn)生的還原型輔酶Q10，根據(jù)需要進(jìn)行精制處理后，將還原型輔酶Q10氧化而轉(zhuǎn)變成氧化型輔酶Q10。
根據(jù)本發(fā)明的方法，通過微生物的培養(yǎng)、還原型輔酶Q10的回收等非常簡便的操作，可以工業(yè)規(guī)模廉價(jià)地制備還原型輔酶Q10。另外，也可以通過簡便的操作制備氧化型輔酶Q10。進(jìn)一步地，通過微生物產(chǎn)生的這些輔酶Q10基本不含(Z)-異構(gòu)體，可以得到與肉、魚等中所含的相同的(全-E)-異構(gòu)體。
發(fā)明詳述本發(fā)明中，首先培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，得到還原型輔酶Q10在全部輔酶Q10中的含量比率為70摩爾％或70摩爾％以上、優(yōu)選75摩爾％或75摩爾％以上的微生物細(xì)胞(發(fā)酵)。
全部輔酶Q10中以上述那樣的高比率含有還原型輔酶Q10的微生物細(xì)胞基本上可以通過培養(yǎng)下述微生物得到，該微生物能以全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上、優(yōu)選75摩爾％或75摩爾％以上的比率生成還原型輔酶Q10。
微生物以全部輔酶Q10的何種比率生成還原型輔酶Q10可以通過例如下述方法進(jìn)行評價(jià)用試管(內(nèi)徑21mm、全長200mm)將微生物在10mL培養(yǎng)基[(葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物(マルトェキス)3g)/L、pH＝6.0]中在25℃振蕩培養(yǎng)72小時(shí)(振幅2cm，310來回/分)。
工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中優(yōu)選的培養(yǎng)條件如后述，但上述培養(yǎng)條件是進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以在沒有大誤差的范圍內(nèi)反映微生物作為其能力所具有的還原型輔酶Q10比率的方法之一。
可以將在上述培養(yǎng)條件下顯示還原型輔酶Q10的含量為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上、優(yōu)選75摩爾％或75摩爾％以上的微生物細(xì)胞用于本發(fā)明。另外，進(jìn)一步優(yōu)選地使用下述微生物在上述培養(yǎng)條件下，作為單位培養(yǎng)基的還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力，該微生物通常具有1μg/mL或1μg/mL以上、優(yōu)選2μg/mL或2μg/mL以上的生產(chǎn)能力。
上述還原型輔酶Q10的含量和全部輔酶Q10中的還原型輔酶Q10比率如下確定將微生物細(xì)胞進(jìn)行物理破碎后，用有機(jī)溶劑提取，然后進(jìn)行HPLC分析。具體地，按照以下順序進(jìn)行測定1)根據(jù)需要濃縮微生物增殖液，將該增殖液10體積份轉(zhuǎn)移到螺旋口(ネジロ)試管(內(nèi)徑16.5mm、全長130mm)，加入10體積份玻璃珠(425～600微米，SIGMA公司)。
2)在氮?dú)夥諊?，相對該增殖?0體積份，加入異丙醇3體積份和正己烷18.5體積份。
3)在氮?dú)夥諊拢瑒×艺袷?分鐘，由此進(jìn)行微生物細(xì)胞的破碎和提取。
4)將所得的疏水性有機(jī)溶劑相(正己烷相)在減壓下蒸發(fā)(浴溫40℃)，通過HPLC進(jìn)行分析。
柱YMC-Pack4.6×250mm(YMC.Co.，Ltd.制)
流動相甲醇/正己烷＝85/15流速1mL/分鐘檢測波長UV275nm保留時(shí)間還原型輔酶Q1013.5分鐘氧化型輔酶Q1022.0分鐘上述測定方法是為了使所得的結(jié)果盡可能地正確反映還原型輔酶Q10含量和全部輔酶Q10中的還原型輔酶Q10比率，并且將可以保證最低限的還原型輔酶Q10的含量和比率標(biāo)準(zhǔn)化。該方法是本發(fā)明人通過數(shù)次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的實(shí)施容易且合適的方法。
本發(fā)明所用的上述產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物可以無限制地使用細(xì)菌、酵母、霉菌中的任意一種。所述微生物具體包括例如土壤桿菌屬(Agrobacterium)、曲霉屬(Aspergillus)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、氨基桿菌屬(Aminobacter)、土壤單胞菌屬(Agromonas)、嗜酸菌屬(Acidiphilium)、ブレロミセス(Bulleromyces)屬、布勒擲胞酵母屬(Bullera)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、隱球菌屬(Cryptococcus)、キォノスファェラ(Chionosphaera)屬、念珠菌屬(Candida)、セリノステルス(Cerinosterus)屬、ェキソフィァラ(Exisophiala)屬、外擔(dān)子菌屬(Exobasidium)、フィロミセス(Fellomyces)屬、線狀黑粉菌屬(Filobasidiella)、フィロバシジゥム(Filobasidium)屬、地霉屬(Geotrichum)、粉座菌屬(Graphiola)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、コッコバェラ(Kockovaella)屬、クルッマノミセス(Kurtzmanomyces)屬、ララリァ(Lalaria)屬、ロィコスポリジゥム(Leucosporidium)屬、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、枝動菌屬(Mycoplana)、卵胞酵母屬(Oosporidium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、シュドジマ(Psedozyma)屬、副球菌屬(Paracoccus)、ペトロミセス(Petromyces)屬、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬胞屬(Rhodosporidium)、根單胞菌屬(Rhizomonas)、紅菌屬(Rhodobium)、紅游動菌屬(Rhodoplanes)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、擲胞酵母屬(Sporobolomyces)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、サィトェラ(Saitoella)屬、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、孢子絲菌屬(Sporotrichum)、シンポジォミコプシス(Sympodiomycopsis)屬、ステリグマトスポリジゥム(Sterigmatosporidium)屬、外囊菌屬(Tapharina)、銀耳屬(Tremella)、絲胞酵母屬(Trichosporon)、チレチァリァ(Tilletiaria)、腥黑粉菌屬(Tilletia)、褶胞黑粉菌屬(Tolyposporium)、チレチォプシス(Tilletiopsis)、黑粉菌屬(Ustilago)、ゥデニォミセス(Udeniomyces)屬、キサントフィロミセス(Xanthophilomyces)屬、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、擬青霉屬(Paecilomyces)、頂胞霉屬(Acremonium)、生絲單胞菌屬(Hyhomonus)、根瘤菌屬(Rhizobium)等微生物。
從培養(yǎng)的容易性或生產(chǎn)率方面考慮，優(yōu)選細(xì)菌(優(yōu)選非光合細(xì)菌)和酵母，例如細(xì)菌中的土壤桿菌屬、葡糖桿菌屬等，而酵母中的裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、サィトェラ(Saitoella)屬等。
優(yōu)選種類包括例如根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefacienceIFO13263)、放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter ATCC4718)、棒曲霉(Aspergillus clavatus JCM1718)、木質(zhì)醋桿菌(Acetobacter xylinum IFO15237)、阿賀野氨基桿菌(Aminobacter aganouensis JCM7854)、寡養(yǎng)土壤單胞菌(Agromonas oligotrophica JCM1494)、多嗜嗜酸菌(Acidiphilium multivorumJCM8867)、ブレロミセス·ァルバス(Bulleromyces albus IFO1192)、ブレラ·ァルメニカ(Bullera armeniaca IFO10112)、缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta JCM2788)、羅侖氏隱球菌(Cryptococcus laurentii IFO0609)、キォノスファェラ·ァポバシジァリス(Chionosphaera apobasidialis CBS7430)、彎假絲酵母(Candida curvata ATCC10567)、セリノステルス·ルテォァルバス(Cerinosterus luteoalbus JCM2923)、ェキソフィァラ·ァルカロフィラ(Exisophiala alcalophila JCM12519)、細(xì)麗外擔(dān)子菌(Exobasidium gracileIFO7788)、フィロミセス·フゾェンシス(Fellomyces fuzhouensis IFO10374)、新型線狀黑粉菌(Filobasidiella neoformans CBS132)、フィロバシジゥム·カプスロィゲヌム(Filobasidium capsuloigenum CBS1906)、ゲォトリカム·カピタゥム(Geotrichum capitatum JCM6258)、グラフィォラ·シリンドリカム(Graphiola cylindrica IFO6426)、弱氧化葡糖桿菌(Gluconobacter suboxydansIFO3257)、コッコバェラ·ィムペラタェ(Kockovaella imperatae JCM7826)、クルッマノミセス·ネクタィレィ(Kurtzmanomyces nectairei IFO10118)、ララリァ·セラシ(Lalaria cerasi CBS275.28)、ロィコスポリジゥム·スコティ一(Leucosporidium scottii IFO1212)、茴芹軍團(tuán)菌(Legionella anisa JCM7573)、扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorguens JCM2802)、多枝枝動菌(Mycoplana ramosa JCM7822)、珍珠狀卵胞酵母(Oosporidium margaritiferumCBS2531)、脫氮假單胞菌(Pseudomonas denitrificans IAM 12023)、シュ一ドモナス·シルキリェンシス(Pseudomonas shuylkilliensis IAM 1092)、シュドジマ·ァフィジス(Psedozyma aphidis CBS517.23)、脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans JCM6892)、ペトロミセス·ァリァセゥス(Petromyces alliaceusIFO7538)、膠粘紅酵母(Rhodotorula glutinis IFO1125)、微小紅酵母(Rhodotorula minuta IFO0387)、雙倒卵形紅冬胞(Rhodosporidium diobovatumATCC1830)、木栓化根單胞菌(Rhizomonas suberifaciens IFO15212)、東方紅菌(Rhodobium orients JCM9337)、優(yōu)美紅游動菌(Rhodoplanes elegansJCM9224)、血色紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris JCM2524)、莢膜紅細(xì)菌(Phodobacter capsulatus SB1003)、不對稱擲胞酵母(Sporobolomycesholsaticus IFO1034)、近玫瑰紅擲胞酵母(Sporobolomyces pararoseusIFO0471)、強(qiáng)遜氏鎖擲酵母(Sporidiobolus johnsonii IFO1840)、サィトェラ·コンプリカタ(Saitoella complicata IFO10748)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe IFO0347)、類少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonasparapaucimobilis IFO15100)、スポトリクム·セルロフィリゥム(Sporotrichum cellulophilium ATCC20493)、シンポジォミコプシス·パフィォペジリ(Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318)、ステリグマトスポリジゥム·ポリモルファ(Sterigmatosporidium polymorphum IFO10121)、粘連鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas adhesiva JCM7370)、櫟外囊菌(Tapharinacaerulescens CBS351.35)、トレメラ·メセンテリカ(Tremella mesentericaATCC24438)、皮狀絲胞酵母(Trichosporon cutaneum IFO1198)、チレチァリァ·ァノマラ(Tilletiaria anomala CBS436.72)、小麥網(wǎng)腥黑粉菌(Tilletia cariesJCM1761)、水泡狀褶胞黑粉菌(Tolyposporium bullatum JCM2006)、チレチォプシス·ヮシントネシス(Tilletiopsis washintonesis CBS544)、ゥスチラゴ·ェスクレンタ(Ustilago esculenta IFO9887)、ゥデニォミセス·メガロスポラス(Udeniomyces megalosporus JCM5269)、キサントフィロミセス·デンドロロゥス(Xanthophilomyces dendrorhous IFO10129)、黃黃色桿菌(Xanthobacterflavus JCM1204)、ペキロマィセス·リァシヌス(Paecilomyces lilacinusATCC10114)、ァクレモニゥム·クリソゲナム(Acremonium chrysogenumATCC11550)、赫氏生絲單胞菌(Hyphomonas hirschiana ATCC33886)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti ATCC9930)等。
作為產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，不僅可以使用上述微生物的野生株，例如，還可以優(yōu)選使用改變或改良參與上述微生物還原型輔酶Q10生物合成的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性、或表達(dá)蛋白質(zhì)的酶活性的微生物。
改變或改良基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性或表達(dá)蛋白質(zhì)的酶活性的方法可以列舉基因重組(包括自身基因的改良、擴(kuò)增、破壞或外源基因的導(dǎo)入和該基因的改良、擴(kuò)增)、通過誘變劑的變異誘發(fā)，優(yōu)選通過誘變劑的變異誘發(fā)。
可以用于本發(fā)明的更優(yōu)選的微生物是下述微生物經(jīng)上述改變或改良的微生物，優(yōu)選通過誘變劑進(jìn)行過變異處理的微生物，通過上述增殖方法和測定方法進(jìn)行評價(jià)時(shí)，顯示還原型輔酶Q10的含量為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上、優(yōu)選75摩爾％或75摩爾％以上、更優(yōu)選80摩爾％或80摩爾％以上、進(jìn)一步優(yōu)選85摩爾％或85摩爾％以上、特別優(yōu)選90摩爾％或90摩爾％以上的微生物。在工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中，可以使用下述微生物作為單位培養(yǎng)基的還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力，該微生物具有1μg/mL或1μg/mL以上、優(yōu)選2μg/mL或2μg/mL以上、更優(yōu)選3μg/mL或3μg/mL以上、進(jìn)一步優(yōu)選5μg/mL或5μg/mL以上、特別優(yōu)選10μg/mL或10μg/mL以上、特別更優(yōu)選15μg/mL、最優(yōu)選20μg/mL或20μg/mL以上的生產(chǎn)能力。
變異誘發(fā)可以以單一變異誘發(fā)的形式進(jìn)行，但優(yōu)選進(jìn)行兩次或兩次以上的變異誘發(fā)。其理由是從各變異誘發(fā)階段發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)還原型輔酶Q10的能力得到改善。當(dāng)然，作為接受變異誘發(fā)處理的微生物細(xì)胞的候補(bǔ)，通常優(yōu)選在通過上述增殖方法和測定方法進(jìn)行評價(jià)時(shí)盡可能具有高還原型輔酶Q10生產(chǎn)能力的細(xì)胞。
變異誘發(fā)處理可以用任意的適當(dāng)?shù)恼T變劑進(jìn)行。術(shù)語“誘變劑”從廣義上講，不僅包括例如具有變異誘發(fā)效果的藥物，還包括UV照射等具有變異誘發(fā)效果的處理。合適的誘變劑的例子包括甲磺酸乙酯、、UV照射、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、溴代尿嘧啶等核苷酸堿類似物和吖啶類等，但不限于這些物質(zhì)。
如果按照常用的變異誘發(fā)方法，繼變異誘發(fā)之后，適當(dāng)選擇具有高還原型輔酶Q10生產(chǎn)能力的微生物細(xì)胞。為此，用例如上述增殖方法和測定方法進(jìn)行由單一菌落制備的培養(yǎng)物的評價(jià)。由于還原型輔酶Q10的結(jié)晶形成白色固體層或無色液相，選則菌落時(shí)，可以通過上述測定方法適當(dāng)評價(jià)還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力。
在本發(fā)明的方法中，工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中，還原型輔酶Q10的高生產(chǎn)率一部分通過使用如下的微生物細(xì)胞獲得，該細(xì)胞中上述還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上；一部分通過使用下述合適的培養(yǎng)(發(fā)酵)條件獲得，該條件用于提高后述單位培養(yǎng)基的還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力。特別優(yōu)選將上述合適的微生物細(xì)胞的使用和下述合適的培養(yǎng)(發(fā)酵)條件的使用進(jìn)行組合。
培養(yǎng)通常在適于微生物增殖的含大量營養(yǎng)素或微量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中進(jìn)行。所述營養(yǎng)素包括例如碳源(例如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、玉米淀粉、糖蜜等碳水化合物；甲醇、乙醇等醇等)、氮源(例如玉米浸漬液、硫酸銨、磷酸銨、氫氧化銨、尿素、蛋白胨等)、磷源(例如磷酸銨、磷酸等)以及微量營養(yǎng)素(例如鎂、鉀、鋅、銅、鐵、錳、鉬、硫酸、鹽酸等礦物質(zhì)、生物素、脫硫生物素、維他命B 1等維生素類，丙氨酸、組氨酸等氨基酸；酵母提取物或麥芽提取物等含有維生素類的天然原料等)，但不限于這些物質(zhì)，可以使用通常使用的營養(yǎng)素。另外，酵母提取物等天然培養(yǎng)基成分中也含有磷酸鹽等磷源。上述營養(yǎng)素可以適當(dāng)組合使用。
培養(yǎng)的溫度通常為15～45℃，優(yōu)選20～37℃。低于15℃時(shí)，工業(yè)生產(chǎn)允許的微生物增殖速度有降低傾向，而超過45℃高溫下則微生物的存活有易于受到損害的傾向。
培養(yǎng)的pH通常為4～9，優(yōu)選5～8。pH低于或等于3或高于或等于10時(shí)微生物的增殖有容易受到抑制的傾向。
在工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中，雖然因微生物的種類而異，但優(yōu)選將培養(yǎng)中碳源(也包含生成的醇)濃度控制在實(shí)質(zhì)上不給還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力造成不良影響的濃度。因此，優(yōu)選控制培養(yǎng)，使培養(yǎng)液中的碳源濃度為實(shí)質(zhì)上不給還原型輔酶Q10生產(chǎn)能力帶來不良影響的濃度。即，通常為20g/L或20g/mL以下，優(yōu)選5g/L或5g/L以下，更優(yōu)選2g/L或2g/L以下。
為了控制碳源的濃度，優(yōu)選采用流加培養(yǎng)法。基于pH、溶解氧濃度(DO)或殘?zhí)菨舛鹊扰囵B(yǎng)管理指標(biāo)調(diào)節(jié)營養(yǎng)源(特是碳源)的供給，由此可以控制培養(yǎng)液中的碳源濃度。營養(yǎng)源的供給因微生物的種類而異，可以在培養(yǎng)初期開始，也可以在培養(yǎng)途中開始。營養(yǎng)源的供給，即可以連續(xù)，也可以間斷。另外，供給營養(yǎng)源時(shí)，優(yōu)選將上述碳源與其它成分分別供給到培養(yǎng)基。
培養(yǎng)可以在達(dá)到所需的還原型輔酶Q10生產(chǎn)量的時(shí)點(diǎn)終止。對培養(yǎng)時(shí)間沒有特別限制，通常為20～200小時(shí)。
上述的培養(yǎng)通常有氧性地進(jìn)行。術(shù)語“有氧性”是指在培養(yǎng)過程中供給氧以不產(chǎn)生氧的限制(氧的缺乏)，優(yōu)選指在培養(yǎng)過程中充分供給氧以實(shí)質(zhì)上不出現(xiàn)氧的限制(氧的欠乏)。培養(yǎng)通常在通風(fēng)下進(jìn)行，優(yōu)選在通風(fēng)攪拌下進(jìn)行。
通過采用上述的微生物和培養(yǎng)條件，可以得到還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上、優(yōu)選75摩爾％或75摩爾％以上的微生物細(xì)胞。另外，也可以獲得高還原型輔酶Q10產(chǎn)量，為1μg/mL或1μg/mL以上、優(yōu)選2μg/mL或2μg/mL以上、進(jìn)一步優(yōu)選3μg/mL或3μg/mL以上。
下面說明通過上述培養(yǎng)生產(chǎn)的還原型輔酶Q10的回收。
在本發(fā)明中，工業(yè)規(guī)模的高效制備還原型輔酶Q10一部分通過上述合適的培養(yǎng)成為可能。另外，一部分通過下述還原型輔酶Q10的適當(dāng)?shù)幕厥詹僮鞒蔀榭赡堋?br> 還原型輔酶Q10的回收是通過用有機(jī)溶劑從上述培養(yǎng)獲得的微生物細(xì)胞進(jìn)行提取進(jìn)行的。
提取時(shí)，可以根據(jù)需要將上述細(xì)胞進(jìn)行破碎。細(xì)胞破碎有助于高效地提取細(xì)胞中產(chǎn)生、蓄積的還原型輔酶Q10。當(dāng)然，也可以同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的破碎和提取。
本發(fā)明的“破碎”中，在能夠提取還原型輔酶Q10的程度上使細(xì)胞壁等表面結(jié)構(gòu)受損即可，微生物細(xì)胞不一定必須破裂或形成片斷。
另外，上述的細(xì)胞破碎處理在細(xì)菌中有時(shí)不一定必要。但是，酵母或霉菌中通常必須進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，細(xì)胞沒有破碎時(shí)，難于有效地回收細(xì)胞中產(chǎn)生、蓄積的還原型輔酶Q10。
上述微生物細(xì)胞的破碎通過以下一種或多種破碎方法以任意順序進(jìn)行。破碎方法包括物理處理、化學(xué)處理、酶處理，此外還有加熱處理、自身消化、滲透壓溶解、原生質(zhì)溶解等。
上述物理處理包括例如使用高壓勻化器、超聲勻化器、法式壓力機(jī)(フレンチプレス)、球磨機(jī)等或它們的組合。
上述化學(xué)處理包括例如用鹽酸、硫酸等酸(優(yōu)選強(qiáng)酸)的處理、用氫氧化鈉或氫氧化鉀等堿(優(yōu)選強(qiáng)堿)的處理等或它們的組合。
上述酶處理包括例如用溶菌酶、酶解酶(ザィモリァ一ゼ)、葡聚糖酶、ノボザィム、蛋白酶、纖維素酶等的方法或?qū)⑦@些方法適當(dāng)組合使用。
上述加熱處理包括例如在60～100℃進(jìn)行30分鐘～3小時(shí)左右的處理。
上述自身消化包括例如使用乙酸乙酯等溶劑的處理。
另外，單獨(dú)采用通過用與細(xì)胞內(nèi)的鹽濃度不同的溶液處理細(xì)胞而使細(xì)胞破壞的滲透壓溶解或原生質(zhì)溶解方法多數(shù)情況下破碎效果不足，因此多將上述物理處理、化學(xué)處理、酶處理、加熱處理、自身消化等組合使用。
作為還原型輔酶Q10提取·回收的前處理的細(xì)胞破碎方法，在上述破碎方法中，優(yōu)選物理處理、化學(xué)處理(特別是酸處理，優(yōu)選通過強(qiáng)酸(例如在水溶液中pKa為2.5或2.5以下的酸)在如后述的使還原型輔酶Q10不發(fā)生氧化反應(yīng)的條件下進(jìn)行的酸處理)或加熱處理，從破碎效率方面考慮，更優(yōu)選物理處理。
現(xiàn)有的細(xì)胞破碎和輔酶Q10的提取方法，具體地，在氫氧化鈉和焦棓酚的存在下用有機(jī)溶劑提取的方法中，存在成本、廢棄物處理、廢微生物(廢菌體)有效利用(蛋白質(zhì)的回收等)時(shí)的安全性等方面的問題。但是，本發(fā)明的細(xì)胞破碎方法，特別是物理處理法不會因中和導(dǎo)致產(chǎn)生大量鹽副產(chǎn)物，不僅在廢棄物處理方面，而且在廢微生物(廢菌體)的有效利用方面都是合適的方法。
上述細(xì)胞破碎所用的微生物細(xì)胞的形態(tài)可以是培養(yǎng)液、培養(yǎng)液濃縮物、從培養(yǎng)液以濕菌體形式采集微生物細(xì)胞所得的物質(zhì)、將這些洗凈的物質(zhì)、將濕菌體懸浮在溶劑(包括例如水、生理鹽水、緩沖液等)中的物質(zhì)、干燥上述濕菌體所得的干燥菌體、將干燥菌體懸浮在溶劑(包括例如水、生理鹽水、緩沖液等)中的物質(zhì)等，優(yōu)選微生物細(xì)胞的水性懸浮液，從操作性等方面考慮，更優(yōu)選培養(yǎng)液、培養(yǎng)液濃縮物或?qū)⑦@些洗凈所得的物質(zhì)。
還原型輔酶Q10的提取·回收中所用的上述微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的形態(tài)也與上述相同，沒有特殊限制，可以是微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的濕菌體或干燥菌體，優(yōu)選微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液，更優(yōu)選培養(yǎng)液、將培養(yǎng)液濃縮和/或洗凈所得的物質(zhì)或它們的破碎液(均為水性懸浮液)。
上述微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的懸浮液中的菌體濃度沒有特別限制，以干燥重量計(jì)，通?？梢詾?～25重量％，但從經(jīng)濟(jì)方面考慮，優(yōu)選10～20重量％。
將如上獲得的上述微生物細(xì)胞和該細(xì)胞破碎物用有機(jī)溶劑提取，由此可以回收還原型輔酶Q10。
用于提取的有機(jī)溶劑可以列舉烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類(包括腈類、酰胺類)、硫化合物類等。
特別地，在提取還原型輔酶Q10時(shí)，從防止分子氧導(dǎo)致的氧化這一方面考慮，優(yōu)選用選自烴類、脂肪酸酯類、醚類和腈類中的至少一種作為提取溶劑，其中優(yōu)選烴類、脂肪酸酯類，最優(yōu)選烴類。
工業(yè)規(guī)模的制備中，極難完全除去氧，并且各操作所需的時(shí)間與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的制備不同，需要長時(shí)間，因此，殘存的氧導(dǎo)致極大的不良影響。上述氧化與由還原型輔酶Q10生成氧化型輔酶Q10副產(chǎn)物直接相關(guān)。因此，在還原型輔酶Q10的提取中使用上述氧化防護(hù)效果高的有機(jī)溶劑(烴類、脂肪酸酯類、醚類、腈類等)有助于高效地提取。
對烴類沒有特別限制，包括例如脂肪烴、芳烴、鹵代烴等。優(yōu)選脂肪烴、芳烴，更優(yōu)選脂肪烴。
作為脂肪烴，不管環(huán)狀、非環(huán)狀或飽和、不飽和，沒有特別限制，一般優(yōu)選使用飽和脂肪烴。通常用碳原子數(shù)為3～20、優(yōu)選碳原子數(shù)為5～12、更優(yōu)選碳原子數(shù)為5～8的脂肪烴。具體例子包括丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構(gòu)體(例如2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷)、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、2-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、環(huán)戊烷、甲基環(huán)戊烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷、對_烷、環(huán)己烯等。優(yōu)選戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構(gòu)體(例如2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷)、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二(碳)烷、環(huán)戊烷、甲基環(huán)戊烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷、對_烷等。更優(yōu)選戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構(gòu)體(例如2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷)、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、環(huán)戊烷、甲基環(huán)戊烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷等。
一般優(yōu)選使用庚烷類，當(dāng)然包括庚烷，具有7個(gè)碳原子的甲基環(huán)己烷等不同種類的庚烷或它們的多種混合物。進(jìn)一步優(yōu)選碳原子數(shù)為5的戊烷類(例如戊烷等)、碳原子數(shù)為6的己烷類(例如己烷、環(huán)己烷等)、碳原子數(shù)為7的庚烷類(例如庚烷、甲基環(huán)己烷等)等。從上述氧化防護(hù)效果高的方面考慮，特別優(yōu)選庚烷類(例如庚烷、甲基環(huán)己烷等)等，最優(yōu)選庚烷。
對芳烴沒有特別限制，通常使用碳原子數(shù)為6～20、優(yōu)選碳原子數(shù)為6～12、更優(yōu)選碳原子數(shù)為7～10的芳烴。具體例子包括苯、甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙苯、枯烯、均三甲苯、1，2，3，4-四氫化萘、丁基苯、對傘花烴、環(huán)己基苯、二乙基苯、戊基苯、二戊基苯、十二烷基苯、苯乙烯等。優(yōu)選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙基苯、枯烯、均三甲苯、1，2，3，4-四氫化萘、丁基苯、對傘花烴、環(huán)己基苯、二乙基苯、戊基苯等。更優(yōu)選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、枯烯、1，2，3，4-四氫化萘等。最優(yōu)選枯烯。
作為鹵代烴，不管環(huán)狀、非環(huán)狀或飽和、不飽和，沒有特別限制，但一般優(yōu)選使用非環(huán)狀的鹵代烴。更優(yōu)選氯代烴、氟代烴，進(jìn)一步優(yōu)選氯代烴。另外，合適使用碳原子數(shù)為1～6、優(yōu)選碳原子數(shù)為1～4、更優(yōu)選碳原子數(shù)為1～2的鹵代烴。具體例子包括二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、1，1，2-三氯乙烷、1，1，1，2-四氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1，2-二氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷、氯苯、1，1，1，2-四氟乙烷等。優(yōu)選二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、1，1，2-三氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1，1，1，2-四氟乙烷等。更優(yōu)選二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1，1，1，2-四氟乙烷等。
對脂肪酸酯類沒有特別限制，包括例如丙酸酯、乙酸酯、甲酸酯等。優(yōu)選乙酸酯、甲酸酯，更優(yōu)選乙酸酯。對酯基沒有特別限制，通常使用碳原子數(shù)為1～8的烷基酯、碳原子數(shù)為7～12的芳烷基酯，優(yōu)選碳原子數(shù)為1～6的烷基酯，更優(yōu)選碳原子數(shù)為1～4的烷基酯。
丙酸酯的具體例子包括丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸異戊酯等，優(yōu)選丙酸乙酯。
乙酸酯的具體例子包括乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、乙酸仲己酯、乙酸環(huán)己酯、乙酸芐酯等。優(yōu)選乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、乙酸仲己酯、乙酸環(huán)己酯等。更優(yōu)選乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯等，最優(yōu)選乙酸乙酯。
甲酸酯的具體例子包括甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸仲丁酯、甲酸戊酯等。優(yōu)選甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸戊酯等。最優(yōu)選甲酸乙酯。
作為醚類，不管環(huán)狀、非環(huán)狀或飽和、不飽和，沒有特別限制，一般優(yōu)選使用飽和醚。通常使用碳原子數(shù)為3～20、優(yōu)選碳原子數(shù)為4～12、更優(yōu)選碳原子數(shù)為4～8的醚。具體例子包括乙醚、甲基叔丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、二丁基醚、二己基醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二噁烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇單甲基醚、乙二醇單乙基醚、乙二醇單丁基醚等。優(yōu)選乙醚、甲基叔丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、二丁基醚、二己基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二噁烷、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇單甲基醚、乙二醇單乙基醚等。更優(yōu)選乙醚、甲基叔丁基醚、苯甲醚、二噁烷、四氫呋喃、乙二醇單甲基醚、乙二醇單乙基醚等。進(jìn)一步優(yōu)選乙醚、甲基叔丁基醚、苯甲醚等，最優(yōu)選甲基叔丁基醚。
作為醇類，不管環(huán)狀、非環(huán)狀或飽和、不飽和，沒有特別限制，但一般優(yōu)選使用飽和醇。通常使用碳原子數(shù)為1～20、優(yōu)選碳原子數(shù)為1～12、更優(yōu)選碳原子數(shù)為1～6的醇，其中優(yōu)選碳原子數(shù)為1～5的一元醇、碳原子數(shù)為2～5的二元醇、碳原子數(shù)為3的三元醇。
所述醇類的具體例子包括甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁基醇、叔丁基醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、丙炔醇、芐醇、環(huán)己醇、1-甲基環(huán)己醇、2-甲基環(huán)己醇、3-甲基環(huán)己醇、4-甲基環(huán)己醇等一元醇；1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、1，5-戊二醇等二元醇；丙三醇等三元醇。
一元醇優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁基醇、叔丁基醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、芐醇、環(huán)己醇、1-甲基環(huán)己醇、2-甲基環(huán)己醇、3-甲基環(huán)己醇、4-甲基環(huán)己醇等，更優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁基醇、叔丁基醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、環(huán)己醇等，進(jìn)一步優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁基醇、叔丁基醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等，特別優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁基醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇等，最優(yōu)選2-丙醇。
二元醇優(yōu)選1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇等，最優(yōu)選1，2-乙二醇。三元醇優(yōu)選丙三醇。
脂肪酸類包括例如甲酸、乙酸、丙酸等。優(yōu)選甲酸、乙酸，最優(yōu)選乙酸。
對酮類沒有特別限制，適于使用碳原子數(shù)為3～6的酮類。具體例子包括丙酮、甲基乙基酮、甲基丁基酮、甲基異丁基酮等。優(yōu)選丙酮、甲基乙基酮，最優(yōu)選丙酮。
作為腈類，不管環(huán)狀、非環(huán)狀或飽和、不飽和，沒有特別限制，一般優(yōu)選使用飽和腈類。通常使用碳原子數(shù)為2～20、優(yōu)選碳原子數(shù)為2～12、更優(yōu)選碳原子數(shù)為2～8的腈類。
具體例子包括乙腈、丙腈、丙二腈、丁腈、異丁腈、丁二腈、戊腈、戊二腈、己腈、庚基氰化物、辛基氰化物、十一烷腈、十二烷腈、十三烷腈、十五烷腈、硬脂腈、氯乙腈、溴乙腈、氯丙腈、溴丙腈、甲氧基乙腈、氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、甲苯基腈、苯甲腈、氯苯甲腈、溴苯甲腈、氰基安息香酸、硝基苯甲腈、茴香腈、鄰苯二甲腈、溴甲苯基腈、甲基氰基苯甲酸酯、甲氧基苯甲腈、乙?；郊纂?、萘甲腈、聯(lián)苯基腈、苯基丙腈、苯基丁腈、甲基苯基乙腈、二苯基乙腈、萘基乙腈、硝基苯基乙腈、氯芐基氰化物、環(huán)丙烷腈、環(huán)己烷腈、環(huán)庚烷腈、苯基環(huán)己烷腈、甲苯基環(huán)己烷腈等。
優(yōu)選乙腈、丙腈、丁二腈、丁腈、異丁腈、戊腈、氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、苯甲腈、甲苯基腈、氯丙腈，更優(yōu)選乙腈、丙腈、丁腈、異丁腈，最優(yōu)選乙腈。
腈類以外的氮化合物類包括甲酰胺、N-甲基甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺類或硝基甲烷、三乙胺、吡啶等。
硫化合物類包括二甲亞砜、環(huán)丁砜等。
在上述有機(jī)溶劑中，優(yōu)選考慮沸點(diǎn)、粘性等性質(zhì)(例如具有如下的沸點(diǎn)和熔點(diǎn)為了提高溶解度可以適當(dāng)加熱，并且容易從濕物干燥除去溶劑或從晶析濾液等回收溶劑的沸點(diǎn)(一個(gè)大氣壓下約為30～150℃)、在室溫處理時(shí)和冷卻至室溫或室溫以下時(shí)難于固化的熔點(diǎn)(約0℃或0℃以上，優(yōu)選約10℃或10℃以上、更優(yōu)選約20℃或20℃以上)，粘性低(在20℃約為10cp或10cp以下等))后進(jìn)行選擇。
溶劑中的還原型輔酶Q10的氧化防護(hù)效果有在還原型輔酶Q10的高濃度溶液中則升高的傾向。還原型輔酶Q10對氧化防護(hù)效果高的上述有機(jī)溶劑(例如烴類、脂肪酸酯類等)顯示出高溶解性，該高溶解性使在高濃度溶液中的處理成為可能，促進(jìn)氧化防護(hù)。對提高還原型輔酶Q10的氧化防護(hù)效果的提取時(shí)的優(yōu)選濃度沒有特別限制，但對于上述有機(jī)溶劑的還原型輔酶Q10的濃度通常為0.001重量％或0.001重量％以上、優(yōu)選0.01重量％或0.01重量％以上、更優(yōu)選0.1重量％或0.1重量％以上。對上限沒有特別限制，通常為10重量％或10重量％以下。
上述有機(jī)溶劑中，為了從微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的濕菌體或干燥菌體提取·回收還原型輔酶Q10，優(yōu)選使用親水性有機(jī)溶劑，具體包括丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等。
另外，在上述有機(jī)溶劑中，為了從微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液提取·回收還原型輔酶Q10，優(yōu)選使用疏水性有機(jī)溶劑，這有助于除去來自微生物的水溶性物質(zhì)。疏水性有機(jī)溶劑大多為上述的氧化防護(hù)效果高的有機(jī)溶劑，因此極其合適。
疏水性有機(jī)溶劑優(yōu)選烴類、脂肪酸酯類、醚類。
然而，在上述提取操作中，微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液，特別是該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液，尤其在通過物理處理用有機(jī)溶劑從該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液中提取時(shí)，由于一部份蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分的存在，容易形成乳液，從而使相分離有容易變得困難的傾向。因此，抑制上述乳液的形成并高效地進(jìn)行提取非常重要。
因此，作為提取溶劑，除了上述疏水性有機(jī)溶劑，還優(yōu)選并用親水性有機(jī)溶劑作為輔助溶劑。
這種情況下，對疏水性有機(jī)溶劑沒有特殊限制，可以使用上述溶劑，但優(yōu)選烴類，更優(yōu)選脂肪烴。脂肪烴中適合使用碳原子數(shù)為5～8的烴。
上述碳原子數(shù)為5～8的脂肪烴的具體例子包括戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構(gòu)體(例如2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷)、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、環(huán)戊烷、甲基環(huán)戊烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷等。特別優(yōu)選己烷、庚烷、甲基環(huán)己烷，最優(yōu)選己烷、庚烷。
對與上述疏水性有機(jī)溶劑組合使用的親水性有機(jī)溶劑沒有特殊限制，可以使用上述溶劑，但優(yōu)選醇類。醇類中適合使用碳原子數(shù)為1～5的一元醇。其具體例子包括甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁基醇、叔丁基醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等。特別優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇，最優(yōu)選2-丙醇。
對上述親水性有機(jī)溶劑和疏水性有機(jī)溶劑的用量沒有特別限制，但相對全部溶液的體積，作為提取時(shí)的濃度，優(yōu)選親水性有機(jī)溶劑為5～50體積％，疏水性有機(jī)溶劑為25～65體積％的范圍。
在還原型輔酶Q10的回收過程中，對提取時(shí)的溫度沒有特別限制，通常為0～60℃、優(yōu)選20～50℃的范圍。
作為提取方法，可以通過分批提取、連續(xù)提取(優(yōu)選逆流多段提取)中的任何方法進(jìn)行，但從生產(chǎn)率方面考慮，特別優(yōu)選連續(xù)提取(優(yōu)選逆流多級提取)。分批提取中的攪拌時(shí)間沒有特別限制，通常5分或5分鐘以上。連續(xù)提取中的平均滯留時(shí)間沒有特別限制，通常10分或10分鐘以上。
在回收還原型輔酶Q10時(shí)，優(yōu)選注意使還原型輔酶Q10不發(fā)生分解(例如不被氧化成氧化型輔酶Q10)。為此，上述提取(也包括細(xì)胞破碎)適合在酸性～弱堿性的條件下、優(yōu)選酸性～中性條件下進(jìn)行。以pH為指標(biāo)時(shí)，與接觸時(shí)間也有關(guān)，但pH為10或10以下，優(yōu)選pH為9或9以下，更優(yōu)選pH為8或8以下，進(jìn)一步優(yōu)選pH為7或7以下。
通過上述方法雖然可以實(shí)質(zhì)上地防止氧化反應(yīng)，但優(yōu)選根據(jù)需要在更嚴(yán)密地防止還原型輔酶Q10發(fā)生氧化反應(yīng)的條件下進(jìn)行上述細(xì)胞的破碎和/或提取。更優(yōu)選在該條件下至少進(jìn)行上述提取，進(jìn)一步優(yōu)選進(jìn)行上述破碎和提取。
“防止氧化反應(yīng)的條件下”是指例如在脫氧氣體氛圍中(氮?dú)?、二氧化碳?xì)怏w、氦氣、氬氣、氫氣等惰性氣體氛圍中、減壓下、沸騰下等)；高鹽濃度下，例如優(yōu)選水相的鹽類(例如氯化鈉、硫酸鈉等無機(jī)鹽)濃度為約5％或5％以上的條件下；強(qiáng)酸(例如在水溶液中的pKaが2.5或2.5以下的酸)存在下，例如在相對還原型輔酶Q101摩爾，強(qiáng)酸以0.1摩爾％或0.1摩爾％以上的比率存在的條件下；氧化防止劑存在下，例如在抗壞血酸、枸櫞酸、它們的鹽或酯類的共存下(例如相對還原型輔酶Q10為0.1重量％或0.1重量％以上)等。另外，在還原條件下(氧化型輔酶Q10可以變成還原型輔酶Q10的條件)還可以列舉與例如連二亞硫酸類等還原劑的接觸。
通過以上的培養(yǎng)(發(fā)酵)和提取，還原型輔酶Q10被適當(dāng)?shù)厣a(chǎn)和回收。優(yōu)選得到還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上、優(yōu)選75摩爾％或75摩爾％以上的提取液。
將如上獲得的含有還原型輔酶Q10的提取液根據(jù)需要通過柱色譜、還原處理等精制后，采用晶析操作，可以得到高純度的還原型輔酶Q10結(jié)晶。而且，此時(shí)也優(yōu)選一系列操作在上述“防止氧化反應(yīng)的條件下”進(jìn)行。
本發(fā)明中，將上述微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物進(jìn)行氧化處理后，用有機(jī)溶劑提取氧化型輔酶Q10，或者，用有機(jī)溶劑從上述微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物提取還原型輔酶Q10，根據(jù)需要進(jìn)行精制處理后，將其進(jìn)行氧化處理，由此可以制備氧化型輔酶Q10。
上述氧化可以如下進(jìn)行例如，將還原型輔酶Q10(優(yōu)選含有上述還原型輔酶Q10的微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液或還原型輔酶Q10的提取液等)與氧化劑(例如二氧化錳等)混合，在例如室溫(例如30℃)下處理30分或更長時(shí)間。將微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物進(jìn)行氧化處理時(shí)，氧化型輔酶Q10的提取操作可以與上述還原型輔酶Q10的提取操作同樣地進(jìn)行。由此可以高效地回收氧化型輔酶Q10。另外，氧化型輔酶Q10的回收沒有必要在還原型輔酶Q10，的回收中推薦的“防止氧化反應(yīng)的條件下”進(jìn)行，可以在考慮通常的安全操作等后實(shí)施。這樣獲得的氧化型輔酶Q10也可以根據(jù)需要通過柱色譜等進(jìn)行精制，最終采用晶析操作，可以獲得高純度的氧化型輔酶Q10結(jié)晶。
附圖簡述

圖1是實(shí)施例8中所用的逆流3段連續(xù)提取裝置的概要圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施形態(tài)以下通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
(實(shí)施例1)將表1～3的各種輔酶Q10生產(chǎn)性微生物用試管(內(nèi)徑21mm、全長200mm)在10mL的培養(yǎng)基[(葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g)/L、pH＝6.0]中于25℃振蕩培養(yǎng)72時(shí)間(振幅2cm、310來回/分)，將所得的增殖液根據(jù)需要進(jìn)行濃縮，在氮?dú)夥諊拢鄬υ撛鲋骋?0體積份，在異丙醇3體積份和正己烷18.5體積份的共存下，用玻璃珠(425～600微米)10體積份，劇烈振蕩3分鐘進(jìn)行細(xì)胞的破碎和提取。將所得的己烷相減壓蒸發(fā)(40℃)，通過高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析，測定還原型輔酶Q10的比率和還原型輔酶Q10生產(chǎn)量。
HPLC條件柱YMC-Pack4.6×250mm(YMC.Co.，Ltd.制)流動相甲醇/正己烷＝85/15流速1mL/分檢測波長UV275nm結(jié)果如表1～3所示。還原型輔酶Q10比率是指以還原型輔酶Q10和氧化型輔酶Q10的峰面積以及兩者的摩爾吸光系數(shù)比(1∶7.5)為基礎(chǔ)，以摩爾百分率表示還原型輔酶Q10相對氧化型輔酶Q10和還原型輔酶Q10的總和的比率的值。
表1


表2


表3


(實(shí)施例2)將膠粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)IFO1125在培養(yǎng)基(蛋白胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g、葡萄糖20g/L、pH＝6.0)于25℃有氧培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后的菌體通過離心分離收集菌體，懸浮于添加N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍使其濃度為200μg/mL的pH＝7的磷酸緩沖液中。25℃1小時(shí)后，將菌體用0.9％NaCl溶液洗滌5次，再懸浮于0.9％NaCl溶液中。將該細(xì)胞懸浮液適當(dāng)稀釋，使其在上述培養(yǎng)基的瓊脂平皿上形成菌落。分離的變異株的還原型輔酶Q10生產(chǎn)量和還原型輔酶Q10的比率與實(shí)施例1同法測定。對生產(chǎn)量、還原型輔酶Q10的比率高于野生株的菌株進(jìn)一步反復(fù)進(jìn)行變異操作。結(jié)果通過反復(fù)進(jìn)行10次變異，得到表現(xiàn)出15μg/mL或更高的生產(chǎn)能力的變異株。此時(shí)還原型輔酶Q10的比率為80摩爾％或80摩爾％以上。
(實(shí)施例3)將サィトェラ·コンプリカタ(Saitoella complicata)IFO 10748用培養(yǎng)基(蛋白胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g、葡萄糖20g/L、pH＝6.0)在25℃有氧培養(yǎng)(10L)72小時(shí)。所得的菌體通過ラニ一公司制的用氮?dú)饷荛]的壓力式勻化器在80MPa的破碎壓力下破碎2次，制備菌體破碎液。從該菌體破碎液以異丙醇30體積份、己烷40體積份的比例反復(fù)提取3次，得到提取液。提取率為99％，還原型輔酶Q10的比率為97摩爾％。
(實(shí)施例4)將膠粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)IFO1125的變異株用培養(yǎng)基10L(蛋白胨10g、酵母提取物5g、麥芽提取物3g、葡萄糖20g/L、pH6.0)在25℃有氧培養(yǎng)時(shí)，48小時(shí)后開始以4g/小時(shí)的比例流加葡萄糖至第96小時(shí)(流加葡萄糖量190g)。單位培養(yǎng)基的還原型輔酶Q10的生產(chǎn)量為20μg/mL或20μg/mL以上，還原型輔酶Q10的比率為80摩爾％或80摩爾％以上。
(實(shí)施例5)將實(shí)施例3中所得的提取液變成己烷溶液，吸附到填充硅膠的柱上，用正己烷/乙醚(9/1)溶液展開、洗脫，得到含有還原型輔酶Q10的級分。進(jìn)一步地，將該級分?jǐn)嚢瑁瑫r(shí)冷卻至2℃，得到白色漿狀物。以上所有操作均在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行。所得的漿狀物減壓過濾，將濕結(jié)晶用上述展開液洗滌(洗凈溶劑的溫度為2℃)，濕結(jié)晶減壓干燥(20～40℃、1～30mmHg)，由此獲得白色干燥結(jié)晶81mg。所得結(jié)晶的純度為99.9％，還原型輔酶Q10的比率為90摩爾％。
(實(shí)施例6)將實(shí)施例3中所得的提取液變成正己烷，加入二氧化錳50mg，在30℃攪拌30分鐘。分取該反應(yīng)液，與實(shí)施例5同法精制，得到高純度的氧化型輔酶Q1074mg。
(實(shí)施例7)將サィトェラ·コンプリカタ(Saitoella complicata)IFO 10748用培養(yǎng)基(蛋白胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g、葡萄糖20g/L、pH6.0)在25℃有氧培養(yǎng)(500mL)72小時(shí)。將所得的菌體通過用氮?dú)饷荛]的ラニ一公司制壓力式勻化器在80MPa的破碎壓力下破碎2次，制備菌體破碎液。破碎液中還原型輔酶Q10的比例是包括氧化型輔酶Q10在內(nèi)的全部輔酶Q10的97％。對該菌體破碎液200mL，按照表4中第1次提取欄所示的比率混合異丙醇和正己烷，使溶劑量總量達(dá)到500mL，在40℃攪拌30分鐘，進(jìn)行第1次的提取操作。提取完畢后，靜置10分鐘，分離分層出來的上層。此時(shí)以下層(殘?jiān)?相對于總液體量的體積比作為分離性指標(biāo)，界面位置如表4中所示。
然后，為了進(jìn)行第2次的提取，測定殘?jiān)鼘拥娜軇舛龋a(bǔ)加異丙醇和己烷，使全體溶劑的比例為表4中第2次一欄所示的比率，在40℃攪拌30分鐘，然后靜置10分鐘，與上述同樣分離上層，測定殘?jiān)鼘拥娜軇舛?，補(bǔ)加異丙醇和己烷，使全體溶劑的比例為表4中第3次一欄所示的比率，在25℃攪拌30分鐘，作為第3次的提取操作。
以第1次、第2次、第3次各階段分離的上層中所含的還原型輔酶Q10的量，相對于進(jìn)行提取操作前的菌體破碎液或提取殘?jiān)兴倪€原型輔酶Q10的量比例，作為各階段的還原型輔酶Q10的提取率，其計(jì)算結(jié)果如表4所示。另外，表4還示出了第2次、第3次總計(jì)的輔酶Q10提取率。各階段的靜置分離性均良好，進(jìn)行3次提取時(shí)的總計(jì)提取率為90％或90％以上，表現(xiàn)出高回收率。特別是當(dāng)使異丙醇濃度為30％或更高時(shí)，達(dá)到99％或99％以上的高回收率。
表4

(實(shí)施例8)將サィトェラ·コンプリカタ(Saitoella complicata)IFO 10748用培養(yǎng)基(蛋白胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g、葡萄糖20g/L、pH6.0)在25℃有氧培養(yǎng)(750L)72小時(shí)。將所得的菌體通過ラニ一公司制的用氮?dú)饷荛]的壓力式勻化器在140MPa的破碎壓力下破碎2次，制備菌體破碎液。將該菌體破碎液用圖1所示的逆流3段連續(xù)提取裝置進(jìn)行連續(xù)提取。攪拌槽的體積為630L，靜置分離槽的體積為200L。向第1段攪拌槽供給微生物菌體破碎液，向各段供給異丙醇和正己烷。菌體破碎液的供給液量為2L/分鐘，異丙醇和正己烷的供給量如下以向各段供給量的合計(jì)總量計(jì)，異丙醇為1.3L/分，正己烷為3.7L/分。此時(shí)，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)各段的溶劑濃度，使異丙醇濃度在5～50v/v％，正己烷濃度在25～65v/v％的范圍。提取的溫度為40℃，處理時(shí)間為6小時(shí)。在第6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)由第3段靜置分離槽的提取殘?jiān)袣埩舻倪€原型輔酶Q10量計(jì)算從菌體破碎液提取的還原型輔酶Q10的回收率，結(jié)果為98.9％。另外，在整個(gè)運(yùn)轉(zhuǎn)期間靜置分離進(jìn)行良好，可以進(jìn)行穩(wěn)定的提取連續(xù)操作。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的方法，通過微生物的培養(yǎng)、還原型輔酶Q10的回收這樣非常簡便的操作，可以在工業(yè)規(guī)模上廉價(jià)地制備還原型輔酶Q10。另外，也可以通過簡便的操作制備氧化型輔酶Q10。
權(quán)利要求
1.一種還原型輔酶Q10的制備方法，該方法是下式(I)所示的還原型輔酶Q10的制備方法 其特征在于，通過在含有碳源、氮源、磷源和微量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，獲得還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上的微生物細(xì)胞，根據(jù)需要將該微生物細(xì)胞破碎，所產(chǎn)生的還原型輔酶Q10用有機(jī)溶劑提取。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，其中得到還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上的提取液。
3.權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中培養(yǎng)結(jié)束時(shí)還原型輔酶Q10的產(chǎn)量為1μg/mL或1μg/mL以上。
4.權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中培養(yǎng)在15～45℃并且pH＝4～9的條件下進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中在培養(yǎng)過程中，將碳源濃度控制在實(shí)質(zhì)上不給還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力造成不良影響的濃度。
6.權(quán)利要求5所述的制備方法，其中培養(yǎng)通過流加培養(yǎng)法進(jìn)行。
7.權(quán)利要求6所述的制備方法，其中將碳源與其他成分分別供給到培養(yǎng)基。
8.權(quán)利要求1～7中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中培養(yǎng)是有氧性地進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1～8中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中在提取時(shí)將微生物細(xì)胞破碎。
10.權(quán)利要求9所述的制備方法，其中細(xì)胞的破碎通過物理處理、化學(xué)處理、酶處理、加熱處理、自身消化、滲透壓溶解或原生質(zhì)溶解進(jìn)行。
11.權(quán)利要求9所述的制備方法，其中細(xì)胞破碎通過物理處理、用強(qiáng)酸的酸處理或加熱處理進(jìn)行。
12.權(quán)利要求9所述的制備方法，其中細(xì)胞破碎通過物理處理進(jìn)行。
13.權(quán)利要求12所述的制備方法，其中物理處理通過高壓勻化器、超聲勻化器、法式壓力機(jī)或球磨機(jī)進(jìn)行。
14.權(quán)利要求9～13中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中細(xì)胞破碎在酸性～弱堿性的條件下進(jìn)行。
15.權(quán)利要求1～14中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中還原型輔酶Q10的提取中所用的有機(jī)溶劑是選自烴類、脂肪酸酯類、醚類和腈類中的至少一種。
16.權(quán)利要求1～14中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中還原型輔酶Q10的提取是從微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的濕菌體或干燥菌體用親水性有機(jī)溶劑進(jìn)行。
17.權(quán)利要求16所述的制備方法，其中親水性有機(jī)溶劑為丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇。
18.權(quán)利要求1～15中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中還原型輔酶Q10的提取是從微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液用疏水性有機(jī)溶劑進(jìn)行。
19.權(quán)利要求18所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑為烴類、脂肪酸酯類或醚類。
20.權(quán)利要求18或19所述的制備方法，其中除了疏水性有機(jī)溶劑，還并用親水性有機(jī)溶劑作為輔助溶劑。
21.權(quán)利要求20所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑為烴類，親水性有機(jī)溶劑為醇類。
22.權(quán)利要求20所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑為脂肪烴，親水性有機(jī)溶劑是碳原子數(shù)為1～5的一元醇。
23.權(quán)利要求20所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑是己烷和庚烷中的至少一種，親水性有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、1-丙醇和2-丙醇中的至少一種。
24.權(quán)利要求20～23中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中提取在疏水性有機(jī)溶劑為25～65體積％、親水性有機(jī)溶劑為5～50體積％的條件下進(jìn)行。
25.權(quán)利要求18～24中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中提取通過連續(xù)提取進(jìn)行。
26.權(quán)利要求1～25中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中提取在酸性～弱堿性的條件下進(jìn)行。
27.權(quán)利要求1～26中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中細(xì)胞破碎和/或提取在防止還原型輔酶Q10發(fā)生氧化反應(yīng)的條件下進(jìn)行。
28.權(quán)利要求27所述的制備方法，其中在防止氧化反應(yīng)的條件下是在脫氧氣體氛圍下、高鹽濃度下、強(qiáng)酸存在下、氧化防止劑存在下或還原條件下。
29.權(quán)利要求1～28中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物用試管(內(nèi)徑21mm、全長200mm)在10mL的培養(yǎng)基[(葡萄糖20g、蛋白胨5 g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g)/L、pH＝6.0]中于25℃振蕩培養(yǎng)72小時(shí)(振幅2cm、310來回/分)，將所得的增殖液根據(jù)需要進(jìn)行濃縮，在氮?dú)夥諊?，相對該增殖?0體積份，在異丙醇3體積份和正己烷18.5體積份的共存下，用玻璃珠(425～600微米)10體積份，劇烈振蕩3分鐘進(jìn)行破碎，將所配制的疏水性有機(jī)溶劑相(正己烷相)通過HPLC進(jìn)行測定時(shí)，還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上。
30.權(quán)利要求29所述的制備方法，其中將產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物在權(quán)利要求29所述的條件下通過HPLC進(jìn)行測定時(shí)，單位培養(yǎng)基的還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力為1μg/mL或1μg/mL以上。
31.權(quán)利要求1～30中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中微生物為土壤桿菌屬、曲霉屬、醋酸桿菌屬、氨基桿菌屬、土壤單胞菌屬、嗜酸菌屬、Bulleromyces屬、布勒擲胞酵母屬、短波單胞菌屬、隱球菌屬、Chionosphaera屬、念珠菌屬、Cerinosterus屬、Exisophiala屬、外擔(dān)子菌屬、Fellomyces屬、線狀黑粉菌屬、Filobasidium屬、地霉屬、粉座菌屬、葡糖桿菌屬、Kockovaella屬、Kurtzmanomyces屬、Lalaria屬、Leucosporidium屬、軍團(tuán)菌屬、甲基桿菌屬、枝動菌屬、卵胞酵母屬、假單胞菌屬、Psedozyma屬、副球菌屬、Petromyces屬、紅酵母屬、紅冬胞屬、根單胞菌屬、紅菌屬、紅游動菌屬、紅假單胞菌屬、紅細(xì)菌屬、擲胞酵母屬、鎖擲酵母屬、Saitoella屬、裂殖糖酵母屬、鞘氨醇單胞菌屬、孢子絲菌屬、Sympodiomycopsis屬、Sterigmatosporidium屬、外囊菌屬、銀耳屬、絲胞酵母屬、Tilletiaria屬、腥黑粉菌屬、褶胞黑粉菌屬、Tilletiopsis屬、黑粉菌屬、Udeniomyces屬、Xanthophilomyces屬、黃色桿菌屬、擬青霉屬、頂胞霉屬、生絲單胞菌屬或根瘤菌屬的微生物。
32.權(quán)利要求1～31中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中將所得的還原型輔酶Q10根據(jù)需要精制后，進(jìn)行晶析，得到還原型輔酶Q10結(jié)晶。
33.一種氧化型輔酶Q10的制備方法，該方法是下式(II)所示的氧化型輔酶Q10的制備方法 其特征在于，通過在含有碳源、氮源、磷源和微量營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物，得到還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上的微生物細(xì)胞，根據(jù)需要將該微生物細(xì)胞破碎，將所產(chǎn)生的還原型輔酶Q10氧化轉(zhuǎn)變成氧化型輔酶Q10后用有機(jī)溶劑將其提取，或者將所產(chǎn)生的還原型輔酶Q10用有機(jī)溶劑提取，根據(jù)需要進(jìn)行精制處理后，將還原型輔酶Q10氧化轉(zhuǎn)變成氧化型輔酶Q10。
34.權(quán)利要求33所述的制備方法，其中培養(yǎng)結(jié)束時(shí)還原型輔酶Q10的產(chǎn)量為1μg/mL或1μg/mL以上。
35.權(quán)利要求33或34所述的制備方法，其中培養(yǎng)在15～45℃并且pH＝4～9的條件下進(jìn)行。
36.權(quán)利要求33～35中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中在培養(yǎng)過程中，將碳源濃度控制在實(shí)質(zhì)上不給還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力造成不良影響的濃度。
37.權(quán)利要求36所述的制備方法，其中培養(yǎng)通過流加培養(yǎng)法進(jìn)行。
38.權(quán)利要求37所述的制備方法，其中將碳源與其他成分分別供給到培養(yǎng)基。
39.權(quán)利要求33～38中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中培養(yǎng)是有氧性地進(jìn)行。
40.權(quán)利要求33～39中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中在提取時(shí)將微生物細(xì)胞破碎。
41.權(quán)利要求40所述的制備方法，其中細(xì)胞的破碎通過物理處理、化學(xué)處理、酶處理、加熱處理、自身消化、滲透壓溶解或原生質(zhì)溶解進(jìn)行。
42.權(quán)利要求41所述的制備方法，其中細(xì)胞破碎通過物理處理進(jìn)行。
43.權(quán)利要求42所述的制備方法，其中物理處理通過高壓勻化器、超聲勻化器、法式壓力機(jī)或球磨機(jī)進(jìn)行。
44.權(quán)利要求33～43中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中輔酶Q10的提取是從微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的濕菌體或干燥菌體用親水性有機(jī)溶劑進(jìn)行。
45.權(quán)利要求44所述的制備方法，其中親水性有機(jī)溶劑為丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇。
46.權(quán)利要求33～43中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中輔酶Q10的提取是從微生物細(xì)胞或該細(xì)胞破碎物的水性懸浮液用疏水性有機(jī)溶劑進(jìn)行。
47.權(quán)利要求46所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑為烴類、脂肪酸酯類或醚類。
48.權(quán)利要求46或47所述的制備方法，其中除了疏水性有機(jī)溶劑，還并用親水性有機(jī)溶劑作為輔助溶劑。
49.權(quán)利要求48所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑為烴類，親水性有機(jī)溶劑為醇類。
50.權(quán)利要求48所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑為脂肪烴，親水性有機(jī)溶劑是碳原子數(shù)為1～5的一元醇。
51.權(quán)利要求48所述的制備方法，其中疏水性有機(jī)溶劑是己烷和庚烷中的至少一種，親水性有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、1-丙醇和2-丙醇中的至少一種。
52.權(quán)利要求48～51中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中提取在疏水性有機(jī)溶劑為25～65體積％、親水性有機(jī)溶劑為5～50體積％的條件下進(jìn)行。
53.權(quán)利要求46～52中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中提取通過連續(xù)提取進(jìn)行。
54.權(quán)利要求33～53中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物用試管(內(nèi)徑21mm、全長200mm)在10mL的培養(yǎng)基[(葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g)/L、pH＝6.0]中于25℃振蕩培養(yǎng)72小時(shí)(振幅2cm、310來回/分)，將所得的增殖液根據(jù)需要進(jìn)行濃縮，在氮?dú)夥諊?，相對該增殖?0體積份，在異丙醇3體積份和正己烷18.5體積份的共存下，用玻璃珠(425～600微米)10體積份，劇烈振蕩3分鐘進(jìn)行破碎。將所配制的疏水性有機(jī)溶劑相(正己烷相)通過HPLC進(jìn)行測定時(shí)，還原型輔酶Q10的含量比率為全部輔酶Q10的70摩爾％或70摩爾％以上。
55.權(quán)利要求54所述的制備方法，其中將產(chǎn)還原型輔酶Q10的微生物在權(quán)利要求54所述的條件下通過HPLC進(jìn)行測定時(shí)，單位培養(yǎng)基的還原型輔酶Q10的生產(chǎn)能力為1μg/mL或1μg/mL以上。
56.權(quán)利要求33～55中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中微生物為土壤桿菌屬、曲霉屬、醋酸桿菌屬、氨基桿菌屬、土壤單胞菌屬、嗜酸菌屬、Bulleromyces屬、布勒擲胞酵母屬、短波單胞菌屬、隱球菌屬、Chionosphaere屬、念珠菌屬、Cerinosterus屬、Exisophiala屬、外擔(dān)子菌屬、Fellomyces屬、線狀黑粉菌屬、Filobasidium屬、地霉屬、粉座菌屬、葡糖桿菌屬、Kockovaella屬、Kurtzmanomyces屬、Lalaria屬、Leucosporidium屬、軍團(tuán)菌屬、甲基桿菌屬、枝動菌屬、卵胞酵母屬、假單胞菌屬、Psedozyma屬、副球菌屬、Petromyces屬、紅酵母屬、紅冬胞屬、根單胞菌屬、紅菌屬、紅游動菌屬、紅假單胞菌屬、紅細(xì)菌屬、擲胞酵母屬、鎖擲酵母屬、Saitoella屬、裂殖糖酵母屬、鞘氨醇單胞菌屬、孢子絲菌屬、Sympodiomycopsis屬、Sterigmatosporidium屬、外囊菌屬、銀耳屬、絲胞酵母屬、Tilletiaria屬、腥黑粉菌屬、褶胞黑粉菌屬屬、Tilletiopsis屬、黑粉菌屬、Udeniomyces屬、Xanthophilomyces屬、黃色桿菌屬、擬青霉屬、頂胞霉屬、生絲單胞菌屬或根瘤菌屬的微生物。
57.權(quán)利要求33～56中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中將所得的氧化型輔酶Q10根據(jù)需要精制后，進(jìn)行晶析，得到氧化型輔酶Q10結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明是下述還原型輔酶Q
文檔編號C12P7/02GK1608136SQ0282624
公開日2005年4月20日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者矢島麗嘉, 加藤隆久, 神田彰久, 北村志郎, 上田恭義 申請人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會社