專利名稱：一種重組嗜甲醇酵母的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組嗜甲醇酵母發(fā)酵的改進(jìn)方法。
畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)體系是近十年來發(fā)展起來的真核表達(dá)體系。畢赤酵母的醇氧化酶(Alcohol Oxidase，AOX)基因的強(qiáng)啟動子特別適合于外源基因的表達(dá)調(diào)控。畢赤酵母培養(yǎng)基成分明確，不含熱源或毒素，作為誘導(dǎo)劑和碳源的甲醇價格低廉，適宜于高密度發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)藥用蛋白。根據(jù)利用甲醇的能力，整合外源基因的方法，重組畢赤酵母可劃分為3種表型。對于含有完整AOX1和AOX2基因的Pichia pastoris菌株，在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似，稱為甲醇利用正表型(Mut+)。當(dāng)aox1被外源基因取代，則甲醇代謝需依賴AOX2，AOX2與AOX1有97％的同源性，但甲醇代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型(MutS)。當(dāng)AOX基因全部缺失，不能利用甲醇，稱為甲醇負(fù)表型(Mut-)。后二者表達(dá)外源蛋白有時優(yōu)于Mut+型，且消耗甲醇較少。三種表型菌株在AOX1啟動子調(diào)控下均可誘導(dǎo)異源蛋白的表達(dá)。
重組畢赤酵母的高菌體密度發(fā)酵過程一般為三個階段首先是分批發(fā)酵階段，菌體利用培養(yǎng)基中的甘油生長；其次為甘油完全消耗后進(jìn)入補(bǔ)料發(fā)酵階段，流加甘油進(jìn)一步提高菌體濃度；最后是外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加甲醇誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。由于具有MutS表型的畢赤酵母在以甲醇為唯一碳源時生長緩慢，所以在表達(dá)階段常采用混合碳源流加的方式，即流加甲醇的同時流加易被其代謝的其它碳源，以使菌體維持一定的生長。甘油—甲醇是常用的混合碳源組合，其中甲醇既是誘導(dǎo)劑又是碳源，甘油作為主要碳源。由于甲醇傳感器的發(fā)明和應(yīng)用，甲醇的流加可實(shí)現(xiàn)反饋控制，發(fā)酵液中的甲醇濃度可以穩(wěn)定地控制在需要的水平；由于甘油對AOX1啟動子有嚴(yán)重的阻遏作用，甘油的代謝產(chǎn)物乙醇也會阻遏AOX1啟動子，所以在流加甘油—甲醇混合碳源時，必須嚴(yán)格控制甘油的流加，避免發(fā)酵液中出現(xiàn)殘余甘油；甘油的在線檢測尚未解決，也增加了控制甘油流加的難度。因此，這些不利因素影響了甘油—甲醇混合碳源流加的效果，也限制了MutS表型畢赤酵母的應(yīng)用。鑒于上述原因，山梨醇作為一種非阻遏碳源被廣泛地用在誘導(dǎo)表達(dá)階段的混合碳源中代替甘油，例如文獻(xiàn)Biotechnol.Lett.1999，21669-672中，在誘導(dǎo)表達(dá)階段流加山梨醇—甲醇混合碳源，蛋白的比生產(chǎn)速率比流加甘油—甲醇混合碳源時的提高了33％，但由于山梨醇的細(xì)胞得率較甘油低，最終的蛋白產(chǎn)量差別不大。因此，開發(fā)更為有效的非阻遏碳源用于畢赤酵母發(fā)酵的誘導(dǎo)表達(dá)階段，對提高Pichiapastoris表達(dá)異源蛋白的能力是十分重要的。
根據(jù)上述構(gòu)思，發(fā)明人提出如下技術(shù)方案本發(fā)明所說的重組嗜甲醇酵母的發(fā)酵方法，依次包括培養(yǎng)基發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵和外源基因誘導(dǎo)表達(dá)三階段，其特征在于，在所說的外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段中的碳源含有C2-C3的有機(jī)酸(如乳酸或乙酸)和甲醇，所說的碳源中有機(jī)酸流加速率可以根據(jù)發(fā)酵罐中的溶氧變化情況進(jìn)行調(diào)節(jié)(見文獻(xiàn)Biotechnol.Lett.2003，25(2)173-177)。在所說的外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段中其它培養(yǎng)條件均為同技術(shù)領(lǐng)域中一般技術(shù)人員所熟知的現(xiàn)有技術(shù)，在此不再贅述。為更好控制外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段中的pH值，可采用C2-C3的有機(jī)酸鹽替代部分有機(jī)酸。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于克服了現(xiàn)有技術(shù)中使用甘油—甲醇混合碳源時甘油及其代謝產(chǎn)物乙醇等對AOX1啟動子的阻遏而導(dǎo)致重組基因表達(dá)量低、發(fā)酵過程中碳源流加控制困難等問題，使重組基因表達(dá)量得以很大程度的提高。
1mL甘油冷凍菌種保藏管融化后，取0.7mL種液接入裝有25mL BMGY培養(yǎng)基(1L含YNB 13.4g，甘油10mL，生物素0.4mg，1mol/L pH6.0磷酸緩沖溶液100mL，Yeast Extract 10g，Polypepton 20g)的250mL的搖瓶中，于250rpm，30℃搖床培養(yǎng)14h，得一級種子。250mL搖瓶中裝入25mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(1L含甘油5g，(NH4)2SO42g，CaSO40.06g，K2SO41.2g，MgSO4·7H2O 1g，生物素0.2mg，1mol/L pH6.0磷酸緩沖溶液100mL)，接入5mL一級種子，于250rpm，30℃搖床培養(yǎng)12-14h至培養(yǎng)基中的甘油被消耗，同時加入3g/L甲醇及一定量碳源。所選用碳源為甘油，山梨醇，乳酸，乙酸銨，乙酸鈉，其中甘油和山梨醇為參照組。由于乙酸的加入會導(dǎo)致發(fā)酵液的pH有較大改變，所以使用乙酸銨和乙酸鈉。碳源的加入量與5g/L甘油碳原子摩爾數(shù)相等，每種碳源都有三個搖瓶平行試驗(yàn)，于250rpm，30℃搖床培養(yǎng)8h。取樣測定菌體濃度(采用濁度法，發(fā)酵液經(jīng)稀釋后于波長600nm測光密度OD600，1OD600相當(dāng)于菌體干重0.36g/L)。發(fā)酵液6000rpm離心10min后采用ELISA方法測定發(fā)酵上清液中血管生長抑制素的濃度。結(jié)果見表1。
表1五種碳源對菌體生長及蛋白表達(dá)的影響碳源 甘油山梨醇乳酸乙酸銨乙酸鈉OD60019.517.1 13.716.9 16.5血管生長抑制素(mg/L) 0.432.65 0.611.65 1.59實(shí)施例2將如實(shí)施例1中所述的一級種子分別接于三個裝有50mL BMGY培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于250rpm，30℃搖床培養(yǎng)7-8h，得二級種子。將二級種子接種于5-L發(fā)酵罐中的BSM培養(yǎng)基(1L含85％磷酸26.7mL，CaSO40.93g，K2SO418.2g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，PTM1溶液4.35mL。1L PTM1含CuSO46.0g，KI 0.8g，MnSO43.0g，Na2MoO40.2g，H3BO30.2g，CoCl20.5g，ZnCl220.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0g，生物素0.2g，硫酸5mL)中，接種后體積為2.5L(接種量7％)，溫度30℃，通氣量4mL/min下培養(yǎng)。通過自動流加5MKOH調(diào)節(jié)pH5.0，手動調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速維持溶氧不低于20％。甘油耗盡后，饑餓0.5h開始流加50％(w/w)甘油(每升含12mL PTM1溶液)，菌體密度達(dá)64g/L時停止流加甘油，饑餓0.5h后開始誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，流加甲醇(每升加12mLPTM1溶液)，發(fā)酵罐中的甲醇濃度由甲醇檢測控制系統(tǒng)(見文獻(xiàn)無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22(1)12-15)維持在5g/L；同時流加28.7％(w/w)乙酸銨(每升加12mL PTM1溶液)，乙酸銨流加速率由48h的3mL/h逐漸提高到78.8h的7mL/h并至發(fā)酵結(jié)束，并用50％(v/v)乙酸維持pH5.0。采用乙酸銨—乙酸流加系統(tǒng)時，加入的乙酸銨的CH3COO-被菌體作為碳源而代謝，其消耗造成殘余在發(fā)酵液中的NH4+引起pH上升，從而加入乙酸維持pH恒定。乙酸不僅是pH調(diào)節(jié)劑，同時也是碳源。菌體濃度和蛋白表達(dá)量的測定同實(shí)施例1。經(jīng)55h誘導(dǎo)(全部發(fā)酵時間為111.5h)，菌體濃度達(dá)到125g/L，血管生長抑制素的表達(dá)水平達(dá)到51.5mg/L，平均比生產(chǎn)速率0.01mg/gh。在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)階段采用乙酸銨(乙酸)—甲醇混合碳源，在5-L發(fā)酵罐中發(fā)酵水平與采用山梨醇—甲醇混合碳源相當(dāng)。
實(shí)施例3菌體生長階段的發(fā)酵過程如實(shí)施例2中所述，進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)階段后，流加甲醇(每升加12mL PTM1溶液)，發(fā)酵罐中的甲醇濃度由甲醇檢測控制系統(tǒng)維持在5g/L；同時流加51％(w/w)乳酸(每升含12mL PTM1溶液)，乳酸流加速率由49.1h的5.7g/h逐漸提高到102.6h的21.8g/h并至發(fā)酵結(jié)束，用14％(v/v)氨水調(diào)節(jié)pH5.0。經(jīng)64.5h誘導(dǎo)(全發(fā)酵時間為113h)，菌體濃度達(dá)到87g/L，血管生長抑制素的表達(dá)水平達(dá)到191mg/L，平均比生產(chǎn)速率達(dá)到0.04mg/g·h。誘導(dǎo)階段采用不同碳源和甲醇混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)血管生長抑制素的結(jié)果見表2，采用乳酸—甲醇混合碳源時重組蛋白表達(dá)水平較采用甘油—甲醇混合碳源和山梨醇—甲醇混合碳源有較大提高。
表2誘導(dǎo)表達(dá)階段流加混合碳源發(fā)酵結(jié)果表達(dá)時間 血管生長抑制素 菌體濃度 碳源*用量/甲醇用量 平均比生產(chǎn)速率混合碳源(h)(mg/L)(g/L) (w/w) (mg/g·h)甘油—甲醇 102108 1651.50.02山梨醇—甲醇 65 54.6 1051 0.01乙酸銨—甲醇 55 51.5 1254 0.01乳酸—甲醇 64.5 191 87 1.80.04*所指碳源為混合碳源中甲醇以外的碳源。
根據(jù)本發(fā)明公開的技術(shù)方案和實(shí)施例，有關(guān)的工程技術(shù)人員可以方便地將本發(fā)明所述的重組畢赤酵母發(fā)酵過程控制方法用于其它重組畢赤酵母特別是具有MutS表型的重組畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)其它外源蛋白的發(fā)酵過程中。
權(quán)利要求
1.一種重組嗜甲醇酵母的發(fā)酵方法，依次包括在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的分批發(fā)酵、流加甘油的補(bǔ)料發(fā)酵和外源基因誘導(dǎo)表達(dá)三階段，其特征在于，在所說的外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段中的碳源含有C2-C3的有機(jī)酸和甲醇。
2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，其中所說的有機(jī)酸為乳酸。
3.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，在所說的外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段中的碳源還含有C2-C3的有機(jī)酸鹽。
4.如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征在于，其中所說的有機(jī)酸鹽為C2-C3的有機(jī)酸銨鹽。
5.如權(quán)利要求4所述的發(fā)酵方法，其特征在于，其中所說的有機(jī)酸為乳酸，所說的有機(jī)酸鹽為乳酸銨。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組嗜甲醇酵母(特別是巴斯德畢赤酵母)發(fā)酵的改進(jìn)方法，即在重組嗜甲醇酵母發(fā)酵生產(chǎn)外源基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)表達(dá)階段流加短碳鏈有機(jī)酸—甲醇混合碳源以促進(jìn)菌體的生長和誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，克服了使用甘油—甲醇混合碳源時甘油及其代謝產(chǎn)物乙醇等對AOX1啟動子的阻遏而導(dǎo)致重組基因表達(dá)量低、發(fā)酵過程中碳源流加控制困難等問題。采用短碳鏈有機(jī)酸替代甘油后，重組基因表達(dá)量得以很大程度的提高。
文檔編號C12N1/16GK1446906SQ0311603
公開日2003年10月8日 申請日期2003年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月27日
發(fā)明者葉勤, 謝靜莉 申請人:華東理工大學(xué)