專利名稱：誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力方法及所用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是果實(shí)采后病害防治技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，國(guó)內(nèi)外對(duì)果實(shí)采后病害的控制主要依賴于殺菌劑。但是，隨著人們對(duì)食 品安全和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷增強(qiáng)，化學(xué)殺菌劑的使用范圍和劑量受到了越來(lái)越嚴(yán)格的限 制。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，許多高效但存在食品安全和環(huán)境污染隱患的化學(xué)殺菌劑被禁止使用。 因此，研究、開(kāi)發(fā)能替代化學(xué)殺菌劑的方法和技術(shù)具有重大的社會(huì)意義和廣闊的應(yīng)用前景。在眾多被研究的可能替代化學(xué)殺菌劑的方法中，利用拮抗微生物，特別是拮抗酵 母抑制采后果實(shí)病害的生物防治技術(shù)是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外最為關(guān)注的新型采后病害控制方法之 一(Droby等，2009)。這主要是由于酵母具有遺傳穩(wěn)定、抑菌譜廣、效價(jià)高、一般不產(chǎn)生對(duì) 人和寄主植物有害的代謝產(chǎn)物、安全性高等特點(diǎn)；且其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低，生長(zhǎng)快；并有對(duì)多種 脅迫、逆境具有較強(qiáng)的耐受力，對(duì)大多數(shù)殺菌劑不敏感，并能與多種其它化學(xué)和物理處理相 容。但目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道，甚至已商業(yè)化開(kāi)發(fā)的拮抗酵母對(duì)果實(shí)病害的控制效力與化 學(xué)殺菌劑相比還存在差距(Droby等，2009)。而且由于國(guó)內(nèi)外研究的果實(shí)病害生防酵母均 為非模式酵母，其遺傳背景信息大多不明確，對(duì)其生防生理代謝的研究也尚少，嚴(yán)重限制了 定向提高果實(shí)生防酵母活性技術(shù)的發(fā)展。幾丁質(zhì)，又稱甲殼素，廣泛分布于蝦蟹殼、軟體動(dòng)物的外殼與內(nèi)骨骼，節(jié)肢動(dòng)物的 外骨骼及真菌、酵母菌等微生物細(xì)胞壁中。幾丁質(zhì)不僅資源豐富，而且具有多種重要的生物 學(xué)特性，因此幾丁質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用深受?chē)?guó)內(nèi)外的關(guān)注。一般認(rèn)為，細(xì)菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖等 成分組成，絲狀真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)，而酵母細(xì)胞壁的主要是由葡聚糖(約 占細(xì)胞壁干重35-60% )和幾丁質(zhì)(約占細(xì)胞壁干重1. 5-6% )等成分組成。中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)03135134. 4，一種防治植物寄生線蟲(chóng)的生防制劑)顯示與 含有幾丁質(zhì)等成分的物質(zhì)混合后，能提高中華輪枝菌對(duì)防治植物寄生線蟲(chóng)的效果。中國(guó)發(fā) 明專利(專利號(hào)ZL200410075042.8，海洋小單孢菌抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵促進(jìn)劑)將幾丁質(zhì)作 為用于海洋小單孢菌(一種放線菌)抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵促進(jìn)劑，可提高對(duì)枯草芽孢桿菌和 念珠菌的抗菌效價(jià)。中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)200510039128. X，一種抗灰霉病的生物殺菌劑 及其制備方法)通過(guò)含幾丁質(zhì)等培養(yǎng)基培養(yǎng)木霉菌，可防治植物的灰霉病。此外，中國(guó)國(guó)家 發(fā)明申請(qǐng)?zhí)?200710057189. 8 (—種利用表面活性劑提高綠色木霉生防活性的方法)公開(kāi) 了一種利用表面活性劑提高綠色木霉生防活性的方法。該方法在綠色木霉孢子培養(yǎng)后，與 含有幾丁質(zhì)等物質(zhì)混和，可以提高對(duì)蔬菜灰霉病、白粉病等的防治效果，提高綠色木霉在植 株的定殖能力。中國(guó)國(guó)家發(fā)明申請(qǐng)?zhí)?200710300087. 4 (—種防治煙草黑脛病的菌株及其 菌劑)公開(kāi)了一種以0.8 2.0%膠體幾丁質(zhì)為碳源培養(yǎng)淡紫擬青霉的方法，通過(guò)該方法可 提高其對(duì)煙草黑脛病的防治能力。此外，中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)ZL200510090063. 1，一種酵 母拮抗菌的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基)還公開(kāi)了一種羅倫隱球酵母的培養(yǎng)基配方，該培養(yǎng)
3基由檸檬酸、大豆蛋白胨、硫酸錳、氯化鈣和水組成。但是，目前還沒(méi)有專門(mén)用于誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)Droby S. , ffisniewski M. , Macarisin D. , Wilson C. 2009. Twenty years of postharvestbiocontrol research :Is it time for a new paradigm ？ Postharvest Biology and Technology 52:137-145.(爵勞比等，2009，20年采后生物防治研究采后生 物學(xué)和技術(shù)，52 :137-145.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的 培養(yǎng)基，以及利用該培養(yǎng)基進(jìn)行的誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力 的培養(yǎng)基，包括活化培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基；活化培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2 30g、瓊脂20g和幾丁質(zhì)1 50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCA活化培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2 30g和幾丁質(zhì)1 50g (較優(yōu) 為1 20g)，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCB種子培養(yǎng)基。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述培養(yǎng)基進(jìn)行的誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防 治效力的方法，生防酵母為羅倫隱球酵母，其保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地 址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年1月 20日，保藏號(hào)CGMCC NO. 3590 ；依次進(jìn)行以下步驟1)、活化:①、羅倫隱球酵母CGMCC N0. 3590在NYCA活化培養(yǎng)基中25 28 °C培養(yǎng)46 50 小時(shí)，然后在相同條件下重復(fù)傳代培養(yǎng)2次；②、將上述重復(fù)傳代培養(yǎng)2次所得的活化好的酵母用接種環(huán)接到NYCB種子培養(yǎng)基 中，于150 200rpm、25 28°C的條件下培養(yǎng)22 26小時(shí)；然后在上述相同條件下重復(fù) 培養(yǎng)1次；2)、液體培養(yǎng)將步驟1)活化所得的酵母按照5%重量比的接種量接到NYCB種子培養(yǎng)基中，于 150 200rpm、25 28°C的條件下培養(yǎng)24 144小時(shí)。作為本發(fā)明的誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的方法的改進(jìn)將步驟2) 液體培養(yǎng)后的所得物依次進(jìn)行以下步驟離心分離將步驟2)液體培養(yǎng)后的所得物在3000rpm離心10分鐘，并用滅菌蒸餾水洗以去 除培養(yǎng)介質(zhì)；懸浮和確定濃度用無(wú)菌蒸餾水重新懸浮酵母細(xì)胞，并用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整到細(xì)胞濃度為1 X 106細(xì)胞 /毫升 1X109細(xì)胞/毫升。
本發(fā)明利用幾丁質(zhì)作為拮抗酵母活性激發(fā)子，從而來(lái)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得對(duì)果實(shí)病害控 制更高活性的方法。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)羅倫隱球酵母CGMCC NO. 3590進(jìn)行培養(yǎng)，所得 酵母細(xì)胞具有更好的對(duì)果實(shí)進(jìn)行防腐保鮮的效果。本發(fā)明所得的濃度為1乂106細(xì)胞/毫 升 1 X 109細(xì)胞/毫升的懸浮酵母細(xì)胞能作為果實(shí)生物保鮮劑，將上述果實(shí)生物保鮮劑對(duì) 采前果實(shí)進(jìn)行表面噴灑(果實(shí)表面潤(rùn)濕即可)或采后浸泡1-5分鐘的方法，可防治青霉病 等；果實(shí)包括蘋(píng)果、梨和桃等等。綜上所述，采用本發(fā)明所提供的拮抗酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，能有效激發(fā)拮抗酵母的 活性，具有促進(jìn)拮抗酵母在果實(shí)內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)抑菌物質(zhì)分泌和病原菌水解酶活性等作 用，從而顯著抑制果實(shí)病害的發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明具有安全高效、環(huán)境友好，病害防治效果 突出等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的使用有利于轉(zhuǎn)變長(zhǎng)期以來(lái)依賴化學(xué)殺菌劑為主的果實(shí)真菌病害控制 方法，對(duì)確保食品安全、環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收和經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)的發(fā)展等具有重 要意義。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是幾丁質(zhì)對(duì)羅倫隱球酵母在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響對(duì)比圖；圖中(a)為在NYDB或在不同幾丁質(zhì)含量的NYCB中培養(yǎng)的對(duì)比圖；(b)為在不同葡萄糖濃度的NYCB中培養(yǎng)的對(duì)比圖；圖2是幾丁質(zhì)培養(yǎng)后羅倫隱球酵母在梨果實(shí)體內(nèi)的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)對(duì)比圖；圖中6-D代表NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為106個(gè)細(xì)胞
浮液，6-C代表NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為106個(gè)細(xì)胞 浮液，7-D代表NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為107個(gè)細(xì)胞
浮液，7-C代表NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為107個(gè)細(xì)胞 浮液，8-D代表NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為108個(gè)細(xì)胞 浮液，8-C代表NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為108個(gè)細(xì)胞浮液。圖3是幾丁質(zhì)培養(yǎng)后羅倫隱球酵母在蘋(píng)果果實(shí)體內(nèi)的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)對(duì)比圖；圖4是幾丁質(zhì)培養(yǎng)后的羅倫隱球酵母對(duì)蘋(píng)果誘導(dǎo)抗性的增強(qiáng)效應(yīng)對(duì)比圖；圖中7-D代表NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為107個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，7-C代表NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為107個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，
/毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸 /毫升的C. laurentii懸
8-D代表NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為108個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，8-C代表NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為108個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，9-D代表NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為109個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸 浮液，9-C代表NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)的原始接入濃度為109個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸 浮液；圖5是不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)基對(duì)羅倫隱球酵母幾丁質(zhì)酶和0 -1，3-葡聚糖酶活性 的影響對(duì)比圖；圖中，(a)為不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)基對(duì)羅倫隱球酵母幾丁質(zhì)酶活性的影響對(duì)比 圖；(b)為不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)基對(duì)0 -1,3-葡聚糖酶活性的影響對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式
下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1、一、培養(yǎng)基的配置NYCA活化培養(yǎng)基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g、瓊脂20g和幾丁質(zhì)5g， 水定容至1000ml，高壓滅菌(121°C，30分鐘)后得NYCA活化培養(yǎng)基；NYCB種子培養(yǎng)基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g和幾丁質(zhì)5g，水定容至 1000ml，高壓滅菌(121°C，30分鐘)后得NYCB種子培養(yǎng)基。二、菌種活化和制備1)、活化①、選用于低溫(4°C)下保存在NYCA活化培養(yǎng)基中的羅倫隱球酵母CGMCC NO. 3590 ；將上述羅倫隱球酵母CGMCC NO. 3590在NYCA活化培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)48小時(shí)，然 后在相同條件下重復(fù)傳代培養(yǎng)2次(每次均為在NYCA活化培養(yǎng)基基中28°C培養(yǎng)48小時(shí))。②、將上述重復(fù)傳代培養(yǎng)2次所得的活化好的酵母用接種環(huán)接到NYCB種子培養(yǎng)基 中，于200rpm、28°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)；然后在上述相同條件下重復(fù)培養(yǎng)1次，即將NYCB種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得的酵母再 次用接種環(huán)接到NYCB種子培養(yǎng)基中，于200rpm、28°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)。2)、液體培養(yǎng)將步驟1)活化所得的酵母按照5%重量比的接種量接到NYCB種子培養(yǎng)基中(即 酵母與NYCB種子培養(yǎng)基的重量比為5% )，于200rpm、28°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。3)、離心分離將步驟2)液體培養(yǎng)后的所得物在3000rpm條件下離心10分鐘，并用滅菌蒸餾水 洗2次，以去除培養(yǎng)介質(zhì)；4)、懸浮和確定濃度
用無(wú)菌蒸餾水重新懸浮酵母細(xì)胞，用血球記數(shù)板的方法確定酵母的濃度，并用無(wú) 菌蒸餾水調(diào)整到濃度為1 x 106細(xì)胞/毫升 1 X 109細(xì)胞/毫升；得C. laurentii懸浮液。實(shí)施例2、將NYCB種子培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)的重量由5g改成10g，其余同實(shí)施例1。實(shí)施例3、將NYCB種子培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)的重量由5g改成20g，其余同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)1、對(duì)果實(shí)的生防實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1.1、對(duì)梨的生防實(shí)驗(yàn)以相同品種及成熟度的梨果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用消過(guò)毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面 形成統(tǒng)一大小和深度的傷口。實(shí)驗(yàn)組1 實(shí)驗(yàn)組5、對(duì)比組1 對(duì)比組3以及空白對(duì)照組均為先加入30 yl不同的試劑，加入試劑2小時(shí)后在每個(gè)傷口加入等量(30 yl)的 P. expansum孢子懸浮液，濃度為1 X 104SpOreS/ml。處理完畢后在常溫下(20-25°C )貯藏， 并用PE塑料膜密封作保濕處理。每天定時(shí)對(duì)果實(shí)傷口處病害發(fā)生和發(fā)展情況進(jìn)行觀察和 記錄，結(jié)果以平均病害發(fā)生率(％ )和平均病斑直徑(mm)表示。每處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù) 24個(gè)果實(shí)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次以上。每個(gè)傷口處加入的30 U 1試劑具體如下實(shí)驗(yàn)組1、果實(shí)傷口處加入30 iU實(shí)施例1所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)濃度為0. 5% )；實(shí)驗(yàn)組2、果實(shí)傷口處加入30 yl實(shí)施例2所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)濃度為)；實(shí)驗(yàn)組3、果實(shí)傷口處加入30 yl實(shí)施例3所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)濃度為2% )；實(shí)驗(yàn)組4、果實(shí)傷口處加入30 ill實(shí)施例2所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)濃度為)；實(shí)驗(yàn)組5、果實(shí)傷口處加入30 ill實(shí)施例2所得的濃度為 C. laurentii懸浮液(NYCB種子培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)濃度為)；對(duì)比實(shí)驗(yàn)以NYDA活化培養(yǎng)基替代NYCA活化培養(yǎng)基，以NYDB種子培養(yǎng)基替代NYCB種子培 養(yǎng)基，其余均同實(shí)施例1，得對(duì)比例。NYDA活化培養(yǎng)基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g和瓊脂20g，水定容至 1000ml，高壓滅菌(121°C，30分鐘)后所得NYDA活化培養(yǎng)基。NYDB種子培養(yǎng)基將牛肉浸膏8g、酵母粉5g和葡萄糖10g，水定容至1000ml，高壓 滅菌(12rc，30分鐘)后所得NYDB種子培養(yǎng)基。對(duì)比組1、果實(shí)傷口處加入30 ill對(duì)比例所得的濃度為108個(gè)細(xì)胞/毫升的 C. laurentii 懸浮液；對(duì)比組2、果實(shí)傷口處加入30iU對(duì)比例所得的濃度為106個(gè)細(xì)胞/毫升的 C. laurentii 懸浮液；對(duì)比組3、果實(shí)傷口處加入30iU對(duì)比例所得的濃度為107個(gè)細(xì)胞/毫升的 C. laurentii 懸浮液。空白對(duì)照組果實(shí)傷口處加入30 U 1的無(wú)菌水。
108個(gè)細(xì)胞/毫升的 108個(gè)細(xì)胞/毫升的 108個(gè)細(xì)胞/毫升的 106個(gè)細(xì)胞/毫升的 107個(gè)細(xì)胞/毫升的
以下結(jié)果分別為在處理后5天和6天檢測(cè)而得，具體結(jié)果如表1所示表1、對(duì)梨青霉病的控制效果
~ 表中數(shù)字為平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤。實(shí)驗(yàn)1. 2、對(duì)蘋(píng)果的生防實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)1. 1中的梨改成蘋(píng)果，并選取實(shí)驗(yàn)1. 1中的若干個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組，其余等 同實(shí)驗(yàn)1.1，結(jié)果如表2所示表2、對(duì)蘋(píng)果青霉病的控制效果 表中數(shù)字為平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤。實(shí)驗(yàn)1. 3、對(duì)桃果實(shí)的生防實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)1. 1中的梨改成油桃，并選取實(shí)驗(yàn)1. 1中的若干個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組，其余同 實(shí)驗(yàn)1.1，結(jié)果如表3所示(為病原菌接種后第6天的統(tǒng)計(jì)數(shù))表3、對(duì)桃青霉病的控制效果
度為0%) 與利用現(xiàn)有技術(shù)給出的NYDA活化培養(yǎng)基和NYDB種子培養(yǎng)基相比，利用本發(fā)明的 NYCA活化培養(yǎng)基和NYCB種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的C. Iaurentii能顯著提高其拮抗效力，即降低了 水果果實(shí)的發(fā)病率(％ )、減小了水果果實(shí)的病斑直徑(mm)。C. Iaurentii的拮抗效力總體 上與酵母的濃度成正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)2、幾丁質(zhì)對(duì)羅倫隱球酵母在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響按5% (V/V)接種量將羅 倫隱球酵母菌接入不同的NYCB培養(yǎng)基中(幾丁質(zhì)含量分別為0. 1，0. 2，0. 5，1. 0，2. 0%，w/ ν ；葡萄糖均為IOg ；)以NYDB為對(duì)照；或者該不同的NYCB培養(yǎng)基為幾丁質(zhì)恒定(w/v)，葡萄糖加入量分別設(shè)置在每 L 中含 0、2、4、8、10、12、14、16、18 和 20 克。
在28°C條件下震蕩培養(yǎng)(200rpm) 24-144小時(shí)后，取樣在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)器 對(duì)酵母數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以每ml總酵母數(shù)量為單位(log細(xì)胞數(shù)/毫升)。每個(gè)處理重復(fù) 3次，每重復(fù)4個(gè)獨(dú)立樣品。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。結(jié)果如下C. Iaurentii在含0. 1-2. 0% (w/v)幾丁質(zhì)的NYCB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-144小時(shí)的 生長(zhǎng)量沒(méi)有顯著差異，C. Iaurentii在不同葡萄糖濃度的NYCB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-144小時(shí) 的生長(zhǎng)量沒(méi)有顯著差異(圖1)。實(shí)驗(yàn)3、幾丁質(zhì)培養(yǎng)后的羅倫隱球酵母在果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)用消過(guò)毒的打 孔器在每個(gè)果實(shí)表面形成統(tǒng)一大小和深度的傷口，在每個(gè)傷口處加入等量(30μ1)的經(jīng)過(guò) NYCB培養(yǎng)基(IOg幾丁質(zhì)，IOg葡萄糖)培養(yǎng)后C. Iaurentii細(xì)胞懸浮液。以在正常NYDB 培養(yǎng)基培養(yǎng)的作為對(duì)照。處理后貯藏在常溫(20°C )下，并定期取樣對(duì)酵母的群體數(shù)量進(jìn)行 測(cè)定。測(cè)定方法是用打孔器將果實(shí)傷口處組織完全取出(確保酵母的完全提取)，放于定 量無(wú)菌蒸餾水中，并用捻缽搗碎，取樣在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)器對(duì)酵母菌數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié) 果以每個(gè)傷口處總酵母數(shù)量為單位(log細(xì)胞數(shù)/孔)。每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)6個(gè)果 實(shí)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。1、梨果實(shí)果實(shí)生物防腐保鮮實(shí)驗(yàn)設(shè)置以下處理(1)處理1 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的濃度為IO8個(gè)細(xì)胞 /毫升的C. Iaurentii懸浮液。(2)處理2 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì)濃度為l%，10g 葡萄糖)培養(yǎng)的濃度為IO8個(gè)細(xì)胞/毫升的C. Iaurentii懸浮液。(3)處理3 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的濃度為IO7個(gè)細(xì)胞 /毫升的C. Iaurentii懸浮液。(4)處理4 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì)濃度為l%，10g 葡萄糖)培養(yǎng)的濃度為IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的C. Iaurentii懸浮液。(5)處理5 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的濃度為IO6個(gè)細(xì)胞 /毫升的C. Iaurentii懸浮液。(6)處理6 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì)濃度為l%，10g 葡萄糖)培養(yǎng)的濃度為IO6個(gè)細(xì)胞/毫升的C. Iaurentii懸浮液。2、蘋(píng)果果實(shí)生物防腐保鮮實(shí)驗(yàn)設(shè)置以下處理(1)處理1 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的濃度為IO8個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸浮液；(2)處理2 果實(shí)傷口處加入上述體積經(jīng)過(guò)NYCB培養(yǎng)基(1 %幾丁質(zhì)，10g葡萄糖) 培養(yǎng)的濃度為108個(gè)細(xì)胞/毫升的C. laurentii懸浮液。C. laurentii在梨和蘋(píng)果果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)速度分別如圖2和圖3所示，說(shuō)明 C. laurentii本發(fā)明經(jīng)過(guò)本發(fā)明培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)后在梨和蘋(píng)果果實(shí)傷口處的生長(zhǎng)速度明 顯優(yōu)于在常規(guī)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度。實(shí)驗(yàn)4、培養(yǎng)液上清液對(duì)果實(shí)病害的抑制效應(yīng)實(shí)施例1的步驟3)離心分離所得液體經(jīng)0.45 ym膜過(guò)濾，得培養(yǎng)液上清液。實(shí)驗(yàn)4. 1、培養(yǎng)液上清液對(duì)梨果實(shí)病害的抑制，設(shè)置以下處理以相同品種及成熟度的梨果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用消過(guò)毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面 形成統(tǒng)一大小和深度的傷口(使用5mm直徑打孔器)，先加入30 yl不同的試劑，2小時(shí)后 在原傷口接入病原菌P.expansum孢子懸浮液(1 X 104個(gè)孢子/毫升)30 yl。上述處理完 成后，將果實(shí)貯藏于常溫(20-25°C )下貯藏，并用PE塑料膜密封作保濕處理。4天后對(duì)病 害發(fā)生率(％)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)12個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。每個(gè)傷口處加入的30 U 1試劑具體如下無(wú)菌水，對(duì)照；NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)后的上清液；NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì)含量為0. 5%,10g葡萄糖)培養(yǎng)后的上清液；NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì)含量為l%，10g葡萄糖)培養(yǎng)后的上清液。培養(yǎng)液上清液的抑菌效果如表4所示。表4、培養(yǎng)液上清液對(duì)梨青霉病的控制效果 表中數(shù)字為平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤。實(shí)驗(yàn)4. 2、培養(yǎng)液上清液對(duì)蘋(píng)果病害的抑制，設(shè)置以下處理將實(shí)驗(yàn)4. 1中的梨改成蘋(píng)果，并選取實(shí)驗(yàn)4. 1中的若干個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組，其余同 實(shí)驗(yàn)4. 1，結(jié)果如表5所示表5、培養(yǎng)液上清液對(duì)蘋(píng)果青霉病的控制效果
表中數(shù)字為平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤。實(shí)驗(yàn)4. 3培養(yǎng)液上清液對(duì)桃病害的抑制設(shè)置以下處理將實(shí)驗(yàn)4. 1中的梨改成桃，每個(gè)傷口處加入的30 iU試劑具體如下無(wú)菌水，對(duì)照；NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)后的上清液；NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)后的上清液并經(jīng)過(guò)100°C、15分鐘加熱處理；NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì)濃度為1%，葡萄糖10克)培養(yǎng)后的上清液；NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì)濃度為1 %，葡萄糖10克)培養(yǎng)后的上清液并經(jīng)過(guò)100°C、15 分鐘加熱處理；其余內(nèi)容同實(shí)驗(yàn)4. 1，結(jié)果如表6所示表6、培養(yǎng)液上清液對(duì)桃青霉病的控制效果 表中數(shù)字為平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤。根據(jù)上述表格可知，C. laurentii在NYDB中培養(yǎng)后的上清液沒(méi)有抑菌效力。而在 NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，C. laurentii的發(fā)酵上清液(培養(yǎng)液上清液)顯示了出對(duì)擴(kuò)展青霉在梨果實(shí)傷口處侵染的抑制作用。特別是完全抑制了早期(第4天)病害癥狀的出現(xiàn)，而且 到第7天時(shí)仍能顯著抑制青霉病的病斑直徑(表4)。在蘋(píng)果果實(shí)傷口上也有類似的結(jié)果 (表5)。在水蜜桃果實(shí)上(表6)，NYDB中培養(yǎng)后酵母上清液，同樣對(duì)P.expansum沒(méi)有抑制 作用。但在NYCB培養(yǎng)基(幾丁質(zhì))培養(yǎng)后的酵母上清液，能對(duì)桃果實(shí)青霉病產(chǎn)生20% 左右的抑制作用(平均病斑直徑)。NYCB培養(yǎng)基加熱后的發(fā)酵上清液沒(méi)有抑菌性能。實(shí)驗(yàn)5、對(duì)果實(shí)傷口系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)果實(shí)先用消過(guò)毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面 形成統(tǒng)一大小和深度的傷口。每個(gè)傷口處30 yl等量以下處理在NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的濃度為107個(gè)細(xì)胞/毫升酵母懸浮液；在NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的濃度為108個(gè)細(xì)胞/毫升酵母懸浮液；在NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的濃度為109個(gè)細(xì)胞/毫升酵母懸浮液；NYCB培養(yǎng)基中(1%幾丁質(zhì)，葡萄糖10克)培養(yǎng)的濃度為107個(gè)細(xì)胞/毫升酵母 懸浮液；NYCB培養(yǎng)基(1 %幾丁質(zhì)，葡萄糖10克)培養(yǎng)的濃度為108個(gè)細(xì)胞/毫升酵母懸 浮液；NYCB培養(yǎng)基(1 %幾丁質(zhì)，葡萄糖10克)培養(yǎng)的濃度為109個(gè)細(xì)胞/毫升酵母懸 浮液；無(wú)菌水(作為對(duì)照)。上述處理完成后，將果實(shí)貯藏于常溫(20_25°C )下貯藏，并用PE塑料膜密封作保 濕處理。72小時(shí)后在離原傷口 5mm處新開(kāi)一個(gè)同樣大小的傷口，并接入病原菌P. expansum 孢子懸浮液(1乂104個(gè)孢子/毫升)。病原菌接種處理后果實(shí)繼續(xù)貯藏在原先同樣條件下， 4天后對(duì)病害發(fā)生率(％)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)12個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2次。結(jié)果如下在NYDB中培養(yǎng)的C. laurentii在最高使用濃度(109個(gè)細(xì)胞/毫升)能誘導(dǎo)蘋(píng)果 果實(shí)產(chǎn)生對(duì)青霉病的抗性，而在較低濃度(107個(gè)細(xì)胞/毫升和108個(gè)細(xì)胞/毫升)均不能 誘導(dǎo)果實(shí)的抗性(圖4)。而經(jīng)過(guò)NYCB培養(yǎng)基培養(yǎng)后的C. laurentii，在接種處理到蘋(píng)果果實(shí)上后，其對(duì)蘋(píng) 果抗性的誘導(dǎo)能力顯著增強(qiáng)，且在較低濃度(108個(gè)細(xì)胞/毫升)時(shí)也能誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生對(duì)青 霉病的抗性。實(shí)驗(yàn)6、羅倫隱球酵母對(duì)幾丁質(zhì)酶和0 -1. 3-葡聚糖酶的活性實(shí)驗(yàn)6. 1、羅倫隱球酵母對(duì)幾丁質(zhì)酶活性酵母經(jīng)過(guò)NYDB或NYCB培養(yǎng)基(分別含0. 1、0. 5、1或2%幾丁質(zhì)，葡萄糖均為10 克)培養(yǎng)后所得的培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)3000rpm離心、0. 45 u m膜過(guò)濾后所得上清液作為酶測(cè)定提 取液。反應(yīng)液組成為1ml濃度為0.4% (w/v)膠體幾丁質(zhì)，lml 50mmol/l醋酸緩沖液(Ph 5. 0)，lml上清液。反應(yīng)液在37°C培養(yǎng)反應(yīng)1小時(shí)后，離心去除沉淀，所得的上清液取0. 5ml 加入lOiU濃度為20% (w/v)的蝸牛酶溶液，繼續(xù)在37°C培養(yǎng)反應(yīng)1小時(shí)。釋放出的N-乙 酰葡萄糖胺含量按以下方法進(jìn)行測(cè)定加入0. 2ml濃度為0. 8mol/l四硼酸納，沸水浴中 加熱3分鐘，迅速冷卻；加入預(yù)先用2. 7ml冰醋酸和0. 3ml濃度為10%的二甲氨苯甲醛〔 dimethylaminobenzaldehyde，DMAB，用冰醋酸和濃鹽酸按87. 5 12. 5(體積比)比例配制而成〕混合的溶液，37°C培養(yǎng)反應(yīng)20分鐘后迅速冷卻；在585nm測(cè)定吸光度。以反應(yīng)0小 時(shí)樣品作為對(duì)照，同時(shí)測(cè)定N-乙酰葡萄糖胺含量；用N-乙酰葡萄糖胺做標(biāo)準(zhǔn)曲線；以每ml 上清液每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生釋放lnmol N-乙酰葡萄糖胺作為一個(gè)酶活力單位(U)； 每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。實(shí)驗(yàn)6. 2、對(duì)0 -1. 3-對(duì)葡聚糖酶活性酵母經(jīng)過(guò)NYDB或NYCB培養(yǎng)基(分別含0. 1、0. 5、1或2%幾丁質(zhì)，葡萄糖均為10 克)培養(yǎng)后所得的培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)3000rpm離心、0. 45 u m膜過(guò)濾后所得上清液作為酶測(cè)定提 取液。反應(yīng)液組成為1ml濃度為0.4% (w/v)昆布多糖(Sigma)溶液，lml 50mmol/l醋酸 緩沖液(Ph 5. 0)，lml上清液。在37°C培養(yǎng)反應(yīng)1小時(shí)后，加入1. 5mL3. 5 一二硝基水揚(yáng)酸 試劑(DNS)試劑，在沸水浴中保溫10分鐘，取出試管，冷卻后測(cè)定530nm吸光度；并以反應(yīng) 0小時(shí)樣品同時(shí)做測(cè)定葡萄糖含量；用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線；以每ml上清液每小時(shí)分解產(chǎn)生 lnmol葡萄糖作為一個(gè)酶活力單位(U)；每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。上述實(shí)驗(yàn)6. 1和實(shí)驗(yàn)6. 2的統(tǒng)計(jì)分析為每個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)中每個(gè)處理至少設(shè)3個(gè) 以上重復(fù)，并按照完全隨機(jī)區(qū)組原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。每個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)至少重復(fù)2次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用SPSS/PC統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)組內(nèi)比較個(gè)數(shù)為3個(gè)及3個(gè)以上時(shí)，采用Duncan' s 多重比較進(jìn)行方差分析，分離平均數(shù)；當(dāng)組內(nèi)個(gè)數(shù)為2個(gè)時(shí)，采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)進(jìn)行平均 數(shù)分離。結(jié)果如圖5所示；C. laurentii在NYCB培養(yǎng)基(0.5-2%幾丁質(zhì))培養(yǎng)24小時(shí)后， 其上清液中的幾丁質(zhì)酶活性顯著提高，特別是在最佳濃度(1%)時(shí)，幾丁質(zhì)酶活性是未添 加幾丁質(zhì)對(duì)照的5倍左右。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的培養(yǎng)基，包括活化培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，其特征是所述活化培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g、瓊脂20g和幾丁質(zhì)1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCA活化培養(yǎng)基；所述種子培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g和幾丁質(zhì)1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCB種子培養(yǎng)基。
2.利用權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基進(jìn)行的誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的方法， 其特征是所述生防酵母為羅倫隱球酵母，其保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地 址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年1月 20日，保藏號(hào)CGMCCN0. 3590 ；依次進(jìn)行以下步驟1)、活化:①、羅倫隱球酵母CGMCCNO. 3590在NYCA活化培養(yǎng)基中25 28°C培養(yǎng)46 50小時(shí)， 然后在相同條件下重復(fù)傳代培養(yǎng)2次；②、將上述重復(fù)傳代培養(yǎng)2次所得的活化好的酵母用接種環(huán)接到NYCB種子培養(yǎng)基中， 于150 200rpm、25 28°C的條件下培養(yǎng)22 26小時(shí)；然后在上述相同條件下重復(fù)培養(yǎng) 1次；2)、液體培養(yǎng)將步驟1)活化所得的酵母按照5%重量比的接種量接到NYCB種子培養(yǎng)基中，于150 200rpm、25 28°C的條件下培養(yǎng)24 144小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的方法，其特征是 將步驟2)液體培養(yǎng)后的所得物依次進(jìn)行以下步驟離心分離將步驟2)液體培養(yǎng)后的所得物在3000rpm離心10分鐘，并用滅菌蒸餾水洗以去除培 養(yǎng)介質(zhì)；懸浮和確定濃度用無(wú)菌蒸餾水重新懸浮酵母細(xì)胞，并用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整到細(xì)胞濃度為1 X 106細(xì)胞/毫 升 1X109細(xì)胞/毫升。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的培養(yǎng)基，包括活化培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g、瓊脂20g和幾丁質(zhì)1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCA活化培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖2～30g和幾丁質(zhì)1～50g，水定容至1000ml，高壓滅菌后得NYCB種子培養(yǎng)基。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了利用上述培養(yǎng)基進(jìn)行的誘導(dǎo)提高生防酵母對(duì)果實(shí)病害防治效力的方法，包括對(duì)羅倫隱球酵母CGMCC NO.3590進(jìn)行活化和液體培養(yǎng)等步驟。
文檔編號(hào)A23B7/155GK101857843SQ20101015356
公開(kāi)日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者余挺, 盧黃娉, 王一非, 鄭曉冬 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)