專利名稱：高效耐酸性液化糖化酶及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效耐酸性液化糖化酶及其制備方法，屬于淀粉原料的酶水解利用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淀粉質(zhì)原料的酶分解，一般由α-淀粉酶和糖化酶兩種酶協(xié)同作用，完成淀粉的液化和糖化過程。α-淀粉酶(α-amylase，EC3.2.1.1.)是一種有內(nèi)切活性的淀粉酶，在中性pH條件下可從內(nèi)部切開α-1，4糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖，麥芽寡糖及少量葡萄糖；糖化酶全稱葡萄糖淀粉酶(glucoamylase，EC3.2.1.3.)是一種外切酶，在酸性pH條件下可從淀粉的非還原性末端逐個切開α-1，4和α-1，6糖苷鍵，反應(yīng)最終產(chǎn)物為葡萄糖分子。
由于α-淀粉酶和糖化酶的最適反應(yīng)pH不同，中性淀粉酶與酸性糖化酶不能同時使用，淀粉質(zhì)原料的液化、糖化需由兩個工序完成；現(xiàn)市面上雖已有α-淀粉酶和糖化酶的復(fù)合酶出現(xiàn)，基于以上原因，在釀酒等發(fā)酵過程的酸性環(huán)境下，α-淀粉酶的活性變得極低甚至失去活性；現(xiàn)在雖也有細(xì)菌產(chǎn)生的耐酸性α-淀粉酶面世，但只有國外有極少公司生產(chǎn)，且價格高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種高效耐酸性液化糖化酶及其制備方法，其特點是借助基因工程技術(shù)進行遺傳育種，獲得含有多拷貝耐酸性α-淀粉酶和糖化酶融合基因的特種霉菌TR12菌株(Journal of The Institute of Brewing，Vol.105，No.9，1999)，本發(fā)明者旨在以該基因工程菌株作為實用菌株，通過發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)酶制劑以及淀粉液化糖化過程的一體化工藝實現(xiàn)。
本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實現(xiàn)。其中所述原料份數(shù)除特殊說明外，均為重量份數(shù)。
高效耐酸性液化糖化酶及其制備方法
淀粉及多種原材料經(jīng)配料制成種子培養(yǎng)基，接種由基因工程育種所得的特種霉菌TR12菌株，經(jīng)培養(yǎng)制得種子，該種子接入淀粉及各種原材料經(jīng)配料制成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在通氣及一定溫度下，獲得發(fā)酵產(chǎn)物-耐酸性液化糖化酶，再經(jīng)提取制得酶制劑產(chǎn)品。
(1)斜面菌種培養(yǎng)取工程菌TR12保存菌種(或凍干管、或砂土管、或保藏斜面)，接種選擇斜面培養(yǎng)基，于溫度30-35℃培養(yǎng)7-10日，選取表面生長均勻，孢子層厚實的斜面菌落，再次移種淀粉培養(yǎng)基，于溫度30-35℃培養(yǎng)5-7日，獲得斜面菌種，可在溫度4℃，保存15-30日。
(2)種子培養(yǎng)將種子培養(yǎng)基的淀粉質(zhì)原料加水混合均勻，加熱攪拌直至淀粉糊化，冷卻后，加α-淀粉酶液化，用雙層紗布過濾，加入玉米漿，定容。分裝于錐形瓶中。在溫度118-122℃滅菌20-25分鐘，冷卻后接種，在120-220r/min的回旋搖床上于溫度32-35℃培養(yǎng)20-30小時，獲得種子。
(3)搖瓶發(fā)酵(不補料發(fā)酵工藝)將發(fā)酵培養(yǎng)基的淀粉質(zhì)原料加水糊化，液化，過濾，加玉米漿，調(diào)pH，定容，分裝于錐形瓶中，在溫度118-122℃滅菌20-30分鐘后，冷卻，按10～20％的接種量加入已培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)物，然后在120-220r/min的回旋搖床上于溫度30-32℃培養(yǎng)3-4日，獲得發(fā)酵液產(chǎn)物。
(4)搖瓶發(fā)酵(補料發(fā)酵工藝)發(fā)酵的基礎(chǔ)料培養(yǎng)基的配制同上不補料發(fā)酵工藝所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基分裝于錐形瓶中。在溫度118-122℃滅菌20-30min。冷卻后，按10～20％的接種量加入已培養(yǎng)好的種子物。在120-220r/mm的回旋搖床上，每次10～20％補料量、1-3次補料條件下(補料培養(yǎng)基，僅碳源濃度為基礎(chǔ)料的3-5倍，其它成分同)，在30-32℃培養(yǎng)4-6日，獲得發(fā)酵液產(chǎn)物。
(5)酶制劑提取將上述發(fā)酵液產(chǎn)物放入離心機內(nèi)，以3000～3500rpm、離心10～20分鐘、洗滌，上層清液經(jīng)過濾、合并后得粗酶液。粗酶液在真空度0.07-0.09Mpa、溫度40-45℃條件下獲得濃縮酶液。濃縮酶液調(diào)pH＝3.5-4.5，按每升酶液中加入10-20g玉米淀粉，攪拌均勻，使酶和淀粉充分吸附，在溫度10～20℃緩慢加入2-2.5倍的冷藏乙醇，邊加邊攪拌，即可看到酶的沉淀。沉淀物離心分離后，所得酶泥放入真空干燥箱中，在真空度0.07-0.09Mpa、于溫度40-45℃干燥3-4小時，獲得粗酶制劑成品。
酶制劑中的耐酸性α-淀粉酶活性參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB1805.1-93測定，耐酸性α-淀粉酶活性為500～1000U/g，糖化酶活性參照QB1805.2-93測定，糖化酶活性為20000～50000U/g，最適宜溫度50-60℃，pH＝4.0-5.0，在50℃熱穩(wěn)定性最好，K+、Na+、Ca2+、Mg2+等金屬化合物可以作為酶制劑活性的保護劑或促進劑。液化糖化酶主要用于淀粉糖制品中的淀粉水解和酒精、氨基酸、有機酸、抗生素及其它發(fā)酵工業(yè)中的淀粉水解，本發(fā)明的耐酸性液化糖化酶制劑與現(xiàn)有酶制劑指標(biāo)的比較，詳見表1所示。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、填補了我國在耐酸性α-淀粉酶品種上的空白，實現(xiàn)了酸性環(huán)境下液化糖化工序一體化，不僅可以替代進口，而且可以出口創(chuàng)匯，為我國國民經(jīng)濟發(fā)展做出貢獻。
2、本產(chǎn)品應(yīng)用范圍廣泛，市場前景廣闊，而且對環(huán)境和生態(tài)的保護具有重要意義。
3、使用耐酸性液化糖化酶，pH＝4.0-5.0，液化酸度低，液化糖化工序同時進行，粘度低、能耗低、過濾性好、收率高。例如，每噸酒渣加酶再發(fā)酵，可望多產(chǎn)50°酒20公斤，經(jīng)濟效益顯著。
4、可使應(yīng)用本產(chǎn)品的企業(yè)降低生產(chǎn)成本和勞動強度，提高生產(chǎn)力，促進傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)躍上新臺階。
四

圖1為高效耐酸性液化糖化酶制備的流程圖。
五具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
實施例1(酶制劑的制備)1)斜面菌種培養(yǎng)取工程菌TR12保藏菌種，接種選擇斜面培養(yǎng)基(KCl 2g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g/L，Sugar 1mol/L，乙酰胺10mM，CsCl 15mM，瓊脂15g/L)，于溫度32℃，培養(yǎng)7日，移種淀粉斜面培養(yǎng)基(玉米淀粉20g/L，KNO32g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO42.7g/L，瓊脂粉20g/L，pH5.0)，于溫度32℃培養(yǎng)7日，獲得斜面菌種。
2)種子培養(yǎng)將種子培養(yǎng)基(玉米粉60g/L，玉米漿20g/L，黃豆粉20g/L)淀粉質(zhì)原料加水混合均勻，加熱攪拌直至淀粉糊化。冷卻后加入α-淀粉酶液化，雙層紗布過濾后，加入玉米漿成分，定容。按每瓶50ml分裝250-ml錐形瓶，8層紗布塞住瓶口，牛皮紙包扎。在121℃滅菌20分鐘，冷卻后接種，然后在210r/min的回旋搖床上32℃培養(yǎng)25小時。
3)搖瓶發(fā)酵將發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉50g/L，玉米漿20g/L，黃豆粉20g/L，麩皮30g/L，檸檬酸調(diào)pH值3.5-4.0)的淀粉質(zhì)原料加水糊化、液化，過濾，最后加玉米漿，調(diào)pH，定容，按50ml分裝250-ml錐形瓶中。于溫度121℃滅菌20分鐘，冷卻，按10％的接種量加入已培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)物，然后在210r/mm的回旋搖床上于溫度32℃培養(yǎng)4天，獲得發(fā)酵液產(chǎn)物。
4)酶制劑提取將上述發(fā)酵液產(chǎn)物加入離心機內(nèi)，以3500rpm離心15分鐘、洗滌，上面清液經(jīng)紗布過濾，合并后得到的含耐酸性α-淀粉酶活性20.9U/ml、糖化酶活性786U/ml的粗酶液，在真空度0.09Mpa、45℃水浴中濃縮，獲得含耐酸性α-淀粉酶活性202.9U/ml、糖化酶活性7540U/ml的濃縮酶液。濃縮酶液調(diào)pH＝3.5，加入1％玉米粉，攪拌均勻，在10～20℃緩慢加入2.2倍的冷藏乙醇，邊加邊攪拌，析出酶的沉淀，離心后酶泥放入真空干燥箱中，在真空度0.09Mpa、溫度45℃下干燥3小時，干燥物為含耐酸性α-淀粉酶活性863U/g、糖化酶活性30736U/g的粗酶制劑成品。
實施例2(酶制劑的制備)
1)斜面菌種培養(yǎng)同實施例1。
2)種子培養(yǎng)同實施例1。
3)搖瓶發(fā)酵將發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉50g/L，玉米漿20g/L，黃豆粉20g/L，麩麥30g/L，檸檬酸調(diào)pH值3.5)的淀粉質(zhì)原料加水糊化、液化，過濾。按800mL分裝于3000ml錐形瓶中。于溫度122℃滅菌25min。冷卻后，按15％的接種量加入已培養(yǎng)好的錐形瓶種子物。在160r/min的回旋搖床上32℃培養(yǎng)，并分別在32小時、80小時按20％量各補料1次(補料培養(yǎng)基，僅碳源濃度為基礎(chǔ)料的3倍，其它成分同)，培養(yǎng)5日后，獲得發(fā)酵液產(chǎn)物。
4)酶制劑提取提取方法與實施例1同，上述發(fā)酵液產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌、過濾、濃縮、干燥后，獲得含耐酸性α-淀粉酶活性925U/g、糖化酶活性35142U/g的粗酶制劑成品。
實施例3(酶制劑的制備)1)斜面菌種培養(yǎng)同實施例1。
2)種子培養(yǎng)同實施例1。
3)搖瓶發(fā)酵將發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉50g/L，玉米漿20g/L，黃豆粉20g/L，麩麥30g/L，檸檬酸調(diào)pH值3.5)的淀粉質(zhì)原料加水糊化、液化，過濾。按500ml分裝于3000-ml錐形瓶中。于溫度118℃滅菌30min。冷卻后，按20％的接種量加入已培養(yǎng)好的錐形瓶種子物。在160r/min的回旋搖床上32℃培養(yǎng)，并分別在32小時、64小時、96小時按15％量各補料1次(補料培養(yǎng)基，僅碳源濃度為基礎(chǔ)料的5倍，其它成分同)，培養(yǎng)6日后，獲得發(fā)酵液產(chǎn)物。
4)酶制劑提取提取方法與實施例1同，上述發(fā)酵液產(chǎn)物經(jīng)離心、洗滌、過濾、濃縮、干燥后，獲得含耐酸性α-淀粉酶活性711U/g、糖化酶活性21754U/g的粗酶制劑成品。
應(yīng)用實例1(葡萄糖漿制備)玉米淀粉加水調(diào)成濃度300～320g/L的淀粉乳，用HCl水溶液將淀粉乳調(diào)至pH4.5-4.6，按每千克干淀粉添加氯化鈣500mg和氯化鈉10mg。加入本實驗室自制酶8U/g淀粉(以耐酸性α-淀粉酶活性計)，在60-65℃保溫60min左右，至用碘液測試呈棕橙色，液化純度20-22％為止。再降溫到55℃，再補充加入自制的酶制劑100U/g淀粉(以糖化酶活性計)繼續(xù)糖化30小時左右，保溫測定糖化度至96％～98％。加活性碳1％-1.5％，加熱至80℃-90℃保溫脫色30min，調(diào)pH4.0-4.2。經(jīng)過濾、離子交換樹脂處理，可得到純凈的葡萄糖漿。
應(yīng)用實例2(酒精發(fā)酵)稱取玉米粉50g，加2.5倍量的水調(diào)漿，調(diào)pH值為4.6，煮沸糊化2min，冷卻至60℃，加入10U/g淀粉(以耐酸性α-淀粉酶活性計)的自制酶液，于60℃液化糖化15min，再降溫到50℃，補加150U/g淀粉(以糖化酶活性計)的自制酶液繼續(xù)糖化30min，至稀碘液顯棕色。把糖化液裝入500-ml三角瓶中，糖化液補水至225g，加入1g干酵母，常溫25℃發(fā)酵3日。蒸餾，獲濃度28.3％v/v的酒精80ml，乙醇收率為45.28ml/100g淀粉。
應(yīng)用實例3(酒精發(fā)酵)稱取玉米粉50g，加2.5倍量的水調(diào)漿，調(diào)pH值為4.6后，直接加入10U/g淀粉(以耐酸性α-淀粉酶活性計)的自制酶液，于60℃液化糖化1h，再降溫到50℃，補加80U/g淀粉(以糖化酶活性計)的自制酶液繼續(xù)糖化30min，至稀碘液顯棕色。把糖化液裝入500-ml三角瓶中，糖化液補水至225g，加入1g干酵母，常溫25℃發(fā)酵4日。蒸餾，獲濃度30.9％v/v的酒精80ml，乙醇收率為49.44ml/100g淀粉。
表1本發(fā)明的耐酸性液化糖化酶制劑與現(xiàn)有酶制劑指標(biāo)的比較

權(quán)利要求
1.一種由下述方法制得的高效耐酸性液化糖化酶，其特征在于淀粉及多種原材料經(jīng)配料制成種子培養(yǎng)基，接種由基因工程育種所得的特種霉菌TR12菌株，經(jīng)培養(yǎng)制得種子，該種子接入淀粉及各種原材料經(jīng)配料制成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在通氣及一定溫度下，獲得發(fā)酵產(chǎn)物-耐酸性液化糖化酶，再經(jīng)提取制得酶制劑產(chǎn)品，其中耐酸性α-淀粉酶活性參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB1805.1-93測定，耐酸性α-淀粉酶活性為500～1000U/g，糖化酶活性參照QB1805.2-93測定，糖化酶活性為20000～50000U/g。
2.按照權(quán)利要求1所述方法制得的高效耐酸性液化糖化酶，其特征在于(1)斜面菌種培養(yǎng)取工程菌TR12保存菌種，接種選擇斜面培養(yǎng)基，于溫度30-35℃培養(yǎng)7-10日，選取表面生長均勻，孢子層厚實的斜面菌落，再次移種淀粉培養(yǎng)基，于溫度30-35℃培養(yǎng)5-7日，獲得斜面菌種，(2)種子培養(yǎng)將種子培養(yǎng)基的淀粉質(zhì)原料加水混合均勻，加熱攪拌直至淀粉糊化，冷卻后，加α-淀粉酶液化，用雙層紗布過濾，加入玉米漿，定容，分裝于錐形瓶中，在溫度118-122℃滅菌20-25分鐘，冷卻后接種，在120-220r/min的回旋搖床上于溫度32-35℃培養(yǎng)20-30小時，獲得種子，(3)搖瓶發(fā)酵(不補料發(fā)酵工藝)將發(fā)酵培養(yǎng)基的淀粉質(zhì)原料加水糊化，液化，過濾，最后加玉米漿，調(diào)pH，定容，分裝于錐形瓶中，在溫度118-122℃滅菌20-30分鐘后，冷卻，按10～20％的接種量加入已培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)物，然后在120-220r/min的回旋搖床上于溫度30-32℃培養(yǎng)3-4日，獲得發(fā)酵液產(chǎn)物，(4)搖瓶發(fā)酵(補料發(fā)酵工藝)發(fā)酵的基礎(chǔ)料培養(yǎng)基的配制同上不補料發(fā)酵工藝所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基分裝于錐形瓶中，在溫度118-122℃滅菌20-30min，冷卻后，按10～20％的接種量加入已培養(yǎng)好的種子物，在120-220r/min的回旋搖床上，每次10～20％補料量1-3次補料條件下(補料培養(yǎng)基，僅碳源濃度為基礎(chǔ)料的3-5倍，其它成分同)，在30-32℃培養(yǎng)4-6日，獲得發(fā)酵液產(chǎn)物，(5)酶制劑提取將上述發(fā)酵液產(chǎn)物放入離心機內(nèi)，以3000～3500rpm、離心10～20分鐘、洗滌，上層清液經(jīng)過濾、合并后得粗酶液，粗酶液在真空度0.07-0.09Mpa、溫度40-45℃條件下獲得濃縮酶液，濃縮酶液調(diào)pH＝3.5-4.5，按每升酶液中加入10-20g玉米淀粉，攪拌均勻，使酶和淀粉充分吸附，在溫度10～20℃緩慢加入2-2.5倍的冷藏乙醇，邊加邊攪拌，即可看到酶的沉淀，沉淀物離心分離后，所得酶泥放入真空干燥箱中，在真空度0.07-0.09Mpa、溫度40-45℃干燥3-4小時，獲得粗酶制劑成品，其中耐酸性α-淀粉酶活性參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB1805.1-93測定，耐酸性α-淀粉酶活性為500～1000U/g，糖化酶活性參照QB1805.2-93測定，糖化酶活性為20000～50000U/g。
3.按照權(quán)利要求1或2所述高效耐酸性液化糖化酶的用途，其特征在于液化糖化酶主要用于淀粉糖制備中的淀粉水解和酒精、氨基酸、有機酸、抗生素及其它發(fā)酵工業(yè)中的淀粉水解。
全文摘要
一種高效耐酸性液化糖化酶及其制備方法和用途，其特點是借助基因工程技術(shù)進行遺傳育種，獲得含有多拷貝耐酸性α－淀粉酶和糖化酶融合基因的特種霉菌TR12作為實用菌株，通過發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)酶制劑以及液化糖化過程一體化工藝實現(xiàn)，該酶制劑中耐酸性α－淀粉酶活性參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB1805.1－93測定，耐酸性α－淀粉酶活性為500～1000U/g，糖化酶活性參照QB1805.2－93測定，糖化酶活性為20000～50000U/g，液化糖化酶主要用于淀粉糖制品中的淀粉水解和酒精、氨基酸、有機酸、抗生素及其它發(fā)酵工業(yè)中的淀粉水解，它具有液化糖化工序同時進行，能耗低、產(chǎn)品粘度低、過濾性好、收率高、質(zhì)量穩(wěn)定、無三廢污染、大幅度降低生產(chǎn)成本和勞動強度，有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C12N1/14GK1477200SQ0311747
公開日2004年2月25日 申請日期2003年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月17日
發(fā)明者張文學(xué), 何殿松, 楊瑞, 胡承 申請人:四川大學(xué)