專(zhuān)利名稱(chēng)：梅嶺霉素細(xì)胞色素p450羥化酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種催化梅嶺霉素糖苷配基C6-C8a呋喃環(huán)生物合成的基因，特別是一種梅嶺霉素細(xì)胞色素P450羥化酶基因，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
梅嶺霉素(meilingmycin)是由南昌鏈霉菌(Streptomyces nanchangensis)產(chǎn)生的一種十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，它的母核和世界著名抗生素阿弗菌素(avermectin)一致，而側(cè)鏈則完全不同。由于阿弗菌素獨(dú)特的作用機(jī)制，以及所具有的高效、毒副作用低、安全性高和對(duì)環(huán)境影響極小等優(yōu)點(diǎn)，使這一大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素逐漸成為目前世界上使用最廣泛的驅(qū)線蟲(chóng)和除殺外寄生蟲(chóng)抗生素，尤其是該類(lèi)抗生素防治節(jié)肢動(dòng)物類(lèi)寄生蟲(chóng)病的效果是當(dāng)今其它抗生素不可替代的，阿弗菌素對(duì)防治全球性的畜禽寄生蟲(chóng)病起到了極為重要的作用并獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，詳見(jiàn)Haruo Ikeda and Satoshi Omura.Avermectin biosynthesis(阿弗菌素的生物合成)。Chemical reviews(化學(xué)綜述)。1997，97，2591-2609。從母核相同的角度考慮，梅嶺霉素與阿弗菌素有著相似的生物學(xué)活性。實(shí)驗(yàn)證明，梅嶺霉素和阿弗菌素一樣，完全無(wú)抗微生物活性，而有廣譜殺蟲(chóng)活性，并且梅嶺霉素也是通過(guò)破壞昆蟲(chóng)、螨類(lèi)、圓蟲(chóng)類(lèi)的神經(jīng)系統(tǒng)而起作用的，而且殺蟲(chóng)譜及活性?xún)?yōu)于阿弗菌素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種梅嶺霉素細(xì)胞色素P450羥化酶基因，使其可用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的化合物或蛋白的創(chuàng)新和發(fā)展。本發(fā)明根據(jù)已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列(國(guó)際GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AB032367)，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出阿弗菌素生物合成基因簇中負(fù)責(zé)催化阿弗菌素糖苷配基C6-C8a呋喃環(huán)形成的細(xì)胞色素P450羥化酶基因(aveE)片段，并以之為探針進(jìn)行Southern雜交，從南昌鏈霉菌基因文庫(kù)中獲得包含有其同源序列的陽(yáng)性科斯質(zhì)粒(cosmid)。對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定和分析后，從南昌鏈霉菌中獲得了與細(xì)胞色素P450羥化酶基因高度同源的基因，被命名為meiE，其核苷酸序列長(zhǎng)度為1380個(gè)堿基對(duì)(bp)，編碼459個(gè)氨基酸。
本發(fā)明利用已克隆的基因在抗生素生物合成基因簇中進(jìn)行同源基因的定向敲除或增加，創(chuàng)造出非天然的“雜合”分子以開(kāi)辟利用組合生物合成及遺傳工程技術(shù)創(chuàng)新微生物藥物的新途徑，為已知生物活性分子的高產(chǎn)和新微生物農(nóng)藥的創(chuàng)新提供新的技術(shù)和手段。在藥物的創(chuàng)新方面，可利用已克隆的基因進(jìn)行下述基因操作(1)基因敲除通過(guò)基因置換或基因中斷技術(shù)定向去除或失活不同抗生素生物合成基因簇中的該同源基因，獲得在相應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)處不發(fā)生氧化的新的結(jié)構(gòu)衍生物。
(2)基因加倍通過(guò)將該基因克隆至單拷貝或多拷貝基因表達(dá)載體上，在異源宿主進(jìn)行表達(dá)，獲得在相應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)處發(fā)生氧化的新的結(jié)構(gòu)衍生物。


圖1由MeiE所催化的梅嶺霉素糖苷配基C6-C8a呋喃環(huán)形成過(guò)程的示意圖具體實(shí)施方式
如圖1所示，由AveE的生物學(xué)功能類(lèi)比，MeiE的生物學(xué)功能是催化梅嶺霉素糖苷配基C6-C8a呋喃環(huán)的形成。以下進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的實(shí)施具體描述1、從阿弗菌素產(chǎn)生菌Streptomyces avermitilis NRRL8165中PCR擴(kuò)增aveE基因部分片段(1)按照《鏈霉菌遺傳操作實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(霍普伍德等著，鄧子新等譯，1988，湖南科學(xué)技術(shù)出版社)實(shí)驗(yàn)程序，從阿弗菌素產(chǎn)生菌Streptomyces avermitilisNRRL8165中提取總DNA。
(2)根據(jù)已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AB032367)，在aveE基因內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)引物引物15’GAG TGC TCT CGC CCC CAC CC 3’引物25’CGA CGA CCG CGA CCG TAA CG 3’(3)按以下體系與條件進(jìn)行PCR反應(yīng)試劑 反應(yīng)濃度 體積(μl)buffer(10x) 1x 4DNTP(各2.5mM) 0.2mM 3.2MgCl2(25mM)1.2mM 2引物1(4μM) 0.5μM 5引物2(4μM) 0.5μM 5模版總DNA(1μg/μl) 1μg 1DMSO(50％)2.5％2Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5U 1H2O16.8步驟 溫度(℃) 時(shí)間預(yù)變性94 8分鐘變性 94 30秒退火 60 40秒延伸 72 60秒循環(huán) 352、aveE PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證純化680bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，與aveE序列進(jìn)行比較，驗(yàn)證一致。
3、aveE PCR產(chǎn)物與南昌鏈霉菌NS3226總DNA基因文庫(kù)的Southern雜交以純化測(cè)序的680bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為探針，進(jìn)行α-P32放射性同位素標(biāo)記后與南昌鏈霉菌NS3226總DNA基因文庫(kù)進(jìn)行Southern雜交，在高嚴(yán)謹(jǐn)度洗膜條件下(65℃，0.2×SSC)獲得2個(gè)陽(yáng)性科斯質(zhì)粒(cosmid)。
4、陽(yáng)性科斯質(zhì)粒的測(cè)序與分析選取其中一個(gè)陽(yáng)性科斯質(zhì)粒2E4進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。將DNA片段用550SonicDismembrator超聲波(Fisher Scientific公司)斷裂并0.7％用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收其中1.6-2.0kb片段，再經(jīng)過(guò)Geneclean II reagent kit(Bio 101，Inc公司)純化后克隆至pUC18的SmaI位點(diǎn)(預(yù)先經(jīng)CIAP處理)，構(gòu)建成一系列測(cè)序亞克隆。測(cè)序亞克隆質(zhì)粒DNA的制備采用Prep 96 Plasmid Kit(Qiagen公司)。序列的測(cè)定采用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystem Division，Perkin Elmer公司)在377 DNA Sequencers(PE/ABD)上自動(dòng)完成，測(cè)序通用引物為5’GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’(forward)，5’GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAGG 3’(reverse)。序列的0RF分析是通過(guò)日本國(guó)立衛(wèi)生研究院的在線服務(wù)器http//watson.nih.go.jp/~jun/cgi-bin/frameplot.pl提供的Frame-Plot 2.3.2在線軟件進(jìn)行。序列的同源性比較是通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的在線服務(wù)器提供的PSI-BLAST軟件(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行。
序列1為催化梅嶺霉素糖苷配基C6-C8a呋喃環(huán)形成的基因meiE的核苷酸序列，長(zhǎng)度為1380個(gè)堿基對(duì)(bp)。
序列2為催化梅嶺霉素糖苷配基C6-C8a呋喃環(huán)形成的基因meiE的氨基酸序列，長(zhǎng)度為459個(gè)氨基酸。
以下根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容提供基因序列序列列表<110>上海交通大學(xué)<120>梅嶺霉素細(xì)胞色素P450羥化酶基因(meiE)<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1380<212>DNA<213>南昌鏈霉菌NS3226(Streptomyces nanchangensis n.sp.NS3226)<400>1atgcctgccc ctctccaagt ccccgatgtg ccgggctcgt ggccggtggt gggccatctg 60ccccaactgg cccggcggcc gctcgacttc ctgtcctccc tggccgacca cggagacctg120gtcagaatcc ggctcggccg caagcccgtc tacgtggcca cccacccgga tctggtgcgg180tcgctgctgg tgaccgacgc acacgcctac acacgaggcg ccggacacgc caaggcgctg240gccttcatcg gaccgatcct cgtcgcgacg accggtgagc cccaccggcg ccagcgccgc300atgatgcagc cctgcttcca ccggcaacgg ctcggcagct acgtgtccgc catgtgctcg360gccgccacgg agacagccga ctcctggtcg gcccaggacg tggtggatgt ggtgcccgtc420atgaccgagc tggccacagc aatgatcgcc aagtcgttgt tcgtctccga acgtgccgca480cacgccgagg cggaactgcg taagaccggc aacgccatcc tgaccgtggc caggatgagc540gcgatcctgc ccgggatcta ccgacggctg ccgacccctg gcaaccggca actgcccccg600gcccgaaccg tgatcgagga gaccatcgcc gcctaccgcg ccgaggggca ggaccacggc660gatatgctct cgacgctcct gcggacgacg gacgccaccg gcaccggact gaccgacgag720gagatccgcg acgaggtcat gggcctggcc atcaccggaa tcggcgggcc cgccgccatc780gcgtcgtgga tcttctacga gctcggccag aaccctgacc tcgaacgacg gctgcacgag840gagctcgaca cggtcctcga cggccggcca cccagctccc aggacctcac ccggctggtc900ttcacccagc ggctcgtcaa ggaggccctg cgcaagtacc cgggatgggt cggcgcccgg960cgcacacgag agtcggtgcg cctcggcggc cacgaaatcc ccgccgacgc ggaggtcatg 1020tacagcgcct acgccctcca gaacgacccc cgctggtacc cggaccccga gcggttcgac1080cccgaccgct gggaccccca gcagaacgcc acgcgggtca agaagggcgc ctgggttccc1140ttctcgggag gtgtctacaa gtgcatcgga gacgcgttca ccgagaccga gaccgcggtg1200gccgtcgccg tcatcgcctc ccggtggcgg ctgcgcccgg cggacgggcg cagtgtccga1260gcgagccatc tggccaccca tgtggtcccc cggccgctcc gtatggtcgt ggagcccagg1320agccggaaca aggacgaggc ggagcgctca ccgcatgagg cgccacaggt gagccgatga1380<210>2<211>459<212>PRT<213>南昌鏈霉菌NS3226(Streptomyces nanchangensis n.sp.NS3226)<400>1Met Pro Ala Pro Leu Gln Val Pro Asp Val Pro Gly Ser Trp Pro Val1 5 10 15Val Gly His Leu Pro Gln Leu Ala Arg Arg Pro Leu Asp Phe Leu Ser20 25 30Ser Leu Ala Asp His Gly Asp Leu Val Arg Ile Arg Leu Gly Arg Lys35 40 45Pro Val Tyr Val Ala Thr His Pro Asp Leu Val Arg Ser Leu Leu Val50 55 60Thr Asp Ala His Ala Tyr Thr Arg Gly Ala Gly His Ala Lys Ala Leu65 70 75 80Ala Phe Ile Gly Pro Ile Leu Val Ala Thr Thr Gly Glu Pro His Arg85 90 95Arg Gln Arg Arg Met Met Gln Pro Cys Phe His Arg Gln Arg Leu Gly100105110Ser Tyr Val Ser Ala Met Cys Ser Ala Ala Thr Glu Thr Ala Asp Ser115 120 125Trp Ser Ala Gln Asp Val Val Asp Val Val Pro Val Met Thr Glu Leu130135140Ala Thr Ala Met Ile Ala Lys Ser Leu Phe Val Ser Glu Arg Ala Ala145150 155160His Ala Glu Ala Glu Leu Arg Lys Thr Gly Asn Ala Ile Leu Thr Val
165 170 175Ala Arg Met Ser Ala Ile Leu Pro Gly Ile Tyr Arg Arg Leu Pro Thr180185190Pro Gly Asn Arg Gln Leu Pro Pro Ala Arg Thr Val Ile Glu Glu Thr195 200 205Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Gly Gln Asp His Gly Asp Met Leu Ser210215220Thr Leu Leu Arg Thr Thr Asp Ala Thr Gly Thr Gly Leu Thr Asp Glu225230 235240Glu Ile Arg Asp Glu Val Met Gly Leu Ala Ile Thr Gly Ile Gly Gly245250255Pro Ala Ala Ile Ala Ser Trp Ile Phe Tyr Glu Leu Gly Gln Asn Pro260265270Asp Leu Glu Arg Arg Leu His Glu Glu Leu Asp Thr Val Leu Asp Gly275280285Arg Pro Pro Ser Ser Gln Asp Leu Thr Arg Leu Val Phe Thr Gln Arg290295300Leu Val Lys Glu Ala Leu Arg Lys Tyr Pro Gly Trp Val Gly Ala Arg305310 315320Arg Thr Arg Glu Ser Val Arg Leu Gly Gly His Glu Ile Pro Ala Asp325330335Ala Glu Val Met Tyr Ser Ala Tyr Ala Leu Gln Asn Asp Pro Arg Trp340345350Tyr Pro Asp Pro Glu Arg Phe Asp Pro Asp Arg Trp Asp Pro Gln Gln355360365Asn Ala Thr Arg Val Lys Lys Gly Ala Trp Val Pro Phe Ser Gly Gly370375380Val Tyr Lys Cys Ile Gly Asp Ala Phe Thr Glu Thr Glu Thr Ala Val385390 395400Ala Val Ala Val Ile Ala Ser Arg Trp Arg Leu Arg Pro Ala Asp Gly405410415Arg Ser Val Arg Ala Ser His Leu Ala Thr His Val Val Pro Arg Pro420425430Leu Arg Met Val Val Glu Pro Arg Ser Arg Asn Lys Asp Glu Ala Glu435440445Arg Ser Pro His Glu Ala Pro Gln Val Ser Arg45045權(quán)利要求
1.一種梅嶺霉素細(xì)胞色素P450羥化酶基因，其特征在于它編碼細(xì)胞色素P450羥化酶，催化梅嶺霉素糖苷配基C6-C8a呋喃環(huán)的形成，基因的核苷酸序列長(zhǎng)度為1380個(gè)堿基對(duì)(bp)，編碼459個(gè)氨基酸，序列分別如下atgcctgccc ctctccaagt ccccgatgtg ccgggctcgt ggccggtggt gggccatctg 60ccccaactgg cccggcggcc gctcgacttc ctgtcctccc tggccgacca cggagacctg 120gtcagaatcc ggctcggccg caagcccgtc tacgtggcca cccacccgga tctggtgcgg 180tcgctgctgg tgaccgacgc acacgcctac acacgaggcg ccggacacgc caaggcgctg 240gccttcatcg gaccgatcct cgtcgcgacg accggtgagc cccaccggcg ccagcgccgc 300atgatgcagc cctgcttcca ccggcaacgg ctcggcagct acgtgtccgc catgtgctcg 360gccgccacgg agacagccga ctcctggtcg gcccaggacg tggtggatgt ggtgcccgtc 420atgaccgagc tggccacagc aatgatcgcc aagtcgttgt tcgtctccga acgtgccgca 480cacgccgagg cggaactgcg taagaccggc aacgccatcc tgaccgtggc caggatgagc 540gcgatcctgc ccgggatcta ccgacggctg ccgacccctg gcaaccggca actgcccccg 600gcccgaaccg tgatcgagga gaccatcgcc gcctaccgcg ccgaggggca ggaccacggc 660gatatgctct cgacgctcct gcggacgacg gacgccaccg gcaccggact gaccgacgag 720gagatccgcg acgaggtcat gggcctggcc atcaccggaa tcggcgggcc cgccgccatc 780gcgtcgtgga tcttctacga gctcggccag aaccctgacc tcgaacgacg gctgcacgag 840gagctcgaca cggtcctcga cggccggcca cccagctccc aggacctcac ccggctggtc 900ttcacccagc ggctcgtcaa ggaggccctg cgcaagtacc cgggatgggt cggcgcccgg 960cgcacacgag agtcggtgcg cctcggcggc cacgaaatcc ccgccgacgc ggaggtcatg1020tacagcgcct acgccctcca gaacgacccc cgctggtacc cggaccccga gcggttcgac1080cccgaccgct gggaccccca gcagaacgcc acgcgggtca agaagggcgc ctgggttccc1140ttctcgggag gtgtctacaa gtgcatcgga gacgcgttca ccgagaccga gaccgcggtg1200gccgtcgccg tcatcgcctc ccggtggcgg ctgcgcccgg cggacgggcg cagtgtccga1260gcgagccatc tggccaccca tgtggtcccc cggccgctcc gtatggtcgt ggagcccagg1320agccggaaca aggacgaggc ggagcgctca ccgcatgagg cgccacaggt gagccgatga1380MPAPLQVPDV PGSWPVVGHL PQLARRPLDF LSSLADHGDL VRIRLGRKPV YVATHPDLVR 60SLLVTDAHAY TRGAGHAKAL AFIGPILVAT TGEPHRRQRR MMQPCFHRQR LGSYVSAMCS 120AATETADSWS AQDVVDVVPV MTELATAMIA KSLFVSERAA HAEAELRKTG NAILTVARMS 180AILPGIYRRL PTPGNRQLPP ARTVIEETIA AYRAEGQDHG DMLSTLLRTT DATGTGLTDE 240EIRDEVMGLA ITGIGGPAAI ASWIFYELGQ NPDLERRLHE ELDTVLDGRP PSSQDLTRLV 300FTQRLVKEAL RKYPGWVGAR RTRESVRLGG HEIPADAEVM YSAYALQNDP RWYPDPERFD 360PDRWDPQQNA TRVKKGAWVP FSGGVYKCIG DAFTETETAV AVAVIASRWR LRPADGRSVR 420ASHLATHVVP RPLRMVVEPR SRNKDEAERS PHEAPQVSR459
全文摘要
一種梅嶺霉素細(xì)胞色素P450羥化酶基因，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。它編碼細(xì)胞色素P450羥化酶，催化梅嶺霉素糖苷配基C6－C8a呋喃環(huán)的形成，基因的核苷酸序列長(zhǎng)度為1380個(gè)堿基對(duì)(bp)，編碼459個(gè)氨基酸。根據(jù)已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出阿弗菌素生物合成基因簇中負(fù)責(zé)催化阿弗菌素糖苷配基C6－C8a呋喃環(huán)形成的細(xì)胞色素P450羥化酶基因片段，并以之為探針進(jìn)行Southern雜交，從南昌鏈霉菌基因文庫(kù)中獲得包含有其同源序列的陽(yáng)性科斯質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序與功能分析，獲得梅嶺霉素細(xì)胞色素P450羥化酶基因。本發(fā)明開(kāi)以辟利用組合生物合成及遺傳工程技術(shù)創(chuàng)新微生物藥物的新途徑，為已知生物活性分子的高產(chǎn)和新微生物農(nóng)藥的創(chuàng)新提供新的技術(shù)和手段。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1472323SQ03116990
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者鄧子新, 孫宇暉, 周秀芬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)