專(zhuān)利名稱：一種SARS病毒DNA疫苗pVPS的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的SARS病毒DNA疫苗pVPS。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織將嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome；SARS)簡(jiǎn)稱薩斯病，并確認(rèn)是一種SARS病毒(SARS coronavirus)引起的傳染性疾病。目前尚無(wú)針對(duì)SARS病毒的特效藥，研制有效的預(yù)防性疫苗勢(shì)在必行。DNA疫苗，是近年興起的新型疫苗，具有抗體效價(jià)維持時(shí)間長(zhǎng)和交叉保護(hù)效果好等優(yōu)點(diǎn)。此外DNA疫苗還具有以下突出優(yōu)點(diǎn)(1)能誘發(fā)體液及細(xì)胞全方位免疫應(yīng)答，起到預(yù)防作用；(2)免疫保護(hù)時(shí)間長(zhǎng)；(3)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯運(yùn)方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種SARS病毒DNA疫苗pVPS，可用于預(yù)防人嚴(yán)重急性呼吸道綜合征。其作用機(jī)理為將SARS病毒表面抗原S抗原決定簇編碼序列插入真核表達(dá)載體，將其注射于肌肉組織，使其在肌細(xì)胞中表達(dá)病毒表面抗原，經(jīng)過(guò)抗原提呈過(guò)程，可激活體內(nèi)的體液免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)。激活的體液免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異的抗體，消除游離在血液中的病毒，預(yù)防SARS病毒的入侵；而激活的細(xì)胞免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)，攻擊已被感染的細(xì)胞，消除隱藏的SARS病毒。
目前已知，S蛋白是存在于SARS病毒表面的糖蛋白，參與病毒入侵細(xì)胞時(shí)的受體結(jié)合、細(xì)胞融合，是病毒的主要抗原。已知的SARS病毒CUHK-W1(GENEBANKnumberAY278554)、HKU-39849(GENEBANK numberAY278491)、BJ01(GENEBANKnumberAY278488)、BJ02(GENEBANK numberAY278487)、BJ03(GENEBANK numberAY278490)、BJ04(GENEBANK numberAY279354)、GZ01(GENEBANK numberAY278489)等株中的基因具有極高的同源性。它們的S基因基本結(jié)構(gòu)為全長(zhǎng)3768bp，編碼1255個(gè)氨基酸的成熟蛋白。
本發(fā)明對(duì)S蛋白進(jìn)行抗原決定簇分析，選擇編碼抗原決定簇的編碼序列作為插入的外源DNA序列，其結(jié)構(gòu)為T(mén)ATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTTAA鑒于人TPA(纖溶酶原激活劑)的信號(hào)肽具有將蛋白質(zhì)前體搬運(yùn)到細(xì)胞膜，之后信號(hào)肽被切割，成熟蛋白就分泌到細(xì)胞外的功能，故將其編碼序列接在S抗原決定簇編碼序列前端，所組成的SARS病毒分泌型S蛋白抗原決定簇編碼序列簡(jiǎn)稱為S-P，其表達(dá)的抗原蛋白能分泌到細(xì)胞外，從而大大提高體液免疫，起到更好的預(yù)防病毒感染的作用。
本發(fā)明SARS病毒DNA疫苗pVPS的制備方法如下1.人工合成SARS病毒分泌型S蛋白抗原決定簇編碼序列S-P(見(jiàn)核苷酸序列表1)a)序列特征長(zhǎng)度282bp類(lèi)型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類(lèi)型DNAc)來(lái)源人工合成d)序列描述分泌型S蛋白抗原決定簇編碼序列S-P ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGATCTGAATTCTATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTTAA 其中，加下劃線的序列為T(mén)PA的人信號(hào)肽編碼序列，共114bp；5’末端的 為Hind III酶切位點(diǎn)；3’末端的 是Xho I酶切位點(diǎn)。
2.制備DNA疫苗pVPS用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xho I分別對(duì)上述合成的DNA片段S-P和真核表達(dá)載體pVAX1(購(gòu)自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見(jiàn)該公司的產(chǎn)品目錄)進(jìn)行雙酶切，酶切片段分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收。然后將上述pVAX1載體酶切片段與S-P酶切片段按一定比例混合，通過(guò)連接酶進(jìn)行連接，以CaCl2法將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α(購(gòu)自GIBLCO公司)中，在卡那霉素平板上得到轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行篩選。篩選到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為重組pVPS的工程菌，該工程菌可用于制備DNA疫苗pVPS。
本發(fā)明DNA疫苗是真核表達(dá)載體pVAX1與S-P DNA片段的重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒含有pUC ori質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、卡那霉素抗性基因Kanamycin、一個(gè)完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子PCMV、SARS病毒分泌型S蛋白抗原決定簇編碼序列S-P及3’端的多聚腺苷酸BGH pA。
本發(fā)明DNA疫苗制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，可在真核細(xì)胞中表達(dá)S-P抗原并可激活淋巴細(xì)胞。其表達(dá)的抗原蛋白能分泌到細(xì)胞外，從而大大提高體液免疫，預(yù)防病毒感染的作用更強(qiáng)。


圖1為本發(fā)明SARS病毒DNA疫苗pVPS的結(jié)構(gòu)示意2為本發(fā)明SARS病毒DNA疫苗pVPS的構(gòu)建流程圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的制備方法作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1SARS病毒DNA疫苗pVPS的制備DNA疫苗pVPS結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，構(gòu)建流程見(jiàn)圖2。
1.合成S-P DNA序列(結(jié)構(gòu)如前所述)，其5’末端含Hind III酶切位點(diǎn) 3’末端含Xho I酶切位點(diǎn) 2.構(gòu)建pVPS的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xho I對(duì)S-P DNA片段進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為S-P DNA片段5μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl)2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；補(bǔ)H2O至總體積20μl。37℃溫浴消化2小時(shí)。之后將消化樣品進(jìn)行1％低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收S-P酶切片段。同時(shí)，用Hind III和Xho I雙酶切pVAX1載體。反應(yīng)體系為pVAX1載體2μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mM MgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl) 2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；補(bǔ)水至總體積20μl。37℃溫浴消化2小時(shí)。之后將消化樣品進(jìn)行1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收pVAX1酶切片段。
將上述pVAX1酶切片段與S-P酶切片段混合，以連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為pVAX1酶切片段0.5μl(200ng/μl)；S-P酶切片段1μl(50ng/μl)；連接Buffer(660mM Tris-Hcl pH7.6；66mM MgCl2；100mM DTT；1mM ATP)1μl；T4 DNA連接酶1μl(5U/μl)，補(bǔ)H2O至總體積20μl。連接反應(yīng)的條件為12℃10小時(shí)。
3.構(gòu)建pVPS工程菌將上述連接反應(yīng)產(chǎn)物以CaCl2法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中(詳見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002)連接產(chǎn)物10μl與DH5α(1～2×109細(xì)菌/ml)感受態(tài)細(xì)胞200μl混合，冰浴放置30分鐘，42℃2分鐘，冰浴10分鐘，加入0.6ml 2YT液體培養(yǎng)基(16g蛋白胨/L；10g酵母抽提物/L；5g NaCl/L)，37℃培養(yǎng)45分鐘后鋪于含卡那霉素的瓊脂平板。37℃培養(yǎng)12小時(shí)后在瓊脂平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子接種在含100μg/ml卡那霉素的3ml2YT培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，6,000rpm/分鐘離心收集菌體，以質(zhì)粒小量抽提試劑盒(Qiagen)提取質(zhì)粒DNA。然后用Hind III和Xho I雙酶切鑒定。反應(yīng)體系為重組質(zhì)粒1μl(200ng/μl)；10×M Buffer(100mM Tris-Hcl pH7.5；100mMMgCl2；10mM Dithionthreitol；500mM NaCl)2μl；Hind III酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；補(bǔ)H2O至總體積20μl。37℃溫浴消化2小時(shí)。之后將消化樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見(jiàn)283bp S-P片段和2.9kb的pVAX1載體大片段。說(shuō)明篩選到的該陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為重組pVPS的工程菌。
4.SARS病毒DNA疫苗pVPS的制備本發(fā)明的DNA疫苗是用上述重組工程菌株制備的。培養(yǎng)方式為液體培養(yǎng)。采用細(xì)菌發(fā)酵罐行高密度懸浮通氣培養(yǎng)。選用2×YT(含1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化鈉，PH7.0)。發(fā)酵時(shí)添加礦物油等作為消泡劑。培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為14小時(shí)。
從擴(kuò)增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，采用常規(guī)方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002)。具體步驟如下100g濕菌中加入800mL溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl pH8.0，10mMEDTA)強(qiáng)裂振蕩混勻。加入新鮮配制的1L溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)垂直輕柔混勻，室溫5分鐘。再加入冰預(yù)冷的0.75L溶液III(1M醋酸鉀，7M醋酸銨pH4.8)垂直輕柔混勻，冰浴5分鐘。連續(xù)流12000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心取上清。在上清中加入1.53L異丙醇室溫10分鐘，連續(xù)流12000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心留沉淀。加70％乙醇450ml漂洗過(guò)夜。10 000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心10分鐘留沉淀。加1L PBS(pH7.4)溶解，加RNaseA(終濃度0.1％，華美生物工程有限公司)65℃消化30分鐘。再加入等體積的PEG溶液(PEG8000 13％，氯化鈉1.6M)沉淀，12000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心10分鐘，留沉淀。200ml PBS溶解沉淀，加1％體積Triton X114混勻，冰浴5-10分鐘，37℃30分鐘，37℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上層水相。最后用0.45μm和0.22μm雙層濾膜加壓過(guò)濾，用PBS緩沖液稀釋至1mg/ml，即為SARS病毒DNA疫苗pVPS，可用于肌肉注射。
當(dāng)然，構(gòu)建pVPS也可采用其他真核表達(dá)載體，如pCDNA3。
表1分泌型SARS病毒S蛋白抗原決定簇編碼序列S-P的核苷酸序列表AAGCTTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGATCTGAATTCTATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTTAACTCGAG。
權(quán)利要求
1.一種SARS病毒DNA疫苗pVPS，其特征在于由分泌型S蛋白抗原決定簇編碼序列S-P和真核表達(dá)載體構(gòu)成，S-P的核苷酸序列如下AAGCTTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGATCTGAATTCTATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTTAACTCGAG。
2.按權(quán)利要求1所述的SARS病毒DNA疫苗pVPS，其特征在于所說(shuō)的真核表達(dá)載體為pVAX1。
3.權(quán)利要求1或2所述SARS病毒DNA疫苗pVPS用于預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的SARS病毒DNA疫苗pVPS。它由SARS病毒S蛋白抗原決定簇編碼序列與纖溶酶原激活劑TPA的信號(hào)肽編碼序列組成的分泌型S蛋白抗原決定簇編碼序列S－P，插入真核表達(dá)載體所構(gòu)成。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α就成pVPS工程菌，可用于制備疫苗pVPS。由于其表達(dá)的抗原蛋白能分泌到細(xì)胞外，從而增強(qiáng)了體液免疫，起到更好的預(yù)防SARS病毒感染的作用。本發(fā)明DNA疫苗制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，可在真核細(xì)胞中表達(dá)S－P抗原并可激活淋巴細(xì)胞。故可作為預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的DNA疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/50GK1449829SQ03129019
公開(kāi)日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者孫樹(shù)漢, 郭瀛軍, 黃力, 王開(kāi)宇, 張術(shù) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)