一種埃博拉病毒分型熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種埃博拉病毒分型熒光PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉病毒（EBOV)屬絲狀病毒科（Filiviridae)，為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 病毒。病毒呈長絲狀體，可呈桿狀、絲狀、"L"形等多種形態(tài)。毒粒長度平均lOOOnm，直徑 70-90nm。病毒有脂質(zhì)包膜，包膜上有呈刷狀排列的突起，主要由病毒糖蛋白組成。埃博拉 病毒基因組是不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA，大小為18. 9kb，編碼7個結(jié)構(gòu)蛋白和1個非結(jié)構(gòu)蛋白。
[0003] EB0V可在人、猴、豚鼠等哺乳類動物細(xì)胞中增殖，其中Vero-98、Vero_E6、 Hela-229細(xì)胞最敏感。病毒接種后，6-7小時出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞圓化、皺縮，細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)可見纖維狀或顆粒狀結(jié)構(gòu)的包含體。給獼猴接種埃博拉病毒后可產(chǎn)生與人類疾病相似的 癥狀體征并引起死亡。在鳥類、爬行類、節(jié)肢動物和兩棲類動物細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制，在倉鼠與 豚鼠中，需多次傳代才能引起死亡。
[0004] 埃博拉病毒包括五種亞型：扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、塔伊森林型、萊斯頓 型。前四種亞型埃博拉病毒已證實能夠致人類疾病。不同亞型毒力不同，扎伊爾型毒力強， 人感染后病死率高，蘇丹型次之，本迪布焦型更次，塔伊森林型對黑猩猩有致死性，但對人 的毒力較弱。萊斯頓型對非人靈長類動物有致死性，而人感染后不發(fā)病。不同亞型病毒糖 蛋白的基因組核苷酸構(gòu)成差異較大（同源性為34% -43%)，但同一亞型的病毒基因組相對 穩(wěn)定，遺傳特性很少發(fā)生變化。
[0005] 埃博拉出血熱（Ebolafeve)是由埃博拉病毒（Ebolavirus,EB0V)引起的一種急 性出血性傳染病。主要通過接觸病人或感染動物的血液、體液、分泌物和排泄物等而感染， 臨床表現(xiàn)主要為突起發(fā)熱、出血和多臟器損害。埃博拉出血熱病死率高，可達(dá)50% -90%。 本病于1976年在非洲首次發(fā)現(xiàn)，主要在烏干達(dá)、剛果、加蓬、蘇丹、科特迪瓦、南非、幾內(nèi)亞、 利比里亞、塞拉利昂、尼日利亞等非洲國家流行。
[0006] 接觸傳播是本病最主要的傳播途徑。病人或動物的血液及其他體液、嘔吐物、分泌 物、排泄物（如尿、糞便）等均具有高度的傳染性，可以通過接觸病人和亞臨床感染者（特 別是血液、排泄物及其他污染物）而感染。病人自急性期至死亡前血液中均可維持很高的 病毒含量，醫(yī)護人員在治療、護理病人時、或處理病人尸體過程中容易受到感染，病人的轉(zhuǎn) 診還可造成醫(yī)院之間的傳播。醫(yī)院內(nèi)傳播是導(dǎo)致埃博拉出血熱暴發(fā)流行的重要因素。此外， 吸入感染性的分泌物、排泄物、未經(jīng)消毒的注射器等也可造成感染。
[0007] 本病潛伏期為2-21天，一般為5-12天。感染埃博拉病毒后可不發(fā)病或呈輕型，非 重病患者發(fā)病后2周逐漸恢復(fù)。典型病例為急性起病，臨床表現(xiàn)為高熱、畏寒、頭痛、肌痛、 惡心、結(jié)膜充血及相對緩脈。發(fā)病2-3天后可有惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、粘液便或血便等表 現(xiàn)，半數(shù)病人可有咽痛及咳嗽。病后4-5天進(jìn)入極期，發(fā)熱持續(xù)并出現(xiàn)神志的改變，如譫妄、 嗜睡等。重癥病人在發(fā)病數(shù)日可出現(xiàn)不同程度的出血傾向，有咯血，鼻、口腔、結(jié)膜、胃腸道、 陰道及皮膚出血或血尿，病后第10日為出血高峰，50%以上的患者出現(xiàn)嚴(yán)重的出血，并可 因出血、肝腎功能衰竭及致死性并發(fā)癥而死亡。病人最顯著的表現(xiàn)為低血壓、休克和面部 水腫，還可出現(xiàn)DIC、電解質(zhì)和酸堿的平衡失調(diào)等。90%的死亡患者在發(fā)病后12天內(nèi)死亡 (7-14天）。急性期并發(fā)癥有心肌炎、細(xì)菌性肺炎等。由于病毒持續(xù)存在于精液中，也可引 起睪丸炎、睪丸萎縮等遲發(fā)癥。在病程第5-7日可出現(xiàn)麻瘆樣皮瘆，以肩部、手心和腳掌多 見，數(shù)天后消退并脫肩，部分患者可較長期地留有皮膚的改變。目前對埃博拉出血熱尚缺乏 特效治療方法，主要是對癥和支持治療。
[0008] 臨床早期診斷埃博拉出血熱相當(dāng)困難，因其癥狀無特殊性，不易與其他病毒性出 血熱如拉沙熱、黃熱病、馬爾堡出血熱、克里米亞一剛果出血熱、腎綜合征出血熱等鑒別?？?以參考這些疾病的流行病學(xué)特點，主要是流行地區(qū)、流行季節(jié)等進(jìn)行鑒別。確診主要依靠實 驗室檢測，具體方法如下：
[0009] ( -）血清學(xué)檢測
[0010] 患者最早可在癥狀出現(xiàn)后7-10天從血清中檢出特異性IgM、IgG抗體，IgM抗體可 維持3個月，IgG抗體可維持很長時間。多數(shù)患者抗體出現(xiàn)于起病后10-14天，也有重癥病 人至死也未能檢出抗體，故IgG抗體檢測主要用于血清流行病學(xué)調(diào)查，IgM抗體可作為近期 感染的血清流行病學(xué)調(diào)查指標(biāo)，但不能滿足早期診斷的需要。血清特異性IgM抗體多采用 IgM捕捉ELISA法檢測；血清特異性IgG抗體多采用ELISA、免疫熒光等方法檢測。
[0011] (二）病原學(xué)檢測
[0012] 埃博拉病毒高度危險，與活病毒相關(guān)的實驗必須在BSL-4實驗室進(jìn)行。病原學(xué)檢 測包括如下三個方面。病毒抗原檢測：由于埃博拉出血熱有高滴度病毒血癥，可采用ELISA 等方法檢測血清中病毒抗原。免疫熒光法應(yīng)用也很廣泛，它可從感染動物肝、脾中檢測病毒 抗原。病毒分離：采集發(fā)病一周內(nèi)患者血清標(biāo)本，用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。核酸檢 測：采用RT-PCR等核酸擴增方法檢測。一般發(fā)病后一周內(nèi)的病人血清或血漿中可檢測到病 毒核酸。
[0013] 以下實驗室結(jié)果均可確診：病毒抗原陽性；血清特異性IgM抗體陽性；恢復(fù)期血清 特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍以上增高；從患者標(biāo)本中檢出埃博拉病毒RNA ;從患者 標(biāo)本中分離到埃博拉病毒。
[0014] 埃博拉病毒血清學(xué)檢測、病毒抗原檢測檢測時間長，靈敏度低；病毒的分離培養(yǎng)是 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，分離培養(yǎng)的病毒可用于其它研宄，但是分離培養(yǎng)的過程耗時長，需要16-21 天，且需要嚴(yán)格的實驗條件。近年發(fā)展的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，巢式PCR(nestedPCR)技術(shù) 將病毒RNA檢測的特異性和靈敏度大大提高，而實時熒光PCR的出現(xiàn)又將此檢測技術(shù)推向 了另一臺階。實時熒光PCR作為一種現(xiàn)代分子生物學(xué)基因診斷技術(shù)，具有高度敏感性和特 異性，能在數(shù)小時內(nèi)檢出痕量病原，為埃博拉病毒早期快速診斷提供了敏感、快速、實用的 方法。
[0015] 通過熒光PCR的方法直接檢測埃博拉病毒RNA，大大提高埃博拉病毒感染的檢測 準(zhǔn)確性，有利于疾病的早期診斷，熒光PCR方法與其它檢測方法相比具有以下優(yōu)勢：（1)與 免疫學(xué)檢測比較，具有更高的靈敏度，從理論上講只要有一個基因拷貝就可以檢測出來。 (2)根據(jù)各種病原體獨特的保守基因序列設(shè)計引物，能夠保證PCR反應(yīng)的高度特異性，避免 交叉反應(yīng)。（3)能對病毒進(jìn)行定量或定性檢測，可反映出患者體內(nèi)病原體拷貝數(shù)的高低和復(fù) 制情況。定量檢測有助于判斷病原體感染與疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，探討藥物對病原體的 作用，了解感染性疾病病人用藥后病情的變化情況。這對理解發(fā)病機制和預(yù)測抗病毒治療 的有效性十分關(guān)鍵。（4)可擴大檢測人群的范圍，適用于大規(guī)模的流行病調(diào)查。對埃博拉病 毒這類自然感染率極高的病原微生物尤其適用。（5)將PCR敏感性與探針特異性相結(jié)合，在 很大程度上改變了傳統(tǒng)PCR的缺陷，縮短了反應(yīng)時間，簡化了操作步驟。（6)全過程均在單 管封閉條件下進(jìn)行，避免了由于樣本間交叉引起的假陰性和環(huán)境污染。（7)實時檢測技術(shù)可 連續(xù)不斷的檢測PCR過程中微弱信號的變化，避免了傳統(tǒng)PCR的"平臺期效應(yīng)"，并且模板的 定量不通過終產(chǎn)物，而由Ct值算出，準(zhǔn)確性和靈敏性都有提高。（8)通過采用不同反應(yīng)管或 不同熒光探針的標(biāo)記可以區(qū)分具體的病毒基因型，可以有效地監(jiān)測EBOV感染的變化，判斷 病毒致病性的強弱，并且為治療性的疫苗研發(fā)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
[0016] 結(jié)合目前現(xiàn)狀，在臨床埃博拉瘤病毒感染的實驗診斷中，實時熒光PCR技術(shù)憑借 著快速、敏感、特異等優(yōu)點顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性。但是現(xiàn)有試劑盒缺乏完善的質(zhì)控 體系，且還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。
[0017] 國內(nèi)已有多種基于實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測埃博拉病毒的試劑盒，這些試 劑盒所提供的EBOV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。但酚-氯仿法操作繁瑣， 對于設(shè)備和人員操作要求高，低病毒載量的標(biāo)本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；而 柱提取方法雖無需高速離心，但是需頻繁更換離心管，且提取用時長，特異性較差。另外，受 限于其引物探針序列，本領(lǐng)域還需開發(fā)出一種檢測埃博拉病毒特異性好且綜合性能優(yōu)良的 PCR檢測試劑盒。尤其是提供一種能對EBOV進(jìn)行分型檢測的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有埃博拉病毒熒光定量PCR檢測試劑盒的缺陷，提供一 種操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢