專利名稱：一類雙鏈rna分子及其在制備抑制乙型肝炎病毒復(fù)制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種利用大腸桿菌發(fā)酵制備RNA干擾用雙鏈RNA(dsRNA)分子或小干擾RNA(siRNA)分子的方法，并將這些RNA分子用于制備治療乙型肝炎的新藥物。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指雙鏈RNA(dsRNA)特異性地誘發(fā)與其同源序列的mRNA分子被降解，導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)抑制的現(xiàn)象，是一種特殊的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默(post transcriptional gene silence，PTGS)現(xiàn)象。RNAi技術(shù)是指基于RNAi現(xiàn)象而開發(fā)的抑制特定基因表達(dá)的分子生物學(xué)技術(shù)。最早的有關(guān)RNAi現(xiàn)象的報(bào)道出現(xiàn)在1990年，由兩個(gè)不同的研究小組同時(shí)報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物中的共抑制(co-suppression)現(xiàn)象。以后又在線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了RNAi現(xiàn)象。
對(duì)RNAi原理的研究始于在線蟲(C. elegans)中的遺傳學(xué)分析，用這種方法找到了一系列與RNAi相關(guān)的基因。1999年，Hamilton和Baulcombe在發(fā)生RNAi現(xiàn)象的植物中檢測(cè)到了長(zhǎng)度為21-25個(gè)核苷酸(nt)的RNA片段，這些RNA片段被證明是RNAi所必需的，稱為小干擾RNA(short interfering RNA，“siRNA”)。在果蠅中的研究，使RNAi的機(jī)制被基本闡明當(dāng)長(zhǎng)鏈的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，它被一種被稱為Dicer的核酸水解酶所識(shí)別并被剪切成21-25nt的siRNA，雙鏈的siRNA被RNA解鏈酶解鏈，以單鏈的形式與另一核酸水解酶結(jié)合形成RNA酶復(fù)合體，復(fù)合體中的單鏈RNA象向?qū)б粯右龑?dǎo)酶復(fù)合體識(shí)別序列與之互補(bǔ)的mRNA并將其水解，從而特異性地抑制基因的翻譯表達(dá)。在線蟲和植物中，單鏈的siRNA除了起“向?qū)А弊饔弥?，還可作為聚合反應(yīng)的引物。在RdRP的作用下，以mRNA為模板，單鏈的siRNA為引物合成互補(bǔ)鏈，使得單鏈的mRNA成為雙鏈RNA，新合成的dsRNA則又被核酸酶Dicer剪切成siRNA。RdRP的作用使RNAi的信號(hào)得到放大，只要極微量的dsRNA就能引起強(qiáng)烈的基因表達(dá)抑制。
RNAi高效而專一地抑制基因表達(dá)的特性使其在基因功能研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。與反義核酸、核酶和利用同源重組進(jìn)行小鼠基因敲除等技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有無(wú)法比擬的優(yōu)越性。在利用反義核酸技術(shù)和核酶技術(shù)抑制基因的表達(dá)時(shí)，如何從目的基因中選擇有效的抑制序列，到目前為止仍沒(méi)有精確的理論指導(dǎo)，只能通過(guò)不斷的嘗試和改進(jìn)，是一個(gè)比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過(guò)程。而利用RNAi技術(shù)則沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題，研究表明目的基因mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和GC含量都不會(huì)影響RNAi的效率。在線蟲和植物中，RdRP的作用能夠使RNAi的信號(hào)得到放大，只要極微量的dsRNA就能引起強(qiáng)烈的基因表達(dá)抑制。尤其在線蟲中，只要用能夠表達(dá)目的基因dsRNA的大腸桿菌喂養(yǎng)線蟲，該基因的表達(dá)就會(huì)被抑制。這種優(yōu)越性使得RNAi技術(shù)首先在線蟲功能基因組研究中得到廣泛的應(yīng)用，并極大地推進(jìn)了線蟲的功能基因組研究。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，超過(guò)30bp的dsRNA會(huì)通過(guò)激活PKR系統(tǒng)和RNase L，導(dǎo)致翻譯起始的抑制以及非特異的RNA降解，最終導(dǎo)致非特異性的基因表達(dá)抑制。這種機(jī)制阻礙了RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用。Elbashir等人的工作解決了這一問(wèn)題。他們用人工合成的21nt的互補(bǔ)雙鏈siRNA在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘發(fā)了RNAi機(jī)制，并避開了PKR系統(tǒng)和RNase L，專一性地抑制了目的基因的表達(dá)。他們的工作首次證明了RNAi技術(shù)可以應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
RNAi技術(shù)不僅在功能基因組研究中顯示出無(wú)法替代的優(yōu)越性，而且也為某些目前難以治療的疾病提供一種新的治療手段成為可能。病毒性疾病，尤其是反轉(zhuǎn)錄病毒感染導(dǎo)致的疾病，象HIV感染引起的AIDS病和HBV、HCV感染引起的病毒性肝炎嚴(yán)重影響著人們的健康，而且目前的治療手段無(wú)法達(dá)到根治，RNAi技術(shù)的應(yīng)用，可能會(huì)提供更好的治療和預(yù)防手段。目前已經(jīng)在體外培養(yǎng)細(xì)胞體系中實(shí)現(xiàn)了利用RNAi技術(shù)抑制HIV、HCV、HBV、以及流感病毒的感染復(fù)制?？梢灶A(yù)見(jiàn)RNAi技術(shù)同樣可以為腫瘤、心血管疾病和糖尿病等現(xiàn)代高發(fā)性疾病提供新的治療手段。
RNAi技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物體系的關(guān)鍵是制備siRNA。目前大約有3種制備方法化學(xué)合成法、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)法和體外轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片段dsRNA(ldsRNA)后用大腸桿菌III型RNase或Dicer水解制備siRNA。最初只能用化學(xué)合成法制備siRNA。很多生物技術(shù)公司都提供RNA合成服務(wù)。只要從目的基因mRNA序列中選擇出合適的堿基序列，就能由生物技術(shù)公司合成此序列的正義RNA鏈及其互補(bǔ)鏈，經(jīng)變性退火后就得到雙鏈siRNA。這一方法比較簡(jiǎn)單直接，由于RNA合成的價(jià)格相當(dāng)昂貴，限制了化學(xué)合成法的推廣應(yīng)用。2002年4月，國(guó)際上數(shù)個(gè)研究小組幾乎同時(shí)報(bào)道了利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞III型RNA聚合酶啟動(dòng)子表達(dá)短片段的(19-21bp)帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系中產(chǎn)生RNAi，對(duì)特定基因表達(dá)的抑制率達(dá)到90％以上，優(yōu)于人工合成的siRNA。這一技術(shù)的產(chǎn)生使得哺乳動(dòng)物體系的RNAi技術(shù)變得更為簡(jiǎn)便更為成熟。然而要將這種方法應(yīng)用于臨床，類似于基因治療，而且比基因治療難度更大。除了需要克服基因治療所需克服的靶向性、安全性等困難以外，它對(duì)整合效率的要求更高，因?yàn)樗话愕幕蛑委熓且黾幽骋换虻墓δ芟喾?，它需要抑制特定基因的表達(dá)。安全有效而簡(jiǎn)便的方法是給病人服用或注射siRNA，這類似于以往的反義核酸藥物。用大腸桿菌RNase III或Dicer水解體外轉(zhuǎn)錄的ldsRNA來(lái)制備siRNA是目前已有的最方便的制備方法。本發(fā)明提供了一種更為高效、簡(jiǎn)便和低成本的siRNA制備方法。
乙型肝炎病毒在感染人體肝臟以后會(huì)嚴(yán)重影響肝臟功能，尤其在形成慢性感染后會(huì)引起多種嚴(yán)重的慢性肝臟疾病，如肝纖維化、肝硬化和肝癌等嚴(yán)重疾病。原發(fā)性肝癌患者中約三分之一病人有慢性乙肝病史，血清HBsAg陽(yáng)性率為66％～80％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出正常人群10％～15％的陽(yáng)性率。我國(guó)是乙型肝炎病毒高感染地區(qū)。我國(guó)人群中的HBsAg檢出率約為10％，包括抗HBs和抗HBc的流行率為50-60％。慢性無(wú)癥狀攜帶者約1.2億。乙肝患病率約為2770/10萬(wàn)，其中慢性乙肝患病率0.1-1％。由于現(xiàn)有的乙肝治療手段效果不佳，并面臨耐藥突變株的問(wèn)題，因此對(duì)開發(fā)新的乙肝治療方法仍有急切的需求。目前國(guó)外數(shù)個(gè)研究小組已報(bào)道成功地應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在細(xì)胞體系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中高效地抑制了乙肝病毒的感染復(fù)制。對(duì)小鼠血清中乙肝表面抗原含量的抑制率可達(dá)94％。小鼠肝臟中的病毒DNA和RNA轉(zhuǎn)錄物也能被有效抑制。盡管這些數(shù)據(jù)表明RNA干擾技術(shù)可能是非常有前景的乙肝治療新方法，但要將這一技術(shù)應(yīng)用于臨床治療尚需解決若干問(wèn)題。例如目前用來(lái)獲得可抑制病毒感染復(fù)制的siRNA的方法有限，且均價(jià)格昂貴，不適合于大規(guī)模制備。本發(fā)明提供的方法彌補(bǔ)了這一缺陷，為應(yīng)用RNA干擾技術(shù)治療人體乙肝奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種利用大腸桿菌發(fā)酵大規(guī)模制備RNAi用長(zhǎng)鏈dsRNA(ldsRNA)和siRNA分子的方法，并將ldsRNA或siRNA分子用于制備治療乙肝病毒的新藥物。
本發(fā)明提出的用大腸桿菌發(fā)酵大規(guī)模制備RNAi用ldsRNA和siRNA分子的方法，包括構(gòu)建ldsRNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵，用堿-SDS法抽提發(fā)酵菌體得到全RNA和質(zhì)粒DNA的混合物；該混合物用CF-11柱進(jìn)行純化得到ldsRNA，并利用大腸桿菌RNase III將ldsRNA切成12-30bp的siRNA。
本發(fā)明中提出了兩種可在大腸桿菌中表達(dá)長(zhǎng)鏈dsRNA的表達(dá)載體，具體如下1.莖環(huán)結(jié)構(gòu)dsRNA的表達(dá)載體的構(gòu)建帶頸環(huán)結(jié)構(gòu)的ldsRNA的表達(dá)載體的構(gòu)建方法是將目的基因片段以相反的方向?qū)⒒虻?’端連接到第三段DNA片段的兩側(cè)，然后克隆到帶有一個(gè)T7啟動(dòng)子的載體中去，質(zhì)粒示意圖見(jiàn)附圖1。當(dāng)把此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到能表達(dá)T7 RNA聚合酶的宿主菌內(nèi)后，目的基因的正反兩個(gè)方向的DNA鏈以及兩者之間的第三段DNA鏈就能被依次轉(zhuǎn)錄，成為一條連續(xù)的RNA鏈。由于這條RNA鏈中的目的基因部分是完全互補(bǔ)的序列，在生理?xiàng)l件下整條RNA鏈就會(huì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中的雙鏈部分就是目的基因的ldsRNA。
2.雙向啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建雙向啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建是利用帶有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，在合適的位置加入抗性基因和多克隆位點(diǎn)，并在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別加入相對(duì)的兩個(gè)啟動(dòng)子以及終止子(如圖2所示)，當(dāng)在多克隆位點(diǎn)中插入目的DNA片段后就可以以正反兩個(gè)方向轉(zhuǎn)錄RNA。由于轉(zhuǎn)錄出來(lái)這兩條RNA鏈?zhǔn)峭耆パa(bǔ)的序列，所以在生理?xiàng)l件下會(huì)形成雙鏈，這就是目的基因的雙鏈RNA。
本發(fā)明中提出的利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)與分離純化dsRNA的步驟如下1.菌體發(fā)酵將dsRNA表達(dá)載體通過(guò)常規(guī)的氯化鈣法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。含有表達(dá)載體的大腸桿菌菌落接種到含相應(yīng)篩選抗生素的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8-12小時(shí)，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)3-5小時(shí)后，加入乳糖或IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時(shí)后放罐，以連續(xù)式離心機(jī)收集菌體，進(jìn)行l(wèi)dsRNA抽提和純化。
2.RNA抽提每1g菌體中加入10-20ml的懸浮液(50mM葡萄糖，25mMTris·HCl，10mM EDTA，pH8.0)中，充分懸浮后加入2倍于懸浮液體積的裂解液(含0.2NNaOH，1％SDS)，輕輕攪拌混勻后加入1.5倍于懸浮液體積的乙酸鉀溶液(含5M醋酸根，3M鉀離子)，攪拌混勻后冰浴放置10-20分鐘后，10000-12000g離心10-30分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中。加入與上清液等體積的酚·氯仿·異戊醇(25∶24∶1)，激烈振蕩混勻后10000-12000g離心10-30分鐘，收集上清液后用于纖維素CF-11吸附純化。
3.用纖維素CF-11的吸附層析分離ldsRNA在上述2中得到的離心上清液中向抽提液加入乙醇至終濃度為17-30％，預(yù)冷后上樣到用含同樣比例酒精的STE溶液(0.1M NaCl，10mM Tris·HCl，1mM EDTA，pH8.0)預(yù)平衡的CF-11層析柱中；用含有17-20％乙醇的STE溶液連續(xù)洗CF-11柱以除去單鏈RNA和DNA，直至洗脫液OD260無(wú)吸收時(shí)停止。然后用STE溶液洗脫雙鏈RNA，收集流出液，至OD260無(wú)吸收時(shí)結(jié)束。所收集的含ldsRNA的溶液或以酒精沉淀或以正丁醇進(jìn)行濃縮，備用。
本發(fā)明中提出的利用大腸桿菌III型RNA酶水解ldsRNA制備小干擾RNA的方法如下經(jīng)CF-11純化得到的ldsRNA經(jīng)定量后，按每微克ldsRNA用0.02-0.03微克大腸桿菌來(lái)源的RNaseIII在37℃水解2-4小時(shí)。反應(yīng)溶液中含1mM DTT，20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，5mM MgCl2，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.9。
本發(fā)明提出的用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的ldsRNA和siRNA抑制乙肝病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制的方法如下1.可用于抑制乙肝病毒感染復(fù)制的ldsRNA和siRNA的制備按本發(fā)明提供的長(zhǎng)鏈dsRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法將乙肝病毒基因組任何片段構(gòu)建到雙向啟動(dòng)子表達(dá)載體或莖環(huán)結(jié)構(gòu)ldsRNA的表達(dá)載體中，然后按本發(fā)明提供的利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)與分離純化ldsRNA的方法制備所需的ldsRNA，最后用本發(fā)明提供的利用大腸桿菌III型RNA酶水解長(zhǎng)鏈ldsRNA制備siRNA的方法制備相應(yīng)的siRNA。
2.乙肝病毒表達(dá)載體的構(gòu)建乙型肝炎adr亞型環(huán)狀基因組DNA用BamHI線性化后連接到pUCmT質(zhì)粒載體(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)的BglII/BamHI位點(diǎn)中，然后再在得到的重組質(zhì)粒載體的BamHI位點(diǎn)中連接同一病毒環(huán)狀基因組DNA的BamHI線性化片段。用PCR和酶切方法鑒定后，得到兩拷貝乙肝病毒基因組DNA以首尾相連的方式排列的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pUC-HBV。該質(zhì)粒用QIAGEN公司質(zhì)粒純化試劑盒純化后用紫外分光光度法定量。
3.按上述方法制備的pUC-HBV和ldsRNA或siRNA以適當(dāng)?shù)谋壤梦察o脈液壓法注射到小鼠體內(nèi)，24小時(shí)后開始以不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠血清中的乙肝表面抗原含量，乙肝病毒e抗原含量，以及小鼠肝臟功能。結(jié)果顯示，當(dāng)pUC-HBV質(zhì)粒的注射劑量為10μg/只小鼠時(shí)，從25μg到100μg的ldsRNA注射劑量均可顯著抑制乙肝病毒的復(fù)制，并且未見(jiàn)肝臟功能損傷。在所有試驗(yàn)組中，以100μg編碼乙肝病毒DNA復(fù)制酶部分序列的ldsRNA的抑制效果最佳。
上述結(jié)果表明，由本發(fā)明制備的雙鏈ldsRNA和siRNA可用于制備治療乙型肝炎的新藥物。
本發(fā)明中可以上述ldsRNA或siRNA為主要成份，配以輔料制制成注射液劑型。具體配方如下ldsRNA 12.5-50mgNaCl 8.6gKCl 0.3gCaCl20.13g加注射用水至1000ml注射劑量為1.25-5mg/kg體重。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與化學(xué)合成法和體外轉(zhuǎn)錄法相比，本發(fā)明提供的siRNA制備方法更為簡(jiǎn)便，成本更加低廉，尤其適合用于藥物制造目的的工業(yè)化規(guī)模siRNA制備。本發(fā)明制備的ldsRNA和siRNA均可特異而高效地抑制乙肝病毒在小鼠體內(nèi)的感染復(fù)制，因而可用于制備高效治療乙型肝炎的新藥物。


圖1 表達(dá)帶頸環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的質(zhì)粒載體示意圖。
圖2 雙向啟動(dòng)子表達(dá)載體示意圖。
圖3 pET-HBXII圖譜。
圖4 pET-2P質(zhì)粒圖譜。
圖5 CF-11柱純化dsRNA。其中，A含pET-SEAP2的大腸桿菌RNA抽提液，B含pET-22b的大腸桿菌RNA抽提液，C含pET-SEAP2的大腸桿菌RNA抽提液經(jīng)過(guò)CF-11柱純化后的樣品，D含pET-22b的大腸桿菌RNA抽提液經(jīng)過(guò)CF-11柱純化后的樣品。
圖6 dsRNA的RNaseIII水解。其中，1為24bp分子量Marker；2為水解0小時(shí)；3為水解2小時(shí)；4為水解4小時(shí)。
圖7 pST質(zhì)粒圖譜。
圖8 轉(zhuǎn)染后第一天小鼠血清中乙肝病毒表面抗原的相對(duì)表達(dá)量。
圖9 轉(zhuǎn)染后第一天小鼠血清中乙肝病毒e抗原的相對(duì)表達(dá)量。
圖10轉(zhuǎn)染后第一天小鼠血清中堿性磷酸酯酶的相對(duì)活性。
圖11轉(zhuǎn)染后第四天小鼠血清中乙肝病毒表面抗原的相對(duì)表達(dá)量。
圖12轉(zhuǎn)染后第四天小鼠血清中乙肝病毒e抗原的相對(duì)表達(dá)量。
圖13轉(zhuǎn)染后第一天小鼠血清中堿性磷酸酯酶的相對(duì)活性。
圖14轉(zhuǎn)染后第七天小鼠血清中乙肝病毒表面抗原的相對(duì)表達(dá)量。
圖15轉(zhuǎn)染后第七天小鼠血清中乙肝病毒e抗原的相對(duì)表達(dá)量。
具體實(shí)施例方式
1.人乙肝病毒(HBV病毒)X蛋白基因帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)雙鏈RNA表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如下以寡核苷酸5’-GGAATTC ATG GCT GCT AGG CTG TG-3’和5’-GGGGTACC GGCAGA GGT GAAAAA GTT G-3’為引物，以乙肝病毒基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出HBV病毒X蛋白基因，并在5’端和3’端分別引入EcoRI和KpnI位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因分別克隆到pUC-118(購(gòu)自TaKaRa公司)和pST(如圖7，構(gòu)建過(guò)程如下人工合成寡核苷酸5’-ggccgcaacggtaccaccaagcttagtggatccgaattccggct-3’，將此片段連接到pSectag2a(Invitrogen公司)質(zhì)粒的SfiI/NotI酶切位點(diǎn)之間，得到pST質(zhì)粒。)載體上，得到pUC-HBX和pST-HBX，將pST-HBX用SalI酶切得到1.5Kb片斷，將此片斷克隆到pUC-HBX的SalI位點(diǎn)中，用BamHI酶切鑒定得到重組質(zhì)粒，能釋放出1Kb片斷的克隆為正確克隆，命名為pUC-HBXII。用NheI和PvuII酶切克隆進(jìn)入pCI(購(gòu)自Clontech公司)質(zhì)粒的NheI和SmaI位點(diǎn)中，得到的克隆稱為pCXII。用EcoRI酶切得到的1Kb的片斷克隆到pET-22b(購(gòu)自Novagen公司)中，得到了pET-HBXII，如圖3。
2.雙向啟動(dòng)子表達(dá)載體pET-2P的構(gòu)建過(guò)程如下已知pET-22b(購(gòu)自Novagen公司)表達(dá)載體上有T7的啟動(dòng)子和T7終止子，用PCR引物(p55’-ccgctcgagttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgcggccgcaagcttgtc-3’；p35’-aagatctggcccacccgtgaaggtgagccc gatcccgcgaaattaatacg-3’)以pET-22b為模板擴(kuò)增出的DNA片斷中引入了tac啟動(dòng)子和T3終止子，將此片斷用XhoI和BglII酶切克隆進(jìn)入pET-22b，得到的重組質(zhì)粒具有雙向啟動(dòng)子和終止子，將此質(zhì)粒命名為pET-2P，如圖4。
3.乙肝病毒表面抗原X蛋白以及聚合酶部分編碼區(qū)基因dsRNA表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建乙肝病毒表面抗原，X蛋白以及聚合酶部分編碼區(qū)DNA片段用pUC-HBV作模板，以下述引物擴(kuò)增得到HBVS1Ag-sense5’-cgggatcctaccacagagtctagactcg-3’，HBVS1Ag-antisense5’-catgtcgacgcaacataccttggtagtcc-3’，HBX-sense 5’-ggaattcatggctgctaggetgtg-3’HBX-antisense 5’-ggggtaccggcagaggtgaaaaagttg-3’HBVP-sense 5’-ggaattcgtcttgggtatacatttgacc-3’，HBVP-antisense 5’-ggggtaccagaggacaacagagttg-3’，擴(kuò)增得到的編碼乙肝表面抗原的DNA片段用BamHI/SalI酶切位點(diǎn)克隆入pUC118質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)中，編碼乙肝X蛋白和聚合酶部分區(qū)域的DNA片段用EcoRI/KpnI酶切位點(diǎn)克隆入pUC118質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)中。得到的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序確認(rèn)克隆到的DNA片段序列的正確性。正確的編碼乙肝表面抗原的DNA片段用BamHI/SalI酶切位點(diǎn)克隆入pET-2P的相應(yīng)位點(diǎn)中。正確的編碼X蛋白和聚合酶部分區(qū)域的DNA片段用EcoRI/SalI酶切位點(diǎn)克隆入pET-2P的相應(yīng)位點(diǎn)中。得到的表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pET-HBS，pET-HBX和pET-HBVP。
4.dsRNA的發(fā)酵表達(dá)，提取與純化過(guò)程如下菌體發(fā)酵將含有pET-HBXII(其中含有一個(gè)可轉(zhuǎn)錄出發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA的基因SEAP2)的BL21(DE3)菌株接種到200ml升含氨卞青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)接到25升的小發(fā)酵罐培養(yǎng)8-9小時(shí)后再轉(zhuǎn)入裝液300升(溶積500升)的大發(fā)酵罐中，37℃發(fā)酵培養(yǎng)3小時(shí)后加入6kg乳糖誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA，繼續(xù)發(fā)酵3小時(shí)后以上海離心機(jī)研究所產(chǎn)的GL105型離心機(jī)收集菌液，備用。
RNA抽提將100克菌體以1000ml的懸浮液(同2中所敘)中，加入2000ml的裂解液(同2中所敘)，輕輕攪拌混勻后加入1500ml乙酸鉀溶液(同2中所敘)，輕輕攪拌混勻后分裝在數(shù)個(gè)三角燒瓶中后在冰上放置10分鐘，以10000g離心10分鐘，將上清液回收在數(shù)個(gè)三角燒瓶中后，加入等體積的酚·氯仿·異戊醇(25∶24∶1)，激烈振蕩混勻后以10000g離心10分鐘，再回收上清液，備用。
dsRNA的純化將1kg CF-11粉末用含20％乙醇STE溶液浸泡平衡后裝在一根直徑為8cm的玻璃柱中，放置在4℃冷庫(kù)中。將酚·氯仿·異戊醇抽提后離心得到的上清液中補(bǔ)加乙醇至終濃度20％，在冰上放置20分鐘后在冷庫(kù)中上樣到CF-11柱上。用5L含17％乙醇的STE溶液進(jìn)行洗滌除去單鏈RNA和質(zhì)粒DNA后，在用2L預(yù)熱到55℃的不含乙醇的STE溶液回收dsRNA。下圖為純化前后的DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳(泳道A與C)，與普通質(zhì)粒進(jìn)行的對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果(泳道B和D)相比可知，純化得到的樣品(泳道C)為長(zhǎng)鏈dsRNA。
5.利用RNase III水解長(zhǎng)鏈dsRNA制備siRNA的過(guò)程如下取4微克經(jīng)CF-11純化得到的dsRNA，用0.1微克RNase III 37℃，在不同時(shí)間取樣，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果25μg 50μg或者100μg編碼HBsAg，HBX，HBV聚合酶部分片段和堿性磷酸酯酶基因的dsRNA(命名為dsHBS，dsHBX，dsHBVP和dsAP)同10μg乙肝病毒表達(dá)質(zhì)粒pUC-HBV2和10μg堿性磷酸酯酶pSEAP2-Control質(zhì)粒用尾靜脈液壓法共轉(zhuǎn)染到小鼠肝臟，負(fù)對(duì)照組只轉(zhuǎn)染10μg pUCmT質(zhì)粒，正對(duì)照組只轉(zhuǎn)染10μg pUC-HBV2和10μgpSEAP2-Control質(zhì)粒。正對(duì)照組小鼠血清中的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)達(dá)到最高峰，并在觀察的7天時(shí)間內(nèi)基本保持穩(wěn)定。共轉(zhuǎn)染dsHBS，dsHBX和dsHBVP實(shí)驗(yàn)組的小鼠血清中的HBsAg和HBeAg被明顯抑制，并具有劑量依賴關(guān)系，而這些小鼠血清中的堿性磷酸酯酶活性并沒(méi)有被抑制.。相反的，共轉(zhuǎn)染dsAP實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中堿性磷酸酯酶活性被抑制，而HBsAg幾乎沒(méi)有被抑制。上述結(jié)果表明乙肝病毒的復(fù)制被特異性地抑制。抑制效率在轉(zhuǎn)染后第一天最高，以后逐漸減弱。在3種雙鏈RNA中dsHBVP的抑制效率最為顯著，轉(zhuǎn)染100μg dsHBVP后第一天對(duì)HBsAgHbeAg的抑制率分別為98.5％和100％，并在實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中始終保持顯著的抑制效果第7天的抑制率分別為88.3％and 98.6％。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠肝臟功能保持良好，血清白蛋白以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平均表現(xiàn)正常。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。
乙肝表面抗原抑制率％組別*第一天 第四天 第七天dsAP 25 3.85 2.99 22.12dsAP 50 10.08 -3.97 35.69dsAP 10015.85 9.53 6.66dsHBS 2573.69 11.59 2.07dsHBS 5084.46 58.47 28.92dsHBS 100 91.38 79.99 53.6dsHBVP 25 96.46 42.11 67.86dsHBVP 50 99.07 90.22 88.3dsHBVP 100 98.46 92.02 88.3dsHBX 25 49.07 16.73 31.96dsHBX 50 73.38 26.78 27.01dsHBX 100 77.07 10.74 54.63表一不同種類不同劑量雙鏈RNA對(duì)乙肝表面抗原的抑制率乙肝e抗原抑制率％組別*第一天第四天 第七天dsAP 25 55.53 40.79 32.68dsAP 50 62.84 38.48 55.43dsAP 100 59.93 32.93 34.16dsHBS 25 94.65 44.03 40.85dsHBS 50 96.31 71.28 61.74dsHBS 100 97.48 78.78 53.01dsHBVP 25 99.45 89.39 86.35dsHBVP 50 10098.4 93.5dsHBVP 100 100100.57 98.6dsHBX 25 86.56 59.87 57.38dsHBX 50 96.7 71.99 41.78dsHBX 100 91.98 45.36 49.76表二不同種類不同劑量雙鏈RNA對(duì)乙肝e抗原的抑制率*dsAP編碼堿性磷酸酯酶的雙鏈RNA；dsHBS 編碼乙肝表面抗原的雙鏈RNA；dsHBVP編碼乙肝DNA聚合酶的雙鏈RNA；dsHBX編碼乙肝X蛋白的雙鏈RNA。
數(shù)字表示所用雙鏈RNA的劑量(μg)。
權(quán)利要求
1.一種利用大腸桿菌發(fā)酵制備用RNAi用ldsRNA和siRNA分子的方法，其特征在于包括構(gòu)建ldsRNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵，用堿-SDS法抽提發(fā)酵菌體得到全RNA和質(zhì)粒DNA的混合物；該混合物用CF-11柱進(jìn)行純化得到ldsRNA，并利用大腸桿菌RNase III將ldsRNA切成12-30bp的siRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于構(gòu)建在大腸桿菌中表達(dá)長(zhǎng)鏈dsRNA的表達(dá)載體的方法如下將目的基因片段以相反的方向?qū)⒒虻?’端連接到第三段DNA片段的兩側(cè)，然后克隆到帶有一個(gè)T7啟動(dòng)子的載體中去，當(dāng)把此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到能表達(dá)T7 RNA聚合酶的宿主菌內(nèi)后，目的基因的正反兩個(gè)方向的DNA鏈以及兩者之間的第三段DNA鏈就能被依次轉(zhuǎn)錄，成為一條連續(xù)的RNA鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于構(gòu)建在大腸桿菌中表達(dá)長(zhǎng)鏈dsRNA的表達(dá)載體的方法如下利用帶有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，在合適的位置加入抗性基因和多克隆位點(diǎn)，并在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別加入相對(duì)的兩個(gè)啟動(dòng)子以及終止子，當(dāng)在多克隆位點(diǎn)中插入目的DNA片段后就可以以正反兩個(gè)方向轉(zhuǎn)錄RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于所選的目的基因?yàn)橐腋尾《净蚪M中的任何片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所選目的基因片段為用pUC-HBV作模板，以下述引物擴(kuò)增得到的片段HBVP-sense5’-ggaattcgtcttgggtatacatttgacc-3’，HBVP-antisense5’-ggggtaccagaggacaacagagttg-3’。
6.一種由權(quán)利要求1-5之一的方法所制備的長(zhǎng)鏈ldsRNA分子和siRNA分子，在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的長(zhǎng)鏈ldsRNA分子和siRNA分子在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，其注射劑量為1.25-5mg/kg體重。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的治療乙型肝炎的藥物，其特征在于以ldsRNA分子和siRNA分子為主要成份，配以輔料，制成注射液劑型，具體配方如下ldsRNA 12.5-50mgNaCl 8.6gKCl 0.3gCaCl20.13g加注射用水1000ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用大腸桿菌發(fā)酵制備RNA干擾用雙鏈RNA分子或小干擾RNA分子的方法，并將這些RNA分子用于制備治療乙型肝炎的藥物。將本發(fā)明得到的ldsRNA或siRNA以適當(dāng)?shù)谋壤c乙型肝炎病毒表達(dá)載體混合，并用尾靜脈液壓法注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示非同源性序列l(wèi)dsRNA和siRNA基本不抑制乙型肝炎病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，而與乙肝病毒基因同源性的ldsRNA和siRNA可以有效抑制乙型肝炎病毒在小鼠體內(nèi)的感染復(fù)制，抑制率高達(dá)90％以上。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1488761SQ0314223
公開日2004年4月14日 申請(qǐng)日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者錢志康, 宣寶琴, 徐劍鋒, 李琳, 閔太善, 程小偉, 史順成, 黃偉達(dá) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué), 上海恒達(dá)科技發(fā)展股份有限公司