專利名稱：豬斷奶重psme1基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及豬斷奶重PSME1基因及其制備方法背景技術(shù)近年來，國內(nèi)外學(xué)者對豬遺傳標(biāo)記與生產(chǎn)性能的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究。合適的遺傳標(biāo)記對于開展標(biāo)記輔助選擇，實行早期選種，提高選種準(zhǔn)確性以及加速遺傳進(jìn)展是大有裨益的。
斷奶重是衡量母豬繁殖力的重要指標(biāo)，它與豬肥育期間的增重和屠宰體重呈強的正相關(guān)。一般說來，斷奶重大的仔豬有較好的生長速度和較高的飼料報酬，有較短的肉豬飼養(yǎng)期和較低的飼養(yǎng)成本，經(jīng)濟效益高。斷奶重大，一方面說明其早期生長速度快，另一方面說明其身體免疫功能良好，抗病力強，它是進(jìn)行粗選的主要依據(jù)。雖然，有些單位已經(jīng)開始進(jìn)行“提高仔豬斷奶重的推廣”試驗測定，但是，斷奶重這個重要指標(biāo)依舊沒有受到遺傳工作者的足夠重視，對它的相關(guān)研究也是鳳毛麟角。
李文平等選擇大約克夏，長白豬和杜洛克豬進(jìn)行了19項血液生化指標(biāo)測定，分析了它們與斷奶重的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明斷奶重與生化指標(biāo)的相關(guān)程度在品種間存在差異。大約克豬的堿性磷酸酶(AKP)活性，銅氧化酶(CP)活性，蛋白質(zhì)含量與斷奶重呈較強正相關(guān)；長白豬斷奶重與淀粉酶活性，銅氧化酶活性，葡萄糖含量呈較強正相關(guān)，而與無機磷(Pi)，鉀離子及氧離子含量呈負(fù)相關(guān)；杜洛克豬斷奶重與生化指標(biāo)相關(guān)程度非常低(李文平等，幾個外來豬品種血液生化指標(biāo)于斷奶重關(guān)系的探討。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2000 26(1)58-60)。
Rothschild實驗室長期從事豬第7號染色體著絲粒附近的主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibility complex，MHC)基因單倍型與豬初生重、斷奶重、生長速度、背膘厚等性狀有關(guān)等性狀的研究，他們認(rèn)為MHC基因單倍型與上述生產(chǎn)性能存在相關(guān)關(guān)系(Rothschild MF，Identificationof quantitative trait loci and interesting candidate genes in the pigprogress and prospects.Proc 6th WCGALP 1998，26403-409)。
李鳳娥等對促卵泡素β(FSH-β)基因微衛(wèi)星位點多態(tài)性與豬的生產(chǎn)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該基因與斷奶重有顯著相關(guān)(李鳳娥，豬ESR和FSH-β位點對繁殖性狀的調(diào)控及其調(diào)控建立研究。博士學(xué)位論文。武漢，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002)。促卵泡素β基因定位于豬的二號染色體上(Mellink等，PCRamplification and physical localization of the genes for pig FSH-βand LH-βcytogenet cellgenet，1995，70224-227)。
PSME1基因編碼20S蛋白酶體激活因子PA28α。PA28α是20S蛋白酶體的重要調(diào)節(jié)因子之一，該亞基在體外有激活20S蛋白酶體的肽酶活性，PA28α和PA28β形成異源二聚體，可增大20S蛋白酶體產(chǎn)生適合于與MHCI類分子結(jié)合的多種底物肽的能力，提高最大反應(yīng)速度(zhang等，The proteasomeactivator 11S regulator or PA28 J Biol Chem，1998，273(46)30660-30668)。
目前已有人、小鼠、大鼠和斑馬魚(McCusker等，Organization of the genes encoding the humanproteasome activators PA28αand β.Immunogenetics 1999，49438-445；Jiang等，Sequence andexpression of mouse proteasome activator PA28 and the related autoantigen Ki.Immunol，1997，4693-98.；Murray等，Immunoproteasome assembly and antigen presentation in mice lacking bothPA28α and PA28β.The EMBO Journal 2001，20(21)5898-5907)的PSME1基因組織結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能研究報道。人和小鼠PSME1基因的cDNA全長已被克隆和測序。Northern Blotting分析表明，PSME1基因在免疫組織，如脾臟、胸腺和睪丸中的表達(dá)量較高(Jiang等，Sequence and expression of mouseproteasome activator PA28 and the related autoantigen Ki.Immunol，1997，4693-98)。人和小鼠PSME1基因均被定位在14號染色體上(Tanahashi等.Molecular properties of the proteasomeactivator PA28 family proteins and γ-interferom regulation.Genes cells 1997，2195-211；Nadeau，Mouse chromosome 14.Mamm Genome 1996，6245-255)。PSME1基因有11個外顯子，小鼠PSME1基因的第4個內(nèi)含子5’端并非GT，而是GC。這與GT/AG規(guī)則是不相符的。這個很稀少的剪接位點經(jīng)實驗證明，在mRNA的剪接過程中能夠被準(zhǔn)確地切開，都是要比切開GT序列的速度要慢得多。在人類的PSME1基因中，也有相同的現(xiàn)象存在(Kohda K等，Characterization of the Mouse PA28 ActivatorComplete Organizations of the Three Member Genes and a Physical Map of the 150-Kb Regioncontaining the α-subunit and β-subunit Genes.The Journal of Immunology 1998，1604923-4935；McCusker D等，Organization of the genes encoding the human proteasome activatorsPA28α and β.Immunogenetics 1999，49438-4451999)。
系統(tǒng)發(fā)生分析表明PSME1基因最初是在軟骨魚中檢測到的，而MHC最初也是在這種脊椎動物中檢測到的。這個基因因為參與MHC I類分子介導(dǎo)的抗原提呈過程，所以研究者推斷PSME1基因與動物的免疫系統(tǒng)有關(guān)。研究人員用敲除基因的小鼠探討這個基因的功能。Preckel等人認(rèn)為，缺少PSME1基因的小鼠，其免疫蛋白酶體的裝配與免疫應(yīng)答遭到了損壞(Preckel T等，Impaired ImmunoproteasomeAssembly and Immune Responses in PA28-/-Mice.Science 1999，2862162-2165)，而Murata等學(xué)者卻認(rèn)為PSME1基因與免疫蛋白酶體的裝配與免疫應(yīng)答沒有關(guān)系，但是可以降低依賴于ATP的蛋白水解活性。它們并不是所有的抗原提呈的先決條件，而只與一定的抗原加工起關(guān)鍵的作用(Murata S等，Immunoproteasome assembly and antigen presentation in mice lacking both PA28α and PA28β.TheEMBO Journal 2001，20(21)5898-5907)。
但目前國內(nèi)外對豬PSME1基因的研究還是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆豬的PSME1基因cDNA全長，對PSME1基因進(jìn)行染色體定位，它的制備方法以及它的基因多態(tài)性的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種豬斷奶重PSME1基因，它的全長cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
所述的基因，它的基因組DNA序列如序列表SEQ ID NO2所述。
所獲得的PSME1基因cDNA全序列為1039bp，其中包含如附圖3所述的750bp的開放閱讀框，121bp的5’非翻譯區(qū)和168bp的3’非翻譯區(qū)。
序列表SEQ ID NO2的第741位堿基處有一個堿基突變C741-T741，導(dǎo)致SphI-RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism)多態(tài)性。
序列表SEQ ID NO2的第802位堿基處有一個堿基突變C802-G802，沒有導(dǎo)致酶切位點的變化。
檢測741位堿基突變C741-T741的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO3和序列表SEQ ID NO4所述。
檢測802位堿基突變C802-G802的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO5和序列表SEQ ID NO6所述制備所述的cDNA或基因組DNA序列的方法，其特征按照以下步驟(1)用人PSME1基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)；然后對EST進(jìn)行拼接；設(shè)計5’和3’RACE(Rapid Amplification of cDNA ends)引物；提取豬脾臟組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；RACE的PCR擴增和RACE產(chǎn)物的純化克隆和測序、通過序列分析獲得如序列表SEQ ID No.1的序列；(2)制備如權(quán)利要求2所述的DNA序列的方法，其特征按照以下步驟從豬血液基因組提取DNA，以豬PSME1基因cDNA序列為模板設(shè)計引物，PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。
應(yīng)用PCR-RFLP的方法檢測豬PSME1基因C741-T741的多態(tài)性，并根據(jù)其基因型，初步判斷豬的斷奶重。我們還應(yīng)用PCR-SSCP的方法檢測豬PSME1基因C802-G802的多態(tài)性。本發(fā)明為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標(biāo)記。
對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述1.PSME1基因全長cDNA的克隆(1)引物設(shè)計用人PSME1基因cDNA(GenBank收錄號NM_006263)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90％以上的ESTs(片段長度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查詢相應(yīng)序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)EST拼接序列設(shè)計3’RACE和5’RACE引物。序列如下5’-TCCGTGAAGACCTGTGTACCAAG-3’(3’RACE)5’-AACCTTCTCCTGGACAGCCACTC-3’(5’RACE)(2)RACE技術(shù)利用TRIzoL試劑盒(美國GIBCO公司)從成年香豬脾臟組織中提取總RNA，具體操作依照試劑盒說明書進(jìn)行?？俁NA溶于RACE試劑盒提供的超純水，用Beckman DU640核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀測定其A260nm值，并通過1.2％的甲醛凝膠電泳檢測其完整性。
利用RACE試劑盒(美國CLONTECH公司)進(jìn)行cDNA末端快速擴增，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。(3)RACE產(chǎn)物的純化、克隆和測序RACE產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，于70℃溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300μl融化的凝膠中加入1ml Resin，混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使?jié){液通過Minicolumn擠出。再在注射器中加入80％的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，10,000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個干凈的1.5ml Ependorff管中，加入30~50μl滅菌水，靜置1min，10,000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管中。
連接反應(yīng)將純化RACE產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，連接反應(yīng)總體積是5μl，其中包括2.5μl2×buffer，0.5μl的T載體，0.5μl的純化PCR產(chǎn)物，0.5μl的T4連接酶，最后加入1μl滅菌水置4℃水浴過夜。
感受態(tài)細(xì)胞的制備從37℃培養(yǎng)了16~20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接1ml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達(dá)到0.3~0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10~15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4℃4,000g離心10min以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4℃ 4,000g離心10min一次，用4ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100~120μl感受態(tài)細(xì)胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
質(zhì)粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于2-3ml LB中，37℃300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5mlEP管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體。每管加入100μl用冰預(yù)冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，渦旋振蕩至菌體充分懸浮。加入新配制的溶液II
200μl，快速顛倒混勻，冰浴5min，然后加入預(yù)冷的溶液III[5M乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2O28.5ml]150μl，混勻后冰浴5min，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)至另一EP管中，加入苯酚氯仿異戊醇500μl，渦旋振蕩，離心后小心吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
重組質(zhì)粒的酶切鑒定取3μl質(zhì)粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為15μl，加入2-3U限制性內(nèi)酶EcoR I及2μl相應(yīng)的10X限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37℃水浴1-2小時，取2-3μl反應(yīng)液于瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切結(jié)果與預(yù)計完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進(jìn)行測序，序列測定由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
(4)DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。
2.物理定位用于物理定位的實驗材料用豬×嚙齒類體細(xì)胞雜種板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)進(jìn)行染色體區(qū)域定位，用美國Minnesota大學(xué)共同構(gòu)建的豬輻射雜種板(INRA-Minnesota porcine radiation hybridpanel，IMpRH)進(jìn)行染色體精確定位，兩套體細(xì)胞雜種板均由由法國Martin Yerle博士(Laboratoire deGénétique Cellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，F(xiàn)rance)惠贈。
其中SCHP包括27個體細(xì)胞雜種細(xì)胞系，1~19號是豬×倉鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系，20~27號是豬×小鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系，并以倉鼠、小鼠和豬基因組DNA作為陽性對照(Yerle等，1996)。經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定該雜種板保留了豬的除Y染色體外的全部18條常染色體以及X染色體，其中含有127個非重疊的染色體區(qū)域，各細(xì)胞系中所包含的豬染色體及染色體片段信息可從WWW(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)獲得。
IMpRH使用的輻射劑量是7,000-rad。IMpRH包括118個豬×倉鼠輻射雜種細(xì)胞系，以及倉鼠和豬基因組DNA陽性對照，用757個標(biāo)記的鑒定結(jié)果表明IMpRH中的平均標(biāo)記存留率為29.3％，包含有128個連鎖群，覆蓋了18對常染色體及X染色體，用于估計標(biāo)記間距離的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理論分辨率是145kb。
(3)PCR分型條件進(jìn)行擴增的PCR反應(yīng)總體積為15μl，其中模板DNA為20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94℃ 3min，循環(huán)35次94℃ 30s，61℃ 30s，然后72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3.PCR-RFLP診斷方法建立(1)引物序列5’-TGAAAAGAAGAAGGGGGAAG-3’(正向，如序列表SEQ ID3所示)，
5’-GTAAGCATTGCGGATCTCCA-3’(反向，如序列表SEQ ID4所示)該引物擴增片段長度1030bp。
(2)PCR擴增條件PCR反應(yīng)總體積為20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94℃ 4min，然后循環(huán)35次94℃ 40s，62℃ 45s，72℃ 1min，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)RFLP檢測條件PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是15μl，其中1×buffer 1.5μl，PCR產(chǎn)物3~5μl，限制性內(nèi)切酶SphI為0.5μl(5U)，用H2O補足15μl，將樣品混勻后離心，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
4、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析試驗豬群是一個商業(yè)大白豬群，190個DNA樣品用于基因型檢測。
5.PCR-SSCP方法建立(1)引物序列5’-TGCCTTCGGCCAGGATTGAG-3’(正向，在序列表SEQ ID5所示)，5’-ACTAGCTGCCGATAATCACC-3’(反向，在序列表SEQ ID6所示)該引物擴增片段長度219bp。
(2)PCR擴增條件PCR反應(yīng)總體積為20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.3μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是94℃ 4min，然后循環(huán)35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)SSCP檢測PSME1基因C802-G802的多態(tài)性a中性聚丙稀酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠的配制10％，20cm×20cm，1mm薄膠，每板膠約需35mL膠液。
雙蒸水 22mL40％膠貯存液9mL10×TBE緩沖液 3.5mL10％AP溶液 200μL將以上溶液于燒杯中混合均勻，在臨灌膠前加入20μL TEMED，加速聚合反應(yīng)。
b.PCR產(chǎn)物變性取4μL經(jīng)2％瓊脂糖電泳驗證過的PCR產(chǎn)物與6μL變性緩沖液于0.2mL PCR管中混合均勻，置PCR儀上100℃變性8min。變性結(jié)束后立即將PCR管置冰水中冰浴，防止DNA單鏈復(fù)性。
c上樣、電泳凝膠聚合后拔掉梳子，用注射器吸取1×TBE緩沖液沖洗梳孔，以除去未聚合的膠液，使樣品容易沉降。組裝好電泳設(shè)備，用1％的瓊脂糖膠液封閉好玻板與電泳槽之間的縫隙，防止電泳緩沖液滲漏。在上下緩沖槽中倒入足量1×TBE電泳緩沖液，于100V恒壓下預(yù)電泳10min。用50μL微量進(jìn)樣器將變性的PCR產(chǎn)物緩緩注入梳孔，并點上未變性的PCR產(chǎn)物作為對照。上樣完畢后開啟電泳電源，在110V-120V恒壓下電泳12-15小時，直至二甲苯青電泳指示條帶遷移到凝膠底部。
d凝膠染色電泳完畢，取下玻板，小心地將凝膠從玻板上剝離下來，立即將浸入10％乙醇溶液固定20min。固定完畢，用雙蒸水短暫洗滌凝膠(換水兩次，每次1分鐘)。接著將凝膠浸泡入0.1％的硝酸銀溶液中染色，在搖床上避光輕柔振蕩30min。染色結(jié)束后用雙蒸水快速沖洗凝膠兩次(每次10s)，洗去凝膠表明殘留的硝酸銀溶液。在染膠盒中倒入含3％Na2CO3和微量甲醛的顯色液，立即快速地晃動膠盒，避免析出的黑色銀顆粒在凝膠表面沉積。顯色液顏色變暗時立即更換新鮮的顯色液。注意觀察顯色情況，目的條帶顯現(xiàn)清晰后立刻將凝膠轉(zhuǎn)入3％的乙酸溶液，浸泡10min停顯。
本發(fā)明的效果1、豬PSME1基因全長cDNA的克隆3’和5’RACE擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物(如圖2所示)。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測序，測序結(jié)果顯示3’RACE產(chǎn)物長度為914bp，5’RACE產(chǎn)物長度為634bp。
將此兩個片段用GeneTool軟件的ASSEMBLY程序進(jìn)行拼接，得到了PSME1基因的全長cDNA，長度為1039bp(圖3所示)。將這段cDNA序列在GenBank中進(jìn)行同源性檢索，檢索結(jié)果該序列與人PSME1基因cDNA(GenBank收錄號NM226263)的同源性達(dá)90％，序列分析表明該cDNA序列具有750bp(nt122-872)的開放閱讀框，編碼一個由249個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
2、豬PSME1基因的定位SCHP克隆板PCR分型結(jié)果表明，19個豬×中國倉鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系(1-19號)中，10，11，12，16號出現(xiàn)與豬基因組DNA陽性對照擴增一致的188bp的目的片段，而在8個豬×小鼠體細(xì)胞雜種細(xì)胞系(20-27號)中，21，23，25，27號雜種細(xì)胞系均擴增得到188bp的目的片段。將上述實際觀測的PCR分型數(shù)據(jù)提交給HybWeb(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)進(jìn)行統(tǒng)計分析以獲得區(qū)域定位信息，數(shù)據(jù)分析結(jié)果是PSME1基因定位于豬7號染色體上(P＝1.000)，進(jìn)一步的區(qū)域定位結(jié)果為SSC7 q12-q23或者SSC7 q26(P＝0.4494，P＜0.1％)。
用IMpRH克隆板對PSME1進(jìn)行精確定位。統(tǒng)計分析結(jié)果表明PSME1基因定位于SSC7 q12-q23，與豬7號染色體上的TCRA(T細(xì)胞受體α)基因緊密連鎖，LOD值為10.58，RH圖距是0.39Ray。
3、PCR-RFLP診斷方法建立用引物擴增豬基因組DNA得到了1030bp特異性擴增片段，包括部分外顯子5和和部分外顯子10序列以及完整的內(nèi)含子6.7.8.9.10的DNA序列(詳見圖4)。序列分析結(jié)果表明在740bp處存在1個SphI酶切位點(GCATG↓C)，在741處存在T741-C741的突變。當(dāng)741處為C時，該基因座由B等位基因控制(740bp+290bp兩個片段)，當(dāng)741處為T時，該基因由A等位基因控制(只有1030bp一個片段)，這兩個等位基因可組成三種基因型AA，AB，BB。
4、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析對豬PSME1基因SphI-RFLP多態(tài)性位點基因型檢測結(jié)果表明在190個個體中AA基因型有10個，AB基因型有62個個體，BB基因型有118個個體。在與部分生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析中，所分析的性狀是初生重、斷奶重和170日齡屠宰時的背膘厚?；蛐烷g性狀的簡單均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)于表1。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，AA與AB基因型豬的斷奶重呈極顯著差異(P＜0.01)，AA與BB基因型豬，以及AB型與BB型豬的斷奶重呈顯著差異(P值分別為0.047和0.013)。
表1不同PSM1基因SphI-RFLP基因型與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析基因型 個體數(shù) 初生重 斷奶重 背膘厚GenotypesN Birth weight Weaning weight Backfat thickness(kg) (kg)(mm)Psme1-SphI AA 10 1.50±0.16 11.57±1.5111.01±1.40BB 118 1.47±0.24 10.11±1.6411.25±1.94AB 62 1.59±0.27 10.66±1.4211.17±2.09P-value AA-AB 0.30 0.008 0.32AA-BB 0.44 0.047 0.38AB-BB 0.28 0.013 0.395.PCR-SSCP方法建立用引物擴增豬基因組DNA得到了219bp特異性擴增片段，對該片段進(jìn)行PCR-SSCP分析.對電泳帶型有差異的個體進(jìn)行不同PCR反應(yīng)、不同批次電泳的重復(fù)實驗，選取差異可重復(fù)的代表個體進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測序，將雙向測序峰圖用DNAstar5.01的seqMan軟件比較，結(jié)果表明在序列表SEQ ID No.2的802處，找到變異位點(C/G)。由測序結(jié)果可知存在兩種純合子，GG純合子和CC純合子和一種雜合子GC型。
序列表、附圖及其說明序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明克隆的豬斷奶重PSME1基因的全長cDNA序列；序列表SEQ ID NO2是本發(fā)明克隆的豬斷奶重PSME1基因的DNA序列；序列表SEQ ID NO3是本發(fā)明克隆的用PCR-RFLP檢測豬斷奶重PSME1基因多態(tài)性的引物序列；序列表SEQ ID NO4是本發(fā)明克隆的用PCR-RFLP檢測豬斷奶重PSME1基因多態(tài)性的引物序列。
序列表SEQ ID NO5是本發(fā)明克隆的用PCR-SSCP檢測豬斷奶重PSME1基因的引物序列；序列表SEQ ID NO6是本發(fā)明克隆的用PCR-SSCP檢測豬斷奶重PSME1基因的引物序列。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程2是5’和3’RACE的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
瓊脂糖膠濃度為1.2％。1泳道3’RACE產(chǎn)物，長度為914bp；2泳道5’RACE產(chǎn)物，長度為634bp；M泳道DNA分子量標(biāo)記(100-1000bp ladder)圖3是豬PSME1基因全長cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。起始密碼子和終止密碼子用加黑字母表示，引物的序列用方框顯示，Poly(A)信號用下畫線表示，推導(dǎo)的氨基酸用單字母符號寫在密碼子的下面。
圖4是豬PSME1的基因組DNA序列。
陰影部分分別為外顯子5，6，7，8，9，10。空白區(qū)域分別為內(nèi)含子6，7，8，9，10。5’-和3’拼接位點的兩個保守核苷酸(GT/AG)用黑體標(biāo)出，引物的位置用方框顯示。
具體實施例方式
實施例1PCR-RFLP-Sph I多態(tài)性在3個豬品種中的分布情況(1)引物序列5’-TGAAAAGAAGAAGGGGGAAG-3’(正向，如序列表SEQ ID3所示)，5’-GTAAGCATTGCGGATCTCCA-3’(反向，如序列表SEQ ID4所示)(2)PCR擴增條件PCR反應(yīng)總體積為20μl，其中豬基因組DNA約100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP終濃度為150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。擴增程序94℃ 4min，然后循環(huán)35次94℃ 40s，62℃ 45s，72℃ 1min，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)RFLP檢測條件酶切反應(yīng)體積是15μl，其中1×buffer 1.5μl，PCR產(chǎn)物3~5μl，限制性內(nèi)切酶Sph I為0.5μl(5U)，用H2O補足15μl，37℃水浴4h，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
表2 PCR-RFLP-Sph I多態(tài)性在3個豬品種中的分布基因型 等位基因頻率品種 個體數(shù)AA AB BB AB杜洛克 210021 01藏豬 25114 100.32 0.68二花臉 2506190.12 0.88根據(jù)表2的基因型和基因頻率的結(jié)果顯示，在所檢測的3個豬品種中，都是B等位基因占優(yōu)勢。
實施例2我們用建立起的PCR-RELP診斷方法，對一個大白豬群190個DNA樣品進(jìn)行PSME1-RFLE-SphI的基因型檢測。
檢測結(jié)果表明在190個個體中AA基因型有10個，AB基因型有62個個體，BB基因型有118個個體。在與斷奶重的關(guān)聯(lián)分析中，基因型間性狀的簡單均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)于表4。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，AA與AB基因型豬的斷奶重呈極顯著差異(P＜0.01)，AA與BB基因型豬，以及AB型與BB型豬的斷奶重呈顯著差異(P＜0.05)。
表3不同PSME1基因SphI-RFLP基因型與斷奶重的關(guān)聯(lián)分析基因型Genotypes 個體數(shù)N 斷奶重Weaning weight(kg)Psme1-SphI AA 10 11.57±1.51BB 118 10.11±1.64AB 62 10.66±1.42P-valueAA-AB 0.008AA-BB 0.047AB-BB 0.013實施例3用如前所述的基因診斷方法檢測108頭通城豬的基因型和仔豬斷奶重的關(guān)系。通城豬的基因型和仔豬斷奶重的關(guān)系見表5。
表4通城豬的基因型和仔豬斷奶重的關(guān)系基因型 個體數(shù) 斷奶重(kg)Psme1-SphI AA 2 10.69±1.35BB 829.36±1.58AB 2410.21±1.40P-value BB-AB 0.032在本例中，由于只檢測出2例AA型的豬，所以在做關(guān)聯(lián)分析時，我們將AA型忽略不計，只對BB-AB型的斷奶重做了T檢驗。結(jié)果表明，AB和BB型豬的斷奶重呈顯著差異，與前面得出的結(jié)果是一致的。
實施例4PCR-RFLP-Sph I多態(tài)性在小梅山，大白和清平豬的分布情況表5 PCR-RFLP-Sph I多態(tài)性在3個豬品種中的分布基因型 等位基因頻率品種 個體數(shù)AAAB BB A B梅山32 8 21 3 0.5781 0.4219
大白 12 0 3 9 0.125 0.875東北民豬 42 13 19 10 0.5357 0.4643清平豬 47 17 23 7 0.6064 0.3936小梅山，東北民豬和清平豬都是中國地方豬種，它們都是A等位基因占優(yōu)勢，大白豬是歐洲豬種，B等位基因占優(yōu)勢。
實施例5PCR-SSCP檢測豬斷奶重PSME1基因的C802-G802突變的多態(tài)性表6 PCR-SSCP檢測豬斷奶重PSME1基因的C802-G802突變的多態(tài)性基因型 等位基因頻率品種 個體數(shù)CC CG GG CG梅山22513 4 0.52280.4772大自1200 12 0 1東北民豬42821 13 0.44050.5595二花臉 2204 18 0.09090.9091藏豬36719 10 0.45830.5417清平豬 2517 7 10.82 0.18在上述6個豬群中就上述變異位點按照經(jīng)測序驗證的差異代表的電泳條帶模式統(tǒng)計群體的等位基因頻率。T檢驗說明該變異位點在豬群中存在著變異。
序列表(豬斷奶重)SEQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>豬斷奶重PSME1基因及其制備方法<130>
<141>2003-08-26<150>02139235.8<151>2002-11-01<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1039<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(1039)<223>
<220>
<221>3’UTR<222>(872)..(1039)<223>
<220>
<221>polyA_signal<222>(989)..(994)<223>
<220>
<221> CDS<222>(122)..(871)<223>
<220>
<221>5’UTR<222>(1)..(121)<223>
<400>1acgcgggaag cagtggtatc aacgcagagt acgcgggggc ggggagcgag cgctgctttc60
gctttccctt ccctgtgccc actcctcgct ccgcgtgtga cgctaggccc cctccccggc120c atg gcc gcg ctc agg gtc cag ccc gaa gcc caa gcc aag gtc gat gtg169Met Ala Ala Leu Arg Val Gln Pro Glu Ala Gln Ala Lys Val Asp Val1 5 10 15ttc cgt gaa gac ctg tgt acc aag aca gag aac cta ctc ggg agc tat 217Phe Arg Glu Asp Leu Cys Thr Lys Thr Glu Asn Leu Leu Gly Ser Tyr20 25 30ttc ccc aag aag att tct gag ttg gat gca ttt tta aag gag cca gct 265Phe Pro Lys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Pro Ala35 40 45ctc aat gaa gcc aac ctg agc aat ctg aag gcc cca ttg gac att cca 313Leu Asn Glu Ala Asn Leu Ser Asn Leu Lys Ala Pro Leu Asp Ile Pro50 55 60gtg cct gat ccg gtc aag gag aaa gag aag gag gaa agg aag aaa cag 361Val Pro Asp Pro Val Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Arg Lys Lys Gln65 70 75 80cag gag aag gaa gac aaa gat gaa aag aag aag ggg gaa gat gag gat 409Gln Glu Lys Glu Asp Lys Asp Glu Lys Lys Lys Gly Glu Asp Glu Asp85 90 95aaa ggt cct ccc tgt ggc cca gtg aac tgc aat gag aag atc gtg gtc 457Lys Gly Pro Pro Cys Gly Pro Val Asn Cys Asn Glu Lys Ile Val Val100 105 110ctt ctg cag cgc ctg aag cct gag atc aag gat gtc att gag cag ctc 505Leu Leu Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Lys Asp Val Ile Glu Gln Leu115 120 125aac ctg gtt acc acc tgg ttg cag ctg cag ata cct cgg att gaa gac 553Asn Leu Val Thr Thr Trp Leu Gln Leu Gln Ile Pro Arg Ile Glu Asp130 135 140ggt att aat ttt gga gtg gct gtc cag gag aag gtt ttc gag ctg atg 601Gly Ile Asn Phe Gly Val Ala Val Gln Glu Lys Val Phe Glu Leu Met145 150 155 160acc gcc ctt cac acc aaa ctg gaa ggc ttc cac act caa atc tcc aag 649Thr Ala Leu His Thr Lys Leu Glu Gly Phe His Thr Gln Ile Ser Lys165 170 175tat ttc tct gag cgg ggc gat gct gtg gcc aaa gca gct aag cag cct 697Tyr Phe Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Lys Gln Pro
180 185 190cac gtg ggt gat tat cgg cag cta gtg cac gag ctg gat gag gca gag 745His Val Gly Asp Tyr Arg Gln Leu Val His Glu Leu Asp Glu Ala Glu195 200 205tac cgg gat atc cgg ctg atg gtc atg gag atc ctc aat gct tac gct 793Tyr Arg Asp Ile Arg Leu Met Val Met Glu Ile Leu Asn Ala Tyr Ala210 215 220gtg tta tat ggc atc atc ctg aag aac ttt gag aaa ctc aag aag cct 841Val Leu Tyr Gly Ile Ile Leu Lys Asn Phe Glu Lys Leu Lys Lys Pro225 230 235 240agg gga gaa aca aaa ggc atg atc tat tga gagcctcccc tccttctgtg 891Arg Gly Glu Thr Lys Gly Met Ile Tyr245atgggtccag cagaccttcc tgacttttac tggggactcc aggctttccc caccttctgc 951ctgttgaggt ttctccctca ccttgcctct caggcacaat aaatatagtc gtaccgttaa 1011aaaaaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaagt 1039<210>2<211>249<212>PRT<213>豬(Sus scrofa)<400>2Met Ala Ala Leu Arg Val Gln Pro Glu Ala Gln Ala Lys Val Asp Val1 5 10 15Phe Arg Glu Asp Leu Cys Thr Lys Thr Glu Asn Leu Leu Gly Ser Tyr20 25 30Phe Pro Lys Lys Ile Ser Glu Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Pro Ala35 40 45Leu Asn Glu Ala Asn Leu Ser Asn Leu Lys Ala Pro Leu Asp Ile Pro50 55 60Val Pro Asp Pro Val Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Arg Lys Lys Gln65 70 75 80Gln Glu Lys Glu Asp Lys Asp Glu Lys Lys Lys Gly Glu Asp Glu Asp85 90 95Lys Gly Pro Pro Cys Gly Pro Val Asn Cys Asn Glu Lys Ile Val Val100 105 110
Leu Leu Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Lys Asp Val Ile Glu Gln Leu115 120 125Asn Leu Val Thr Thr Trp Leu Gln Leu Gln Ile Pro Arg Ile Glu Asp130 135 140Gly Ile Asn Phe Gly Val Ala Val Gln Glu Lys Val Phe Glu Leu Met145 150 155 160Thr Ala Leu His Thr Lys Leu Glu Gly Phe His Thr Gln Ile Ser Lys165 170 175Tyr Phe Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Ala Lys Ala Ala Lys Gln Pro180 185 190His Val Gly Asp Tyr Arg Gln Leu Val His Glu Leu Asp Glu Ala Glu195 200 205Tyr Arg Asp Ile Arg Leu Met Val Met Glu Ile Leu Asn Ala Tyr Ala210 215 220Val Leu Tyr Gly Ile Ile Leu Lys Asn Phe Glu Lys Leu Lys Lys Pro225 230 235 240Arg Gly Glu Thr Lys Gly Met Ile Tyr245<210>3<211>1030<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<220>
<221>primer_bind<222>(1011)..(1030)<223>
<220>
<221>exon<222>(944)..(1030)<223>
<220>
<221>exon<222>(813)..(867)<223>
<220>
<221>exon<222>(651)..(718)<223>
<220>
<221>exon<222>(497)..(565)<223>
<220>
<221>exon<222>(150)..(257)<223>
<220>
<221>exon<222>(1)..(32)<223>
<220>
<221>variation<222>(802)..(802)<223>
<220>
<221>variation<222>(741)..(741)<223>
<400>3tga aaa gaa gaa ggg gga aga tga gga taa ag gtatcattgt ggtggaaggg 52Lys Glu Glu Gly Gly Arg Gly Arg1 5atttgcatct tacctcccag gagttccttc ctaaggatgc ctcttccctg cccctcacag 112ccccagccat gtgactgacc cagtgtccac ctcttag g tcc tcc ctg tgg ccc 165Ser Ser Leu Trp Pro10
agt gaa ctg caa tga gaa gat cgt ggt cct tct gca gcg cct gaa gcc 213Ser Glu Leu Gln Glu Asp Arg Gly Pro Ser Ala Ala Pro Glu Ala15 20 25tga gat caa gga tgt cat tga gca gct caa tct ggt gag ccc tc 257Asp Gln Gly Cys His Ala Ala Gln Ser Gly Glu Pro Ser30 35 40ctcgttctac tccctgattt cagatcaaac cctttgtcct cctttgtcca tgccagttag317ggcatggcac ctgccagctc tttacaggcg agggcacaac aagtgaagcc agaataccct377ggggctccga acagacctga catacttctc cccactgtgg tcagagaaac aaagaaggac437aggaacctgg gatttggggc ggggactaat ggggctttga tgccattcct tcctcccag 496g tta cca cct ggt tgc agc tgc aga tac ctc gga ttg aag acg gta ata545Leu Pro Pro Gly Cys Ser Cys Arg Tyr Leu Gly Leu Lys Thr Val Ile45 50 55att ttg gag tgg ctg tcc ag gtgagagtgc taccccactc tcctgccttc 595Ile Leu Glu Trp Leu Ser Arg60cttctctctc cagtccatgc tgtcttccac ttcccccctt gctttctttc cccag g 651aga agg ttt tcg agc tga tga ccg ccc ttc aca cca aac tgg aag gct 699Arg Arg Phe Ser Ser Pro Pro Phe Thr Pro Asn Trp Lys Ala65 70 75tcc aca ctc aaa tct cca a gtgagtgact tgcacccgca tgctcctgcc 748Ser Thr Leu Lys Ser Pro80ttcggccagg attgaggcca gggctccctc ctcctcccac tccacaccct tctccttccc808acag gt att tct ctg agc ggg gcg atg ctg tgg cca aag cag cta agc 856Ser Ile Ser Leu Ser Gly Ala Met Leu Trp Pro Lys Gln Leu Ser90 95agc ctc acg tg gtaggtgagg cctaggtcag ggtgcatggg aggagggaca 907Ser Leu Thr Trp100cctttgaagt cagggcgtga cccgtgtctc ccacag g gtg att atc ggc agc tag962Val Ile Ile Gly Ser105tgc acg agc tgg atg agg cag agt acc ggg ata tcc ggc tga tgg tca 1010Cys Thr Ser Trp Met Arg Gln Ser Thr Gly Ile Ser Gly Trp Ser
110 115 120tgg aga tcc gca atg ctt ac1030Trp Arg Ser Ala Met Leu125<210>4<211>20<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
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<400>4tgaaaagaag aagggggaag20<210>5<211>20<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<400>5gtaagcattg cggatctcca20<210>6<211>20<212>DNA<213>豬(Sus scrofa)<220>
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<400>6tgccttcggc caggattgag20<210>7<211>20
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<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<400>7actagctgcc gataatcacc20
權(quán)利要求
1.豬斷奶重PSME1基因，它的全長cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，它的基因組DNA序列如序列表SEQ ID NO2所述。
3.、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所獲得的PSME1基因cDNA全序列為1039bp，其中包含如附圖3所述的750bp的開放閱讀框，121bp的5’非翻譯區(qū)和168bp的3’非翻譯區(qū)。
4..根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO2的第741位堿基處有一個堿基突變C741-T741，導(dǎo)致SphI-RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)多態(tài)性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO2的第802位堿基處有一個堿基突變C802-G802，沒有導(dǎo)致酶切位點的變化。
6.權(quán)利要求2所述的基因，檢測741位堿基處堿基突變C741-T741的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO3和序列表SEQ ID NO4所述。
7.權(quán)利要求2所述的基因，檢測802位堿基處堿基突變C802-G802的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO5和序列表SEQ ID NO6所述
8.制備如權(quán)利要求1或2所述的cDNA序列的方法，其特征按照以下步驟(1)用人PSME1基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)；然后對EST進(jìn)行拼接；設(shè)計5’和3’RACE(RapidAmplification of cDNA ends)引物；提取豬脾臟組織總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；RACE的PCR擴增和RACE產(chǎn)物的純化克隆和測序、通過序列分析獲得如序列表SEQID No.1的序列；(2)制備如權(quán)利要求2所述的DNA序列的方法，其特征按照以下步驟從豬血液基因組提取DNA，以豬PSME1基因cDNA序列為模板設(shè)計引物，PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
9.應(yīng)用PCR-RFLP的方法檢測豬PSME1基因的多態(tài)性。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及豬斷奶重PSME1基因的克隆、制備方法及應(yīng)用?？寺〉腸DNA和DNA序列分別如序列表SEQ ID NO1－2所述。制備步驟包括電腦克隆、豬脾臟組織總RNA提取、RACE、RACE產(chǎn)物克隆測序、獲得全長cDNA序列、設(shè)計引物擴增基因組DNA、獲得PSME1基因的部分基因組DNA序列、RFLP多態(tài)性檢測、RFLP多態(tài)性與斷奶重的關(guān)聯(lián)分析，SSCP多態(tài)性檢測。本發(fā)明公開了豬PSME1基因cDNA全長序列和部分基因組DNA序列，制備基因組DNA序列的兩對引物，并公開了基因組DNA序列中的兩個位點的突變，C741－T741和C802－G802，以及PSME1－RFLP多態(tài)性用于檢測豬斷奶重的技術(shù)，為豬的標(biāo)記輔助育種提供了新的標(biāo)記。
文檔編號C12P19/34GK1498896SQ0315624
公開日2004年5月26日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月1日
發(fā)明者奎 李, 李奎, 王彥芳, 余梅, 劉榜, 潘佩文, 熊統(tǒng)安, 樊斌, 趙書紅 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)