專利名稱：生物技術制備木糖醇的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物制備木糖醇(xylite)的方法，該方法使用了可將木糖代謝為木糖醇的微生物。
背景技術：
木糖醇是天然存在的糖醇，由于其在代謝過程的降解是非胰島素依賴的，因此最常在保健食品中被用作糖替代物。
木糖醇還被用于制藥工業(yè)，例如，用于牙膏。
由于與蔗糖相比，木糖醇具有近似的甜度而沒有致癌效應，因而被廣泛地應用于口香糖、咀嚼片和類似產(chǎn)品。
現(xiàn)有技術中木糖醇經(jīng)化學路線合成，高壓高溫下在鎳催化劑上還原木糖，平均生產(chǎn)率為所用木糖的50至60％。
木糖是植物源原料的主要成分，其通過酸性水解或亞硫酸鹽瀝濾，從富含半纖維素的植物殘渣中獲得。
為了克服化學方法中木糖醇低生產(chǎn)率的缺點，例如，在EP 0716067中提及，從葡萄糖酸開始，經(jīng)過若干處理步驟，化學制備木糖醇，從而獲得60至70％的生產(chǎn)率。
這些化學方法的共同特點是成本高，和/或為了通過化學路線制備木糖醇，需要使用與環(huán)境不相容的催化劑。更為突出地，為了此目的而使用了鎳催化劑，鎳催化劑的使用會導致環(huán)境保護方面的問題。
此外，這些化學方法中部分反應在70至150℃的高溫和高達10Mpa的高壓下進行。而且，這些化學方法還需要復雜的純化和濃縮步驟，以最終獲得純凈的木糖醇。
另一種不同于化學制備木糖醇的方法，生物技術方法在現(xiàn)有技術中已有描述，其在將木糖轉化為木糖醇的過程中提供了非常高的生產(chǎn)率。
德巴利氏酵母屬，假絲酵母屬和畢赤酵母屬用作微生物，一方面是因為，這些微生物是天然的木糖利用者，可在限氧條件下將木糖轉化為木糖醇。
該反應在輔因子NADH的參與下經(jīng)木糖還原酶(XR)而催化。
作為一種天然的木糖醇形成劑的替換物，微生物經(jīng)如EP 0670161中教導的基因技術修飾以便經(jīng)此處理后，它們還能夠通過利用其它碳源來形成木糖醇。
EP 0640429中描述了另一種通過生物技術路線增加木糖醇產(chǎn)量的策略，合成和代謝木糖醇的酵母經(jīng)基因技術修飾，從而消除了轉化所需終產(chǎn)物的酶。
根據(jù)這一發(fā)明的教導，導致所需木糖醇最終產(chǎn)物的轉化和/或降解的基因表達被消除或減少了。
現(xiàn)有技術中還已知以非天然方式還原木糖的微生物，這些微生物經(jīng)基因技術處理后能夠形成木糖還原酶并因此能夠利用木糖制備木糖醇。
還已知這種木糖還原酶可被強烈地過表達從而改善生產(chǎn)率。
上述生物技術方法的共同特征為即使在強烈地過表達木糖還原酶并且同時消除了參與木糖醇天然代謝的酶的情況下，也無法足夠有效地提高木糖醇的生產(chǎn)率，以便成本有效地通過生物技術的方法路線制備木糖醇。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的任務是提供一種優(yōu)勢在于自木糖經(jīng)生物技術制備木糖醇過程中木糖醇的生產(chǎn)率較高的方法，從而使得這一方法具有經(jīng)濟上的可行性。
本發(fā)明的任務通過一種生物技術制備木糖醇的方法得以實現(xiàn)，該方法使用可將木糖代謝為木糖醇的微生物，并且該方法包括如下工序a)修飾微生物從而減少或消除除木糖還原酶以外的酶對NADH的氧化，b)在含有木糖和10-40克每升亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)的底物中培養(yǎng)微生物，c)在需氧生長期和限氧木糖醇生成期培養(yǎng)微生物，以及d)自底物中富集和提取木糖醇。
木糖向木糖醇的轉化路線如下
如已描述的那樣，此反應在輔因子NADH的參與下經(jīng)木糖還原酶而催化。
如已在本領域文獻中描述且討論過的，在修飾微生物的情況中，通過酶的過表達，催化該反應的木糖還原酶的過量供應不會導致木糖醇產(chǎn)率的大量提高，因此也不能導致木糖醇生成中的經(jīng)濟上的改善。
令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)木糖轉化為木糖醇的反應強烈地依賴于輔因子NADH的可獲得性并受其限制。
根據(jù)本發(fā)明的概念，應以這樣的方式修飾微生物例如，消除微生物其它的NADH消耗酶系，例如線粒體NADH脫氫酶，乙醇脫氫酶和磷酸甘油脫氫酶。
本發(fā)明的修飾微生物的效果是基于上述酶顯示了與這種輔因子較強親和力的事實基礎上的。
如果NADH優(yōu)先被與木糖還原酶相競爭的酶氧化成NAD(P)，所需的輔因子就無法提供至高木糖醇生產(chǎn)率所需的程度。
根據(jù)本發(fā)明，應用經(jīng)遺傳修飾的微生物的結果是經(jīng)本發(fā)明的方法實質(zhì)地提高了木糖醇的生產(chǎn)率。因此，這種方法與以前的化學方法相比，是一種具有吸引力的替換方法，因為其克服如上所述為了解決同一任務的其它生物技術方法的缺陷。
而且，本發(fā)明方法的特殊優(yōu)勢在于，其可以使用可再生的原料并且與常規(guī)的化學方法相比，不存在因使用鎳催化劑而引起的環(huán)境損害。
此外，生物技術方法自身固有反應條件相對溫和的特點，因此通常較化學方法更易于與環(huán)境相容。實例中的描述顯示了個別微生物，特別是酵母，怎樣先經(jīng)修飾然后被用于制備木糖醇。
糖酵母菌屬酵母對生物技術方法具有重要意義。在這些酵母中，NADH經(jīng)不同的代謝路線被氧化。特別值得提及的是醇發(fā)酵、由外線粒體NAHD脫氫酶制備和氧化甘油。這些酶與NADH的親和力較木糖還原酶更高，因此輔因子優(yōu)先被這些酶氧化。
由于NADH經(jīng)此概述的分解路線而消耗，因此提供于木糖還原的NADH供應受到限制，無法制備更多的木糖醇。
根據(jù)本發(fā)明，可通過如下方法提高細胞質(zhì)中可用的NADH的含量以及因而參與木糖還原酶反應的NADH量失活微生物中一種或幾種導致NADH氧化的酶或抑制其表達。
酵母的內(nèi)膜線粒體不能透過NADH；因此，酶系的修飾針對與氧化相關的細胞質(zhì)NADH脫氫酶。
在釀酒酵母中，基因NDE1和NDE2編碼外NADH脫氫酶，然而GPD1和GPD2編碼磷酸甘油脫氫酶。根據(jù)本發(fā)明，上述一種或幾種基因的抑制導致可替換代謝路線中NAD消耗的減少，并使得可用于木糖還原酶的NADH達到更高程度。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，向釀酒酵母中加入濃度為10至40克每升的亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)底物時，同等地抑制了葡萄糖降解為乙醇。因此，甘油產(chǎn)量增加。
根據(jù)本發(fā)明，通過基因技術抑制消耗NADH的磷酸甘油脫氫酶的表達可抵消甘油的形成。
在這些條件下，木糖醇的產(chǎn)量輔因子NADH而提高，NADH由于磷酸甘油脫氫酶受到抑制而被額外地提供，從而被自木糖形成木糖醇的木糖還原酶利用。
本發(fā)明使用經(jīng)修飾微生物的方法的這一效果被一個實例證明是可以實現(xiàn)的，特別是使用了經(jīng)重組DNA技術修飾的微生物基因?？商鎿Q地，微生物的修飾可通過受控的或隨機的基因突變而實現(xiàn)。
微生物的這種修飾可以這樣的方式進行，在第一步中，破壞和/或處理利用NADH輔因子的酶序列，使其不能被微生物制備或僅能被活性減弱了的酶合成。
基因技術修飾微生物的這些方法是技術狀態(tài)的一部分。以這樣的方式遺傳處理的微生物提高了木糖醇的產(chǎn)量并將其累積于生長培養(yǎng)基中，木糖醇可通過結晶和/或色譜方法自此生長培養(yǎng)基中富集和/或提取。下面實例中的描述舉例說明了微生物修飾和木糖醇回收的方法。
具體實施例方式
實施例1首先，描述表達異種木糖還原酶的制備酵母株。
酵母中異種木糖還原酶的表達是現(xiàn)有技術的一部分，描述于例如WO91/15588中。
Pichia stipitis在100ml YPD(11培養(yǎng)基中包含10g酵母提取物，20g蛋白胨和20g葡萄糖，pH＝6.5)中于30℃培養(yǎng)過夜。10ml培養(yǎng)基中的細胞經(jīng)離心成團并分離染色體DNA，參照Kaiser等(1994)的試驗設計。這一DNA用作XYL1基因956bp無內(nèi)含子(introne-free)開放讀碼框PCR擴增的模板(Amore等1993)。所得片斷在1％瓊脂糖凝膠中分離并使用Genomed的“JETQUICK Gel Extraction Spin Kit”進行純化。質(zhì)粒經(jīng)相應的限制性核酸內(nèi)切酶處理并經(jīng)上述方法純化。使用p425GPD作為載體以在釀酒酵母菌中的表達。此載體是多拷貝質(zhì)粒且包含作為選擇標記物的釀酒酵母菌LEU2基因(Mumberg等1995)。此載體經(jīng)相同的限制性核酸內(nèi)切酶切為片斷并相應地純化。XYL1基因的開放讀碼框扎結于載體中，通過質(zhì)粒制備和限制性分析鑒定重組質(zhì)粒。在使用此方法制備的質(zhì)粒(p425GPD-PsXYL1)中，XYL1的轉染易于受強GPD啟動子的控制，并確保釀酒酵母菌中外源XR的高表達。釀酒酵母菌株KOY50(MATa；his3Δ1；leu2Δ；ura3Δ0)被p425GPD-PsXYL1轉化，參照Schietstl和Gietz的方法(1989)。分離并分析了Leucin-原養(yǎng)型轉化體。
實施例2通過基因NDE1和NDE2基因替換失活NADH脫氫酶位于線粒體的細胞溶質(zhì)的NADH脫氫酶與XR競爭輔因子NADH。為了減少細胞溶質(zhì)的NADH消耗，通過適宜的DNA片斷基因替換使得基因NDE1和NDE2失活。與NDE1起始密碼子5’端40bp同源和終止密碼子3’端40bp同源的替換片斷經(jīng)PCR擴增。此片斷包含裂殖酵母屬稷酒的his5+基因和補充有釀酒酵母菌的his3突變(Wach等1997)。擴增后，如上述方法分離純化此片斷。根據(jù)Schiestl和Gietz(1989)的方法使用替換片斷轉化釀酒酵母菌株KOY50。分離組氨酸原養(yǎng)型轉化體。使用診斷PCR證實此片斷正確整合與NDE1取代。這一菌株(KOY50Δndel)經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉化，如實施例1所述，并用于制備木糖醇。
如上述方法構建NDE2同源替換片斷，用以制備nde1/nde2雙突變體。此時使用kanMX組件(Wach等1994)作為選擇性標記物。此組件使轉化體可耐受G418(geneticine)。轉化后，KOY50Δnde1細胞置于包含G418的培養(yǎng)基上?？剐钥寺〗?jīng)診斷PCR測試以確定正確插入了替換片斷并使NDE2失活。所得菌株(KOY50Δnde1Δnde2)經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉化，如實施例1所述，并用于制備木糖醇。
實施例3編碼磷酸甘油脫氫酶的基因GPD1和GPD2的基因替換細胞質(zhì)的磷酸甘油脫氫酶GPD1p和GPD2p利用NADH作為輔因子。它們的失活優(yōu)先導致通過使用XR將木糖還原為木糖醇對細胞溶質(zhì)的NADH的氧化。在基因替換時，使用了釀酒酵母菌株KOY50Δnde1和/或KOY50Δnde1Δnde2。
這兩菌株均負有ura3Δ0突變。為了此分裂作用，使用了含有與GPD1和GPD2同源的片斷，如實施例2中對于NDE1的描述。包含白色假絲酵母URA3基因的片斷作為選擇性標記物。此選擇性標記物側翼的DNA部分彼此相同(Goldstein等1999)。白色假絲酵母的URA3補充釀酒酵母菌中ura3突變。
尿嘧啶代謝未受損的細胞與ura3突變細胞相反，對于5-氟orodic acid(5-FOA)敏感。將分裂盒整合入基因組后，在重復DNA部分上生成自發(fā)同源重組并因此失去URA3標記物。發(fā)生這樣的重組的克隆可被簡便的分離，因為它們能耐受5-FOA。
上述DNA片斷經(jīng)PCR擴增并純化。CPD1基因替換片斷根據(jù)Schiestl和Cietz(1989)在釀酒酵母KOY50Δnde1和/或KOY50Δnde1Δnde2中的方法轉化。
尿嘧啶原養(yǎng)型轉化體在相應的選擇培養(yǎng)基上分離。通過診斷PCR替換GPD1。接著，此方法構建的菌株經(jīng)5-FOA耐受選擇。在5-FOA耐受的菌株中，通過診斷PCR檢測URA3標記物的損失。最后，如上所述，在進一步的工作中失活GPD2。
這樣構建的菌株經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉化，如實施例1所述，并用于制備木糖醇。
實施例4通過四分體分析(tetrad analysis)脫氫酶失活的菌株的制備為了制備幾種脫氫酶失活的菌株，首先分別失活各相關基因，如實施例2中所述。隨后雜交育種各突變體并因此形成deploid菌株的孢子，進行四分體分析。
雙突變體可在非親代雙型(NPD)中簡便地鑒定。KOY50株用于失活GPD1和GPD2，如實施例2中對于NDE1的描述，各自被基因替換。雜交相反配對型的轉化體，所得菌株在相應培養(yǎng)基上導致孢子形成(sporilate)。四分體測試組氨酸原養(yǎng)型。NPD四分體GPD1/GPD2雙零突變體作為組氨酸-原養(yǎng)型單孢子的克隆而被分離，經(jīng)p425GPD-PsXYL1轉化，并用于制備木糖醇。
權利要求
1.使用可將木糖代謝為木糖醇的微生物制備木糖醇的生物技術方法，該方法包括如下步驟a)修飾微生物從而減少或消除除木糖還原酶以外的酶對NADH的氧化，b)在含有木糖和每升10-40克亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣、亞硫酸鈉或亞硫酸鉀被用作亞硫酸鹽)的底物中培養(yǎng)所述微生物，c)在需氧生長期和限氧木糖醇生成期培養(yǎng)所述微生物，d)自底物中富集和提取木糖醇。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于經(jīng)修飾的微生物中至少一種酶的表現(xiàn)活性減弱或沒有活性，這些酶為磷酸甘油脫氫酶，外線粒體NADH脫氫酶或乙醇脫氫酶。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于此微生物中編碼磷酸甘油脫氫酶、外線粒體NADH脫氫酶或乙醇脫氫酶的基因的表達被消除或減弱了。
4.根據(jù)權利要求1至3任一項的方法，其特征在于所用的微生物是假絲酵母屬、糖酵母菌、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬和德巴利式酵母屬。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其特征在于使用釀酒酵母時，NED1、NED2、GPD1和GPD2中至少一種基因被消除或失活。
6.根據(jù)權利要求1至5任一項的方法，其特征在于半乳糖、甘露糖、葡萄糖或阿拉伯糖被用于底物中作為進一步的碳源。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物技術制備木糖醇的方法，其中使用了可將木糖代謝為木糖醇的微生物。本發(fā)明方法包括如下步驟a)對微生物進行修飾，以便減少或排除木糖還原酶以外的酶對NADH的氧化；b)在包含木糖和10－40克每升的亞硫酸鹽(例如，亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)的底物中培養(yǎng)此微生物；c)在需氧生長期和限氧木糖醇生成期中培養(yǎng)此微生物；以及d)富集并自底物中收回木糖醇。
文檔編號C12P19/00GK1653187SQ03811033
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月15日 優(yōu)先權日2002年5月15日
發(fā)明者托馬斯·沃爾瑟, 卡伊·奧斯特曼, 漢斯-弗里德·利斯特尼克, 托馬斯·布萊, 格哈德·羅德爾 申請人:德累斯頓科技大學