專利名稱：核酸測序過程中懸臂的應(yīng)用的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域 在此描述的方法和儀器涉及分子生物學(xué)和核酸分析的領(lǐng)域。特別的是，所公開的方法和儀器涉及通過檢測在摻入標(biāo)記的核苷酸過程中質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的變化對核酸進(jìn)行測序。
背景技術(shù)：
遺傳信息以組織進(jìn)入染色體中的脫氧核糖核酸(DNA)的非常長分子的形式被儲存的。人類基因組含有大約30億個DNA序列堿基。DNA序列的信息決定了每個個體的多種特征。許多普遍的疾病至少部分是以DNA序列變異為基礎(chǔ)的。
人類基因組整個序列的測定為鑒定這些疾病的遺傳基礎(chǔ)提供了基礎(chǔ)。但大量的工作仍需進(jìn)行，以便鑒定與每種疾病相關(guān)的遺傳變異。這需要對表現(xiàn)有每種疾病的個體或家族中的部分染色體進(jìn)行DNA測序，以便鑒定可促進(jìn)疾病的DNA序列的特殊變化。核糖核酸(RNA)，一種遺傳信息加工過程中的中間分子，也被測序以鑒定多種疾病的遺傳基礎(chǔ)。
以檢測已根據(jù)大小被分開的熒光標(biāo)記核酸為基礎(chǔ)的已有的核酸測序方法，受被測序的核酸長度的限制。典型地，一次僅有500至1,000個核酸序列堿基可被測定。這比DNA的功能單位長度要短的多，功能單位是指基因，長度為數(shù)萬甚至數(shù)十萬的堿基。使用目前的方法，測定一條完整的基因序列需要產(chǎn)生基因的多個拷貝，切斷成為多個重疊的片段并測序，之后重疊的DNA序列被組裝成完整的基因。這個過程是非常費(fèi)力的，花費(fèi)較大，效率較低，并浪費(fèi)時間。也可典型地需要使用熒光或放射活性標(biāo)記，也潛在地存在安全性和廢物處置問題。
最近，已經(jīng)開發(fā)了許多核酸測序的方法，涉及與已確定序列、附著在DNA芯片上特定位置的短核苷酸雜交。這種方法可用來推斷短核苷酸序列或在樣品中檢測特異核酸的存在，但不適合鑒定長的核酸序列。
附圖簡述 下面的圖表構(gòu)成了部分說明書，并被包含在此，以進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些實施方案。參考這些圖表中的一個或多個，結(jié)合在此提供的詳細(xì)描述，可以更好地理解這些實施方案。


圖1圖解說明了用于核酸214分析的一個實例儀器100(未按比例繪制)。
圖2A，2B和2C圖解說明了核酸214分析的另一個實例儀器100(未按比例繪制)。
圖3圖解說明了測序數(shù)據(jù)的一個實例，該數(shù)據(jù)可采用在此描述的方法和儀器100來產(chǎn)生。
圖4圖解說明了測序數(shù)據(jù)的另一個實例，該數(shù)據(jù)可采用在此所描述的方法和儀器100來產(chǎn)生。
說明性實施方案的描述定義 如在此所使用的，“一個(a)”和“一個(an)”的含義是一種對象中的一個或多個。
如在此所使用的，“大約”的含義是在一個數(shù)量5％的加減范圍內(nèi)。例如，“大約100”的含義為在95至105之間的任何數(shù)量。
如在此所使用的，“可操作連接”的含義是在兩個或多個單位之間功能性的相互作用。例如，檢測單位118可與結(jié)構(gòu)116、212“可操作地連接”，如果檢測單位118的放置可檢測結(jié)構(gòu)116、212特性中的變化。
如在此所使用的，“液體交通”是指在兩個或更多區(qū)室之間的功能性連接，可允許液體在區(qū)室間通過。例如，如果液體可從第一個區(qū)室通過到達(dá)第二個區(qū)室和/或第二個區(qū)室到達(dá)第一個區(qū)室，則第一個區(qū)室與第二個區(qū)室處于“液體交通”狀態(tài)。
“核酸”214包括DNA，RNA，單鏈，雙鏈或三鏈和其任何化學(xué)修飾形式。在本發(fā)明的某些實施方案中，可使用單鏈的核酸214。實際上可考慮核酸214的任何修飾形式?！昂怂帷?14可以是幾乎任何長度，從10，20，50，100，200，300，500，750，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，6000，7000，8000，9000，10,000，15,000，20,000，30,000，40,000，50,000，75,000，100,000，150,000，200,000，500,000，1,000,000，2,000,000，5,000,000或甚至更大長度的堿基，直至全長的染色體DNA分子。
說明性實施方案的詳細(xì)描述 在此公開的方法和儀器100可用來迅速的、自動的對核酸214進(jìn)行測序。相對于本領(lǐng)域中現(xiàn)有方法的優(yōu)勢包括可在單個測序輪次中讀取長的核酸214的能力，更高的獲取序列數(shù)據(jù)的速度，較低的測序成本和在每單位序列數(shù)據(jù)所需的操作時間內(nèi)的更高效率。在本發(fā)明的一些實施方案中，對核酸214測序不需要熒光或放射性標(biāo)記的能力也是有優(yōu)勢的。
下面詳細(xì)的描述包含了許多特別的細(xì)節(jié)以便對公開的本發(fā)明的實施方案提供更為全面的理解。但對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員來說是很明顯的，即不需要這些特別的細(xì)節(jié)本發(fā)明也可實施。在其他的情況下，在本領(lǐng)域中為人所熟知的裝置、方法、步驟和個別部件在此不詳細(xì)描述。
本發(fā)明的某些實施方案涉及核酸214測序的方法和儀器100。在本發(fā)明的一些實施方案中，要被測序的核酸214可與結(jié)構(gòu)116，212附加在一起，如納米級或微米級懸臂116，212。在本發(fā)明的多個實施方案中，被附加的核酸214可作為產(chǎn)生互補(bǔ)鏈220(complementarystrands)或復(fù)制副本核酸214的模板。在本發(fā)明的一些實施方案中，用來合成互補(bǔ)鏈220的核苷酸218可用較大的基團(tuán)標(biāo)記，可對每種類型的核苷酸218提供獨特的質(zhì)量標(biāo)記。核酸214，220可在含有四種類型的標(biāo)記核苷酸218的溶液中孵育。隨著每個核苷酸218被加入至一個生長鏈220(growing strand 220)中，它就加入至與結(jié)構(gòu)116，212附著的物體上。因為每個核苷酸218可通過其獨特的質(zhì)量來鑒定，因此有可能通過測量質(zhì)量依賴的特性和/或在結(jié)構(gòu)116，212表面應(yīng)力上的變化，如它們的共振頻率或偏移，以核苷酸的加入順序來鑒定核苷酸218。在本發(fā)明的多個實施方案中，包括將相同核酸模板214的多個拷貝與每個結(jié)構(gòu)116，212附著在一起，許多互補(bǔ)鏈220的合成可同時發(fā)生，在質(zhì)量上和/或表面應(yīng)力的變化上提供了顯著性增加量，以便可在序列中添加每種核苷酸218的過程中可被檢測到。
在本發(fā)明的可選擇實施方案中，在一次當(dāng)中，生長的互補(bǔ)核酸220僅可暴露給單一類型的核苷酸218。核苷酸218的摻入僅在核苷酸218與模板鏈214中的相應(yīng)核苷酸218互補(bǔ)時可發(fā)生。因此，僅在存在正確的核苷酸218時，與結(jié)構(gòu)116，212附著的核酸214，220的質(zhì)量和/或結(jié)構(gòu)的表面應(yīng)力發(fā)生變化。相同類型的核苷酸218的連續(xù)添加可由相應(yīng)質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的較大幅度變化而指示。在這個實施方案中，不需要每種類型核苷酸218都有一個可識別的質(zhì)量標(biāo)記。
在圖1中圖解說明了與核酸214測序的實例儀器100有關(guān)的多個實施方案。圖1中的儀器100包括數(shù)據(jù)處理和控制單元110，該單元可操作地與儀器100的其他部件連接，如試劑容器112，分析室114，210，檢測單元118和出口128。圖1中的試劑容器通過入口124與分析室114，210處于液體交通狀態(tài)。分析室114，210包括附著模板核酸214的一個或多個結(jié)構(gòu)116，212。微型流體控制(Microfluidic)裝置可被引入以轉(zhuǎn)運(yùn)酶，標(biāo)記的核苷酸218，和/或其他試劑至分析室114，210和從其中轉(zhuǎn)運(yùn)出來。
在序列中與模板核酸214互補(bǔ)的核酸鏈220可通過已知的技術(shù)被合成，例如使用已知的核酸聚合酶222。將標(biāo)記的核苷酸218摻入進(jìn)互補(bǔ)鏈220中可通過測量附著結(jié)構(gòu)116，222的任何質(zhì)量依賴特性和/或表面應(yīng)力而檢測。
可使用的結(jié)構(gòu)116，212的非限制性實例包括懸臂(cantilever)，隔膜(diaphragm)，通過彈簧或其他彈性結(jié)構(gòu)懸掛或支持的平臺(platform)，或在本領(lǐng)域中已知的可測量質(zhì)量依賴特性和/或表面應(yīng)力的測量指標(biāo)，如偏移和/或共振頻率，的任何其他結(jié)構(gòu)116，212。適當(dāng)結(jié)構(gòu)116，212的實例是如在圖1中顯示的懸臂116，212。已知的微制造技術(shù)可用來使用一種或多種這樣的結(jié)構(gòu)116，212來制造分析室114，210(如，B aller等人，2000，Ultramicroscopy.821-9；美國專利No.6,073,484)。制造納米級的懸臂116，212陣列(nanoscalecantilever 116，212 arrays)的技術(shù)是已知的(例如，Bailer等人，2000；Lang等人，Appl.Phys.Lett.72383，1998；Lang等人，Analytica ChimicaActa 39359，1999；也可見http//monet.physik.unibas.ch/nose/inficon/；http//www.phantomsnet.com/phantom/net/phantomsconf/doc/Abadal.pdf；http//lmn.web.psi.ch/annrep/mntech3.pdf；www.nnf.cornell.edu/2001 cnfra/200138.pdf；http//www.princeton.edu/～cml/html/research/biosensor.html)。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，壓電材料如石英晶體微量天平可用作結(jié)構(gòu)116，212。(例如，Zhou等人，Biosensors & Bioelectronics 1685-95，2001；Yamaguchi等人，Anal.Chem.651925-1927；Bardea等人，Chem.Commun.7839-40，1998.) 一種或多種模板核酸214可與每個懸臂116，212附著。檢測單元118可監(jiān)測懸臂116，212的位置和/或共振頻率。在本發(fā)明的一些實施方案中，檢測單元118可以包括與光電檢測器122可操作連接的光源120?？蛇x擇地是，一個壓電傳感器可操作地與探測器122連接或直接連接于數(shù)據(jù)處理和控制單元110。
在圖1中的本發(fā)明實例方案顯示了懸臂116，212偏移的光學(xué)檢測。檢測方法是以光學(xué)杠桿技術(shù)為基礎(chǔ)，已知為原子力顯微鏡(AFM)。低功率激光束132可聚焦在懸臂116，212的游離端。反射的激光束132轟擊方位敏感的光電探測器122(PSD)。當(dāng)懸臂對被附著的核酸214，220的質(zhì)量和/或懸臂116，212的表面應(yīng)力變化反應(yīng)發(fā)生彎曲時，反射的激光束132轟擊PSD122的方位發(fā)生移動，產(chǎn)生偏移信號。質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的變化和隨后懸臂116，212的偏移度可從在PSD122上被反射的激光束132的位移來計算。
在本發(fā)明的多個實施方案中，標(biāo)記核苷酸218的溶液被導(dǎo)入進(jìn)分析室114，210中，每次導(dǎo)入一個標(biāo)記的核苷酸218。例如，由標(biāo)記鳥嘌呤(″G″)核苷酸218組成的溶液通過試劑容器112被導(dǎo)入進(jìn)分析室114，210中。溶液與模板核酸214，引物224或互補(bǔ)核酸220和聚合酶222孵育適當(dāng)?shù)臅r間。如果模板核酸214序列中的下一個核苷酸218是胞嘧啶(″C″)，則標(biāo)記的G將被摻入進(jìn)生長的互補(bǔ)核酸220鏈并檢測到結(jié)構(gòu)中發(fā)生相應(yīng)的變化。如果模板核酸214的下一個核苷酸218不是C，則檢測不到變化。含有標(biāo)記G核苷酸218的溶液從分析室114，220中去除，導(dǎo)入含有下一個標(biāo)記核苷酸218的溶液(腺嘌呤-″A″，胸腺嘧啶-″T″或胞嘧啶-″C″。在所有四種標(biāo)記核苷酸218溶液已經(jīng)通過分析室114，220被循環(huán)后，重復(fù)該循環(huán)，繼續(xù)直至核酸214被測序。模板核酸214的序列通過將已測量到的結(jié)構(gòu)特性變化與不同核苷酸218與模板214接觸的順序關(guān)聯(lián)而進(jìn)行測定。當(dāng)相同類型的多個核苷酸218被摻入進(jìn)互補(bǔ)鏈220中，要注意結(jié)構(gòu)116，212特性成比例的變化。例如，如果單個核苷酸218的摻入在結(jié)構(gòu)116，212特性中產(chǎn)生了“X”的變化，則相同類型的兩個或三個核苷酸可期望分別產(chǎn)生大約2X或3X的變化。
在本發(fā)明的可選擇實施方案中，靶核酸214序列的一部分是已知的。例如，核酸214已經(jīng)被部分測序，或未知核酸214序列已經(jīng)被連接至載體，連接子(linker)或其他已知序列的DNA上。在這種情況下，不是從頭至尾進(jìn)行所有四種核苷酸218循環(huán)，而是針對在序列中的下一次添加的正確核苷酸218直至到達(dá)未知序列區(qū)時才被加入。部分已知序列的使用也可用來校準(zhǔn)系統(tǒng)，并檢查正確的功能。在某些實施方案中，例如當(dāng)單核苷酸多態(tài)性(SNP)被分析時，除了單個位點以外整個核酸214序列是已知的，典型地含有兩個核苷酸218中的一個。這些實施方案可通過分析室114，210對核苷酸218進(jìn)行更為有效的循環(huán)。
圖2A，圖2B和圖2C圖解說明了實例分析室114，210的詳細(xì)視圖，包括懸臂116，212和與懸臂116，212附著的模板核酸214。圖2B圖解說明了于懸臂116，212附著的模板核酸214的放大視圖。模板214與引物224寡核苷酸雜交，該核苷酸在序列中與模板分子214的3’末端是互補(bǔ)的。核算聚合酶222，如DNA聚合酶222，與引物224的3’末端附著，開始合成互補(bǔ)鏈220。序列中的每個核苷酸218通過聚合酶222被添加至引物224的3’末端或互補(bǔ)鏈220?；パa(bǔ)鏈220的序列通過用模板鏈214進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)沃森-克里克(Watson-Crick)堿基對形成而測定，其中A僅與T(或在RNA模板214時，為尿嘧啶-″U″)結(jié)合，C僅與G結(jié)合。盡管在此所討論的本發(fā)明實施方案考慮了從DNA模板鏈214中合成DNA的互補(bǔ)鏈220，但在本發(fā)明的可選擇實施方案中考慮到RNA模板214可被用于合成互補(bǔ)鏈RNA或DNA鏈220，或DNA模板可被用于合成互補(bǔ)RNA鏈220。在RNA合成時，例如使用RNA聚合酶222，不需要使用引物224。
在摻入核苷酸218的過程中質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的變化可使用光學(xué)檢測法或壓電裝置通過懸臂116，212的偏移或共振頻率轉(zhuǎn)變來檢測(見美國專利Nos.6,079,255和6,033,852)。圖2C圖解說明檢測對核苷酸218摻入響應(yīng)的懸臂116，212偏移(Δd)的實例方法。為了增加準(zhǔn)確性和降低背景干擾，含有新?lián)饺牒塑账?18的懸臂212的位置可與一個或多個對照懸臂212進(jìn)行比較，在對照中核苷酸218的摻入已經(jīng)被阻斷了，例如通過在引物224的3’末端使用雙脫氧核苷酸。如在本領(lǐng)域中所已知的，雙脫氧核苷酸的作用是阻斷或終止核酸220的合成。
在本發(fā)明的多個可選擇實施方案中，核苷酸218可獨特地用較大的基團(tuán)標(biāo)記，如納米顆粒和/或不同質(zhì)量的納米顆粒聚集物，它們可用來鑒定每種類型的核苷酸218。核苷酸218的溶液含有一種，兩種，三種或四種不同類型的標(biāo)記核苷酸218(A，G，C和T或U)。在本發(fā)明的某些可選擇實施方案中，四種類型核苷酸218中僅有兩種可用質(zhì)量標(biāo)記，例如A和C核苷酸218。在未標(biāo)記嘧啶(C，T或U)和嘌呤(A，G)核苷酸218之間的質(zhì)量差異應(yīng)該可以通過質(zhì)量和/或表面應(yīng)變檢測來檢測到，標(biāo)記和未標(biāo)記的核苷酸218之間的差異也應(yīng)該如此。
被摻入至互補(bǔ)核酸220鏈中的核苷酸218的同一性可通過質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的顯著變化和它們發(fā)生的順序來測定。在本發(fā)明的某些實施方案中，每種核苷酸218用獨特的較大基團(tuán)來標(biāo)記。摻入的標(biāo)記核苷酸218的同一性可從結(jié)構(gòu)116，212的質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的顯著變化來確定。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，每種核苷酸218可用相同或相似的較大基團(tuán)來標(biāo)記。通過鑒定添加標(biāo)記核苷酸218以延伸互補(bǔ)核酸鏈220的序列，可以測定模板核酸鏈214的序列。
在本發(fā)明的某些實施方案中，要被加入的核苷酸218可以是DNA前體-脫氧腺苷酸5′三磷酸(dATP)218，脫氧胸苷5′三磷酸(dTTP)218，脫氧鳥苷5′三磷酸(dGTP)218和脫氧胞苷5′三磷酸(dCTP)218。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，核苷酸218可以是RNA前體，如腺苷5′三磷酸(ATP)218，胸苷5′三磷酸(TTP)218，鳥苷5′三磷酸(GTP)218和胞苷5′三磷酸(CTP)218。
可采用與單個核苷酸218溶液連續(xù)接觸獲得的代表性數(shù)據(jù)的圖解在圖3中提供。如圖所示，對于每個循環(huán)，模板214，引物224或互補(bǔ)鏈220和聚合酶222將順序地與四種核苷酸218類型(G，T，A和C)中的每一種接觸。在循環(huán)1中，當(dāng)加入T溶液時觀察到質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的變化，表明在模板214上有相應(yīng)A的存在。在循環(huán)2中，當(dāng)加入G溶液時，見到質(zhì)量和/或表面應(yīng)力有變化，表明在模板214中有C等等。模板214的線性序列可通過連續(xù)的循環(huán)添加和測量而鑒定。
可采用可選擇方法獲得的數(shù)據(jù)實例在圖4中圖解，該法中所有四種核苷酸218被區(qū)別標(biāo)記，并加入至相同的溶液中。為了說明的目的，質(zhì)量標(biāo)記可任意選擇，因此G具有單個質(zhì)量單位，A具有2個質(zhì)量單位，T具有三個質(zhì)量單位和C具有4個質(zhì)量單位。專業(yè)技術(shù)人員要意識到質(zhì)量單位的準(zhǔn)確值并不重要，只要它們可區(qū)分四種類型核苷酸218的每一種。如圖4中所示，第一個被加入的核苷酸218具有3個質(zhì)量單位，與T對應(yīng)，第二個被加入的核苷酸218具有1個質(zhì)量單位，對應(yīng)于G，第三個被加入的核苷酸218具有4個質(zhì)量單位，與C對應(yīng)，等等。從5’至3’讀取互補(bǔ)220鏈，序列顯示為TGCAC。從3’至5’模板214鏈的對應(yīng)序列為ACGTG。
在涉及與所有四種核苷酸218混合物接觸的多個模板鏈214的本發(fā)明的實施方案中，聚合反應(yīng)可被同步化，例如通過溫度的可控變化，加入等體積的聚合酶222和/或引物224，迅速混合，或相似的已知技術(shù)使相同的核苷酸218被同時加入至每個互補(bǔ)鏈220中。對于較長的測序輪次，需要對聚合反應(yīng)進(jìn)行周期的再同步化?？蛇x擇的是，同步化的聚合作用可在互補(bǔ)核酸鏈220的3’末端使用一個或多個保護(hù)基團(tuán)。僅在去除以前摻入的核苷酸218的保護(hù)基團(tuán)之后摻入另外的核苷酸218。從核苷酸218添加和切除保護(hù)基團(tuán)是為人熟知的，包括化學(xué)和/或光切割的基團(tuán)，如美國專利6310,189所述。
在使用標(biāo)記核苷酸218的本發(fā)明的實施方案中，逐級測定長的模板鏈214的序列，以避免或減少用于標(biāo)記的較大基團(tuán)的可能空間阻遏效應(yīng)?？臻g阻遏作用潛在地干擾核酸聚合酶222的活性。在一個非限制性的實例中，為了測序模板DNA分子214，如上所述通過加入含有單個標(biāo)記核苷酸218(A，G，T或C)的溶液可加入引物224和已測序的前10個堿基。在分析后，去掉標(biāo)記的核苷酸218，例如使用核酸外切酶活性，和通過接觸含有單個未標(biāo)記核苷酸218溶液用未標(biāo)記核苷酸取代。模板214中的下10個堿基通過接觸含有單個標(biāo)記核苷酸218的溶液而被測序，然后用未標(biāo)記核苷酸218取代標(biāo)記的核苷酸218。重復(fù)該過程直至整個模板214被測序。專業(yè)技術(shù)人員會意識到這種圖解僅是代表性的，該法并不被限制于在一次中測序10個堿基。在聚合酶222活性產(chǎn)生實質(zhì)上的干擾作用前，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員很容易測定被摻入進(jìn)互補(bǔ)鏈220中的連續(xù)標(biāo)記核苷酸的數(shù)量。這個數(shù)字部分依賴于聚合酶222的類型和使用的標(biāo)記類型。
在本發(fā)明的某些實施方案中，與懸臂116，212結(jié)合的模板核酸分子214的數(shù)量被限制。在本發(fā)明的另一個實施方案中，模板核酸214被附著于一個或多個懸臂116，212上，以特殊的圖案結(jié)構(gòu)和/或方向，以獲得優(yōu)化的信號。模板分子214的圖案結(jié)構(gòu)，例如可通過如下所述用多種已知的功能基團(tuán)覆蓋結(jié)構(gòu)116，212而達(dá)到。
模板核酸214的分析可以以時間和成本有效方式提供關(guān)于生物試劑或疾病狀態(tài)的信息。從分析核酸214獲得的信息可用來確定有效的治療，如疫苗的施用，抗體治療，抗病毒給藥或其他治療。微電機(jī)械系統(tǒng)(MEMS) 微電機(jī)械系統(tǒng)(MEMS)是包括機(jī)械元件、傳感器、傳動器和電子設(shè)備的集成系統(tǒng)。所有的組件都通過已知的微制造技術(shù)在普通的芯片上制造，該芯片包括硅基或同等基片(例如，Voldman等人，Ann.Rev.Biomed.Eng.1401-425，1999)。MEMS的傳感器組件可用來測量機(jī)械，溫度，生物學(xué)，化學(xué)，光學(xué)和/或磁性現(xiàn)象。電子設(shè)備可處理從傳感器和控制傳動裝置如泵、閥、加熱器、冷卻器、濾器、等獲得的信息，因此可控制MEMS的功能。
MEMS的電子組件可采用集成電路工藝(IC)制造(例如，CMOS(互補(bǔ)型金屬-氧化物-半導(dǎo)體)，雙極，或BICMOS(雙極與CMOS兼容)工藝)。它們可采用已知用于計算機(jī)芯片制造的光刻和蝕刻法來制造圖案。微機(jī)械組件可采用相配合的“顯微機(jī)械加工”工藝來制造，這種工藝可選擇性的蝕刻掉硅晶片的部分或添加新的結(jié)構(gòu)層形成機(jī)械和/或機(jī)電元件。在MEMS制造中的基本技術(shù)包括將薄膜材料鍍在底物上，將圖像掩模通過光刻印像或其他已知的平板印刷法用于薄膜頂部，并選擇性的蝕刻薄膜。薄膜厚度的范圍為幾納米至100微米。使用的淀積技術(shù)，包括化學(xué)方法如化學(xué)氣相淀積(CVD)，電鍍，外延和熱氧化，以及物理方法象物理氣相淀積(PVD)和澆鑄。
并不限制制造方法，可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法，如激光消融，噴射鑄造，分子束外延，蘸水筆納米平板印刷術(shù)，反應(yīng)性離子束蝕刻，化學(xué)輔助的離子束蝕刻，微波輔助的等離子蝕刻，聚焦離子束銑削，電子束或聚焦離子束技術(shù)或壓印蝕刻技術(shù)。制造納米機(jī)電系統(tǒng)的方法可用在本發(fā)明的某些實施方案中。(見，例如，Craighead，Science 2901532-36，2000.)多種形式的微制造芯片可從商業(yè)渠道獲得，例如從Caliper Technologies Inc.(Mountain View，C A)和ACLARABioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
在本發(fā)明的多個實施方案中，考慮到在圖1和圖2中舉例說明的核酸測序儀器100的一些或所有組件可被構(gòu)造為集成MEMS裝置的一部分。
懸臂 在本發(fā)明的某些實施方案中，核酸214，220要附著的結(jié)構(gòu)116，212包括一個或多個懸臂116，212。懸臂116，212是很小，很細(xì)的彈性杠桿，可一端被附著，另一端游離。制造懸臂116，212陣列的方法是已知的(例如，Bailer等人，Ultramicroscopy 821-9，2000；美國專利No.6,079,255)。用作原子力顯微鏡的懸臂116，212典型地大約為100至200微米(μm)長和大約1μm粗。范圍是15至400μm長，5至50μm寬和320納米(nm)粗，能夠檢測單一大腸桿菌細(xì)胞的二氧化硅懸臂116，212已經(jīng)由已知的方法制造(Ilic等人，Appl.Phys.Lett.77450，2000)。材料不限制，可使用任何其他的材料構(gòu)造懸臂116，212，如硅或氮化硅。在本發(fā)明的其他實施方案中，可使用大約50μm長，10μm寬和100nm粗的懸臂116，212。在本發(fā)明的某些實施方案中，可使用更小的尺寸，納米級的懸臂116，212，小至100nm長。在本發(fā)明的一些實施方案中，可使用大約10至500μm之間長，1至100μm之間寬和100nm至1μm之間粗的懸臂116，212。
當(dāng)懸臂116，212被誘導(dǎo)共振時，可將聚焦在懸臂116，212游離端的激光束132偏移。通過用光束探測器122測量懸臂116，212偏移，可測量到懸臂116，212的共振振蕩頻率?？蛇x擇地，懸臂116，212的偏移可通過使用位置敏感的光電探測器122來測量被反射的光束132，因此可測定懸臂116，212的位置。這些方法是不受限制的，可在要求的主題內(nèi)容之內(nèi)使用可測量結(jié)構(gòu)特性變化的任何方法，該結(jié)構(gòu)受核苷酸218摻入的影響。例如，當(dāng)懸臂116，212彎曲和電線長度(和寬度)發(fā)生變化，與該表面附著或被引入進(jìn)懸臂116，212中的金屬線預(yù)期將改變其電阻。將納米電線附著或引入進(jìn)懸臂116，212中的方法在本領(lǐng)域中是已知的，測量電阻的方法也是一樣。
檢測單位 檢測單位118可用來檢測懸臂的偏移和/或共振頻率。例如，可采用光學(xué)和/或壓阻探測器122(例如，美國專利No.6,079,255)和/或表面應(yīng)力探測器122(例如，F(xiàn)ritz等人，Science 288 316-8，2000)來檢測懸臂116，212的偏移。
在本發(fā)明的一個實例實施方案中，壓阻電阻器可植入在懸臂116，212臂的固定末端。懸臂116，212游離末端的偏移可沿懸臂116，212產(chǎn)生應(yīng)力。這種應(yīng)力可與懸臂116，212的偏移程度成比例的改變電阻器116，212的電阻。電阻測量裝置可與壓阻電阻器連接在一起以測量其電阻，并產(chǎn)生對應(yīng)于懸臂116，212偏移的信號。這種壓阻探測器122可安裝在懸臂116，212固定末端的縊痕中，這樣當(dāng)懸臂116，212被偏移時，探測器122可承受更大的應(yīng)力(PCT專利申請WO97/09584)。
電阻的變化可使用本領(lǐng)域已知的方法來計算懸臂116，212偏移和/或共振頻率的變化。制造小壓阻懸臂116，212的方法也是已知的。在一個非限制性的實例中，壓阻懸臂116，212的形成可通過將一個或多個懸臂116，212在硅絕緣體(SOI)晶片的頂層上成形。懸臂116，212可摻入硼或其他的摻雜劑產(chǎn)生一個p型的傳導(dǎo)層。為形成電接點可將金屬鍍在摻雜層和通過去掉在其下面的大塊硅而釋放的懸臂116，212上。這種方法可使用如上所述的已知的平版印刷法和蝕刻技術(shù)。
在本發(fā)明的一些可選擇實施方案中，在導(dǎo)入摻雜劑以減少壓敏電阻器中所固有的干擾信號后可生成一個薄的氧化層。壓敏電阻器懸臂116，212也可采用已知的技術(shù)通過汽相外延形成。在本發(fā)明的某些實施方案中，壓力可用來驅(qū)動懸臂116，212的振動。通過使用基準(zhǔn)電阻器將壓敏電阻器摻入進(jìn)惠斯頓(Wheatstone)電橋電路中，懸臂116，212的電阻系數(shù)可被監(jiān)測。
在本發(fā)明的其他實施方案中，可采用光偏移傳感器118來檢測懸臂116，212偏移和/或共振頻率。這種探測單位118包括光源120，如激光二極管，或垂直空腔表面發(fā)射激光器(VCSEL)的陣列，和位置敏感的光電探測器。前置放大器可用來將光電流轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷?。光?20發(fā)射的光被引導(dǎo)至懸臂116，212的游離末端上，被反射至一個或多個光電二極管122上。在本發(fā)明的某些實施方案中，懸臂116，212的游離末端包被以高度反射性的表面，如銀，可增加反射光束132的強(qiáng)度。懸臂116，212的偏移可引起反射光束132位置的變化。這種變化可被位置敏感的光電探測器122探測和分析以測量懸臂116，212位移的量。懸臂116，212的位移反過來可用來測量附著于懸臂116，212的核酸214，220的附加質(zhì)量。專業(yè)技術(shù)人員將意識到在此所討論的實例檢測技術(shù)可用于其他類型的結(jié)構(gòu)116，212，如隔膜或懸空操作臺。
在本發(fā)明的其他實施方案中，結(jié)構(gòu)116，212的偏移和/或共振頻率可采用壓電(PE)和/或壓磁探測單位118來測量(例如，Ballato，″通過等效網(wǎng)絡(luò)建模壓電和壓磁裝置和結(jié)構(gòu)，″IEEE Irons.Ultrason.Ferroelectr.Freq.Control 481189-240，2001)。壓電探測單位118使用了傳感元件的壓電效應(yīng)來產(chǎn)生電荷輸出。PE探測單位118的操作不需要外來的電源。“彈性”傳感元件可產(chǎn)生與外加應(yīng)力量成比例的指定數(shù)量的電子。許多天然的和人造材料，如晶體，陶瓷和少量的聚合物顯示這種特性。這些材料具有規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu)，當(dāng)應(yīng)變時凈電荷發(fā)生變化。
壓電材料在其不受力的狀態(tài)下也具有偶極子。在這些材料中，通過應(yīng)力變形產(chǎn)生電場，引起壓電反應(yīng)。電荷實際上沒產(chǎn)生，相反被替代。當(dāng)電場沿偶極子的方向產(chǎn)生時，產(chǎn)生流動電子從壓電材料的一個末端通過信號探測器122移動至壓電材料的另一端以閉合電路。移動電子的數(shù)量市壓電材料中應(yīng)變程度和系統(tǒng)電容的函數(shù)。
專業(yè)技術(shù)人員將意識到在此討論的探測技術(shù)僅為實例，可使用任何已知的技術(shù)來測量偏移和/或共振頻率中的變化，或結(jié)構(gòu)116，212的任何其他質(zhì)量和/或表面應(yīng)力依賴特性。
核酸 被測序的核酸分子214可通過任何已知的技術(shù)來制備。在本發(fā)明的一個實施方案中，核酸214可以天然存在的DNA或RNA分子。實際上任何天然存在的核酸214可通過公開的方法來制備和測序，包括但不限于染色體、線粒體或葉綠體DNA，或信使、異源核、核糖體或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA。制備和分離多種形式核酸214的方法是已知的(見，例如，分子克隆技術(shù)指南，主編，Berger and Kimmel，Academic Press，NewYork，NY，1987；分子克隆實驗室手冊，第二版，主編Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。在引用的參考文獻(xiàn)中公開的方法僅作為實例，可使用本領(lǐng)域中已知的任何變化。
在單鏈DNA(ssDNA)214被測序的情況下，可從雙鏈DNA(dsDNA)通過任何已知的方法制備ssDNA214。這種方法涉及加熱dsDNA，使雙鏈分離，或可選擇性的涉及通過已知的擴(kuò)增或復(fù)制方法從dsDNA制備ssDNA214，如克隆進(jìn)M13中。任何這種已知的方法可被用來制備ssDNA或ssRNA214。
盡管上面的討論涉及天然存在的核酸214的制備，實際上能夠附著于懸臂或相當(dāng)結(jié)構(gòu)116，212的任何類型核酸214可通過已公開的方法被測序。例如，通過多種擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRTM)擴(kuò)增制備的核酸214可被測序。(見美國專利Nos.4,683,195，4,683,202和4,800,159。)被測序的核酸214可選擇性地被克隆進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)載體中，如質(zhì)粒，粘粒，BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)。(見，例如，Berger和Kimmel，1987；Sambrook等人，1989。)核酸插入物214可從載體DNA中分離，例如，通過合適的限制性內(nèi)切酶的切除，然后通過瓊酯糖凝膠電泳。分離插入核酸214的方法是為人熟知的。
被測序的核酸214可從很寬范圍種類的生物體中分離，包括但不限于，病毒，細(xì)菌，病原生物體，真核生物，植物，動物，哺乳動物，狗，貓，羊，牛，豬，山羊和人。也考慮應(yīng)用的是核酸214或核酸214的擴(kuò)增部分。
被用來測序的核酸214可通過任何已知的方法來擴(kuò)增，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，Qbeta復(fù)制酶擴(kuò)增，鏈置換擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增和核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增(NASBA)。
核酸合成 本發(fā)明的某些實施方案涉及互補(bǔ)DNA220的合成，例如使用DNA聚合酶222。這種聚合酶222可與引物分子224結(jié)合，并將標(biāo)記核苷酸218添加至引物224的3’末端。潛在用途的聚合酶222的非限制性實例包括DNA聚合酶222，RNA聚合酶222，逆轉(zhuǎn)錄酶222，和RNA依賴的RNA聚合酶222。這些聚合酶222之間的差異，就其“校對”活性和需要或不需要引物224和啟動子序列而言，在本領(lǐng)域中是已知的。當(dāng)使用RNA聚合酶222時，被測序的模板分子214是雙鏈DNA214?？墒褂玫木酆厦?22的非限制實例包括Thermatogamaritima DNA聚合酶222，AmplitaqFSTMDNA聚合酶222，TaquenaseTMDNA聚合酶222，ThermoSequenaseTM222，Taq DNA聚合酶222，QbetaTM復(fù)制酶222，T4 DNA聚合酶222，特莫氏屬(thermusthermophilus)DNA聚合酶222，RNA-依賴RNA聚合酶222和SP6 RNA聚合酶222。
許多聚合酶222可從商業(yè)渠道購得，包括Pwo DNA聚合酶222(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)；Bst聚合酶222(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)；IsoThermTMDNA聚合酶222(Epicentre Technologies，Madison，WI)；莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶222，Pfu DNA聚合酶222，禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶222，Thermus flavus(Tfl) DNA聚合酶222和Thermococcus litoralis(Tli) DNA聚合酶222(Promega Corp.，Madison，WI)；RAV2逆轉(zhuǎn)錄酶222，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶222，T7 RNA聚合酶222，T3 RNA聚合酶222，SP6 RNA聚合酶222，Thermus aquaticus DNA聚合酶222，T7 DNA聚合酶222+/-3′-＞5′核酸外切酶，DNA聚合酶I 222的Klenow片段，Thermus‘ubiquitous’DNA聚合酶222，和DNA聚合酶I 222(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)?？墒褂迷诒绢I(lǐng)域已知能夠進(jìn)行標(biāo)記核苷酸218的模板依賴性聚合作用的任何聚合酶222。(見，例如，Goodman和Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.l(2)101-9，2000；美國專利No.6,090,589)。使用聚合酶222從標(biāo)記核苷酸218合成核酸220的方法是已知的(例如，美國專利No.4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
引物 通常，引物224的長度在10至20個堿基之間，盡管可應(yīng)用更長的引物224。再本發(fā)明的某些實施方案中，引物224可被設(shè)計為在序列中準(zhǔn)確地與模板核酸214的已知部分互補(bǔ)?？墒褂靡阎囊?24序列，例如，其中選擇鑒定已知常染色體序列附近的序列變異體的引物224，未知核酸214序列被插入進(jìn)已知序列的載體中，或天然核酸214部分已經(jīng)被測序。合成引物224的方法是已知的，自動寡核苷酸合成儀可從商業(yè)渠道購得(例如，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA；Millipore Corp.，Bedford，MA)。引物224也可從商業(yè)供應(yīng)商處購得(例如，Midland Certified Reagents，Midland，TX)。
本發(fā)明的可選擇實施方案涉及在缺少已知引物224結(jié)合位點的情況下對核酸214測序。再這種情況下，可能要使用隨機(jī)引物224，如隨機(jī)六聚物224或隨機(jī)寡聚體224，長度為7，8，9，10，11，12，13，14，15個堿基或更長，以啟動聚合作用。
核酸附著 在本發(fā)明的多個實施方案中，核酸分子214可通過非共價或共價結(jié)合附著于結(jié)構(gòu)116，212。在一個非限制性實例中，附著的發(fā)生可通過用抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白包被結(jié)構(gòu)116，212，然后生物素化核酸214和/或引物224結(jié)合。在不同的實施方案中，被附著的結(jié)構(gòu)116，212的表面和/或核酸分子214可用多種已知的反應(yīng)基團(tuán)修飾以促進(jìn)附著。
例如，表面可用醛基，羧基，氨基，環(huán)氧基，巰基，光敏或其他已知的基團(tuán)來修飾。表面修飾可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法，如用含有反應(yīng)基團(tuán)的硅烷包被。非限制性實例包括氨基硅烷，疊氮三甲硅烷，溴代三甲硅烷，碘代三甲硅烷，氯代二甲硅烷，雙乙酸基二-t-丁氧硅烷，3-縮水甘油丙氧基三甲氧基硅烷(GOP)和氨丙基三甲硅烷(APTS)。可附著核酸的硅烷和其他表面涂料可從商業(yè)渠道購得(例如，United Chemical Technologies，Bristol PA)。
核酸214也可用多種反應(yīng)基團(tuán)來修飾以促進(jìn)附著，盡管在下面所討論的本發(fā)明的某些實施方案中，未修飾的核酸214也可被附著在表面上。再在特殊的實施方案中，核酸214可在其5’或3’末端和/或在內(nèi)部殘基上被修飾以包含一個表面反應(yīng)基團(tuán)，如巰基，氨基，醛，羧基或環(huán)氧基或光反應(yīng)基團(tuán)。在本發(fā)明的特殊實施方案中，核酸214用基團(tuán)修飾以非共價的形式附著在表面上，如生物素，鏈霉抗生物素蛋白，抗生物素蛋白，毛地黃毒苷，熒光素或膽固醇。修飾的核酸，寡核苷酸和/或核苷酸可從商業(yè)渠道獲得(見，例如http//www.operon.com/store/desref.php)或采用本領(lǐng)域中已知的任何方法來制備。
在本發(fā)明的特殊實施方案中，附著的發(fā)生可通過5’-磷酸化核酸214與化學(xué)修飾的結(jié)構(gòu)116，212直接共價附著(Rasmussen等人，Anal Biochem.198138-142，1991)。在核酸214和結(jié)構(gòu)116，212之間可形成共價鍵，例如，通過使用水溶性碳化二亞胺進(jìn)行縮合作用。這種方法通過其5’-磷酸促進(jìn)核酸214主要的5’-附著。在本發(fā)明的某些實施方案中，模板核酸214通過其3’末端被固定，使互補(bǔ)核酸220的聚合作用以5’至3’的方式進(jìn)行。
附著的發(fā)生可通過用poly-L-Lys(賴氨酸)包被結(jié)構(gòu)116，212，然后使用雙能交聯(lián)劑共價附著氨基或巰基修飾的核酸214。(Running等人，BioTechniques 8276-277，1990；Newton等人，NucleicAcids Res.211155-62，1993)。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，可使用光聚合物將核酸214附著于結(jié)構(gòu)116，212上，該光聚合物含有光反應(yīng)核素如氮賓，亞碳化物或羰游離基(見美國專利Nos.5,405,766和5,986,076)。附著的發(fā)生也可通過用金屬如金，包被結(jié)構(gòu)116，212，然后共價附著氨基或巰基修飾的核酸214。
雙能交聯(lián)劑可用來進(jìn)行附著。實例的交聯(lián)劑包括戊二醛(GAD)，雙能環(huán)氧乙烷(OXR)，乙二醇二環(huán)氧甘油醚(EGDE)，和碳化二亞胺，如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)。在本發(fā)明的一些實施方案中，結(jié)構(gòu)116，212共能基團(tuán)可被共價地附著在交聯(lián)化合物中以降低核酸分子214和聚合酶222之間的空間阻遏。典型地交聯(lián)基團(tuán)包括乙二醇寡聚體和二胺類。
在本發(fā)明的某些實施方案中，俘獲寡核苷酸224可與結(jié)構(gòu)116，212結(jié)合。俘獲寡核苷酸224在模板核酸214上與互補(bǔ)序列雜交。一旦模板核酸214被結(jié)合，俘獲寡核苷酸被用作引物224進(jìn)行核酸聚合。
與每個結(jié)構(gòu)116，212附著的核酸214的數(shù)量可根據(jù)結(jié)構(gòu)116，212的敏感性和系統(tǒng)的噪聲水平而變化。長度大約為500μm的大懸臂116，212上每個懸臂116，212附著的核酸214分子可達(dá)1010。但使用較小的懸臂116，212，附著的核酸214的數(shù)量大幅度減少。測定需要產(chǎn)生有效信號的附著核酸214的數(shù)量是為本領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員所熟知的。
附著在結(jié)構(gòu)上的核酸的圖案形成 在本發(fā)明的特殊實施方案中，以選擇的優(yōu)化信號幅度和減少背景噪聲的特異圖案，核酸214被附著在結(jié)構(gòu)116，212表面上。以選擇的圖案將核酸214附著在表面上的方法是本領(lǐng)域中已知的，可使用任何這樣的方法。
例如，硫醇衍生的核酸214可被附著在已經(jīng)涂有薄層金的結(jié)構(gòu)116，212上。硫醇基團(tuán)與金表面反應(yīng)形成共價鍵(Hansen等人，Anal.Chem.731567-71，2001)。核酸214通過可選擇的方法以特殊的圖案進(jìn)行附著。在本發(fā)明的某些實施方案中，結(jié)構(gòu)的整個表面可用金或可選擇的反應(yīng)基團(tuán)來涂覆。經(jīng)衍生的核酸214以選擇的圖案被置于表面上，例如通過蘸水筆納米平板印刷術(shù)(dip-pen nanolithograpy)。可選擇的金箔層可通過已知的方法被蝕刻進(jìn)選擇的圖案中，如反應(yīng)性離子束蝕刻，電子束或聚焦離子束技術(shù)。在與硫醇修飾的核酸214接觸過程中，核酸214僅與有殘余金箔層的結(jié)構(gòu)116，212的表面結(jié)合。
也可采用光刻法來完成圖案形成。將核酸214附著在表面上的光刻法是為人所熟知的(例如，美國專利No.6,379,895)。光掩?？捎脕肀Ｗo(hù)或?qū)⒔Y(jié)構(gòu)116，212的選擇區(qū)域暴露于光束。光束可活化特殊區(qū)域的化學(xué)性質(zhì)，如光活化結(jié)合基團(tuán)，使模板核酸214和活化區(qū)域附著，不與受保護(hù)的區(qū)域附著。光活化基團(tuán)如疊氮基化合物是已知的，可從商業(yè)渠道購得。在本發(fā)明的某些實施方案中，納米級的圖案可采用已知的方法鍍在結(jié)構(gòu)的表面上，如蘸水筆平板印刷術(shù)，反應(yīng)性離子束蝕刻，化學(xué)輔助離子束蝕刻，聚焦離子束銑削，低壓電子束或聚焦離子束技術(shù)或壓印技術(shù)。
已造型核酸214的噴鍍可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來完成。在本發(fā)明的某些實施方案中，核酸214的構(gòu)型可使用自行組裝的單層來進(jìn)行噴鍍，該單層已經(jīng)使用已知的平板印刷技術(shù)，如低壓電子束平板印刷術(shù)，被排列進(jìn)構(gòu)型中。例如，聚對二甲苯或相當(dāng)?shù)幕衔飳颖粐婂冊诮Y(jié)構(gòu)表面，并用發(fā)射法進(jìn)行造型為核酸214的附著形成有圖案的表面(例如，美國專利No.5,612,254；5,891,804；6,210,514)。
核苷酸標(biāo)記 在本發(fā)明的某些實施方案中，一個或多個標(biāo)記可被附著于一種或多種類型的核苷酸218上。標(biāo)記可含有一個較大基團(tuán)。可使用的標(biāo)記的非限制性實例包括納米微粒(例如，金納米微粒)，聚合體，碳納米管，球殼狀碳分子，功能化的球殼狀碳分子，量子圓點，樹枝狀物(dendrimers)，熒光，發(fā)光，磷光，電子致密或質(zhì)譜標(biāo)記?？墒褂萌魏晤愋偷臉?biāo)記，如有機(jī)標(biāo)記，無機(jī)標(biāo)記和/或有機(jī)-無機(jī)雜交標(biāo)記。標(biāo)記可使用多種方法來探測，如結(jié)構(gòu)116，212共振頻率的變化，壓電激發(fā)，結(jié)構(gòu)116，212偏移，和其他測量質(zhì)量和/或表面應(yīng)力變化的手段。
標(biāo)記的核苷酸218包括嘌呤或嘧啶堿基，可通過間隔區(qū)的臂連接至標(biāo)記上。核酸218堿基，糖類和磷酸基團(tuán)的修飾不需要顧及氫鍵的形成或核酸220的聚合。通過添加標(biāo)記被修飾的嘌呤或嘧啶堿基的位置包括，例如鳥嘌呤的N2和N7位置，腺嘌呤的N6和N7位置，胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的C5位置，胞嘧啶的N4位置。
在本領(lǐng)域中已知的可使用的多種標(biāo)記包括TRTT(四甲基若丹明異硫醇)，NBD(7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑)，德克薩斯紅染料，酞酸，異酞酸，固定甲酚紫，甲酚藍(lán)紫，亮甲酚藍(lán)，對氨基苯甲酸，赤蘚紅，生物素，毛地黃毒苷，5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素，5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素，5-羧基熒光素，5-羧基若丹明，6-羧基若丹明，6-羧基四甲基氨基酞菁，甲亞胺，青色素，黃嘌呤，琥珀酰熒光素和氨基氮蒽。這些或其他標(biāo)記可從商業(yè)渠道購得(例如，MolecularProbes，Eugene，OR)。多環(huán)芳族化合物或碳納米管也可用作標(biāo)記。
可與標(biāo)記共價附著的核苷酸218可從熟悉的商業(yè)渠道購得(例如，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有設(shè)計可與其他分子如核苷酸218共價反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)的多種標(biāo)記可從商業(yè)渠道購得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。制備標(biāo)記核苷酸218的方法是已知的(例如，美國專利No.4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
納米微粒 在本發(fā)明的某些實施方案中，納米微粒可用來標(biāo)記核苷酸218。在本發(fā)明的一些實施方案中，納米微粒為銀或金納米微粒。在本發(fā)明的多種實施方案中，可使用直徑在1nm和100nm之間的納米微粒，盡管可考慮不同尺寸規(guī)格和質(zhì)量的納米微粒。制備納米微粒的方法是已知的(例如，美國專利No.6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.863391-3395，1982)。納米微粒也可從商業(yè)渠道購得(例如，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，納米微粒可以是單一的納米微粒?？蛇x擇地，納米微?？梢员唤宦?lián)產(chǎn)生納米微粒的特殊聚合體，如二聚體，三聚體，四聚體或其他聚合體。在本發(fā)明的某些實施方案中，含有選擇數(shù)量的納米微粒(二聚體，三聚體等)的聚合體可通過已知的技術(shù)濃縮或純化，如蔗糖溶液中的超速離心。
交聯(lián)納米微粒的方法是已知的(例如，F(xiàn)eldheim，″采用分子橋組裝金屬納米微粒陣列″，The Electrochemical Society Interface，F(xiàn)all，2001，22-25頁)。金納米微粒可以被交聯(lián)，例如采用含有硫醇或巰基末端基團(tuán)的雙能連接化合物。在與金納米微粒反應(yīng)過程中，連接子形成了被連接子長度分隔的納米微粒二聚體。在本發(fā)明的其他實施方案中，具有三個，四個或更多硫醇基團(tuán)的連接子可用來同時與多個納米微粒附著(Feldheim，2001)。使用對于連接化合物過量的納米微?？煞乐剐纬啥喾N交聯(lián)物和鈉米微粒沉淀。
在本發(fā)明的可選擇實施方案中，在與連接化合物附著之前納米微粒可被修飾以含有多種反應(yīng)基團(tuán)。被修飾的納米微?？蓮纳虡I(yè)渠道購得，如Nanogold那米微粒，來自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)。Nanogold納米微?？膳c每個納米微粒附著的單個或多個馬來酰亞胺，胺或其他基團(tuán)一起獲得。Nanogold納米微粒也可以正電荷或負(fù)電荷的形式獲得。這種修飾的納米微?？膳c多種已知的連接化合物附著以提供納米微粒的二聚體，三聚體或其他聚集體。
在本發(fā)明的多種實施方案中，納米微粒可與核苷酸218共價附著。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，核苷酸218可直接與納米微粒附著或附著于連接化合物，該化合物可與納米微粒共價或非共價鍵合。在本發(fā)明的這種實施方案中，不是一起交聯(lián)兩個或多個納米微粒，連接化合物可用來將核苷酸218附著在納米微?；蚣{米微粒聚集體上。在本發(fā)明的特殊實施方案中，納米微?？捎醚苌墓柰楸话?。這種修飾的硅烷可采用已知的方法被共價附著在核苷酸218上。
在本發(fā)明的實例實施方案中，核苷酸218可分別用含有1個，兩個，三個或四個相似大小納米微粒的聚集體標(biāo)記?？蛇x擇地是，用不同大小和質(zhì)量的個別納米微粒標(biāo)記核苷酸8。使用的金納米微粒實例可從Polysciences，Inc.購得，大小為5，10，15，20，40和60nm。在某些實施方案中，每個不同類型的核苷酸218(A，G，C和T或U)可用納米微?；虿煌|(zhì)量的納米微粒聚集體標(biāo)記。
信息處理和控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析 在本發(fā)明的某些實施方案中，測序儀器100可與數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng)110進(jìn)行界面連接。在本發(fā)明的一個實例實施方案中，系統(tǒng)110合并了計算機(jī)110，該計算機(jī)由總線或其他交換信息的交換方式，處理器或與總線結(jié)合在一起處理信息的其他處理方式組成。在本發(fā)明的一個實施方案中，處理器選自Pentium處理器家族，包括PentiumII家族，PentiumIII家族和Pentium4處理器家族，可從Intel Corp.(Santa Clara，CA)購得。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，處理器可以是Celeron，Itanium，Pentium Xeon處理器或處理器X-級家族成員(Intel Corp.，Santa Clara，CA)。在本發(fā)明的多種其他實施方案中，處理器可基于Intel體系結(jié)構(gòu)，如Intel IA-32或Intel LA-64體系結(jié)構(gòu)?？蛇x擇使用其他處理器。
計算機(jī)110可進(jìn)一步由隨機(jī)存取存儲器(RAM)或其他動態(tài)儲存裝置(主存儲器)組成，為儲存要被處理器執(zhí)行的信息和指令與總線連接。主存儲器也可用來儲存臨時變量或在處理器執(zhí)行指令的過程中的其他中間信息。計算機(jī)110也包括只讀存儲器(ROM)和/或其他與總線連接以存儲處理器的靜態(tài)信息和指令的靜態(tài)存儲器。其他標(biāo)準(zhǔn)的計算機(jī)110組件，如顯示器，鍵盤，鼠標(biāo)，網(wǎng)卡，或其他本領(lǐng)域已知的組件可被合并進(jìn)信息處理和控制系統(tǒng)中。專業(yè)技術(shù)人員將理解與在此所述實例裝備不同的信息處理和控制系統(tǒng)110可用于某些執(zhí)行過程。因此系統(tǒng)110的配置可發(fā)生變化。
在本發(fā)明的特殊實施方案中，探測單位118可與總線連接。處理器可從探測單位118處理數(shù)據(jù)。處理和/或原始數(shù)據(jù)被儲存在主存儲器中。導(dǎo)入進(jìn)分析室114，210中的標(biāo)記核苷酸218的質(zhì)量和/或核苷酸218溶液的序列數(shù)據(jù)也儲存在主存儲器或ROM中。處理器將檢測到的質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的變化與標(biāo)記核苷酸218質(zhì)量進(jìn)行比較以鑒定出合并入互補(bǔ)核酸鏈220中的核苷酸218的序列。處理器可從探測單位118中分析數(shù)據(jù)以測定模板核酸214的序列。
信息處理和控制系統(tǒng)110可進(jìn)一步提供測序儀器100的自動化控制。來自處理器的指令可通過總線傳遞至多個輸出裝置上，例如控制泵，電泳或電滲引線和儀器100的其他組件。
應(yīng)該注意的是當(dāng)在此所述的過程在程序處理器的控制下進(jìn)行時，在本發(fā)明的可選擇實施方案中，該過程可完全或部分通過任何可編程或硬編碼邏輯來實現(xiàn)，例如現(xiàn)場可編程門陣列(FPGAs)，TTL邏輯，或?qū)Ｓ眉呻娐?ASICs)。另外，所述的方法可通過程序通用計算機(jī)110組件和/或定制硬件組件的任何組合來實施。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可使用定制設(shè)計的軟件包來分析從探測單位118中獲得的數(shù)據(jù)。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，數(shù)據(jù)分析可采用數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng)110和公共軟件包來進(jìn)行?？色@得的DNA序列分析軟件的非限制性實例包括PRISM(tm)DNA測序分析軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。Sequencher(tm)package(Gene Codes，Ann Arbor，MI)，和通過National Biotechnology InformationFacility在網(wǎng)址www.nbif.org/links/l.4.l.php上獲得的多種軟件包。
* * * 按照本公開書，在此公開的所有方法和儀器100不需過多的實驗就可制成和實施。對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員很明顯地是多種變化可應(yīng)用于在此所述的方法和儀器100，不背離在此所要求的主題內(nèi)容的概念，精神和范圍。更特殊地是，很明顯地是某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的試劑可替代在此所述的試劑，只要可達(dá)到相同或相似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員很明顯的所有這些相似的替代和修飾被認(rèn)為在所要求的主題內(nèi)容的精神，范圍和概念內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一個方法，包括a)將一種或多種模板核酸分子附著于一種或多種結(jié)構(gòu)；b)從標(biāo)記的核苷酸合成一種或多種互補(bǔ)核酸；c)檢測結(jié)構(gòu)特性中的變化；d)從結(jié)構(gòu)特性的變化中鑒定被摻入的核苷酸；和e)測定模板核酸的序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)特性的變化是所述附著核酸的質(zhì)量的函數(shù)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)特性的變化是所述結(jié)構(gòu)的表面應(yīng)力的函數(shù)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)是懸臂。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)特性的變化是通過光束探測，壓電探測，壓電電阻探測或電阻探測進(jìn)行檢測的。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)特性的變化是通過結(jié)構(gòu)共振頻率或與結(jié)構(gòu)有關(guān)的電路電阻的變化來檢測的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的標(biāo)記核苷酸包括至少一種質(zhì)量標(biāo)記基團(tuán)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的每種不同類型的核苷酸包括可區(qū)別的質(zhì)量標(biāo)記基團(tuán)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述的質(zhì)量標(biāo)記基團(tuán)選自納米微粒，納米微粒聚集體，碳納米管，球殼狀碳分子，功能化的球殼狀碳分子，量子圓點，樹枝狀物，有機(jī)分子，聚合物，重原子，熒光標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記，和質(zhì)譜標(biāo)記基團(tuán)。
10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將引物與模板核酸雜交。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的標(biāo)記核苷酸與引物的3’末端通過聚合酶共價連接。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的模板核酸分子以選擇的圖案被置于結(jié)構(gòu)一部分表面上。
13.權(quán)利要求1的方法，其中在一個時間僅有單一類型的核苷酸與模板和互補(bǔ)核酸接觸。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述的四種類型核苷酸在相同的時間內(nèi)可與模板和互補(bǔ)核酸接觸。
15.一個用于核酸分析的方法，包括a)將至少一種模板核酸與一種或多種結(jié)構(gòu)附著；b)合成至少一種互補(bǔ)核酸片段，其中包括已選擇數(shù)量的標(biāo)記核苷酸；c)在摻入標(biāo)記核苷酸過程中，檢測結(jié)構(gòu)特性中的變化；和d)從結(jié)構(gòu)特性的變化中測定核酸片段的序列。
16.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括e)用未標(biāo)記的核苷酸來替代互補(bǔ)核酸片段中的標(biāo)記核苷酸；f)合成鄰近互補(bǔ)核酸片段，其中包括已選擇數(shù)量的標(biāo)記核苷酸；g)在摻入標(biāo)記核苷酸的過程中，檢測結(jié)構(gòu)特性中的變化；和h)測定鄰近互補(bǔ)核酸片段的序列。
17.權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)(e)至(h)的步驟直至獲得核酸序列。
18.權(quán)利要求16的方法，其中通過從標(biāo)記核苷酸中去掉標(biāo)記，所述的標(biāo)記核苷酸用未標(biāo)記的核苷酸替代。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)是懸臂。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的結(jié)構(gòu)特性是懸臂的偏移，懸臂的共振頻率或與懸臂有關(guān)的電路的電阻。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的懸臂的偏移，懸臂共振頻率的轉(zhuǎn)變或與懸臂有關(guān)的電路電阻的變化是標(biāo)記核苷酸質(zhì)量的函數(shù)。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述的懸臂的偏移，懸臂共振頻率的轉(zhuǎn)變或與懸臂有關(guān)的電路電阻的變化是懸臂表面應(yīng)力的函數(shù)。
23.權(quán)利要求15的方法，其中所述的模板核酸以選擇的圖案被置于結(jié)構(gòu)的一部分表面上。
24.一個儀器，包括a)一個分析室，含有一個或多個結(jié)構(gòu)；b)與所述分析室處于液體交通的一個或多個試劑容器；c)一個探測單位，與所述結(jié)構(gòu)可操作地連接；和d)一個數(shù)據(jù)處理和控制單元。
25.權(quán)利要求24的儀器，進(jìn)一步包括一種或多種附著到所述結(jié)構(gòu)上的核酸。
26.權(quán)利要求25的儀器，進(jìn)一步包括在分析室中的一種或多種聚合酶。
27.權(quán)利要求24的儀器，其中所述的結(jié)構(gòu)是懸臂。
28.權(quán)利要求24的儀器，其中所述的探測單位包括位置敏感的光探測器，壓電探測器或壓電電阻器。
29.權(quán)利要求24的儀器，其中所述的探測單位包括激光。
30.權(quán)利要求25的儀器，所述的探測單位可檢測附著于所述結(jié)構(gòu)上的核酸質(zhì)量變化和/或所述結(jié)構(gòu)的表面應(yīng)力變化。
全文摘要
本方法和儀器100涉及核酸214測序，是通過將核苷酸218摻入進(jìn)核酸鏈220中進(jìn)行的。核苷酸218的摻入可通過結(jié)構(gòu)116，212的質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的變化而檢測到。在本發(fā)明的一些實施方案中，結(jié)構(gòu)116，212由一個或多個納米級或微米級懸臂組成。在本發(fā)明的某些實施方案中，每種不同類型的核苷酸218可用較大的基團(tuán)進(jìn)行可辨別的標(biāo)記，每個摻入的核苷酸218可在核苷酸218的摻入過程中通過結(jié)構(gòu)116，212的質(zhì)量和/或表面應(yīng)力的變化來鑒定。在本發(fā)明的可選擇實施方案中，在一個時間，僅有一種類型的核苷酸218可暴露給核酸214，220。結(jié)構(gòu)116，212特性的變化可被多種方法檢測到，如壓電探測，結(jié)構(gòu)116，212共振頻率的轉(zhuǎn)變和/或位置敏感的光電探測。
文檔編號C12M1/34GK1653194SQ03811307
公開日2005年8月10日 申請日期2003年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月20日
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