專利名稱：基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，尤其是一種進(jìn)行特定物種的基因組測(cè)序、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)譜的檢測(cè)、以及各種基因組DNA(脫氧核糖核苷酸)修飾譜(如DNA甲基化譜)的檢測(cè)，屬于生物醫(yī)學(xué)核酸陣列芯片應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類基因組(測(cè)序)計(jì)劃已經(jīng)完成，后基因組計(jì)劃已步入實(shí)施。特別是人類基因組計(jì)劃完成以后，有關(guān)核酸序列數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長(zhǎng)，越來越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得以測(cè)定，為比較基因組學(xué)的研究提供了豐富的信息資源。如何對(duì)大量的生物分子信息進(jìn)行分析和比較，尋找共同的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)原理，使生物學(xué)由實(shí)驗(yàn)上升到理論，另一方面，隨著人們更深入地從分子層次上認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐將產(chǎn)生革命性的變化。在分子層次上進(jìn)行疾病的預(yù)測(cè)、診斷和治療，將根本地認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的根源，并將有希望根本認(rèn)識(shí)和治療包括癌癥在內(nèi)的重大疾病。這些生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的變革，一個(gè)根本的前提是要對(duì)大量的個(gè)體的基因組信息進(jìn)行檢測(cè)，以及對(duì)大量未知基因序列的快速測(cè)定和鑒定。高效快速地進(jìn)行大量基因組測(cè)列的測(cè)定，將加速人類對(duì)于基因組信息的基因組應(yīng)用，從而推動(dòng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。
雖然在大規(guī)模DNA測(cè)序方面人類已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步。然而，大規(guī)模個(gè)體全基因組DNA的測(cè)序，即對(duì)大量的人類個(gè)體的基因組DNA(包含有30億堿基)進(jìn)行測(cè)序，其成本仍太高。這嚴(yán)重地限制了功能基因組的研究進(jìn)展，影響到人類基因組計(jì)劃研究成果的應(yīng)用。我們知道，功能基因組研究的目的是要認(rèn)識(shí)基因組中每個(gè)核酸的生物學(xué)含義，發(fā)現(xiàn)疾病易感基因。功能基因組的研究途徑是比較基因組學(xué)，即通過比較和分析不同表型個(gè)體之間基因組序列差異，解碼基因組中每個(gè)核酸的生物學(xué)意義，發(fā)現(xiàn)功能基因，識(shí)別與疾病相關(guān)的分子遺傳信息。進(jìn)一步地，根據(jù)個(gè)體基因組信息，實(shí)現(xiàn)疾病的預(yù)測(cè)、預(yù)防和個(gè)體化治療。隨著功能基因組研究的發(fā)展以及人們對(duì)提高醫(yī)療健康水平的不懈追求，“個(gè)體化醫(yī)療”已開始進(jìn)入人們的生活。為了真正實(shí)現(xiàn)“個(gè)體化醫(yī)療”這一目標(biāo)，首先要對(duì)每個(gè)人的基因組進(jìn)行測(cè)序，找出不同個(gè)體在DNA序列上的差異與不同疾病、發(fā)育等的相關(guān)性。而對(duì)于目前的基因組測(cè)序成本而言，“個(gè)體化醫(yī)療”仍然是人類的一個(gè)遙遠(yuǎn)的夢(mèng)想。因此，如何快速、經(jīng)濟(jì)地對(duì)大量個(gè)體全基因組進(jìn)行測(cè)序?qū)⑹且粋€(gè)巨大的挑戰(zhàn)，同時(shí)也蘊(yùn)藏著巨大的商機(jī)。人們急需發(fā)展出一些快速、廉價(jià)的個(gè)體化基因信息檢測(cè)技術(shù)來縮短這個(gè)距離。
目前人們正在研究的高通量低成本DNA測(cè)序技術(shù)大體上可以分為兩類一類是延續(xù)毛細(xì)管分離DNA自動(dòng)化測(cè)序儀的技術(shù)方案，以化學(xué)降解法或雙脫氧鏈終止法為基礎(chǔ)，通過提高電泳分離和熒光檢測(cè)并行度，進(jìn)行高通量DNA序列分析。例如，陣列毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)、微流控毛細(xì)管電泳芯片技術(shù)等方法。但是，基于毛細(xì)管分離的測(cè)序技術(shù)，其提高測(cè)序通量的空間已十分有限，在測(cè)序速度和降低成本方面已經(jīng)不能滿足未來個(gè)體全因組DNA測(cè)序的要求。
另一類則為非凝膠電泳分離測(cè)序方法，主要有雜交測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法、質(zhì)譜法、核苷酸直接閱讀技術(shù)等。DNA雜交測(cè)序(Sequencing by hybridization)是八十年代末提出來的，其原理主要是應(yīng)用一組已知序列的寡核苷酸探針與未知的熒光標(biāo)記的DNA雜交，通過雜交信息來識(shí)別未知DNA序列。這種方法類似于堿基連接法，利用的是DNA鏈與互補(bǔ)序列而非錯(cuò)配序列進(jìn)行結(jié)合或雜交的趨勢(shì)。這一測(cè)序系統(tǒng)由美國(guó)生物科技公司——艾菲矩陣公司(Affymetrix)、佩爾金科學(xué)公司(Perlegen Sciences)和Illumina公司開發(fā)，已經(jīng)在商業(yè)上廣為使用，最初應(yīng)用于查找已知基因序列的變化。測(cè)序時(shí)，首先需要合成有可能與目的DNA分子相匹配的DNA短鏈，然后把它們排列在大的載玻片上。當(dāng)未知的目的DNA分子的多個(gè)拷貝分子與這種載玻片共浴時(shí)，目的DNA分子就能與載玻片上跟自身互補(bǔ)的DNA序列相結(jié)合。如果完全匹配，就會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。但由于其芯片制備的復(fù)雜性以及雜交的非特異性等因素，該方法要達(dá)到長(zhǎng)片段的測(cè)序尚有一段距離。
目前很多研究小組模仿DNA分子復(fù)制的過程，發(fā)明了合成測(cè)序方法(Sequencing by Synthesis)。當(dāng)堿基在聚合酶的作用下，加入到一條新互補(bǔ)鏈的起始端(引物)上，或者當(dāng)連接酶將它作為匹配物加以識(shí)別時(shí)，模板鏈的序列就得以揭示出來。如果將熒光分子連接到加入的堿基上，光學(xué)顯微鏡就可以檢測(cè)到它發(fā)出的顏色信號(hào)。然而該方法卻面臨著堿基的摻入效率和熒光分子間的淬滅作用而導(dǎo)致測(cè)序的長(zhǎng)度比較短。桑格(Sanger)測(cè)序法發(fā)明數(shù)十年來，一直具有準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，但所用材料昂貴、檢測(cè)費(fèi)時(shí)。因此要提高測(cè)序速度、降低測(cè)序成本，必須要做到縮小化學(xué)反應(yīng)體積，以減少化學(xué)制品用量，同時(shí)以大規(guī)模平行反應(yīng)來同步讀取數(shù)百萬個(gè)DNA片斷的序列。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對(duì)目前核酸測(cè)序成本高、速度慢等問題，提出了一種將傳統(tǒng)的桑格(Sanger)測(cè)序法和核酸微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合的DNA測(cè)序方法，即基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，該方法具有測(cè)序通量高、制備成本低、方法簡(jiǎn)單，可用于目標(biāo)核酸的直接測(cè)序檢測(cè)，具有十分重要的應(yīng)用前景和使用價(jià)值。
技術(shù)方案本發(fā)明的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，是將不同待測(cè)序的核酸片段分別固定到一塊固體基片上，形成核酸微陣列，并使不同的核酸片段都含有一段多個(gè)堿基長(zhǎng)度的相同的公共序列作為測(cè)序引物的互補(bǔ)序列；將公共測(cè)序引物與芯片雜交后，利用桑格(Sanger)末端終止法，將某一種核苷酸混合溶液一定比例標(biāo)記的ddNTP(雙脫氧核糖核苷)和對(duì)應(yīng)的未標(biāo)記的dNTP(脫氧核糖核苷)注入到上述的DNA片段微陣列芯片上進(jìn)行在片堿基終止反應(yīng)，每延伸終止一次后立即掃描一次延伸信號(hào)，得到芯片上不同樣品點(diǎn)堿基延伸信息，通過信號(hào)疊加得出每個(gè)樣品點(diǎn)上固定的核酸片段完整的序列信息。
核酸微陣列是指用機(jī)械方法將多種DNA片斷(如聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物等)定點(diǎn)固定(包括化學(xué)鍵合或者物理吸附固定)在固體在片上，使基片上每個(gè)陣列點(diǎn)為單一相同的核酸片段?；?qū)⒍喾N含有多個(gè)相同核酸片斷單分子長(zhǎng)鏈核酸(如RCA產(chǎn)物)隨機(jī)定點(diǎn)固定(包括化學(xué)鍵合或者物理吸附固定)在固體在片上，使基片上每個(gè)陣列點(diǎn)為單一分子核酸。
核苷酸混合溶液是指由一定比例的標(biāo)記的ddNTP和dNTP，該比例為1∶1～1000∶1。其中ddNTP分子標(biāo)記物是可以通過光、電、磁檢測(cè)到信號(hào)的分子。延伸反應(yīng)是指用一條通用測(cè)序引物與基片上固定的核酸片段中一段相同序列雜交后，用4種dNTP和其對(duì)應(yīng)標(biāo)記的ddNTP混合物分別進(jìn)行在片堿基延伸。其中基片上與標(biāo)記的ddNTP發(fā)生延伸反應(yīng)的核酸片段通過信號(hào)檢測(cè)被記錄下來。
基片上不同樣品點(diǎn)堿基延伸信息的疊加是指將每次延伸的信息與所加入的具體的核苷酸混合物對(duì)應(yīng)起來，然后將基片上所有樣品點(diǎn)的每次發(fā)生延伸反應(yīng)的堿基信息疊加起來，得出基片上所有的核酸片段的完整序列。
本發(fā)明涉及的是基于核酸芯片的一種測(cè)序方法，這里的核酸是指所有提取的DNA、RNA(Ribonucleic Acid核糖核酸)或它們的核酸序列擴(kuò)增(PCR(聚合酶鏈反應(yīng))、RCA(滾環(huán)反應(yīng))等)產(chǎn)物、克隆產(chǎn)物。本發(fā)明的采取以下方案實(shí)現(xiàn)的通過PCR、RCA或克隆等方法將制備的含有共同序列的核算片段固定到固相載體上制備微陣列。取四個(gè)分別標(biāo)記有A、T、C、G的PCR反應(yīng)小管，每個(gè)管中的反應(yīng)體系為dNTP/熒光標(biāo)記的ddNTP混合物(如標(biāo)記A的小管中為dATP(腺嘌呤核苷)/CY3(羰花青類熒光染料)標(biāo)記的ddATP(雙脫氧腺嘌呤核苷))、DNA聚合酶延伸體系。測(cè)序時(shí)，分別在芯片點(diǎn)樣區(qū)依次加入dATP/Cy3-ddATP(腺嘌呤核苷/熒光標(biāo)記的雙脫氧腺嘌呤核苷)、dGTP/Cy3-ddGTP(鳥嘌呤核苷/熒光標(biāo)記的雙脫氧鳥嘌呤核苷)、dCTP/Cy3-ddCTP(胞嘧啶核苷/熒光標(biāo)記的雙脫氧胞嘧啶核苷)、dTTP/Cy3-ddTTP(胸腺嘧啶核苷/熒光標(biāo)記的雙脫氧胸腺嘧啶核苷)混合物，充分反應(yīng)后，利用芯片掃描儀或熒光顯微鏡檢測(cè)各個(gè)樣品點(diǎn)的熒光信號(hào)。依次循環(huán)往復(fù)進(jìn)行不同堿基的延伸反應(yīng)，最后將每張掃描圖進(jìn)行信號(hào)分析，得出個(gè)樣品點(diǎn)的序列信息。
其具體原理為I當(dāng)加入dTTP/ddTTP混合物時(shí)，有少部分片段的第一個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddTTP而被終止，其它片段摻入了dTTP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第一個(gè)摻入堿基為T(胸腺嘧啶)；II當(dāng)加入dATP/ddATP混合物時(shí)，有少部分片段的第二個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddATP而被終止，其它片段摻入了dATP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第二個(gè)摻入堿基為A(腺嘌呤)；III當(dāng)加入dGTP/ddGTP混合物時(shí)，有少部分片段的第三個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddGTP而被終止，其它片段摻入了dGTP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第三個(gè)摻入堿基為G(鳥嘌呤)；IV當(dāng)加入dCTP/ddCTP混合物時(shí)，有少部分片段的第四個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddCTP而被終止，其它片段摻入了dCTP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第四個(gè)摻入堿基為C(胞嘧啶)。然后將各掃描圖進(jìn)行信號(hào)處理，得出待測(cè)核酸片段的序列信息。
該方法可以用于功能基因組研究，進(jìn)行特定物種的全基因組測(cè)序、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)效率的檢測(cè)、以及各種基因組DNA修飾譜(如DNA甲基化譜)的檢測(cè)。對(duì)人們?cè)谏^程的分子機(jī)制研究、基因組DNA信息的解碼、個(gè)體化醫(yī)學(xué)、疾病的預(yù)測(cè)和預(yù)防、藥物的開發(fā)和個(gè)體化等方面將具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
有益效果本發(fā)明與以往的方法相比較具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明結(jié)合了傳統(tǒng)的桑格(Sanger)測(cè)序法，技術(shù)成熟，實(shí)施簡(jiǎn)單；2、本發(fā)明結(jié)合了核酸微陣列芯片技術(shù)，可以同時(shí)對(duì)數(shù)以萬計(jì)的核酸片段進(jìn)行再測(cè)序，通量高、速度快、成本低；3、本發(fā)明利用了熒光標(biāo)記的ddNTP(雙脫氧核糖核苷酸)作為測(cè)序指示劑，避免了以往在同一條鏈上進(jìn)行多個(gè)熒光標(biāo)記的dNTP(脫氧核糖核苷酸)摻入，導(dǎo)致熒光分子間的淬滅作用而使測(cè)序信號(hào)不準(zhǔn)確。


圖1是用于雜交的DNA芯片示意圖，其中有a固體基片；b待測(cè)序的DNA分子陣列；c核酸分子單元；d待測(cè)序的核酸片段；e通用核酸片段。
圖2是固定的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序原理圖。
圖3是固定的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序原理圖。
圖4是在片延伸測(cè)序流程圖。
圖5是芯片熒光信號(hào)分析與DNA測(cè)序?qū)嵗龍D。
圖6是基因組DNA的片斷化示意圖，其中①用超聲儀隨機(jī)打斷基因組DNA；②用綠豆核酸酶消化使DNA片段平末端化；③用Lambada核酸酶適度消化使DNA片段帶有5’突出的粘性末端；④用Taq DNA聚合酶延伸DNA片段，使之形成3’端變?yōu)橹挥幸粋€(gè)堿基A突出的粘性末端。
圖7是基因組DNA的片段的環(huán)化及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)示意圖，其中甲、乙、丙分別為化學(xué)合成的寡核苷酸片段，丁為基因組片段；甲、丙分別與乙的3’和5’段互補(bǔ)，復(fù)性后形成一條5’端只有一個(gè)堿基T突出的粘性末端，片斷甲、乙的3’端分別標(biāo)記一個(gè)磷酸基團(tuán)，片斷丙的5’端標(biāo)記一個(gè)氨基連接集團(tuán)。
具體實(shí)施例方式
以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明(實(shí)例中所有的酶均來自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司)。
圖1其中(I)用于雜交的DNA芯片示意圖；II固定的PCR產(chǎn)物或克隆產(chǎn)物；III固定的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物。其中a固體基片；b待測(cè)序的DNA分子陣列；c核酸分子單元；d待測(cè)序的核酸片段；e通用核酸片段。
圖2固定的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序原理圖。I當(dāng)加入dTTP/ddTTP混合物時(shí)，有少部分片段的第一個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddTTP而被終止，其它片段摻入了dTTP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第一個(gè)摻入堿基為T；II當(dāng)加入dATP/ddATP混合物時(shí)，有少部分片段的第二個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddATP而被終止，其它片段摻入了dATP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第二個(gè)摻入堿基為A；III當(dāng)加入dGTP/ddGTP混合物時(shí)，有少部分片段的第三個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddGTP而被終止，其它片段摻入了dGTP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第三個(gè)摻入堿基為G；IV當(dāng)加入dCTP/ddCTP混合物時(shí)，有少部分片段的第四個(gè)堿基摻入了熒光標(biāo)記的ddCTP而被終止，其它片段摻入了dCTP后可以繼續(xù)延伸下一個(gè)堿基，檢測(cè)熒光信號(hào)，得出第四個(gè)摻入堿基為T。
圖3固定的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序原理圖(圖解同圖2)。不同的是滾環(huán)產(chǎn)物為同一DNA片段的重復(fù)序列組成，可以在同一條鏈上進(jìn)行多次末端終止反應(yīng)。
圖4在片延伸測(cè)序流程圖。I將待測(cè)序的核酸片段固定制備微陣列；II加入A混合物(dATP和熒光標(biāo)記的ddATP混合物)，經(jīng)DNA聚合酶延伸后進(jìn)行熒光掃描；III加入T混合物(dTTP和熒光標(biāo)記的ddTTP混合物)，經(jīng)DNA聚合酶延伸后進(jìn)行熒光掃描；IV加入C混合物(dCTP和熒光標(biāo)記的ddCTP混合物)，經(jīng)DNA聚合酶延伸后進(jìn)行熒光掃描；V加入G混合物(dGTP和熒光標(biāo)記的ddGTP混合物)，經(jīng)DNA聚合酶延伸后進(jìn)行熒光掃描。各圖中X軸表示延伸的熒光信號(hào)值，Y軸表示測(cè)序結(jié)果。
圖5芯片熒光信號(hào)分析與DNA測(cè)序?qū)嵗龍D。I兩條不同的固定化PCR產(chǎn)物分別加入A、T、C、G、C的dNTP/ddNTP混合物后熒光掃描圖；II不同堿基摻入與芯片的熒光信號(hào)變化。當(dāng)加入A混合物時(shí)，PCR產(chǎn)物1有熒光信號(hào)，PCR產(chǎn)物2的點(diǎn)沒有熒光信號(hào)，說明PCR產(chǎn)物2的第一個(gè)堿基為A；當(dāng)加入T混合物時(shí)，PCR產(chǎn)物1和2的點(diǎn)都有熒光信號(hào)的增加，說明PCR產(chǎn)物1的第一個(gè)堿基和PCR產(chǎn)物2的第二個(gè)堿基都為T；當(dāng)加入C混合物時(shí)，PCR產(chǎn)物1有熒光信號(hào)增加，PCR產(chǎn)物2的點(diǎn)卻沒有熒光信號(hào)增加，說明PCR產(chǎn)物1的第二個(gè)堿基為C；當(dāng)加入G混合物時(shí)，PCR產(chǎn)物1沒有熒光信號(hào)增加，而PCR產(chǎn)物2有熒光信號(hào)增加，說明PCR產(chǎn)物2的第三個(gè)堿基為G；當(dāng)再次加入C混合物時(shí)，PCR產(chǎn)物1和2的都有熒光信號(hào)增加，說明PCR產(chǎn)物1的第三個(gè)堿基和PCR產(chǎn)物2的第四個(gè)堿基為C；測(cè)序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物1的前3個(gè)堿基為TCC，而PCR產(chǎn)物2的前4個(gè)堿基為ATGC。
圖6基因組DNA的片斷化。其中①用超聲儀隨機(jī)打斷基因組DNA；②用綠豆核酸酶消化使DNA片段平末端化；③用Lambada核酸酶適度消化使DNA片段帶有5’突出的粘性末端；④用Taq DNA聚合酶延伸DNA片段，使之形成3’端變?yōu)橹挥幸粋€(gè)堿基A突出的粘性末端。
圖7基因組DNA的片段的環(huán)化及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。其中甲、乙、丙分別為化學(xué)合成的寡核苷酸片段，丁為基因組片段。(I)片斷甲、丙分別與乙的3’和5’段互補(bǔ)，復(fù)性后形成一條5’端只有一個(gè)堿基T突出的粘性末端，其中片斷甲、乙的3’端分別標(biāo)記一個(gè)磷酸基團(tuán)，片斷丙的5’端標(biāo)記一個(gè)氨基連接集團(tuán)；(II)利用T/A互補(bǔ)，在DNA連接酶的作用下，將基因組DNA片段環(huán)化；(III)然后在Φ29DNA聚合酶反應(yīng)體系中以片段甲為引物按照箭頭的方向進(jìn)行DNA滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(Rolling Cycle Amplification，RCA)，得到單鏈DNA(其結(jié)構(gòu)如圖1-III)。
實(shí)施例1.固定的PCR產(chǎn)物制備的核酸微陣列芯片進(jìn)行測(cè)序1、通用引物PCR產(chǎn)物的制備以擴(kuò)增為例，欲測(cè)出乙肝病毒DNA片段78-257的核酸序列，具體方法為5’...GGCATGGACATTGATCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCCTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCGTCGGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTATATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAACATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAAGCAAGCAATT...3’，設(shè)計(jì)一對(duì)特異擴(kuò)增引物，P15’...NH2-TTTTTTTTTTCCGTACCTGTAACTAG...3’，
P23’...CTCAAGCAAGCAATTGCATGGCCACGGGCGGAC...5’.斜體部分為特異性引物序列，黑體部分為通用序列，即所有PCR下游引物的5，端都帶有此片段。利用這對(duì)引物在常規(guī)PCR擴(kuò)增體系中將乙肝病毒78-257片段擴(kuò)增出來。
2、基因芯片的制備將上步的PCR產(chǎn)物分離純化，然后溶入碳酸鹽緩沖液中，利用點(diǎn)樣的方法將PCR產(chǎn)物固定到氨基硅烷化處理的玻片上，37℃水化2小時(shí)。
3、固定化PCR產(chǎn)物的在片延伸測(cè)序?qū)⒅苽浜玫奈㈥嚵性?0M氫氧化鈉溶液中浸泡10分鐘，對(duì)雙鏈產(chǎn)物進(jìn)行變性，使固定的PCR產(chǎn)物變成單鏈DNA分子。然后將化學(xué)合成的與固定PCR產(chǎn)物通用序列互補(bǔ)的DNA片段(3’...GTCCGCCCGTGGCCATGC...5’)以500nM的濃度溶于雜交緩沖液(10×SSC、50％去離子甲酰胺、0.2％SDS、100ug/μl剪切的的鮭魚精DNA)中，在37℃下與芯片雜交1小時(shí)。雜交結(jié)束后分別用2×SSC、0.2×SSC/0.5％SDS及去離子蒸餾水各洗滌5分鐘，用氮?dú)饬鞔蹈刹Ｆ笥糜诤筮叺脑谄由旆磻?yīng)。
取四個(gè)分別標(biāo)記有A、T、C、G的PCR反應(yīng)小管，每個(gè)管中的反應(yīng)體系為100nM dNTP/CY3-ddNTP混合物(如標(biāo)記A的小管中為dATP/CY3-ddATP)、TherminatorTMDNA聚合酶0.U/μl、20mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％.Triton X-100。由于目前大部分都是DNA序列的再測(cè)序，可以根據(jù)已知的DNA序列，如圖2所示，分別將含有不同單體混合物的反應(yīng)液加到芯片上，50℃反應(yīng)20分鐘。然后分別用2×SSC、0.2×SSC/0.5％SDS及去離子蒸餾水各洗滌5分鐘，用氮?dú)饬鞔蹈刹Ｆ笥糜诤筮叺脑谄由旆磻?yīng)。如圖4及圖5，每次延伸后掃描并分析芯片上各個(gè)點(diǎn)的熒光信號(hào)的變化，得出每步延伸的堿基信息，達(dá)到測(cè)序的目的。
實(shí)施例2.固定的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備的核酸微陣列芯片進(jìn)行測(cè)序1、應(yīng)用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備全基因組的單分子多拷貝DNA片段微陣列芯片(如圖1-III)。
基因組DNA的片斷化如圖6所示，①將提取的基因組DNA，用超聲儀在一定的強(qiáng)度下將基因組DNA打碎為100～500bp的片段，取1μl的產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，檢測(cè)基因組DNA超聲片斷化效果；②取一定量的超聲產(chǎn)物，加入適量的綠豆核酸酶體系，30℃反應(yīng)30～60分鐘，由于該酶具有去除單鏈3′或5′突出端的特性，將所有的DNA片段平末端化，然后80℃15分鐘失活綠豆核酸酶；③在反應(yīng)產(chǎn)物中加入適量的Lambada DNA核酸酶體系，30℃反應(yīng)30～60分鐘，由于該酶可以作用于雙鏈DNA，沿5′→3′方向漸進(jìn)性催化去除5′單核苷酸，將所有的DNA片段消化成5’突出的粘性末端，80℃15分鐘失活Lambada DNA核酸酶；④然后在上步的反應(yīng)產(chǎn)物中加入適量的TaqDNA聚合酶反應(yīng)體系，72℃反應(yīng)5～10分鐘，由于該酶的延伸產(chǎn)物的3’末端通常為單個(gè)堿基A。
基片的表面氨基硅烷化修飾(A)選擇大小合適的低熒光背景的全反射玻片，在80℃的piranha洗液(濃硫酸與30％的H2O2按體積比7∶3混合)超聲洗滌2小時(shí)，然后用洗滌劑徹底清洗；用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘干備用；(B)硅烷化處理在上步洗滌干凈的載玻片置于含有2％APTES(3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5～10分鐘，用丙酮、乙醇、去離子蒸餾水徹底清洗各兩次，氮?dú)獯蹈桑?80℃烘烤1～2小時(shí)。(C)氨基化處理將硅烷化處理的玻片置于含5％的戊二醛(50％水溶液，Amresco)磷酸緩沖液(0.1M批H7.4)中浸泡2小時(shí)，用丙酮、乙醇、去離子蒸餾水徹底清洗各3次，氮?dú)獯蹈桑?℃保存?zhèn)溆谩?D)每處理一張玻片后都必須在高靈敏度光學(xué)顯微鏡上進(jìn)行熒光背景檢測(cè)，以防處理效果不好所導(dǎo)致的熒光背景對(duì)后繼單熒光分子檢測(cè)的干擾。
基因組DNA片段的環(huán)化及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)基因組DNA片斷的環(huán)化及RCA擴(kuò)增如圖7所示甲、乙、丙分別為化學(xué)合成的寡核苷酸片段，丁為基因組片段。(I)片斷甲、丙分別與乙的3’和5’段互補(bǔ)，復(fù)性后形成一條5’端只有一個(gè)堿基T突出的粘性末端，其中片斷甲、乙的3’端分別標(biāo)記一個(gè)磷酸基團(tuán)，片斷丙的5’端標(biāo)記一個(gè)氨基連接集團(tuán)；(II)利用T/A互補(bǔ)，在DNA連接酶的作用下，將基因組DNA片段環(huán)化；(III)然后在Φ29DNA聚合酶反應(yīng)體系中以片段甲為引物按照箭頭的方向進(jìn)行DNA滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(Rolling Cycle Amplification，RCA)，得到單鏈DNA(其結(jié)構(gòu)如圖1-III)。
單分子多拷貝基因組DNA片段微陣列芯片的制備(A)用DNA純化試劑盒純化RCA反應(yīng)產(chǎn)物，然后溶入碳酸鹽緩沖液(pH 9.0)，用紫外分光光度計(jì)確定每個(gè)稀釋梯度的DNA分子濃度；(B)將溶入RCA產(chǎn)物的碳酸鹽緩沖液均勻平鋪到處理過的全反射玻片中間1cm×1cm的表面上，自然晾干后37℃水化過夜；最后將玻片用2×SSC/0.1％SDS及去離子蒸餾水分別徹底清洗2遍，便制備成單分子多拷貝基因組DNA片段微陣列芯片。
2、在片延伸測(cè)序(如圖3)具體的反應(yīng)條件同案例一，其過程如下(A)在TherminatorTMDNA聚合酶體系中依次加入5ul由一種熒光標(biāo)記核苷ddNTP和該核苷的dNTP溶液組成的延伸體系；(B)將固定有DNA片段的全反射玻片置于檢測(cè)平臺(tái)上，通過計(jì)算機(jī)控制平臺(tái)軟件，預(yù)設(shè)好熒光標(biāo)記的核苷單體(A、T、C、G)混合物的加樣順序，按照預(yù)設(shè)程序，通過微流體裝置，每摻入一個(gè)熒光單體后，將殘留的延伸體系清洗掉，在高靈敏度熒光顯微鏡下檢測(cè)各區(qū)域點(diǎn)上的表面熒光信號(hào)強(qiáng)度變化情況，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度差異確定DNA序列上的核苷酸信息。測(cè)序循環(huán)結(jié)束后，將檢測(cè)到的熒光圖片用圖像處理軟件進(jìn)行分析，便可以同時(shí)得到所有固定的單分子DNA序列信息，然后通過生物信息學(xué)的方法，拼接為全長(zhǎng)序列。
權(quán)利要求
1.一種基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于將不同待測(cè)序的核酸片段分別固定到一塊固體基片上，形成核酸微陣列，并使不同的核酸片段都含有一段多個(gè)堿基長(zhǎng)度的相同的公共序列作為測(cè)序引物的互補(bǔ)序列；公共測(cè)序引物與芯片雜交后，將某一種核苷酸混合溶液注入到上述的核酸片段微陣列芯片上進(jìn)行在片堿基延伸終止反應(yīng)，每延伸終止一次后立即掃描一次延伸信號(hào)，得到芯片上不同樣品點(diǎn)堿基延伸信號(hào)，通過對(duì)每個(gè)樣品點(diǎn)堿基延伸信號(hào)疊加得出對(duì)應(yīng)樣品點(diǎn)上固定的核酸片段完整的序列信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于核酸微陣列是指用機(jī)械方法將多種DNA片段定點(diǎn)固定在固體在片上，使基片上每個(gè)陣列點(diǎn)為單一相同的核酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于固定的待測(cè)序的核酸片段為單鏈核酸片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于固定的待測(cè)序的核酸片段為雙鏈DNA，其中只有一條單鏈與基片上的活性基團(tuán)連接，未連接的核酸單鏈可以通過變性從基片表面除去。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于核酸微陣列是指將多種含有多個(gè)相同核酸片段單分子長(zhǎng)鏈核酸隨機(jī)定點(diǎn)固定在固體在片上，使基片上每個(gè)陣列點(diǎn)為單一分子核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于核苷酸混合溶液是指由一定比例的標(biāo)記的ddNTP和dNTP，該比例為1∶1～1000∶1；其中ddNTP分子標(biāo)記物是可以通過光、電、磁檢測(cè)到信號(hào)的分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于延伸終止反應(yīng)是指用一條通用測(cè)序引物與基片上固定的核酸片段中一段相同序列雜交后用4種dNTP和其對(duì)應(yīng)標(biāo)記的ddNTP混合物分別進(jìn)行在片堿基延伸；其中基片上與標(biāo)記的ddNTP發(fā)生延伸反應(yīng)的核酸片段通過信號(hào)檢測(cè)被記錄下來。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列芯片的核酸測(cè)序方法，其特征在于樣品點(diǎn)堿基延伸信號(hào)疊加是指將每次延伸的信息與所加入的具體的核苷酸混合物對(duì)應(yīng)起來，然后將基片上所有樣品點(diǎn)的每次發(fā)生延伸反應(yīng)的堿基信息疊加起來，得出基片上所有的核酸片段的完整序列。
全文摘要
基于核酸微陣列芯片的核酸測(cè)序方法是一種進(jìn)行特定物種的基因組測(cè)序、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)譜的檢測(cè)、以及各種基因組DNA修飾譜的檢測(cè)，將不同待測(cè)序的DNA片段分別固定到一塊固體基片上，形成核酸微陣列，并使每個(gè)DNA片段都含有相同的公共序列作為測(cè)序引物的互補(bǔ)序列。將公共測(cè)序引物與芯片雜交后，利用Sanger末端終止法，通過微流控裝置將某一種核苷酸混合溶液按一定比例的熒光標(biāo)記ddNTP和dNTP，注入到上述的DNA片段微陣列芯片上進(jìn)行在片堿基終止反應(yīng)，每延伸終止一次后立即掃描一次熒光信號(hào)，得到芯片上不同樣品點(diǎn)堿基延伸信息。最后利用圖像處理軟件將每張測(cè)序圖進(jìn)行疊加，得出每個(gè)樣品點(diǎn)上固定的核酸片段完整的序列信息。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1932033SQ20061009637
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月22日
發(fā)明者白云飛, 肖鵬峰, 涂景, 呂華, 陸祖宏 申請(qǐng)人:東南大學(xué)