專利名稱：多肽和生物合成途徑的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的相互參照此專利申請(qǐng)要求2002年4月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)60/374,831的優(yōu)先權(quán)。
領(lǐng)域此說明書提供的多肽和生物合成途徑用于生成吲哚-3-丙酮酸、2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)和/或monatin。
背景吲哚丙酮酸吲哚-3-丙酮酸是強(qiáng)抗氧化劑，它被認(rèn)為在具有高氧濃度的組織中抵消氧化應(yīng)激(Politi等《色氨酸研究的最新進(jìn)展》(Recent advances in TryptophanResearch)，G.A.Filippini等主編.Plenum Press，New York，1996，291-8頁)。吲哚丙酮酸也是生成吲哚-乙酸(IAA)途徑中的中間物，IAA是主要的植物生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)素(可擴(kuò)散生長(zhǎng)促進(jìn)因子)。在生理過程范圍中亞微克量的IAA有活性，包括頂端優(yōu)勢(shì)、向性、枝條伸長(zhǎng)、誘導(dǎo)形成的層細(xì)胞分裂和發(fā)根。合成的生長(zhǎng)素用于園藝以誘導(dǎo)生根和促進(jìn)果實(shí)的種植和發(fā)育。高濃度的合成生長(zhǎng)素是抗闊葉植物的有效除草劑。認(rèn)為發(fā)酵產(chǎn)生的天然生長(zhǎng)素比化學(xué)生成的除草劑對(duì)環(huán)境更有利。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物在1999年的全球銷售額為4億磅(14億美元)。
有關(guān)吲哚乙酸和其衍生物的一些專利的例子包括美國(guó)專利號(hào)5,843,782玫瑰植物的微繁殖、用于培養(yǎng)基的生長(zhǎng)素和美國(guó)專利號(hào)5,952,231玫瑰植物的微繁殖。
除了植物相關(guān)的應(yīng)用之外，吲哚乙酸用于藥物應(yīng)用。例如，美國(guó)專利號(hào)5,173,497《制備α-氧吡咯并[2，3-B]吲哚乙酸和衍生物的方法》建議這些化合物用于治療記憶損傷，如與阿爾茨海默氏病和老年性癡呆相關(guān)的疾病。美國(guó)專利號(hào)5,173,497中提出的機(jī)制是這些化合物抑制多肽乙酰膽堿酯酶且增加腦中的乙酰膽堿水平。
吲哚-3-甲醇通過過氧化物酶催化的氧化從吲哚-3-乙酸中生成，并易轉(zhuǎn)變成二吲哚甲烷。報(bào)導(dǎo)這2種化合物去除毒素且促進(jìn)生成有益女性健康的激素。
色氨酸衍生物氯化D-色氨酸鑒定為非營(yíng)養(yǎng)甜味劑，尋求其它衍生物的興趣也日益增加。Monatin是天然甜味劑，其組成類似氨基酸色氨酸。它能提取自南非灌木硬殼冬青(Sclerochiton ilicifolius)的根樹皮，有希望作為食物和飲料業(yè)的高強(qiáng)度甜味劑。有關(guān)monatin的一些專利的例子包括美國(guó)專利號(hào)5994559合成monatin一種高強(qiáng)度天然甜味劑、美國(guó)專利號(hào)4975298 3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羥基-丁基-4-基)-吲哚化合物、美國(guó)專利號(hào)5128164用于人消耗的含3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羥基-丁基-4-基)-吲哚化合物的組合物；美國(guó)專利號(hào)5128482生成3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羥基-丁基-4-基)-吲哚的方法。
這里所述的monatin的一些前體也能用作合成甜味劑或monatin衍生物合成中的中間物。
概要說明書提供一些生物合成途徑用于從葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或通過monatin前體如吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中產(chǎn)生monatin。公開了多肽和核酸序列可用于產(chǎn)生monatin、吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。
Monatin可通過吲哚-3-丙酮酸、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(monatin前體，MP，monatin的α酮式)、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖(

圖1)生成。公開了生成或制備monatin或圖1-3和11-13所示其中間物的方法，包括將底物轉(zhuǎn)變成第一種產(chǎn)物，隨后使第一種產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成第2種產(chǎn)物，等等，直到產(chǎn)生所需終產(chǎn)物。
圖1-3和11-13以框顯示潛在的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物。例如，從一種產(chǎn)物到另一種產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變能用這些方法進(jìn)行，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到MP、MP到monatin或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。這些轉(zhuǎn)變可用化學(xué)方法或生物學(xué)方法促進(jìn)。術(shù)語“轉(zhuǎn)變”指在將第一種中間物轉(zhuǎn)變成第2種中間物的反應(yīng)中使用化學(xué)方法或多肽。術(shù)語“化學(xué)轉(zhuǎn)變”指不由多肽活性促進(jìn)的反應(yīng)。術(shù)語“生物轉(zhuǎn)變”指由多肽活性促進(jìn)的反應(yīng)。轉(zhuǎn)變可體內(nèi)或體外發(fā)生。當(dāng)使用生物轉(zhuǎn)變時(shí)，多肽和/或細(xì)胞能固定于支持物如化學(xué)附著于聚合物支持物。轉(zhuǎn)變可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何反應(yīng)器完成，例如在分批或連續(xù)反應(yīng)器中。
提供的方法包括使第一種多肽接觸底物并產(chǎn)生第一種產(chǎn)物，隨后使生成的第一種產(chǎn)物接觸第2種多肽并產(chǎn)生第2種產(chǎn)物，然后使生成的第2種產(chǎn)物接觸第3種多肽并產(chǎn)生第3種產(chǎn)物，例如monatin。使用的多肽和生成的產(chǎn)物示于圖1-3和11-13。
公開了多肽和其編碼序列，它們能用于進(jìn)行圖1-3和11-13所示的轉(zhuǎn)變。在一些例子中，具有1個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變的多肽用于產(chǎn)生monatin，點(diǎn)突變可修飾底物特異性和/或多肽活性。
公開了生成monatin的分離和重組細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，如植物、動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、藻類、古菌或真菌細(xì)胞。
在一個(gè)特定例子中，揭示的細(xì)胞包括一種或多種下列活性，例如2種或3種或多種下列活性色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無EC號(hào)，Hadar等，J.Bacteriol 1251096-1104，1976和Furuya等，BiosciBiotechnol Biochem 641486-93，2000)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(EC 4.1.2.-)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Kohiba和Mito，《第8屆國(guó)際維生素B6和羰基催化討論會(huì)會(huì)議錄》(Proceedings of 8thInternational Symposium on VitaminB6and Carbonyl Catalysis)，Osaka，Japan 1990)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)和/或谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)。
在另一個(gè)例子中，細(xì)胞包括一種或多種下列活性，例如2種或多種或者3種或多種下列活性吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羥苯基丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶和/或D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外，揭示的細(xì)胞可包括一種或多種下列活性，例如2種或多種或者3種或多種下列活性色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無EC號(hào))、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)、吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羥苯基丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)和/或D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
能生成Monatin的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接觸第一種多肽，其中第一種多肽將色氨酸和/或吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸可用作轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸的底物；本領(lǐng)域技術(shù)人員理解選擇用于此步驟的多肽理想地表現(xiàn)出適當(dāng)特異性)，所得吲哚-3-丙酮酸接觸第2種多肽，其中第2種多肽將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接觸第3種多肽，其中第3種多肽將MP轉(zhuǎn)變成monatin。能用于這些轉(zhuǎn)變的示范多肽示于圖2和3。
發(fā)明的另一方面提供組合物如MP、含至少2種多肽或者有時(shí)至少3種或至少4種多肽的細(xì)胞，多肽在至少一種外源核酸序列中編碼。
說明書的這些和其它方面通過下列詳細(xì)描述和說明性例子是顯而易見的。
附圖的概述圖1顯示用于生成monatin和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑。一種途徑經(jīng)色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一種經(jīng)吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。隨后經(jīng)2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)生成Monatin。
框中所示化合物是生物合成途徑中生成的底物和產(chǎn)物。
與箭頭相鄰的組合物是輔因子或可在底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物期間使用的反應(yīng)物。所用輔因子或反應(yīng)物取決于生物合成途徑的特定步驟使用的多肽。輔因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不取決于多肽的反應(yīng)，因此僅提供PLP可從底物進(jìn)行到產(chǎn)物。
圖2是使用MP中間物的生物合成途徑的更詳細(xì)圖。途徑中各步驟的底物以框顯示。允許底物間轉(zhuǎn)變的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過其普通名稱和酶分類(EC)號(hào)描述。
圖3顯示將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑的更詳細(xì)圖。底物以框顯示，允許底物間轉(zhuǎn)變的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過其普通名稱和酶分類(EC)號(hào)描述。
圖4顯示一種經(jīng)化學(xué)方法產(chǎn)生MP的可能反應(yīng)。
圖5A和5B是色譜圖，顯示LC/MS鑒定的酶法生成的monatin。
圖6是酶法合成monatin的電噴射質(zhì)譜。
圖7A和7B顯示LC/MS/MS子離子分析酶混合物中生成的monatin的色譜圖。
圖8是色譜圖，顯示酶法生成monatin的高分辨質(zhì)譜測(cè)量。
圖9A-9C是色譜圖，顯示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成monatin的手性分離。
圖10是柱狀圖，顯示IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌細(xì)胞中生成的相對(duì)monatin量。(-)表示缺乏底物加入(不加入色氨酸或丙酮酸鹽)。
圖11-12是示意圖，顯示用于增加monatin產(chǎn)量的途徑，monatin產(chǎn)生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
圖13是示意圖，顯示能用于增加monatin產(chǎn)量的途徑，monatin產(chǎn)生白色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
序列列表所附序列列表中列出的核酸和氨基酸序列用核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的3字母密碼顯示。僅顯示各核酸序列的一條鏈，但通過參考所示鏈認(rèn)為包括互補(bǔ)鏈。
SEQ ID NOS1和2分別顯示來自苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的轉(zhuǎn)氨酶的核酸和氨基酸序列(tatA基因，文獻(xiàn)中稱為酪氨酸或芳族轉(zhuǎn)氨酶)。
SEQ ID NOS3和4分別顯示來自類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)(2.4.1)的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的核酸和氨基酸序列(與通過基因組軟件預(yù)測(cè)為“天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶”的tatA(SEQ ID NOS1和2)同源)。
SEQ ID NOS5和6分別顯示來自類球紅細(xì)菌(35053)的轉(zhuǎn)氨酶的核酸和氨基酸序列(新的，在2.4.1序列SEQ ID NOS 3和4基礎(chǔ)上克隆)。
SEQ ID NOS7和8分別顯示來自碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的廣底物轉(zhuǎn)氨酶(bsat)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS9和10分別顯示來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS11和12分別顯示來自嗜淀粉乳桿菌(L.amylovorus)的芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列(經(jīng)同源性鑒定為芳族轉(zhuǎn)氨酶)。
SEQ ID NOS13和14分別顯示來自類球紅細(xì)菌(35053)的多底物轉(zhuǎn)氨酶(msa)的核酸和氨基酸序列(通過與登錄號(hào)AAAE01000093.1，bp 14743-16155和登錄號(hào)ZP00005082.1的同源性鑒定為多底物轉(zhuǎn)氨酶)。
SEQ ID NOS15和16顯示用于克隆枯草芽孢桿菌D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(dat)序列的引物。
SEQ ID NOS17和18顯示用于克隆苜蓿根瘤菌tatA序列的引物。
SEQ ID NOS19和20顯示用于克隆枯草芽孢桿菌araT轉(zhuǎn)氨酶序列的引物。
SEQ ID NOS21和22顯示用于克隆類球紅細(xì)菌(2.4.1和35053)多底物轉(zhuǎn)氨酶序列的引物。
SEQ ID NOS23和24顯示用于克隆碩大利什曼原蟲bsat序列的引物。
SEQ ID NOS25和26顯示用于克隆嗜淀粉乳桿菌araT序列的引物。
SEQ ID NOS27和28顯示用于克隆類球紅細(xì)菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物。
SEQ ID NOS29和30顯示用于克隆大腸桿菌(E.coli)aspC序列(基因序列Genbank登錄號(hào)AE000195.1，蛋白序列Genbank登錄號(hào)AAC74014.1)的引物。
SEQ ID NOS31和32分別顯示來自大腸桿菌的芳族轉(zhuǎn)氨酶(tyrB)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS33和34顯示用于克隆大腸桿菌tyrB序列的引物。
SEQ ID NOS35-40顯示用于克隆多肽的引物，多肽具有4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(KHG)(EC 4.1.3.16)活性。
SEQ ID NOS41和42顯示的核酸序列分別來自大腸桿菌的色氨酸酶(tna)和來自弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter.freundii)的酪氨酸酚-裂合酶(tpl)，它們編碼蛋白P00913(GI401195)和P31013(GI401201)。
SEQ ID NOS43-46顯示用于克隆色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物。
SEQ ID NOS47-54顯示用于突變色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶多肽的引物。
SEQ ID NOS55-64顯示用于克隆多肽的引物，多肽具有4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.17)活性。
SEQ ID NOS65和66分別顯示來自睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni)的4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(proA)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS67-68顯示引物，用于克隆操縱子中睪丸酮叢毛單胞菌4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(proA)，操縱子具有pET30 Xa/LIC中的大腸桿菌aspC。
SEQ ID NOS69-72顯示用于克隆大腸桿菌aspC和pESC-his中睪丸酮叢毛單胞菌proA的引物。
SEQ ID NOS73-74顯示加入引物的5’末端的序列，用于克隆本文所示基因。
一些實(shí)施方案的詳細(xì)描述縮寫和術(shù)語提供下列術(shù)語和方法的解釋以更好地描述本說明書并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。如本文所用，“包含”指“包括”且單數(shù)形式“a”、“an”或“the”包括復(fù)數(shù)參考物，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，提到“包含蛋白”，包括一種或多種這類蛋白，提到“包含細(xì)胞”，包括1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等。
除非另有解釋，本文所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與此說明書所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。盡管與本文所述類似或相等的方法和材料能用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，適當(dāng)方法和材料描述于下。材料、方法和例子僅用于闡明且不想限制。說明書的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從下列詳細(xì)描述和權(quán)利要求中是顯而易見的。
cDNA(互補(bǔ)DNA)缺乏內(nèi)部、非編碼區(qū)段(內(nèi)含子)和決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列的DNA片段。能通過反轉(zhuǎn)錄從提取自細(xì)胞的信使RNA在實(shí)驗(yàn)室中合成的cDNA。
保守取代1個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(例如2、5或10個(gè)殘基)具有類似生化性質(zhì)的氨基酸殘基。通常，保守取代對(duì)所得多肽活性的影響小或沒有。例如，包括1個(gè)或多個(gè)保守取代的色氨酸轉(zhuǎn)氨酶多肽理想地保持色氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性。可通過操作編碼所用多肽的核苷酸序列生成含1個(gè)或多個(gè)保守取代的多肽，例如標(biāo)準(zhǔn)方法如定點(diǎn)誘變或PCR。
取代變體中去除至少氨基酸序列中的1個(gè)殘基且此位置中插入1個(gè)不同殘基?？扇〈鞍字性及被岵⒄J(rèn)為是保守取代的氨基酸例子包括絲氨酸或蘇氨酸取代丙氨酸；谷氨酰胺、組氨酸或賴氨酸取代精氨酸；谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、組氨酸天冬氨酸、取代天冬酰胺；天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺取代天冬氨酸；絲氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺；天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸或天冬氨酸取代谷氨酸；脯氨酸取代甘氨酸；天冬酰胺、賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、酪氨酸取代組氨酸；亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代異亮氨酸；異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸取代賴氨酸；異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；蘇氨酸、丙氨酸取代絲氨酸；絲氨酸或丙氨酸取代蘇氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；組氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸取代纈氨酸。
關(guān)于保守取代的進(jìn)一步信息可發(fā)現(xiàn)于Ben-Bassat等，(J.Bacteriol.169751-7，1987)、O’Regan等，(Gene 77237-51，1989)、Sahin-Toth等，(Protein Sci.3240-7，1994)、Hochuli等，(Bio/Technology 61321-5，1998)、WO 00/67796(Curd等)和遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)課本。
外源如本文所用，關(guān)于核酸和特定細(xì)胞的術(shù)語“外源”指不是在自然界中發(fā)現(xiàn)那樣起源自特定細(xì)胞的任何核酸。因此，認(rèn)為非天然產(chǎn)生的核酸一旦導(dǎo)入細(xì)胞，它對(duì)細(xì)胞是外源的。天然產(chǎn)生的核酸也可對(duì)特定細(xì)胞外源。例如，一旦染色體導(dǎo)入Y的細(xì)胞，分離自人X的細(xì)胞的完整染色體對(duì)于人Y的細(xì)胞是外源性核酸。
功能相等具有相同功能。在酶方面，功能相等分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通過酶序列中的序列改變提供功能等價(jià)物，其中有1個(gè)或多個(gè)序列改變的肽保持未改變肽的功能，從而它保留其酶活性。在一個(gè)特定例子中，色氨酸轉(zhuǎn)氨酶功能等價(jià)物保持使色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸的能力。
序列改變的例子包括但不限于保守取代、缺失、突變、移碼和插入。在一個(gè)例子中，特定多肽結(jié)合抗體，功能等價(jià)物是結(jié)合相同抗體的多肽。因此，功能等價(jià)物包括具有結(jié)合特異性與多肽相同的肽，且能用作取代多肽的試劑。在一個(gè)例子中，功能等價(jià)物包括多肽，其中結(jié)合序列不連續(xù)，抗體結(jié)合線性抗原表位。因而，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO12的氨基酸1-10)，功能等價(jià)物包括不連續(xù)抗原表位，可表示如下(**＝任何數(shù)量的間插氨基酸)NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH。在此例子中，如果多肽的3維結(jié)構(gòu)能使它結(jié)合單克隆抗體，此抗體結(jié)合SEQ ID NO12的氨基酸1-10，則多肽與SEQ ID NO12的氨基酸1-10功能相等。
雜交如本文所用，術(shù)語“雜交”指測(cè)試2種核酸分子的核苷酸序列中互補(bǔ)性的方法，以互補(bǔ)單鏈DNA和/或RNA形成雙鏈分子的能力為基礎(chǔ)。核酸雜交技術(shù)能用于在本發(fā)明范圍內(nèi)獲得分離的核酸。簡(jiǎn)要地，與SEQ ID NO11所列序列有一些同源性的任何核酸可用作探針以通過在中等到高度嚴(yán)格的條件下雜交來鑒定類似核酸。一旦鑒定，隨后可純化核酸、測(cè)序并分析以確定它是否在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
雜交能分別通過Southern或Northern分析進(jìn)行以鑒定與探針雜交的DNA或RNA序列。標(biāo)記探針可用生物素、洋地黃毒苷、多肽或放射性同位素如32P。待分析的DNA或RNA可在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)至硝化纖維、尼龍或其它合適的膜，用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與探針雜交，如Sambrook等，(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY的7.39-7.52部分所述。通常，探針至少約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。例如，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO11所列20個(gè)連續(xù)核苷酸序列的探針能用于鑒定相同或類似核酸。此外，能使用比20個(gè)核苷酸長(zhǎng)或短的探針。
本發(fā)明也提供至少約12個(gè)堿基長(zhǎng)度(如至少約13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000個(gè)堿基長(zhǎng)度)的分離的核酸序列并在雜交條件下與有SEQ ID NO11所列序列的核酸的有義或反義鏈雜交。雜交條件可以是中等或高度嚴(yán)格的雜交條件。
為了本發(fā)明目的，中等嚴(yán)格的雜交條件指雜交在雜交溶液中約42℃進(jìn)行，溶液含25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart溶液、50μg/ml變性、超聲處理的鮭精DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探針(約5×107cpm/μg)，而洗滌在約50℃進(jìn)行，洗滌液含2X SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉。
高度嚴(yán)格的雜交條件指雜交在雜交溶液中約42℃進(jìn)行，溶液含25mMKPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart溶液、50μg/ml變性、超聲處理的鮭精DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探針(約5×107cpm/μg)，而洗滌在約65℃進(jìn)行，洗滌液含0.2X SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉。
分離如本文所用，關(guān)于核酸的術(shù)語“分離”指天然產(chǎn)生的核酸，它與生物體的天然產(chǎn)生基因組中直接毗連的序列(一個(gè)在5’末端且一個(gè)在3’末端)不直接毗連，它來源于此生物體。例如，分離的核酸可無限制地是任意長(zhǎng)度的重組DNA分子，只要去除或缺少一種核酸序列，通常在天然產(chǎn)生的基因組中發(fā)現(xiàn)這些序列在重組DNA分子側(cè)翼。因此，分離的核酸無限制地包括作為單獨(dú)分子(如通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在且不取決于其它序列的重組DNA以及摻入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰疹病毒)或者摻原核或真核生物基因組DNA的重組DNA。此外，分離的核酸可包括是部分雜合或融合核酸序列的重組DNA分子。
如本文所用，關(guān)于核酸的術(shù)語“分離”也包括任何非天然產(chǎn)生的核酸，因?yàn)榉翘烊划a(chǎn)生的核酸序列不在自然界中發(fā)現(xiàn)且沒有天然產(chǎn)生的基因組中的直接毗連序列。例如，非天然產(chǎn)生的核酸如認(rèn)為工程核酸是分離的核酸。工程核酸能用普通分子克隆或化學(xué)核酸合成技術(shù)產(chǎn)生。分離的非天然產(chǎn)生的核酸可不取決于其它序列，或摻入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰疹病毒)或者原核或真核生物的基因組DNA。此外，非天然產(chǎn)生的核酸可包括是部分雜合或融合核酸序列的核酸分子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明白在百到百萬的其它核酸分子中存在的核酸不認(rèn)為是分離的核酸，這些核酸分子在例如cDNA或基因組文庫(kù)或者含基因組DNA限制酶切消化的凝膠切片內(nèi)。
核酸如本文所用，術(shù)語“核酸”涵蓋RNA和DNA，無限制地包括cDNA、基因組DNA和合成(如化學(xué)合成)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈。當(dāng)單鏈時(shí)，核酸可以是有義鏈或反義鏈。上外，核酸可以是環(huán)形或線性。
可操作連接當(dāng)?shù)谝环N核酸序列以與第2種核酸序列的功能性關(guān)系放置時(shí)，第一種核酸序列“可操作連接”第2種核酸序列。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子可操作連接編碼序列。一般，可操作連接的DNA序列是連續(xù)的，在相同讀框中有必要連接2個(gè)多肽編碼區(qū)。
多肽修飾本發(fā)明包括酶以及其合成的實(shí)施方案。此外，具有所需酶活性的類似物(非肽有機(jī)分子)、衍生物(化學(xué)功能性肽分子，以所示肽序列起始獲得)和變體(同系物)能用于本文所述方法。本文所示肽包括氨基酸序列，氨基酸可以是L-和/或D-氨基酸，天然產(chǎn)生的或其它。
肽能通過多種化學(xué)技術(shù)修飾以產(chǎn)生衍生物，衍生物有與未修飾肽本質(zhì)上相同的活性且任選有其它所需性質(zhì)。例如，蛋白的羧酸基團(tuán)無論是羧基末端或側(cè)鏈，可以藥學(xué)上可接受陽離子的鹽形式提供或酯化以形成C1-C16酯，或者轉(zhuǎn)變成公式NR1NR2的酰胺，其中R1和R2各是獨(dú)立的H或C1-C16烷基，或者結(jié)合以形成雜環(huán)如5-或6-元環(huán)。肽的氨基無論是氨基末端或側(cè)鏈，可以藥學(xué)上可接受的酸加成鹽形式提供如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、馬來酸、酒石酸和其它有機(jī)鹽，或可修飾成C1-C16烷基或二烷基氨基或者進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成酰胺。
肽側(cè)鏈的羥基可用公認(rèn)的技術(shù)轉(zhuǎn)變成C1-C16烷氧基或轉(zhuǎn)變成C1-C16酯。肽側(cè)鏈的苯基和酚環(huán)可用1個(gè)或多個(gè)鹵原子取代如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯或者這種羧酸的酰胺取代。肽側(cè)鏈的亞甲基可延伸到同源的C2-C4亞烴基。硫醇可用一些公認(rèn)保護(hù)基團(tuán)的任何一種保護(hù)，如乙酰胺基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也認(rèn)可將環(huán)狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)入本發(fā)明肽的方法，用于選擇和提供構(gòu)象約束給結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致穩(wěn)定性提高。例如，C-或N-末端半胱氨酸可加入肽中，這樣肽在氧化時(shí)包含二硫鍵，產(chǎn)生環(huán)狀肽。其它肽環(huán)化方法包括形成硫醚及羧基和氨基末端酰胺和酯。
肽模擬物和有機(jī)模擬物實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中這類肽和有機(jī)模擬物的化學(xué)組分的三維排列模擬肽主鏈和組成氨基酸側(cè)鏈的三維排列，產(chǎn)生本發(fā)明蛋白的這種肽和有機(jī)模擬物，它們有可檢測(cè)酶活性。對(duì)于計(jì)算機(jī)模型應(yīng)用，藥效團(tuán)是生物活性的結(jié)構(gòu)要求的、理想的三維定義。能用目前的計(jì)算模型軟件(使用計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì)或CADD)設(shè)計(jì)肽和有機(jī)模擬物符合各藥效團(tuán)。參見Walters，“計(jì)算機(jī)輔助的藥物模型”(Computer-Assisted Modeling of Drugs)，Klegerman和Groves(主編)，《制藥生物技術(shù)》(Pharmaceutical Biotechnology)，1993，InterpharmPressBuffalo Grove，IL，165-74頁和102章，Munson(主編)，《藥理學(xué)原理》(Principlesof Pharmacology)，1995，Chapman&Hall，描述用于CADD的技術(shù)。本發(fā)明范圍也包括用這些技術(shù)制備的模擬物。在一個(gè)例子中，模擬物模擬酶或者其變體、片段或融合產(chǎn)生的酶活性。
探針和引物核酸探針和引物可在本文提供的氨基酸序列和核酸序列基礎(chǔ)上容易制備。“探針”包括分離的核酸，核酸含可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道分子。示范標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、配基、化學(xué)發(fā)光劑和多肽。標(biāo)記方法和選擇適于不同目的的標(biāo)記指南討論于例如Sambrook等(主編)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989，Ausubel等(主編)，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(定期更新)，1987。
“引物”通常是有10個(gè)或更多核苷酸的核酸分子(如有約10個(gè)核苷酸到約100個(gè)核苷酸的核酸分子)。引物可通過核酸雜交與互補(bǔ)靶核酸鏈退火以形成引物與靶核酸鏈間的雜合體，隨后通過例如DNA聚合酶多肽沿著靶核酸鏈延伸。引物對(duì)能用于擴(kuò)增核酸序列，如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它本領(lǐng)域已知的核酸擴(kuò)增方法。
制備和使用探針及引物的方法描述于例如參考文獻(xiàn)如Sambrook等(主編)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.1989；Ausubel等(主編)，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York(定期更新)，1987；Innis等(主編)，《PCR操作方法和應(yīng)用指南》(PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications)，AcademicPressSan Diego，1990。PCR引物對(duì)可來源于已知序列，例如使用用于此目的的計(jì)算機(jī)程序如Primer(版本0.5，1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，Mass.)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解特定探針或引物的特異性隨著長(zhǎng)度增加，但探針或引物大小范圍可從全長(zhǎng)序列到短至5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。因此，例如20個(gè)連續(xù)核苷酸的引物與靶退火的特異性高于僅15個(gè)核苷酸的對(duì)應(yīng)引物。因而，為獲得較大特異性，可選擇探針和引物包含例如10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450或更多連續(xù)核苷酸。
啟動(dòng)子核酸陣列控制指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的序列。啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位置附近的必需核酸序列，如在聚合酶II型啟動(dòng)子的情況中的TATA元件。啟動(dòng)子可包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制子元件，它們可位于離轉(zhuǎn)錄起始位置多達(dá)幾千堿基對(duì)的地方。
純化如本文所用，術(shù)語“純化”不需要絕對(duì)純度；它作為一個(gè)相對(duì)術(shù)語。因此，例如在純化的多肽或核酸制品中，主題多肽或核酸的濃度分別高于其在生物體內(nèi)天然環(huán)境中的多肽或核酸。例如，如果制品中多肽含量代表至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％的制品總蛋白含量時(shí)，認(rèn)為多肽制品純化了。
重組“重組”核酸有(1)其表達(dá)生物體中非天然產(chǎn)生的序列或(2)通過人工組合2種不同分離、較短序列產(chǎn)生的序列。此人工組合通常通過化學(xué)合成完成，或更常通過人工操作分離的核酸區(qū)段，如遺傳工程技術(shù)。“重組”也用于描述人工操作的核酸分子，但它含與生物體中發(fā)現(xiàn)的相同調(diào)節(jié)序列和編碼區(qū)，核酸分離自此生物體。
序列同一性氨基酸序列間的相似性根據(jù)序列間的相似性表示，序列間的相似性另外稱為序列同一性。序列同一性常以百分比同一性(或相似性或同源性)測(cè)量；百分比越高，2種序列越相似。當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)方法排列時(shí)，肽如SEQ ID NO12的同系物或變體具有相對(duì)高程度的序列同一性。
用于比較的序列排列方法在本領(lǐng)域熟知。多種程序和排列算法描述于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443-53，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444-8，1988；Higgins和Sharp，Gene 73237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5151-3，1989；Corpet等，NucleicAcids Research 1610881-90，1988；Altschul等，Nature Genet.6119-29，1994。
NCBI基本局部排列檢索工具(BLASTTM)(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-10，1990)可獲得自一些來源，包括全國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和因特網(wǎng)，用于連接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。
肽的變體的特征通常是在全長(zhǎng)排列氨基酸序列時(shí)計(jì)算具有至少50％序列同一性，使用NCBI Blast 2.0，缺口blastp設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)。為比較大于約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列，使用Blast 2.0序列功能，用設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)的默認(rèn)BLOSUM62矩陣(間隙存在值為11，每殘基間隙值為1)。當(dāng)排列短肽(少于約30個(gè)氨基酸)時(shí)，排列用Blast 2序列功能進(jìn)行，使用設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)的PAM30矩陣(開放間隙9，延伸間隙1罰分)。當(dāng)通過此方法評(píng)估與參考序列相似性更高的蛋白時(shí)，顯示百分比同一性增加，如至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少99％序列同一性。當(dāng)比較不夠完整的序列用于序列同一性時(shí)，同秒物和變體通常在10-20個(gè)氨基酸的短窗口中具有至少80％序列同一性，可具有的序列同一性為至少85％、至少90％、至少95％或98％，這取決于它們與參考序列的相似性。在這種短窗口中確定序列同一性的方法描述于全國(guó)生物技術(shù)信息中心，Bethesda，Maryland維護(hù)的網(wǎng)址。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解提供這些序列同一性范圍僅用于指導(dǎo)；完全有可能在所提供范圍外獲得很顯著的同秒物。
類似方法能用于確定核酸序列的百分比序列同一性。在一個(gè)特定例子中，同源序列與天然序列一起排列，匹配數(shù)通過計(jì)算2種序列中存在的相同核苷酸或氨基酸殘基的位置數(shù)來確定。確定百分比序列同一性是通過匹配數(shù)除以鑒定序列(如SEQ ID NO11)所示序列的長(zhǎng)度或連接長(zhǎng)度(如來自鑒定序列中所示序列的100個(gè)連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基)，接著所得值乘以100。例如，當(dāng)與SEQ ID NO11所示序列排列時(shí)，有1166個(gè)匹配的核酸序列與SEQ ID NO11所示序列是75％相同(即1166÷1554*100＝75.0)。注意到百分比序列同一性值四舍五入到最接近的十分之王。例如，75.11、75.12、75.13和75.14下舍到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19上舍到75.2。也注意到長(zhǎng)度值總是整數(shù)。在另一個(gè)例子中，含20個(gè)核苷酸區(qū)的靶序列與來自鑒定序列的20個(gè)連續(xù)核苷酸如下排列，它包含的區(qū)域享有與鑒定序列75％序列同一性(即15÷20*100＝75)。
1 20靶序列AGGTCGTGTACTGTCAGTCA| || ||| |||| |||| |鑒定序列 ACGTGGTGAACTGCCAGTGA特異結(jié)合劑試劑能特異結(jié)合本文所述任何多肽。例子包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(包含人源化單克隆抗體)、單克隆抗體片段如Fab、F(ab’)2和Fv片段以及任何其它能特異結(jié)合這種多肽的抗原表位的試劑。
本文提供多肽(或其片段、變體或融合)的抗體能用于純化或鑒定這種多肽。本文提供的氨基酸和核酸序列可生成以抗體為基礎(chǔ)的特異結(jié)合劑，試劑識(shí)別本文所述多肽。
可生成多肽、多肽部分或其變體的單克隆或多克隆抗體?？苟嚯目乖?個(gè)或多個(gè)抗原表位產(chǎn)生的抗體最佳地特異檢測(cè)多肽。即抗特定多肽產(chǎn)生的抗體會(huì)識(shí)別和結(jié)合此特定多肽，且不充分識(shí)別或結(jié)合其它多肽?？贵w特異結(jié)合特定多肽通過任何一些標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定方法確定，例如蛋白質(zhì)印跡(參見例如Sambrook等(主編)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。
為通過蛋白質(zhì)印跡確定特定抗體制品(如小鼠中抗多肽生成的制品，多肽具有SEQ ID NO12所列氨基酸序列)特異檢測(cè)適當(dāng)多肽(如有SEQ ID NO12所列氨基酸序列的多肽)，總細(xì)胞蛋白可從細(xì)胞提取并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。
分離的總細(xì)胞蛋白隨后可轉(zhuǎn)至膜(如硝化纖維)，抗體制品與膜孵育。洗膜以去除非特異結(jié)合抗體后，特異結(jié)合抗體的存在能用綴合多肽如堿性磷酸酶的適當(dāng)二抗(如抗小鼠的抗體)檢測(cè)，因?yàn)閼?yīng)用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/硝基藍(lán)四唑通過免疫定位的堿性磷酸酶法生成濃的藍(lán)色化合物。
適合用作免疫原的充分純化多肽能獲得自轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或野生型細(xì)胞?？烧{(diào)節(jié)終制品中的多肽濃度到幾微克每毫升的水平，例如通過Amicon過濾裝置上的濃度。此外，能用作免疫原的多肽大小范圍從全長(zhǎng)多肽到有少至9個(gè)氨基酸殘基的多肽。這種多肽可在細(xì)胞培養(yǎng)中生成，能用標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)合成，或可通過將大多肽切割成能純化的較小多肽來獲得。當(dāng)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子中呈遞給免疫系統(tǒng)時(shí)，有少至9個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的多肽可以是免疫原性的，MHC分子如MHC I類和II類分子。因此，有本文所示任何氨基酸序列的至少9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多連續(xù)氨基酸殘基的多肽可用作免疫原以生成抗體。
本文所示任何多肽的單克隆抗體可根據(jù)Kohler和Milstein(Nature 256495-7，1975)的經(jīng)典方法或其衍生方法制備自鼠雜交瘤。
多克隆抗血清含本文所示任何多肽的異源抗原表位的抗體，抗血清可通過多肽(或其片段)免疫合適的動(dòng)物來制備，多肽可以是未修飾或修飾的以增強(qiáng)免疫原性。用于兔的有效免疫操作可發(fā)現(xiàn)于Vaitukaitis等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33988-91，1971)。
抗體片段可用于取代完整抗體且易在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。免疫有效部分的單克隆抗體也稱為“抗體片段”，其產(chǎn)生和使用的方法熟知且包括Better和Horowitz(Methods Enzymol.178476-96，1989)、Glockshuber等(Biochemistry291362-7，1990)、美國(guó)專利號(hào)5,648,237(《功能性抗體片段的表達(dá)》(Expression ofFunctional Antibody Fragments))、美國(guó)專利號(hào)4,946,778(《單一多肽鏈結(jié)合分子》(Single Polypeptide Chain Binding Molecules))、美國(guó)專利號(hào)5,455,030(《使用單鏈多肽結(jié)合分子的免疫治療》(Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide BindingMolecules))和其引用的參考文獻(xiàn)中描述的抗體片段。
轉(zhuǎn)化“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞是核酸分子導(dǎo)入的細(xì)胞，例如通過分子生物學(xué)技術(shù)。轉(zhuǎn)化涵蓋所有將核酸分子導(dǎo)入這種細(xì)胞的技術(shù)，包括但不限于用病毒載體轉(zhuǎn)染、接合、用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，以及通過電穿孔、脂轉(zhuǎn)染和粒子槍加速導(dǎo)入裸露DNA。
變體、片段或融合蛋白所示蛋白包括其變體、片段和融合。DNA序列(例如SEQ ID NO11)編碼蛋白(例如SEQ ID NO12)、融合蛋白或者蛋白片段或變體，能改造序列以使蛋白在真核細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲和/或植物中表達(dá)。為獲得表達(dá)，可改變DNA序列并可操作連接其它調(diào)節(jié)序列。含調(diào)節(jié)序列和蛋白的終產(chǎn)物稱為載體。此載體能導(dǎo)入真核生物、細(xì)菌、昆蟲和/或植物細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，載體允許蛋白生成。
融合蛋白包括蛋白如色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(或其變體、多態(tài)性、突變體或片段)，例如SEQ ID NO12，融合蛋白連接其它不抑制所需蛋白活性的氨基酸序列，例如使色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸的能力。在一個(gè)例子中，其它氨基酸序列長(zhǎng)度不大于約10、12、15、20、25、30或50個(gè)氨基酸。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解DNA序列能以多種方法改變而不影響編碼蛋白的生物活性。例如，PCR可用于在編碼蛋白的DNA序列中產(chǎn)生變化。這種變體可以是對(duì)宿主細(xì)胞中密碼子優(yōu)先性最佳化的變體，用于表達(dá)蛋白，或者是其它促進(jìn)表達(dá)的序列變化。
載體核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞，從而生成轉(zhuǎn)化細(xì)胞。載體可包括能使它在細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，如復(fù)制起點(diǎn)。載體也可包括1個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記基因和本領(lǐng)域已知的其它遺傳元件。
生物合成途徑的概述如圖1-3和11-13所示，許多生物合成途徑能用于生成monatin或其中間物如吲哚-3-丙酮酸或MP。為將各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)轉(zhuǎn)變成各產(chǎn)物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和monatin)，可使用一些不同多肽。此外，這些反應(yīng)可體內(nèi)、體外完成，或通過體內(nèi)反應(yīng)和體外反應(yīng)的組合，如包括非酶化學(xué)反應(yīng)的體外反應(yīng)。因此，圖1-3和11-13是示范，顯示能用于獲得所需產(chǎn)物的多種不同途徑。
葡萄糖到色氨酸許多生物體能從葡萄糖合成色氨酸。含從葡萄糖和/或色氨酸生成monatin、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的構(gòu)建物可克隆入這種生物體中。本文顯示色氨酸可轉(zhuǎn)變成monatin。
在其它例子中，生物體用已知多肽改造以生成色氨酸或超量產(chǎn)生色氨酸。例如，美國(guó)專利號(hào)4,371,614(納入本文供參考)描述用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，質(zhì)粒含野生型色氨酸操縱子。
美國(guó)專利號(hào)4,371,614所示色氨酸的最大效價(jià)約為230ppm。類似地，WO8701130(納入本文供參考)描述遺傳改造以生成色氨酸的大腸桿菌菌株并討論增加發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到能從葡萄糖生成色氨酸的生物體也能利用其它可轉(zhuǎn)變成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，結(jié)果類似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纖維素或甘油。
色氨酸到吲哚-3-丙酮酸一些多肽可用于使色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括酶種類(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21的成員。這些種類包括名為色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的多肽(也命名為L(zhǎng)-苯丙氨酸-2-氧戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、5-羥基色氨酸-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、羥基色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、L-色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、L-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、L-色氨酸2-氧戊二酸轉(zhuǎn)氨酶)，它將L-色氨酸和2-氧戊二酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶，它使D-色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脫氫酶(也名為NAD(P)-L-色氨酸脫氫酶、L-色氨酸脫氫酶、L-Trp-脫氫酶、TDH和L-色氨酸NAD(P)氧化還原酶(脫氨))，它將L-色氨酸和NAD(P)轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脫氫酶，它使D-氨基酸和FAD轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(也名為L(zhǎng)-色氨酸-α-酮異已酸轉(zhuǎn)氨酶和L-色氨酸苯基丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶)，它將L-色氨酸和苯基丙酮酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也名為蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸氧氧化還原酶(脫氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)變成2-含氧酸和NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶(也名為蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸氧氧化還原酶(脫氨))，它將D-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)變成2-含氧酸和NH3和H2O2；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H2O和O2轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H2O2。這些種類也包含酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)轉(zhuǎn)氨酶和有多種轉(zhuǎn)氨酶活性的廣(多底物)轉(zhuǎn)氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
轉(zhuǎn)氨酶種類的11個(gè)有這種活性的成員描述于下面的實(shí)施例1，包括SEQ IDNOS11和12所示的新轉(zhuǎn)氨酶。因此，本發(fā)明提供分離的核酸和蛋白序列，與SEQID NOS11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性。本發(fā)明也涵蓋SEQ ID NOS11和12的片段和融合，它們保持轉(zhuǎn)氨酶活性或編碼有轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000個(gè)SEQ ID NO11的連續(xù)核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350個(gè)SEQ ID NO12的連續(xù)核苷酸。所示序列(和其變體、片段和融合)可以是部分載體。載體能用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而生成重組細(xì)胞，重組細(xì)胞可從色氨酸產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能進(jìn)一步生成MP和/或monatin。
已知L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，序列可分離自一些不同來源，如蝰蛇(Viperalebetine)(sp P81375)、眼睛蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、蝮蛇(Agkistrodonrhodostonma)(sp P81382)、響尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋蔥假單孢菌(Burkholderia cepaica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄桿菌(Caulobactercresentus)、萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假單胞菌(P.Syringae)、和紅球菌(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文獻(xiàn)且能分離自例如鬼傘(Coprinus)屬SF-1、有根腫病的大白菜、擬南芥和哺乳動(dòng)物的肝。能將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸的1個(gè)L-氨基酸氧化酶類成員討論于下面的實(shí)施例3以及分子克隆的另外來源。許多D-氨基酸氧化酶基因存在于分子克隆的數(shù)據(jù)庫(kù)。
已知色氨酸脫氫酶，且可分離自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黃花牧豆樹(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆樹、小麥、玉米、番茄、煙草、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)和乳桿菌(Lactobacilli)。已知許多D-氨基酸脫氫酶序列。
如圖11-13所示，如果氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶用于使色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸，能加入過氧化氫酶以減少或甚至去除過氧化氫的存在。
吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸的反應(yīng)可通過多種多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽類的成員。1.1.1.110多肽類包括吲哚乳酸脫氫酶(也名為吲哚乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3類包括乳酸脫氫酶(也名為乳酸脫氫酶、乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.1.222類包含(R)-4-羥苯基乳酸脫氫酶(也名為D-芳族乳酸脫氫酶、R-芳族乳酸脫氫酶和R-3-(4-羥苯基)乳酸NAD(P)+2-氧化還原酶)且1.1.1.237類包含3-(4-羥苯基丙酮酸)還原酶(也名為羥苯基丙酮酸還原酶和4-羥苯基乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.3.-類包含乳酸氧化酶，1.1.1.111類包含(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(也名為(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸NAD(P)+氧化還原酶)。可能這些種類的一些多肽能從吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。此轉(zhuǎn)變的例子提供于實(shí)施例2。
化學(xué)反應(yīng)也能用于使吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸。這種化學(xué)反應(yīng)包括能用一些方法完成的氧化步驟，例如空氣氧化，使用B2催化劑(China ChemicalReporter，13卷，28期，18頁(1)，2002)、d金屬催化劑存在時(shí)稀釋高錳酸鹽和高氯酸鹽或過氧化氫。
吲哚-3-丙酮酸到2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成MP。示范多肽種類包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。這些種類包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2種羧酸底物縮合的醛縮酶。肽類EC 4.1.3.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電體，而EC 4.1.2.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作為親電體。
例如，EP 1045-029中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也名為4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶、2-氧-4-羥基戊二酸醛縮酶或KHG醛縮酶)將乙醛酸和丙酮酸轉(zhuǎn)變成4-羥基-2-酮戊二酸，多肽4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.17，也名為4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛縮酶)縮合2種酮酸如2個(gè)丙酮酸到4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用這些裂合酶的反應(yīng)。
圖1-2和11-13顯示這些反應(yīng)的示意圖，其中3-碳(C3)分子結(jié)合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的許多成員特別是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如絲氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇縮合需要此途徑的3個(gè)碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作為C3碳源且可轉(zhuǎn)變成丙酮酸。丙氨酸可通過許多利用PLP的轉(zhuǎn)氨酶來轉(zhuǎn)氨以產(chǎn)生丙酮酸，包括許多上述的轉(zhuǎn)氨酶。可通過β消除反應(yīng)(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)獲得丙酮酸和氨，反應(yīng)用于L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有足夠離去基團(tuán)的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-絲氨酸、O-芐基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-芐基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介導(dǎo)的β-裂合酶反應(yīng)中用作丙酮酸的來源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2，也名為酪氨酸-酚裂合酶)催化的反應(yīng)。通過在(4.1.99.1-2)多肽上進(jìn)行定點(diǎn)突變可增加β-裂合酶反應(yīng)速度，如Mouratou等(J.Biol.Chem 2741320-5，1999)和實(shí)施例8所述。這些修飾使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸鹽也能用作丙酮酸的來源，且通過加入乳酸脫氫酶和氧化輔因子或乳酸氧化酶和氧來氧化成丙酮酸。這些反應(yīng)的例子描述于下。例如，如圖2和圖11-13所示，當(dāng)丙酮酸用作C3分子時(shí)，ProA醛縮酶能接觸吲哚-3-丙酮酸。
MP可用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，如實(shí)施例5提供的醛醇縮合。
MP到MonatinMP到monatin的轉(zhuǎn)變可由下列1個(gè)或多個(gè)催化色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)或更多轉(zhuǎn)氨酶家族(2.6.1.-)的一般成員如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)轉(zhuǎn)氨酶(圖2)。轉(zhuǎn)氨酶類的11個(gè)成員描述于下(實(shí)施例1)，包括SEQ ID NOS11和12所示新的種類成員，實(shí)施例7提供證明轉(zhuǎn)氨酶和脫氫酶活性的反應(yīng)。
此反應(yīng)也能用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。酮酸(MP)胺化通過還原性胺化用氨和氰硼氫化鈉進(jìn)行。
圖11-13顯示另外的多肽，它們能用于使MP轉(zhuǎn)變成monatin以及增加來自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的monatin產(chǎn)量。例如，如果天冬氨酸用作氨基供體，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶能用于使天冬氨酸轉(zhuǎn)變成草酰乙酸(圖11)。草酰乙酸通過脫羧酶轉(zhuǎn)變成丙酮酸和二氧化碳，如草酰乙酸脫羧酶(圖11)。此外，如果賴氨酸用作氨基供體，賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶可用于使賴氨酸轉(zhuǎn)變成ε-醛基賴氨酸(圖12)。ε-醛基賴氨酸自發(fā)轉(zhuǎn)變成1-哌啶6-羧酸鹽(圖12)。如果能催化還原性胺化反應(yīng)的多肽(如谷氨酸脫氫酶)用于將MP轉(zhuǎn)變成monatin，可使用能再循環(huán)NAD(P)H和/或生成揮發(fā)性產(chǎn)物的多肽，如甲酸脫氫酶。
設(shè)計(jì)生物合成途徑中的另外考慮取決于哪種多肽用于產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或monatin，能提供輔因子、底物和/或另外多肽給生產(chǎn)細(xì)胞以提高產(chǎn)物形成。
去除過氧化氫過氧化氫(H2O2)是產(chǎn)物，如果產(chǎn)生，可對(duì)生產(chǎn)細(xì)胞有毒且可能損害多肽或產(chǎn)生的中間物。上述L-氨基酸氧化酶產(chǎn)生H2O2作為產(chǎn)物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平減少以降低對(duì)細(xì)胞或產(chǎn)物的潛在損傷。
過氧化氫酶能用于降低細(xì)胞中的H2O2水平(圖11-13)。生產(chǎn)細(xì)胞可表達(dá)編碼過氧化氫酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化過氧化氫降解成水和氧氣。例如，過氧化氫酶可從轉(zhuǎn)染入生產(chǎn)細(xì)胞的載體中表達(dá)。能使用的過氧化氫酶例子包括但不限于tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐鹽桿菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天蘭色鏈霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黃單胞菌)(SwissProt登錄號(hào)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反應(yīng)也能包含過氧化氫酶多肽。
PLP(吡哆醛5’-磷酸)有效性的調(diào)節(jié)如圖1所示，PLP可用于本文所述1個(gè)或多個(gè)生物合成步驟。能補(bǔ)充PLP濃度，從而PLP不成為對(duì)反應(yīng)總效率的限制。
充分研究大腸桿菌中維生素B6(PLP的前體)的生物合成途徑且已結(jié)晶一些蛋白(Laber等，F(xiàn)EBS Letters，44945-8，1999)。其它代謝途徑中需要2個(gè)基因(epd或gapB和serC)，而3個(gè)基因(pdA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成獨(dú)有的。大腸桿菌途徑中的起始物質(zhì)之一是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。從共同的2和3碳中心代謝物合成此前體是由多肽1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化。另一個(gè)前體是蘇氨酸衍生物，它形成自4-碳糖，D-赤蘚糖4-磷酸。轉(zhuǎn)變到磷酸-4-羥基-L蘇氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一個(gè)反應(yīng)是DXP與HTP間的復(fù)雜分子內(nèi)縮合和閉環(huán)反應(yīng)，由pdxA和pdxJ的基因產(chǎn)物催化。
如果PLP成為發(fā)酵生產(chǎn)monatin期間的限制營(yíng)養(yǎng)物，1個(gè)或多個(gè)途經(jīng)基因在生產(chǎn)宿主細(xì)胞中的表達(dá)增加可用于提高monatin產(chǎn)量。宿主生物體可包含多個(gè)其天然途徑基因的拷貝或非天然途徑基因的拷貝可摻入生物體基因組中。另外，補(bǔ)救途徑基因的多個(gè)拷貝能克隆入宿主生物體中。
1個(gè)在所有生物體中保守的補(bǔ)救途徑使多種維生素B6的衍生物再循環(huán)成活性PLP形式。參與此途徑的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。過量表達(dá)1個(gè)或多個(gè)這些基因可增加PLP有效性。
提高維生素B6水平可通過去除或阻抑宿主生物體中天然生物合成途徑基因的代謝調(diào)節(jié)。PLP阻抑多肽，此多肽參與黃桿菌屬(Flavobacterium)菌株238-7中前體蘇氨酸衍生物的生物合成。此細(xì)菌菌株無代謝控制，過度生成吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。遺傳操作以類似方式ε-醛基賴氨酸生成monatin的宿主生物體可增加PLP生成而不過度表達(dá)生物合成途徑基因。
銨利用能推動(dòng)色氨酸酶反應(yīng)趨向合成方向(從吲哚生成色氨酸)，這是通過制備更能利用的氨或去除水。還原性胺化反應(yīng)如由谷氨酸氫化酶催化的反應(yīng)，也能通過銨過量來推動(dòng)。
氨可作為碳酸或磷酸緩沖系統(tǒng)中的碳酸銨或磷酸銨鹽存在。氨也能作為丙酮酸銨或甲酸銨提供。另外，如果反應(yīng)偶聯(lián)產(chǎn)生氨的反應(yīng)如谷氨酸脫氫酶或色氨酸脫氫酶，可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能產(chǎn)生氨，底物會(huì)水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通過酶水解其優(yōu)選底物也能使增加的合成產(chǎn)物的產(chǎn)量超過正常平衡量。
取出產(chǎn)物和副產(chǎn)物色氨酸經(jīng)色氨酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸可能不利地影響吲哚-3-丙酮酸的產(chǎn)率，因?yàn)榉磻?yīng)生成谷氨酸并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酸可能引起轉(zhuǎn)氨酶的抑制，反應(yīng)會(huì)消耗大量共底物。此外，高谷氨酸濃度對(duì)下游分離過程有害。
多肽谷氨酸脫氫酶(GLDH)使谷氨酸轉(zhuǎn)變成2-氧戊二酸，從而在反應(yīng)中再循環(huán)共底物，反應(yīng)由色氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化。GLDH也產(chǎn)生還原等價(jià)物(NADH或NADPH)，能用于在需氧條件下產(chǎn)生細(xì)胞所用能量(ATP)。通過GLDH利用谷氨酸也減少副產(chǎn)物形成。另外，反應(yīng)產(chǎn)生氨，它能用作細(xì)胞的氮源或作為圖1所示最后步驟中還原性胺化的底物。因此，過度表達(dá)GLDH多肽的生產(chǎn)細(xì)胞能用于增加產(chǎn)量和降低培養(yǎng)基和/或分離方法的成本。
在色氨酸到monatin的途徑中，如果使用來自適當(dāng)酶類的轉(zhuǎn)氨酶，步驟3的氨基供體(如谷氨酸或天冬氨酸)可反轉(zhuǎn)變成步驟1所需的氨基受體(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途徑的2個(gè)不同轉(zhuǎn)氨酶能提高此途徑的效率，其中1個(gè)轉(zhuǎn)氨酶的底物不競(jìng)爭(zhēng)性地抑制另一個(gè)轉(zhuǎn)氨酶的活性。
所述途徑中的許多反應(yīng)是可逆的且因此會(huì)到達(dá)底物和產(chǎn)物間的平衡?？赏ㄟ^從多肽中連續(xù)取出產(chǎn)物來增加此途徑的產(chǎn)量。例如，monatin用通透酶或其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌入發(fā)酵液或者從生物催化反應(yīng)器流中選擇性結(jié)晶monatin并伴隨底物再循環(huán)會(huì)提高反應(yīng)產(chǎn)量。
通過另外的酶反應(yīng)或氨基供體基團(tuán)的取代來去除副產(chǎn)物是另一種增加反應(yīng)產(chǎn)量的方法。一些例子討論于實(shí)施例13且示于圖11-13。理想生成的副產(chǎn)物不能在反方向中反應(yīng)，這是通過相變(蒸發(fā))或自發(fā)轉(zhuǎn)變成惰性的終產(chǎn)物如二氧化碳。
底物庫(kù)的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)吲哚庫(kù)可通過增加色氨酸前體生成和/或改變包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代謝途徑。例如，減少或去除從吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸可通過功能性缺失宿主細(xì)胞中編碼EC 4.1.1.74的基因。減少或去除從色氨酸生成吲哚可通過功能性缺失宿主細(xì)胞中編碼EC 4.1.99.1的基因。另外，過量吲哚能用作體外或體內(nèi)過程中的底物，結(jié)合增加量的編碼EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，82604-6，1996)?？蛇M(jìn)行遺傳修飾以增加中間物的水平，如D-赤蘚糖4-磷酸和分支酸。
在大部分生物體中調(diào)節(jié)色氨酸生成。一種機(jī)制是通過反饋抑制途徑中的某些酶；隨著色氨酸水平增加，色氨酸的產(chǎn)率減少。因此，當(dāng)使用經(jīng)色氨酸中間物生成monatin的工程宿主細(xì)胞時(shí)，可使用對(duì)色氨酸濃度不敏感的生物體。例如，玫瑰長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)品系抗多種色氨酸類似物的生長(zhǎng)抑制，它通過反復(fù)暴露于高濃度5-甲基色氨酸來選擇(Schallenberg和Berlin，Z Naturforsch34541-5，1979)?？赡苡捎诨蛲蛔?，所得品系的色氨酸合酶活性受到產(chǎn)物抑制的影響小。類似地，用于monatin生成的宿主細(xì)胞可最優(yōu)化。
最優(yōu)化色氨酸生成可使用定向進(jìn)化，以形成對(duì)產(chǎn)物抑制不太敏感的多肽。例如，篩選能在培養(yǎng)基中不含色氨酸的平板上進(jìn)行，但具有高水平的非代謝色氨酸類似物。美國(guó)專利號(hào)5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加發(fā)酵生物體中色氨酸產(chǎn)率的方法。色氨酸生物合成的最后步驟是加入絲氨酸到吲哚；因此能增加絲氨酸的有效性以提高色氨酸生成。
可通過增加宿主生物體產(chǎn)生的丙酮酸量來提高發(fā)酵生物體產(chǎn)生的monatin量。一些酵母如絲孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35338-42，2002)和光滑球擬酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.57451-9，2001)超量產(chǎn)生丙酮酸且能用于實(shí)踐本文所述方法。另外，可對(duì)生物體進(jìn)行遺傳修飾以促進(jìn)丙酮酸生成，如在大腸桿菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.82604-6，1996)中。
控制手性通過控制分子的立體化學(xué)(手性)能改變monatin的味覺分布。例如，不同食物系統(tǒng)需要不同濃度混合的不同monatin異構(gòu)體。手性可通過pH和多肽的組合控制。
通過去質(zhì)子化和再質(zhì)子化α碳可在monatin的C-4位置(見上面編號(hào)的分子)外消旋，這能通過pH變化或與輔因子PLP反應(yīng)來發(fā)生。在微生物中，pH不太可能變化到足以引起外消旋，但PLP豐富?？刂贫嚯氖中缘姆椒ㄈQ于用于生成monatin的生物合成途徑。
當(dāng)monatin用圖2所示途徑形成時(shí)，可考慮下列各項(xiàng)。在生物催化反應(yīng)中，碳-2的手性由酶確定，酶使吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成MP。多種酶(如來自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成MP，因此可選擇形成所需異構(gòu)體的酶。另外，將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成MP的酶的對(duì)映特異性可用定向進(jìn)化修飾或能改造催化抗體以催化所需反應(yīng)。一旦生成MP(通過酶法或化學(xué)縮合)，可用轉(zhuǎn)氨酶立體特異性加入氨基，如本文所述的轉(zhuǎn)氨酶。能產(chǎn)生碳-4的R或S構(gòu)象，這取決于使用D-還是L-芳族酸轉(zhuǎn)氨酶。大部分轉(zhuǎn)氨酶對(duì)L-異構(gòu)體特異，然而，D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶存在于一些植物(Kohiba和Mito，《第8屆國(guó)際維生素B6和羰基催化討論會(huì)會(huì)議錄》，Osaka，Japan 1990)。此外，鑒定了D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.22)。一些轉(zhuǎn)氨酶僅接受在C2碳有特定構(gòu)象的此反應(yīng)的底物。因此，即使轉(zhuǎn)變成MP不是立體定向的，可通過適當(dāng)選擇轉(zhuǎn)氨酶控制終產(chǎn)物的立體化學(xué)。由于反應(yīng)是可逆的，未反應(yīng)MP(不需要的異構(gòu)體)可再循環(huán)回到其組分且可再形成MP的外消旋混合物。
底物的激活磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸鹽(PEP)可用于本文所示反應(yīng)。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反應(yīng)速度和/或產(chǎn)量。在醛醇縮合中，加入磷酸基團(tuán)穩(wěn)定親核底物的烯醇互變異構(gòu)體，使它更具反應(yīng)性。在其它反應(yīng)中，磷酸化底物通常提供更好的離去基團(tuán)。類似地，可通過轉(zhuǎn)變成CoA衍生物或焦磷酸鹽衍生物激活底物。
實(shí)施例1色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的克隆和表達(dá)此例子描述用于克隆色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的方法，它可用于使色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸。
實(shí)驗(yàn)概述11個(gè)編碼轉(zhuǎn)氨酶的基因克隆入大腸桿菌中。這些基因是枯草芽孢桿菌D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(dat，Genbank登錄號(hào)Y14082.1 bp 28622-29470和Genbank登錄號(hào)NP 388848.1分別為核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tatA，SEQ ID NOS1和2分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細(xì)菌菌株2.4.1酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tatA通過同源性確定，SEQ ID NOS3和4分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球細(xì)紅菌35053酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(通過同源性確定，SEQ IDNOS5和6，分別碩大利什曼原蟲廣底物轉(zhuǎn)氨酶(bsat，通過與來自墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana)的肽片段的同源性確定，SEQ ID NOS7和8分別為核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢桿菌芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT，通過同源性確定，SEQ ID NOS9和10分別為核酸序列和氨基酸序列)、嗜淀粉乳桿菌芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT，通過同源性確定，SEQ ID NOS11和12，分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細(xì)菌35053多底物轉(zhuǎn)氨酶(通過同源性確定，SEQ ID NOS13和14分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細(xì)菌菌株2.4.1多底物轉(zhuǎn)氨酶(msa，通過同源性確定，Genbank登錄號(hào)AAAE01000093.1，bp 14743-16155和Genbank登錄號(hào)ZP00005082.1分別為核酸序列和氨基酸序列)、大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspC，Genbank登錄號(hào)AE000195.1 bp2755-1565和Genbank登錄號(hào)AAC74014.1分別為核酸序列和氨基酸序列)和大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrB，SEQ ID NOS31和32分別為核酸序列和氨基酸序列)。
克隆、表達(dá)了基因并測(cè)試它在色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸中的活性，與可商業(yè)購(gòu)買的酶一起。所有11個(gè)克隆有活性。
鑒定可能包含有所需活性的多肽的細(xì)菌菌株NCBI(全國(guó)生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有基因命名為色氨酸轉(zhuǎn)氨酶。然而，鑒定了有此酶活性的生物體。在細(xì)胞提取物或純化蛋白中測(cè)量到L.色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)活性，蛋白來自下列來源羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分離物、豌豆線粒體和細(xì)胞溶質(zhì)、向日葵冠癭細(xì)胞、豌豆根瘤菌三葉草生物變種(R.leguminosarumbiovar trifoli)、草生歐文氏菌石頭花致病變種(e.herbicola pv.Gypsophilae)、丁香假單胞菌薩氏致病變種(P.Syringae pv.Savastanio)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮力(A.brasilense)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、團(tuán)聚腸桿菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、麥芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠腦、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(L.Lactis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳桿菌(L.Helveticus)、小麥苗、大麥、金色菜豆菌(？Phaseolus aureus)(綠豆)、酵母uvarum(carlsbergensis)、利什曼原蟲屬、玉米、番茄莖、豌豆植物、煙草、豬、生孢梭菌(C.Sporogenes)和灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)。
分離基因組DNA用于克隆苜蓿根瘤菌(ATCC號(hào)9930)在TY培養(yǎng)基中25℃，pH7.2生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)到600nm(OD600)的光密度為1.85且2％接種物用于基因組DNA制備。Qiagen genomietip 20/G試劑盒(Valencia，CA)用于基因組DNA分離。
枯草芽孢桿菌6051(ATCC)在Bereto營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco；Detroit，MI)中30℃生長(zhǎng)。Qiagen genomic tip 20/G操作用于分離基因組DNA，有下列變化蛋白酶K和溶菌酶的濃度加倍且接種時(shí)間增加2-3倍。
碩大利什曼原蟲ATCC 50122基因組DNA由IDI，Inc.(Quebec，Canada)提供，此DNA在pH8.0，17ng/μL的TE緩沖液中。
類球紅細(xì)菌2.4.1(由Sam Kaplan教授，Univeristy of Texas，Houston提供)、類球紅細(xì)菌35053(ATCC號(hào))和嗜淀粉乳酸菌基因組DNA通過標(biāo)準(zhǔn)酚抽提制備。細(xì)胞在后對(duì)數(shù)后收集，重懸浮于TEN緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5、1mM EDTA、100mM NaCl)，每mL細(xì)胞懸浮液加入0.024mL月桂基肌氨酸鈉裂解。用等體積酚抽提至少3次后，DNA溶液用9∶1氯仿∶辛醇抽提1次并用氯仿抽提3次，酚用TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5、1mM EDTA)飽和。通過加入0.1體積3M乙酸鈉，pH6.8和2體積乙醇沉淀DNA。通過離心收集沉淀并用70％乙醇洗滌1次。最后，DNA溶于0.10mL蒸餾水。
大腸桿菌基因組DNA從菌株DH10B(Invitrogen)分離且用QiagenGenomic-tipTM(500/G)試劑盒制備。菌株在LB中生長(zhǎng)到OD650為1.87，從30mL此菌株中獲得0.3mg純化的DNA。純化的DNA以0.37μg/μL的濃度溶于Qiagen洗脫緩沖液(EB)。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)操作設(shè)計(jì)引物的突出端與pET30 Xa/LIC載體(Novagen，Madison，WI)相容。PET載體在Xa/LIC位點(diǎn)的5’側(cè)有12個(gè)堿基的單鏈突出端且在Xa/LIC位點(diǎn)的3’側(cè)有15個(gè)堿基的單鏈突出端。設(shè)計(jì)質(zhì)粒用于連接獨(dú)立的克隆，用N-末端His和S-標(biāo)記和任選的C-末端His標(biāo)記。Xa蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(IEGR)直接位于感興趣基因的起始密碼子前，從而能去除融合蛋白標(biāo)記。
當(dāng)設(shè)計(jì)引物時(shí)，下列序列加到生物體特定序列的5’末端正向引物，5’GGTATTGAGGGTCGC(SEQ ID NO73)；反向引物5’AGAGGAGAGTTAGAGCC(SEQ ID NO74)。
枯草芽孢桿菌dat引物N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3’和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3’(SEQ ID NO15和16)。
苜蓿根瘤菌tatA引物N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC(SEQ ID NO17和18)。
枯草芽孢桿菌araT引物N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG(SEQ ID NO19和20)。
類球紅細(xì)菌msa(2.4.1和35053)N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG(SEQ ID NO21和22)。
碩大利什曼原蟲bsatN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCGATTCACATTGC(SEQ ID NO23和24)。
嗜淀粉乳桿菌araTN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTGTAAAA(SEQ ID NO25和26)。
類球紅細(xì)菌tatA(2.4.1和35053菌株)N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG(SEQ ID NO27和28)。
大腸桿菌aspCN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3’和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO29和30)。
大腸桿菌tyrBN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3’(SEQ ID NO33和34)。
來源于苜蓿根病菌(tatA)的基因用下列PCR操作擴(kuò)增。在50μL反應(yīng)中使用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U擴(kuò)增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1x expandTM緩沖液。所用熱循環(huán)儀程序包括96℃ 5分鐘的熱啟動(dòng)，接著是29個(gè)下列步驟的重復(fù)94℃ 30秒，55℃ 2分鐘，72℃ 2.5分鐘。29個(gè)重復(fù)后，樣品在72℃保持10分鐘，隨后4℃貯存。此PCR操作產(chǎn)生1199bp的產(chǎn)物。
來源于類球紅細(xì)菌(msa和tatA)、嗜淀粉乳桿菌araT和桿菌araT的基因序列用下列PCR操作擴(kuò)增。在50μL反應(yīng)中，使用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U擴(kuò)增高保真TM聚合酶和有Mg的1X ExpandTM緩沖液。所用熱循環(huán)儀程序包括96℃ 5分鐘的熱啟動(dòng)，接著是29個(gè)下列步驟的重復(fù)94℃ 30秒，40-60℃ 1分鐘、45秒(梯度熱循環(huán)儀)和72℃ 2分鐘、15秒。29個(gè)重復(fù)后，樣品在72℃保持10分鐘，隨后4℃貯存。
對(duì)于各類球紅細(xì)菌msa基因，42℃和48℃退火溫度產(chǎn)生多種產(chǎn)物，但有約1464bp的明顯帶。對(duì)于嗜淀粉乳桿菌araT，42℃、48℃和56℃退火溫度產(chǎn)生單一產(chǎn)物，在1173bp有強(qiáng)帶。對(duì)于枯草芽孢桿菌araT，40℃、45℃、50℃和55℃退火溫度產(chǎn)生單一強(qiáng)產(chǎn)物(1173bp)，來自基因組DNA和菌落。對(duì)于碩大利什曼原蟲bsat，55℃退火溫度產(chǎn)生最清楚的產(chǎn)物(1239bp)。對(duì)于紅細(xì)菌tatA基因，50-55℃退火溫度產(chǎn)生正確大小的清楚產(chǎn)物(1260bp)。對(duì)于大腸桿菌基因和枯草芽孢桿菌dat基因，使用55-60℃的退火溫度，退火時(shí)間縮短至45秒。獲得正確大小的清楚產(chǎn)物(對(duì)于大腸桿菌基因約為1.3kb，dat基因?yàn)?50bp)。
克隆用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia，CA)從0.8或1％TAE-瓊脂糖凝膠中凝膠純化PCR產(chǎn)物。定量PCR產(chǎn)物，通過與瓊脂糖凝膠上的標(biāo)準(zhǔn)比較，隨后用T4 DNA聚合酶處理，遵循廠商推薦的連接獨(dú)立克隆方案(Novagen，Madison，WI)。
簡(jiǎn)要地，在dGTP存在時(shí)，約0.2pmol純化的PCR產(chǎn)物用1U T4 DNA聚合酶22℃處理30分鐘。聚合酶從PCR產(chǎn)物的3’末端去除連續(xù)堿基。當(dāng)聚合酶遇到鳥嘌呤殘基時(shí)，酶的5’到3’聚合酶活性抵消核酸外切酶活性以有效防止更多切除。這產(chǎn)生與pET30 Xa/LIC載體相容的單鏈突出端。通過在75℃孵育20分鐘使聚合酶失活。
如Novagen的建議退火載體和處理插入物。約0.02pmol處理的插入物和0.01pmol載體在22℃孵育5分鐘，加入6.25mM EDTA(終濃度)，重復(fù)22℃孵育。退火反應(yīng)(1μL)加入NovaBlueTM單感受態(tài)細(xì)胞(Novagen，Madison，WI)，冰上孵育5分鐘?；旌虾?，42℃熱激30秒轉(zhuǎn)化細(xì)胞。細(xì)胞置于冰上2分鐘，在250μL室溫SOC中37℃恢復(fù)30分鐘，以225rpm振蕩。細(xì)胞平板培養(yǎng)于含卡那霉素(25-50μg/mL)的LB平板。
質(zhì)粒DNA用Qiagen spin miniprep試劑盒純化，通過XhoI和XbaI限制性消化篩選正確插入物。似乎有正確插入物的質(zhì)粒序列通過雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序確認(rèn)。
SEQ ID NOS1-14和31-32顯示重組轉(zhuǎn)氨酶的核苷酸和對(duì)應(yīng)氨基酸序列，來自Genbank序列的任何變化在蛋白序列中是沉默或產(chǎn)生保守取代。SEQ ID NOS11和12是新序列。
基因表達(dá)和測(cè)定通過序列分析確認(rèn)的質(zhì)粒DNA亞克隆入大腸桿菌表達(dá)宿主BLR(DE3)或BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)。培養(yǎng)物生長(zhǎng)且質(zhì)粒用Qiagen miniprep試劑盒分離，用限制酶切消化分析以證實(shí)同一性。
誘導(dǎo)開始用嗜淀粉乳桿菌araT、枯草芽孢桿菌araT和苜蓿根病菌tatA在BLR(DE3)或BL21(DE3)細(xì)胞中進(jìn)行。時(shí)程研究用培養(yǎng)物進(jìn)行，培養(yǎng)物在含卡那霉素(30mg/L)的LB中生長(zhǎng)到OD600為0.5-0.8，用1mM IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)且在誘導(dǎo)后0、1、2和4小時(shí)取樣。來自2.0mL的細(xì)胞重懸浮于0.10mL 120mMTris-HCl，pH6.8，其中含10％十二烷基硫酸鈉、10％2-巰基乙醇和20％甘油，95℃加熱10分鐘，冷卻，用0.1mL H2O稀釋。這些總細(xì)胞蛋白樣品的等分部分用4-15％梯度凝膠通過SDS-PAGE分析。2小時(shí)和4小時(shí)間誘導(dǎo)的表達(dá)蛋白量間沒有顯著差異，BLR(DE3)和BL21(DE3)細(xì)胞間也沒有。
也從4小時(shí)樣品中制備細(xì)胞提取物，這是通過將來自2mL培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀懸浮于0.25mL Novagen BugBusterTM試劑，試劑含0.25μL benzonase核酸酶，室溫溫和振蕩孵育20分鐘，16,000xg離心以去除細(xì)胞碎片。上清(細(xì)胞提取物)上樣于4-15％梯度凝膠以分析細(xì)胞可溶蛋白。
3個(gè)克隆(嗜淀粉乳桿菌araT(SEQ ID NOS11和12)、枯草芽孢桿菌araT(SEQID NOS9和10)和苜蓿根病菌tatA(SEQ ID NOS1和2)顯示對(duì)應(yīng)于正確大小(約45kDa)的可溶蛋白?？莶菅挎邨U菌araT基因產(chǎn)物以最高水平超量表達(dá)和/或經(jīng)另2種基因產(chǎn)物更溶解。
在隨后的表達(dá)方法中，來自陽性克隆的質(zhì)粒DNA亞克隆入BL21(DE3)，因?yàn)榇怂拗鞯纳L(zhǎng)特征更佳。用1mM IPTG重復(fù)誘導(dǎo)，培養(yǎng)物在含50mg/L卡那霉素的LB中生長(zhǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到約0.8時(shí)誘導(dǎo)。37℃生長(zhǎng)4小時(shí)后收集細(xì)胞，3000rpm離心10分鐘(4℃)，用TEGGP緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.0)、0.5mM EDTA、100mg/L谷胱甘肽、5％甘油，具有Roche完整蛋白酶抑制劑混合物)洗滌，在-80℃乙醇中急驟冷凍。
樣品重懸浮于5mL/g濕細(xì)胞重的BugBusterTM(Novagen)試劑，試劑含5μL/mL蛋白酶抑制劑混合物#3批(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA)和1μL/mL benzonase核酸酶。樣品在定軌搖床上室溫孵育20分鐘。16,000Xg 4℃離心20分鐘去除不溶的細(xì)胞碎片。
細(xì)胞提取物通過SDS-PAGE分析，通過追蹤吲哚-丙酮酸生成來測(cè)定色氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性，使用下列操作。1mL反應(yīng)在50mM四硼酸鈉(pH8.5)、0.5mM EDTA、0.5mM砷酸鈉、50μM吡哆醛磷酸、5mM α-酮戊二酸和5mM L-色氨酸中完成。加入無細(xì)胞提取物或純化酶來起始反應(yīng)且30℃孵育30分鐘。加入20％TCA(200μL)以終止反應(yīng)，沉淀的蛋白通過離心取出。測(cè)量327nm的吸光度并與測(cè)定緩沖液中新穎制備的吲哚-3-丙酮酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。也進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)，反應(yīng)無底物色氨酸或用來自克隆的無細(xì)胞提取物，僅用pET30a轉(zhuǎn)化克隆。
由于細(xì)胞提取物中來自天然大腸桿菌轉(zhuǎn)氨酶的背景，重組蛋白用His-結(jié)合柱體遵循廠商方案(Novagen，Madison，WI)純化。洗脫部分在PD-10(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)柱上脫鹽并在50mM Tris，pH7.0中洗脫。純化的蛋白通過SDS-PAGE分析并測(cè)定轉(zhuǎn)氨酶活性。
來自1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)(4小時(shí))的結(jié)果證明碩大利什曼原蟲bsat、苜蓿根病菌tatA、大腸桿菌aspC和2種類球紅細(xì)菌tatA克隆有顯著水平的色氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性。來自枯草芽孢桿菌的araT蛋白超量表達(dá)且可溶，但顯示小的酶活性。嗜淀粉乳桿菌araT基因產(chǎn)物似乎在細(xì)胞提取物中可溶，但用His-結(jié)合柱體純化僅產(chǎn)生少量有正確分子量的蛋白。msa基因產(chǎn)物不溶，進(jìn)一步的表達(dá)實(shí)驗(yàn)在24℃進(jìn)行以將包含體形成減至最低程度。一些10μM和1mM間的IPTG濃度用于使可溶蛋白的量達(dá)到最大限度。
表1列出每毫克蛋白每分鐘形成的吲哚-3-丙酮酸(I3P)的特異活性，活性以微克測(cè)量。在一些情況中，很少量的重組蛋白顯示大于測(cè)定的有效線性范圍的高活性水平。在這些情況中，’＞’在比活數(shù)前。
表1細(xì)胞提取物(CE)中的克隆和純化(P)及商業(yè)酶的特異活
比較所有克隆的重組蛋白的排列闡明araT、tatA、bsat和msa序列間沒有許多高度保守的區(qū)域。排列活性最高的重組蛋白紅細(xì)菌tatA基因產(chǎn)物同系物、碩大利什曼原蟲廣底物轉(zhuǎn)氨酶和苜蓿根瘤菌酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶顯示出一些保守區(qū)，盡管它們?cè)诘鞍姿絻H約30-43％相同。D-特異(D-丙氨酸)轉(zhuǎn)氨酶的有效性范圍廣，可用于生成monatin的其它立體異構(gòu)體。
實(shí)施例2
吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸如圖1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸間的轉(zhuǎn)變是可逆反應(yīng)，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸間的轉(zhuǎn)變也是可逆反應(yīng)。由于在340nm來自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通?？筛欉胚?乳酸的氧化。
0.1mL標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定混合物包含100mM磷酸鉀，pH8.0、0.3mM NAD+、7單位乳酸脫氫酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。測(cè)定在UV-透明微量滴定板中進(jìn)行2次，使用Molecular Devices SpectraMax Plus板閱讀器?；旌隙嚯暮途彌_液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暫混合后，各孔在340nm的吸光度以9秒間隔閱讀。反應(yīng)在25℃保持5分鐘。從NAD+生成NADH后，340nm的吸光度增加。進(jìn)行單獨(dú)的負(fù)對(duì)照，沒有NAD+且沒有底物。來自腸膜明串珠菌(L.Mesenteroides)的D-LDH(Sigma目錄號(hào)L2395)似乎與吲哚衍生物底物的活性大于來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目錄號(hào)L5275)。
類似方法使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物。丙酮酸還原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸與D-LDH氧化反應(yīng)的Vmax約為乳酸的五分之一。也通過跟蹤在327的吸光度變化(烯醇-硼酸鹽衍生物)測(cè)量吲哚-3-丙酮酸的存在，使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸鈉的50mM硼酸鈉緩沖液。與用于L和D-LDH多肽的負(fù)對(duì)照相比，觀察到小但可重復(fù)的吸光度變化。
此外，可克隆廣特異性乳酸脫氫酶(酶活性與EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC 1.1.2.3相關(guān))并用于從吲哚-3-乳酸產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸。廣特異性脫氫酶的來源包括大腸桿菌、淋病奈瑟氏球菌和植物乳桿菌(L.plantarum)。
另外，生成吲哚-3-丙酮酸可通過吲哚-3-乳酸接觸來自生孢梭菌(C.sporogenes)的細(xì)胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)；或接觸克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi epimastigotes)細(xì)胞提取物，提取物包含已知對(duì)吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羥苯基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)；或接觸嗜酸假單胞菌(P.Acidovorans)或大腸桿菌細(xì)胞提取物，提取物包含咪唑-5-基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.111)；或接觸錦紫蘇(Coleus blumei)，它包含羥苯基丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)；或接觸麥芽念珠菌，它包含D-芳族乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)。描述這種活性的參考文獻(xiàn)包括Nowicki等(FEBS Microbiol Letters，71119-24，1992)、Jean和DeMoss(Canadian J.Microbiol.14 1968、Coote和Hassall(Biochem.J.111237-9，1969)、Cortese等(C.R.Seances Soc.Biol.Fil.162 390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.CBiosci.43 501-4，1988)和Bhatnagar等(J.Gen Microbiol 135353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶如來自假單胞菌屬(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.CatalysisBEnzymatic18299-305，2002)可用于使吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。
實(shí)施例3用L-氨基酸氧化酶使L-色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸此例子描述的方法用于經(jīng)氧化酶(EC 1.4.3.2)使L-色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸，作為實(shí)施例1所述使用色氨酸轉(zhuǎn)氨酶之外的另一種選擇。L-氨基酸氧化酶純化自響尾蛇(Crotalus durissus)(Sigma，St.Louis，MO，目錄號(hào)A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸登錄號(hào)包括CAD21325.1、AAL14831、NP 490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。
反應(yīng)在微離心管中進(jìn)行，總體積1mL，37℃振蕩孵育10分鐘。反應(yīng)混合物包含5mM L-色氨酸、100mM磷酸鈉緩沖液pH6.6、0.5mM砷酸鈉、0.5mM EDTA、25mM四硼酸鈉、0.016mg過氧化氫酶(83U，Sigma C-3515)、0.008mg FAD(Sigma)和0.005-0.125單位的L-氨基酸氧化酶。負(fù)對(duì)照包含所有成分，除了色氨酸，空白包含所有成分，除了氧化酶。過氧化氫酶用于去除在氧化脫氨中形成的過氧化氫。四硼酸鈉和砷酸鈉用于穩(wěn)定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸鹽形式，它在327nm顯示最大吸光度。在反應(yīng)混合物中制備0.1-1mM濃度的吲哚-3-丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)。
購(gòu)得的L-氨基酸氧化酶具有每分鐘每毫克蛋白形成的比活540μg吲哚-3-丙酮酸。這與色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的比活是相同的數(shù)量級(jí)。
實(shí)施例4用醛縮酶使吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸此例子描述的方法可用于將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸monatin前體(MP)，使用醛縮酶(裂合酶)(圖2)。醛醇縮合是形成碳-碳鍵的反應(yīng)，鍵在一種醛的β-碳與另一種醛或酮的羰基碳間。在一個(gè)底物的羰基相鄰碳上形成碳負(fù)離子，并用作親核體攻擊第2個(gè)底物的羰基碳(親電碳)。最通常地，親電底物是醛，因此大部分醛縮酶屬于EC 4.1.2.-類別。親核底物通常是丙酮酸。醛縮酶不常催化2個(gè)酮酸或2個(gè)醛間的縮合。
然而，鑒定了催化2個(gè)羧酸縮合的醛縮酶。例如，EP 1045-029描述從乙醛酸和丙酮酸生成L-4-羥基-2-酮戊二酸，使用假單胞菌培養(yǎng)物(EC 4.1.3.16)。此外，4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC4.1.3.17)能催化2個(gè)酮酸的縮合。因此，類似的醛縮酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸與丙酮酸的縮合。
克隆4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛縮酶，EC 4.1.3.17)和4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛縮酶，EC 4.1.3.16)催化反應(yīng)很類似圖2的醛縮酶反應(yīng)。設(shè)計(jì)引物的突出端與pET3o Xa/LIC載體(Novagen，Madison，WI)相容。這些引物的設(shè)計(jì)描述于上面的實(shí)施例1。
設(shè)計(jì)下列引物用于pET30 Xa/LIC克隆1.稻草假單胞菌(Pseudomonas straminea)proA基因(Genbank登錄號(hào)12964663版本12964663)和g睪丸酮叢毛單胞菌(睪丸酮叢毛單胞菌)proA基因(SEQ ID NOS65-66，分別為核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3’(SEQ ID NOS55和56)。
2.苜蓿根瘤菌1021 SMc00502基因(與proA同源，Genbank登錄號(hào)15074579和CAC46344，分別為核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3’(SEQ ID NOS61和62)。
3.鞘氨醇單孢菌屬LB126 fldZ基因(Genbank登錄號(hào)7573247版本7573247，編碼推定的?；D(zhuǎn)移酶)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3’(SEQ ID NOS57和58)。
4.凱氏節(jié)桿菌(Arthorbacter keyseri)pcmE基因(Genbank登錄號(hào)AF331043版本AF331043.1，編碼草酰檸蘋酸醛縮酶)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3’(SEQ ID NOS59和60)。
5.鼠疫耶爾森氏菌菌株CO92 YPO0082基因(Genbank登錄號(hào)15978115版本15978115，編碼可能的轉(zhuǎn)移酶)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3’(SEQ ID NOS63和64)。
6.枯草芽孢桿菌khg基因(Genbank登錄號(hào)Z99115.1 GI2634478，126711-127301和CAB 14127.1，分別為核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3’(SEQ IDNOS35和36)。
7.大腸桿菌khg基因(Genbank登錄號(hào)AE00279.11331-1972和AAC74920.1，分別為核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3’(SEQ ID NOS37和38)。
8.苜蓿根病菌khg基因(Genbank登錄號(hào)AL591792.1GI15075850，65353-64673和CAC47463.1，分別為核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3’(SEQ ID NOS39和40)。
來自上面1-2和6-8所述生物體的基因組DNA用Qiagen genomic tip操作純化。使用類似技術(shù)，能從3-5所述生物體純化基因組DNA。
稻草假單胞菌(ATCC 33636)在營(yíng)養(yǎng)肉湯和羥基苯甲酸鹽培養(yǎng)基中30℃生長(zhǎng)。睪丸酮叢毛單胞菌(ATCC 49249)在營(yíng)養(yǎng)肉湯和羥基苯甲酸鹽培養(yǎng)基中26℃生長(zhǎng)。鞘氨醇單孢菌屬LB126(Flemish Institute for Technological Research，VITO，B-2400Mol，Belgium)根據(jù)Wattiau等(Research in Microbiol.152861-72，2001)所述方法生長(zhǎng)。凱氏節(jié)桿菌(海灣生態(tài)部門，國(guó)立日生和環(huán)境作用研究實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署，海灣Breeze，F(xiàn)L 32561，USA)根據(jù)Eaton(J.Bacteriol.1833689-3703，2001)所述方法生長(zhǎng)。苜蓿根瘤菌1021(ATCC 51124)在ATCCTY培養(yǎng)基和羥基苯甲酸鹽培養(yǎng)基中26℃生長(zhǎng)。鼠疫耶爾森氏菌菌株CO92(ATCC)在ATCC培養(yǎng)基739馬血瓊脂中26℃生長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌6051(ATCC)在Bereto營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco；Detroit，MI)中30℃生長(zhǎng)。大腸桿菌基因組DNA從菌株DH10B(Invitrogen)中分離，如實(shí)施例1所述。
實(shí)施例1所述PCR、克隆和篩選操作用于克隆睪丸酮叢毛單胞菌和苜蓿根病菌proA序列以及大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和苜蓿根病菌khg序列。相同方法用于克隆上述其它序列。
陽性克隆用雙脫氧鏈終止測(cè)序法(Seqwright，Houston，TX)測(cè)序，用S-標(biāo)記和T7終止引物(Novagen)和來自Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)的內(nèi)部引物。
表達(dá)和活性測(cè)定質(zhì)粒DNA(通過序列分析驗(yàn)證)亞克隆入表達(dá)宿主BLR(DE3)(Novagen)。培養(yǎng)物在含50mg/L卡那霉素的LB中生長(zhǎng)，質(zhì)粒用Qiagen spin plasmid miniprep試劑盒分離，隨后通過限制酶切消化分析以確定特性。用BL21(DE3)構(gòu)建物進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建物在含50mg/L卡那霉素的LB中37℃生長(zhǎng)。OD600達(dá)到約0.6后，用0.1mMIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。細(xì)胞在30℃生長(zhǎng)4小時(shí)并離心收集。隨后用BugBusterTM試劑(Novagen)裂解細(xì)胞且His-標(biāo)記重組蛋白用上述His-結(jié)合柱體純化(實(shí)施例1)純化的蛋白在PD-10一次性柱上脫鹽并在50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.3中洗脫，緩沖液有2mM MgCl2。
蛋白在4-15％梯度凝膠上通過SDS-PAGE分析以檢測(cè)在預(yù)測(cè)重組融合蛋白分子量的可溶性蛋白水平。
使用吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸鈉作為底物測(cè)定蛋白活性。1mL測(cè)定混合物中包含100mM Tris-HCl(pH7-pH8.9)、0-8mM MgCl2、3mM磷酸鉀(pH8)和6mM各底物。通過加入不同量的多肽(例如從10到100μg)來起始反應(yīng)，25℃-37℃孵育30分鐘，過濾，然后-80℃冷凍。
proA基因產(chǎn)物的活性結(jié)果當(dāng)用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，睪丸酮叢毛單胞菌proA和苜蓿根病菌SMc00502基因構(gòu)建物有高水平表達(dá)。重組蛋白是高度可溶的，如通過SDS-PAGE分析總蛋白和細(xì)胞提取物樣品所確定。睪丸酮叢毛單胞菌因產(chǎn)物純化至＞95％純度。由于用His-結(jié)合柱體親和純化后苜蓿根病菌基因產(chǎn)物的產(chǎn)量很低，細(xì)胞提取物用于酶測(cè)定。
2種重組醛縮酶都催化從吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二價(jià)鎂和磷酸鉀的存在。當(dāng)缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸鉀時(shí)，沒有明顯產(chǎn)物。缺乏酶時(shí)也形成少量產(chǎn)物(與酶存在時(shí)通常不到1個(gè)量數(shù)量級(jí))。
從反相C18柱洗脫的產(chǎn)物峰稍遲于吲哚-3-丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)，此峰的質(zhì)譜顯示292.1的碰撞誘導(dǎo)親本離子([M+H]+)，親本離子預(yù)期產(chǎn)物MP。質(zhì)譜中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳離子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳離子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。產(chǎn)物也表現(xiàn)出其它含吲哚的化合物的UV光譜特征，如色氨酸，λmax為279-280且有約290nm的小肩部。
隨著反應(yīng)溫度從室溫增加到37℃、底物量和鎂量增加，睪丸酮叢毛單胞菌醛縮酶法生成的MP量提高。酶的合成活性隨著pH增加而減少，在pH7觀察到最多產(chǎn)物。在色氨酸標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，用20μg純化的蛋白在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定下生成的MP量約為10-40μg酶1mL反應(yīng)。
由于苜蓿根病菌和睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶編碼序列與上述其它基因的高度同源性，預(yù)期所有重組基因產(chǎn)物能催化此反應(yīng)。此外，預(yù)期有類似活性的醛縮酶在59位和87位有蘇氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有組氨酸(H)的醛縮酶(以睪丸酮叢毛單胞菌的編號(hào)系統(tǒng)為基礎(chǔ))。
khg基因產(chǎn)物的活性結(jié)果當(dāng)用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌khg基因構(gòu)建物有高水平表達(dá)，而苜蓿根病菌khg的表達(dá)水平較低。重組蛋白高度可溶的，如通過SDS-PAGE分析總蛋白和細(xì)胞提取物樣品判斷?？莶菅挎邨U菌和大腸桿菌khg基因產(chǎn)物純化到＞95％純度；用His-結(jié)合柱體親和純化后，苜蓿根病菌基因產(chǎn)物的產(chǎn)量不高。
沒有跡象證明此酶活性需要鎂和磷酸鹽。然而，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)在磷酸鈉緩沖液中進(jìn)行測(cè)定，報(bào)導(dǎo)的酶是雙功能并對(duì)磷酸化底物如2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶測(cè)定如上所述進(jìn)行，在一些情況中省略磷酸鹽。結(jié)果表明重組KHG醛縮酶法產(chǎn)生MP，但活性不如ProA醛縮酶。在一些情況中，KHG產(chǎn)生的MP水平幾乎與鎂和磷酸鹽單獨(dú)產(chǎn)生的量相同。磷酸鹽似乎不增加KHG活性。桿菌酶活性最高，比單獨(dú)鎂和磷酸鹽的活性約高20-25％，如SRM所確定(見實(shí)施例10)。根瘤菌酶活性量最低，這可能與表達(dá)中注意到的折疊和溶解度問題相關(guān)。所有3種酶有活性位點(diǎn)谷氨酸(枯草芽孢桿菌編號(hào)系統(tǒng)中的43位)以及與丙酮酸形成Shiff堿基所需的賴氨酸(130位)；然而，枯草芽孢桿菌酶在47位包含活性位點(diǎn)殘基蘇氨酸，而不是精氨酸?？莶菅挎邨U菌KHG較小且似乎在簇中不同于苜蓿根病菌和大腸桿菌酶，其它酶有活性位點(diǎn)蘇氨酸?；钚晕稽c(diǎn)的差異可能是枯草芽孢桿菌酶活性增加的原因。
改進(jìn)醛縮酶活性催化抗體可與天然醛縮酶一樣有效，接受廣范圍的底物，并能用于催化圖2所示反應(yīng)。
也能通過定向進(jìn)化改進(jìn)醛縮酶，例如上述用于KDPG醛縮酶的例子(與上述KHG高度同源)，KDPG醛縮酶通過DNA改組和易錯(cuò)PCR來發(fā)展以去除對(duì)磷酸鹽的需求和反轉(zhuǎn)對(duì)映選擇性。KDPG醛縮酶多肽用于生化反應(yīng)，因?yàn)樗鼈兏叨忍禺愑诠w底物(本文是丙酮酸)，但對(duì)于受體底物(即吲哚-3-丙酮酸)相對(duì)靈活(Koeller和Wong，Nature 409232-9.2001)。KHG醛縮酶有縮合丙酮酸與一些羧酸的活性。認(rèn)為KHG醛縮酶的哺乳動(dòng)物形式的特異性比細(xì)菌形式更廣，包括對(duì)4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸活性較高和接受4-羥基-2-酮戊二酸的2種立體異構(gòu)體。細(xì)菌來源似乎對(duì)R異構(gòu)體有10倍的優(yōu)先性?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)中存在將近100個(gè)KHG同系物，在假單胞菌、副球菌、普羅威登斯菌、根瘤菌、摩根氏菌、大腸桿菌和哺乳動(dòng)物組織中證明活性。這些酶能用作修改對(duì)映特異性的起始點(diǎn)，monatin生成需要對(duì)映特異性。
利用丙酮酸和另一底物的醛縮酶能“進(jìn)化”以修改多肽特異性、速度和選擇性，另一底物是酮酸和/或有大的疏水基團(tuán)像吲哚。除了本文證明的KHG和ProA醛縮酶之外，這些酶的例子包括但不限于KDPG醛縮酶和相關(guān)多肽(KDPH)；來自類諾卡氏菌屬(Nocardioides sp)的轉(zhuǎn)羧基苯丙酮酸水合酶-醛縮酶；4-(2-羧苯基)-2-羥丁基(氧丁)-3-烯醇鹽醛縮酶(2’-羧基苯丙酮酸醛縮酶)，它縮合丙酮酸與2-羧基苯甲醛(一種含芳環(huán)的底物)；來自惡臭假單胞菌(P.Putida)和嗜芳香物鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)的反式-O-羥基苯亞甲基丙酮酸水合酶-醛縮酶，它也利用丙酮酸和含芳族的醛作為底物；3-羥基天冬氨酸醛縮酶(赤-3-羥基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)，它使用2-含氧酸作為底物且認(rèn)為在生物體脫氮微球菌(Micrococcus denitrificans)中；苯偶姻醛縮酶(苯甲醛裂合酶)，它利用含芐基的底物；二氫新蝶呤醛縮酶；L-蘇-3-苯基絲氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基絲氨酸醛縮酶)，它縮合甘氨酸與苯甲醛；4-羥基-2-氧戊酸醛縮酶；1，2-二羥基芐基丙酮酸醛縮酶和2-羥基苯丙酮酸醛縮酶。
通過篩選感興趣的克隆可選擇有所需活性的多肽，使用下列方法。色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型用表達(dá)盒上攜帶感興趣克隆的載體轉(zhuǎn)化且生長(zhǎng)于含少量monatin或MP的培養(yǎng)基。由于轉(zhuǎn)氨酶和醛縮酶反應(yīng)是可逆的，細(xì)胞能從monatin的外消旋混合物生成色氨酸。類似地，通過利用MP或monatin作為碳源和能源的能力可篩選生物體(重組和野生型)。靶醛縮酶的一個(gè)來源是多種假單胞菌和根瘤菌菌株的表達(dá)文庫(kù)。假單胞菌有許多不尋常的分解代謝途徑用于降解芳族分子，它們也包含許多醛縮酶；而根瘤菌包含醛縮酶，已知在植物根際中生長(zhǎng)，有許多描述用于構(gòu)建monatin生物合成途徑的基因。
實(shí)施例5化學(xué)合成Monatin前體實(shí)施例4描述的方法使用醛縮酶將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸monatin前體(MP)。此例子描述另一種化學(xué)合成MP的方法。
MP用典型的醛醇類型縮合形成(圖4)。簡(jiǎn)要地，典型的醛醇類型反應(yīng)包括用強(qiáng)堿基產(chǎn)生丙酮酸酯的碳負(fù)離子，如LDA(二異丙基酰胺鋰)、六甲基二硅氮烷鋰或丁基鋰。產(chǎn)生的碳負(fù)離子與吲哚-丙酮酸反應(yīng)以形成偶聯(lián)產(chǎn)物。
可用于保護(hù)吲哚氮的保護(hù)基團(tuán)包括但不限于t-丁氧基羰基(Boc)和芐氧基羰基(Cbz)。羧酸的阻斷基團(tuán)包括但不限于烷基酯(例如甲基、乙基、芐基酯)。當(dāng)使用這些保護(hù)基團(tuán)時(shí)，不可能控制所形成產(chǎn)物的立體化學(xué)。然而，如果R2和/或R3是手性保護(hù)基團(tuán)(圖4)如(S)-2-丁醇、甲醇或手性胺，可使一種MP對(duì)映異構(gòu)體的形成優(yōu)于另一種。
實(shí)施例6色氨酸或吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成Monatin體外方法使用轉(zhuǎn)氨酶和醛縮酶2種酶，從色氨酸和丙酮酸生成monatin。在第1個(gè)步驟中，α-酮戊二酸是轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中來自色氨酸氨基的受體，反應(yīng)產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛縮酶催化第2個(gè)反應(yīng)，其中丙酮酸在Mg2+和磷酸鹽存在時(shí)與吲哚-3-丙酮酸反應(yīng)，產(chǎn)生monatin(MP)2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的α-酮衍生物。轉(zhuǎn)移第1個(gè)反應(yīng)中形成的谷氨酸的氨基生成所需產(chǎn)物monatin。純化和表征產(chǎn)物確定形成的異構(gòu)體是S，S-monatin。描述另外的底物、酶和條件以及對(duì)此方法進(jìn)行的改進(jìn)。
酶克隆、表達(dá)和純化來自睪丸酮叢毛單胞菌的醛縮酶、4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛縮酶，proA基因)(EC 4.1.3.17)，如實(shí)施例4所述?？寺　⒈磉_(dá)和純化來自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和苜蓿根病菌的4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛縮酶)(EC 4.1.3.16)，如實(shí)施例4所述。
用于結(jié)合醛縮酶以生成monatin的轉(zhuǎn)氨酶是大腸桿菌aspC基因編碼的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、大腸桿菌tyrB基因編碼的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶、苜蓿根病菌TatA酶、碩大利什曼原蟲bsat基因編碼的廣底物轉(zhuǎn)氨酶或來自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(IIa型)。實(shí)施例1描述非哺乳動(dòng)物蛋白的克隆、表達(dá)和純化。來自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(IIa型)獲得自Sigma(#G7005)。
使用ProA醛縮酶和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的方法1升反應(yīng)混合物中包含50mM醋酸銨，pH8.0、0.4mM MgCl2、3mM磷酸鉀、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸銨、50mM色氨酸、10mM α-酮戊二酸、160mg重組睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶(未純化細(xì)胞提取物，～30％醛縮酶)、233mg重組大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(未純化細(xì)胞提取物，～40％醛縮酶)。除了酶，所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。隨后加入酶，反應(yīng)溶液30℃孵育并溫和振蕩(100rpm)3.5小時(shí)。酶加入后0.5和1小時(shí)，固體色氨酸等分樣品(各50mmoles)加入反應(yīng)。所有加入的色氨酸不溶解，但濃度維持于50mM或更高。3.5小時(shí)后，濾去固體色氨酸。使用確定的色氨酸量作為標(biāo)準(zhǔn)通過LC/MS分析反應(yīng)混合物顯示溶液中的色氨酸濃度為60.5mM且monatin濃度為5.81mM(1.05g)。
下列方法用于純化終產(chǎn)物。百分之90的清溶液應(yīng)用于BioRad AG50W-X8樹脂柱(225mL；結(jié)合力為1.7meq/mL)。柱用水洗，收集300mL部分，直到280nm的吸光度＜5％首先流過部分的。然后柱用1M醋酸銨，pH8.4洗脫，收集4個(gè)300-mL部分。所有4個(gè)部分包含monatin并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)到105mL，蒸發(fā)器裝有溫水浴。隨著體積減小形成沉淀且在蒸發(fā)過程中濾去。
通過LC/MS分析柱部分顯示99％色氨酸和monatin結(jié)合柱。蒸發(fā)過程中形成的沉淀包含＞97％的色氨酸和＜2％的monatin。上清中色氨酸與產(chǎn)物的比例約為2∶1。
上清(7ml)應(yīng)用于100mL快流DEAE瓊脂糖(Amersham Biosciences)柱，柱以前通過0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸銨，pH8.4和0.5L水洗轉(zhuǎn)變成醋酸鹽形式。上清以＜2mL/分鐘上樣，柱用3-4mL/分鐘的水洗直到280nm的吸光度～0。Monatin用100mM醋酸銨，pH8.4洗脫，收集4個(gè)100-mL部分。
部分的分析顯示流過部分的色氨酸與monatin比例為85∶15且洗脫部分的比例為7∶93。假定monatin在280nm的消光系數(shù)與色氨酸相同，洗脫部分包含0.146mmole產(chǎn)物。對(duì)于68％的回收，推斷總共1L的反應(yīng)會(huì)生成～2.4mmoles(～710mg)monatin。
來自DEAE瓊脂糖柱的洗脫部分蒸發(fā)到＜20mL。通過應(yīng)用到C8制備性反相柱進(jìn)一步純化等分產(chǎn)物，所用色譜條件與實(shí)施例10所述用于分析-規(guī)模monatin特征的相同。Waters FractionlynxTM軟件用于在檢測(cè)m/z＝293離子基礎(chǔ)上觸發(fā)自動(dòng)分部收集monatin。C8柱對(duì)應(yīng)于monatin的質(zhì)子化分子離子，收集來自C8柱的部分，蒸發(fā)到干燥，隨后溶于小體積水。此部分用于產(chǎn)物的表征。
所得產(chǎn)物用下列方法確定特征。
UV/可見光譜學(xué).UV/可見光譜測(cè)量酶法生成的monatin用Cary 100 Bio UV/可見光分光光度計(jì)完成。溶于水的純化產(chǎn)物顯示280nm的最大吸收，肩部在288nm，是含吲哚的化合物的典型特征。
LC/MS分析.用于monatin的混合物分析如實(shí)施例10所述完成，monatin獲得自體外生化反應(yīng)。圖5描述體外酶合成混合物中monatin的典型LC/MS分析。圖5的下面一組闡明monatin的質(zhì)子化分子離子在m/z＝293的所選離子色譜?；旌衔镏械拇薽onatin鑒定通過圖6所述質(zhì)譜確證。LC/MS分析純化產(chǎn)物顯示293的分子離子單峰和280nm的吸光度。質(zhì)譜與圖6所示相同。
MS/MS分析.如實(shí)施例10所述，也對(duì)monatin進(jìn)行LC/MS/MS子離子實(shí)驗(yàn)。圖7闡述monatin的子離子質(zhì)譜。試驗(yàn)性結(jié)構(gòu)分配圖7中標(biāo)記的所有片段離子。這些包括m/z＝275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳離子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳離子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳離子)、130(3-亞甲基-1H-吲哚-正碳離子)和118(吲哚正碳離子)的片段離子。預(yù)料的那樣，如果獲得自分子的吲哚部分，許多這些情況與MP獲得的(實(shí)施例4)相同。由于存在氨基而不是酮，一些比MP所見高1個(gè)質(zhì)量單位。
高分辨MS分析.圖8闡明獲得的純化monatin的質(zhì)譜，使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star雜合四極/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。使用色氨酸作為內(nèi)部質(zhì)量校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)子化monatin的測(cè)量質(zhì)量是293.1144。在C14H17N2O5元素組成的基礎(chǔ)上，質(zhì)子化monatin的計(jì)算質(zhì)量是293.1137。此質(zhì)量測(cè)量誤差小于每百萬分二(2ppm)，提供酶法生成monatin的元素組成的確證。
NMR光譜學(xué).NMR實(shí)驗(yàn)在Varian Inova 500MHz儀器上進(jìn)行。monatin樣品(～3mg)溶于0.5ml D2O。溶劑(D2O)起初用作4.78ppm的內(nèi)部參考。由于水的峰大，運(yùn)行1H-NMR抑制水峰。隨后，由于水峰的廣度，monatin的C-2質(zhì)子用作參考峰，設(shè)在7.192ppm的發(fā)表值。
對(duì)于13C-NMR，幾百次掃描的初始運(yùn)行表明樣品太稀釋不能在規(guī)定時(shí)間獲得適當(dāng)13C譜。因此，進(jìn)行異核多級(jí)量子相干(HMQC)實(shí)驗(yàn)，它能使其附著的氫和碳相關(guān)，也提供碳化學(xué)位移的信息。
表2和3顯示1H和HMQC數(shù)據(jù)的概括。通過與發(fā)表值比較，NMR數(shù)據(jù)表明酶法生成的monatin是(S，S)、(R，R)或兩者的混合物。
手性LC/MS分析.為確定體外生成的monatin是一種異構(gòu)體而不是(R，R)和(S，S)對(duì)映異構(gòu)體的混合物，手性LC/MS分析用實(shí)施例10所述儀器完成。
手性LC分離用Chirobiotic T(高級(jí)分離技術(shù))手性色譜柱在室溫進(jìn)行。在供應(yīng)商發(fā)表的方案基礎(chǔ)上，最優(yōu)化色氨酸的R-(D)和S-(L)異構(gòu)體的分離和檢測(cè)。LC流動(dòng)相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。洗脫在70％A和30％b為等度。流速為1.0mL/分鐘，從200nm到400nm監(jiān)控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和monatin的儀器參數(shù)與實(shí)施例10所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z150-400區(qū)的質(zhì)譜。質(zhì)子化分子離子的所選離子色譜(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+＝205且用于monatin的[M+H]+＝293)，可直接鑒定混合物中的這些分析物。
圖9顯示R-和S-色氨酸和monatin的色譜，它們由手性色譜分離并通過MS監(jiān)控。monatin色譜中的單峰表明該化合物是一種異構(gòu)體，保留時(shí)間幾乎與S-色氨酸相同。
表21H-NMR數(shù)據(jù)
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.13095-8，1992).
2Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26).
表313C-NMR數(shù)據(jù)(來自HMQC譜)
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.13095-8，1992).
旋光測(cè)定.在Rudolph Autopol III旋光儀上測(cè)量旋光性。Monatin制備為14.6mg/mL的水溶液。對(duì)于1g/mL水溶液，S，S monatin(鹽形式)的預(yù)期比旋光([α]D20)是-49.6(Veleggaar等)。觀察到純化、酶法生成monatin的[α]D20為-28.1，表明它是S，S異構(gòu)體。
改進(jìn)最優(yōu)化包括試劑和酶濃度的反應(yīng)條件，10mg/mL的產(chǎn)量用下列試劑混合物產(chǎn)生50mM醋酸銨，pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸(鈉或銨鹽)、5mMα-酮戊二酸(鈉鹽)、0.05mM吡哆醛磷酸、用于在酶加入后達(dá)到1mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀、50μg/mL重組ProA醛縮酶(細(xì)胞提取物；總蛋白濃度為167μg/mL)、1000μg/mL大腸桿菌aspC基因編碼的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(細(xì)胞提取物；總蛋白濃度為2500μg/mL)和使?jié)舛龋?0mM的固體色氨酸(飽和；一些在反應(yīng)中未溶解)?；旌衔镌?0℃孵育4小時(shí)并溫和攪拌或混合。
取代α-酮戊二酸的濃度能減少到1mM并補(bǔ)充9mM天冬氨酸，monatin的產(chǎn)量相等。另外的氨基酸受體可用于第1個(gè)步驟，如草酰乙酸。
當(dāng)重組碩大利什曼原蟲廣底物轉(zhuǎn)氨酶用于取代大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，獲得類似的monatin產(chǎn)量。然而，分子量為292的第2種未鑒定產(chǎn)物也通過LC-MS分析檢測(cè)。當(dāng)大腸桿菌tyrB編碼的酶、苜蓿根病菌tatA編碼的酶或來自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(IIa型)作為轉(zhuǎn)氨酶加入時(shí)，產(chǎn)生0.1-0.5mg/mL的monatin濃度。當(dāng)反應(yīng)從吲哚-3-丙酮酸開始時(shí)，還原性胺化可用于最后步驟，此步有谷氨酸脫氫酶和NADH(如實(shí)施例7)。
來自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和苜蓿根病菌的KHG醛縮酶也與大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶一起使用以酶法生成monatin。使用下列反應(yīng)條件50mM NH4-OAcpH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、用于在酶加入后達(dá)到0.5mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀、20μg/mL重組枯草芽孢桿菌KHG醛縮酶(純化的)、大約400μg/mL來自細(xì)胞提取物的未純化大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反應(yīng)在30℃振蕩孵育30分鐘。用枯草芽孢桿菌酶法生成的monatin量為80ng/mL，隨著醛縮酶量增加而提高。如果飽和量的色氨酸和5mM α-酮戊二酸取代吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，monatin產(chǎn)量增加到360ng/mL。重復(fù)反應(yīng)，用50mM Tris pH8.3中的3種30μg/mL KHG酶和飽和量的色氨酸，進(jìn)行1小時(shí)以增加檢測(cè)。如實(shí)施例4，桿菌酶活性最高，產(chǎn)生約4000ng/mL monatin。大腸桿菌KHG產(chǎn)生3000ng/mL monatin，苜蓿根病菌酶產(chǎn)生2300ng/mL。
實(shí)施例7MP和Monatin間的互變MP的胺化以形成monatin可通過轉(zhuǎn)氨酶催化如實(shí)施例1和6鑒定的酶，或通過需要還原輔因子如NADH或NADPH的脫氫酶。這些反應(yīng)是可逆的且能以任何一個(gè)方向測(cè)量。當(dāng)使用脫氫酶時(shí)，方向性主要通過銨鹽的濃度控制。
脫氫酶活性.隨著NAD(P)+轉(zhuǎn)變成更發(fā)色的NAD(P)H，通過跟蹤340nm吸光度增加來監(jiān)控monatin的氧化脫氨。如實(shí)施例6所述酶法生成和純化monatin。
典型的0.2mL測(cè)定混合物中包含50mM Tris-HCl，pH8.0到8.9、0.33mM NAD+或NADP+、2到22單位的谷氨酸脫氫酶(Sigma)和10-15mM底物。測(cè)定在UV-透明微量滴定板中進(jìn)行2次，用Molecular Devices SpectraMax Plus板閱讀器。酶、緩沖液和NAD(P)+的混合物移吸入含底物的孔，短暫混合后，以10秒間隔監(jiān)控340nm的吸光度增加。反應(yīng)在25℃孵育10分鐘。負(fù)對(duì)照不加入底物完成，谷氨酸用作正對(duì)照。來自牛肝的III型谷氨酸脫氫酶(Sigma#G-7882)催化monatin轉(zhuǎn)變?yōu)閙onatin前體，轉(zhuǎn)變率約為谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酮戊二酸的百分之一。
轉(zhuǎn)氨活性.用來自大腸桿菌的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)、來自大腸桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TyrB)、來自碩大利什曼原蟲的廣底物轉(zhuǎn)氨酶(BSAT)和2個(gè)實(shí)施例1所述可商業(yè)購(gòu)買的豬谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行monatin轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作為氨基受體測(cè)試。測(cè)定混合物包含(0.5mL中)50mM Tris-HCl，pH8.0、0.05mM PLP、5mM氨基受體、5mM monatin和25μg轉(zhuǎn)氨酶。測(cè)定在30℃孵育30分鐘，通過加入0.5mL異丙醇終止反應(yīng)。Monatin損失通過LC/MS監(jiān)控(實(shí)施例10)。注意到以草酰乙酸作為氨基受體的碩大利什曼原蟲BSAT活性量最高，接著是以α-酮戊二酸作為氨基受體的相同酶。草酰乙酸的相對(duì)活性是BSAT＞AspC＞豬IIa型＞豬I型＝TyrB。α-酮戊二酸的相對(duì)活性是BSAT＞AspC＞豬I型＞豬IIa型＞TyrB。
實(shí)施例8從色氨酸和除了丙酮酸的C3來源生成Monatin如上面實(shí)施例6所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能轉(zhuǎn)變成monatin，使用丙酮酸作為C3分子。然而，在一些情況中，丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源昂貴，或如果加入培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵有不利影響。丙氨酸可通過許多PLP-酶轉(zhuǎn)氨以產(chǎn)生丙酮酸。
色氨酸酶類似酶進(jìn)行β-消除反應(yīng)的速度快于其它PLP酶如轉(zhuǎn)氨酶。來自此類別(4.1.99.-)的酶能從氨基酸產(chǎn)生氨和丙酮酸，氨基酸如L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有良好離去基團(tuán)的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-絲氨酸、O-芐基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-芐基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。
用EC 4.1.99.-多肽生成monatin的方法可通過突變?chǔ)?酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶改進(jìn)，根據(jù)Mouratou等(J.Biol.Chem 2741320-5，1999)的方法。Mouratou等描述將β-酪氨酸酶轉(zhuǎn)變成二羧氨基酸β-裂合酶的能力，此裂合酶沒有報(bào)導(dǎo)在自然界中產(chǎn)生。通過使纈氨酸(V)283轉(zhuǎn)變成精氨酸(R)和精氨酸(R)100變成蘇氨酸(T)來完成特異性變化。這些氨基酸變化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脫氨反應(yīng)(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也能用作丙氨酸來源用于隨后的醛醇縮合反應(yīng)。
另外，能提供乳酸和將乳酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸的酶給細(xì)胞或酶反應(yīng)器。能催化此反應(yīng)的酶的例子包括乳酸脫氫酶和乳酸氧化酶。
分離基因組DNA以前報(bào)導(dǎo)過色氨酸酶多肽，例如Mouratou等(JBC 2741320-5，1999)。為分離編碼色氨酸酶多肽的基因，來自大腸桿菌DH10B的基因組DNA用作PCR模板，如實(shí)施例1所述。
用于酪氨酸-酚裂合酶的基因分離自弗氏檸檬酸桿菌(ATCC目錄號(hào)8090，命名ATCC 133 16；NCTC 9750)并在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Difco 0001)和營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco 0003)中37℃生長(zhǎng)到OD為2.0?；蚪MDNA用Qiagen Genomic-tipTM100/G試劑盒純化。
PCR擴(kuò)增編碼序列設(shè)計(jì)引物的突出端與pET30 Xa/LIC載體(Novagen，Madison，WI)相容，如上面實(shí)施例1所述。
大腸桿菌tna(SEQ ID NO41).用于pET30 Xa/LIC克隆的N-末端引物5’-GGTATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3’(SEQ ID NO43)。用于pET30 Xa/LIC克隆的C-末端引物5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACTTCT TTA AGT TTT G-3’(SEQ ID NO44)。
弗氏檸檬酸桿菌tpl(SEQ ID NO42).用于pET30 Xa/LIC克隆的N-末端引物5’-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3’(SEQ ID NO45)。用于pET30 Xa/LIC克隆的C-末端引物5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAGATG TAATCAAAGCGTG-3’(SEQ ID NO46)。
Eppendorf MastercyclerTM梯度5331熱循環(huán)儀用于所有PCR反應(yīng)。50μL中加入0.5μg模板(基因組DNA)、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U擴(kuò)增高保真聚合酶(Roche)、有Mg的1X ExpandTM緩沖液和5％DMSO(終濃度)。所用熱循環(huán)儀PCR程序如下96℃熱啟動(dòng)(5分鐘)，94℃-30秒，40-60℃-1分鐘45秒，72℃-2分鐘15秒；30個(gè)重復(fù)。最后的聚合步驟是7分鐘，隨后樣品4℃貯存。
克隆上面實(shí)施例1詳細(xì)描述的克隆和陽性克隆鑒定過程用于鑒定適當(dāng)克隆。
基因表達(dá)和活性測(cè)定質(zhì)粒DNA(通過序列分析確認(rèn))亞克隆入表達(dá)宿主BLR(DE3)(Novagen)。培養(yǎng)物在含30mg/L卡那霉素的LB中生長(zhǎng)，質(zhì)粒用Qiagen miniprep試劑盒分離，并通過限制酶切消化分析以確定同一性。
用BL21(DE3)表達(dá)宿主進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建物在含50mg/L卡那霉素的LB中37℃生長(zhǎng)。培養(yǎng)物的OD600達(dá)到約0.6后，蛋白表達(dá)用0.1mM IPTG誘導(dǎo)。細(xì)胞在30℃生長(zhǎng)4小時(shí)并離心收集。然后細(xì)胞在5mL/g濕細(xì)胞重的BugBusterTM(Novagen)試劑中裂解，試劑含5μL/mL蛋白酶抑制劑混合物#III批(Calbiochem)和1μL/mLbenzonase核酸酶(Novagen)，His-標(biāo)記的重組蛋白用His-結(jié)合柱體純化，如上面實(shí)施例1所述。純化蛋白在PD-10(G25 Sephadex，Amersham Biosciences)柱上脫鹽并在100mM Tris-Cl緩沖液，pH8.0中洗脫。蛋白在4-15％梯度凝膠上通過SDS-PAGE分析以檢測(cè)在預(yù)測(cè)的重組融合蛋白分子量的可溶蛋白水平。
誘變多肽類4.1.99.-(色氨酸酶和β-酪氨酸酶)的一些成員與天冬氨酸或沒有任何修飾的類似氨基酸進(jìn)行β-裂合酶反應(yīng)。然而，一些類別成員可能需要誘變以使用底物和/或產(chǎn)生產(chǎn)物。此外，在一些情況中，能進(jìn)行轉(zhuǎn)變的多肽可進(jìn)一步通過誘變最優(yōu)化。
定點(diǎn)誘變?cè)赑LP-結(jié)合多肽的3D結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行。下面顯示改變多肽的底物特異性的2個(gè)例子。
誘變色氨酸酶例子1下面提供的誘變操作在氨基酸序列中導(dǎo)入2個(gè)點(diǎn)突變。第1個(gè)點(diǎn)突變使103位的精氨酸(R)變?yōu)樘K氨酸(T)，第2個(gè)點(diǎn)突變使299位的纈氨酸(V)變?yōu)榫彼?R)(大腸桿菌成熟蛋白的編號(hào)系統(tǒng))。誘變實(shí)驗(yàn)由ATG Laboratories(Eden Prairie，MN)進(jìn)行。通過PCR基因片段連續(xù)引入突變且片段重裝配也由PCR完成。將精氨酸(R)103轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(T)的引物5’-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3’(SEQ ID NO47)和5’-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3’(SEQ ID NO48)。
將纈氨酸(V)299轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?R)的引物5’-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3’(SEQ ID NO49)和5’-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3’(SEQ ID NO50)。
突變體通過XbaI/HindIII和SphI限制酶切消化篩選，通過測(cè)序確認(rèn)。
誘變酪氨酸酚裂合酶(β-酪氨酸酶)例子2對(duì)酪氨酸酚裂合酶氨基酸序列進(jìn)行2次點(diǎn)突變。這些突變使100位的精氨酸(R)轉(zhuǎn)變成蘇氨酸(T)且283位的纈氨酸(V)轉(zhuǎn)變成精氨酸(R)(在弗氏檸檬酸桿菌成熟蛋白序列中)。
用于R100T轉(zhuǎn)變的引物是5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’(SEQ ID NO51)和5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’(SEQ IDNO52)。用于V283R的引物是5’-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3’(SEQ ID NO53)和5’-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3’(SEQ ID NO54)。
使用上述方法，通過KpnI/SacI消化篩選克隆。通過雙脫氧鏈終止測(cè)序確認(rèn)序列。如上面野生型酶所述產(chǎn)生重組蛋白。
反應(yīng)混合物包括50mM Tris-Cl pH8.3、2mM MgCl2、200mM C3碳源、5mMα-酮戊二酸、鈉鹽、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后達(dá)到0.5mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀pH7.5、25μg如實(shí)施例4制備的粗重組睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶、500μg如實(shí)施例1制備的粗L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)、使?jié)舛龋?0mM的固體色氨酸(飽和；一些在反應(yīng)中未溶解)。反應(yīng)混合物在30℃混合孵育30分鐘。提供絲氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作為3-碳源。用或不用二級(jí)PLP酶(純化的進(jìn)行測(cè)定)，PLP酶能進(jìn)行β-消除反應(yīng)和β-裂合酶反應(yīng)(色氨酸酶(TNA)，雙突變體色氨酸酶，β-酪氨酸酶(TPL))。結(jié)果示于表4表4用另外的C3-碳源產(chǎn)生monatin
從作為3-碳源的丙氨酸和絲氨酸產(chǎn)生的monatin通過LC/MS/MS子掃描分析確認(rèn)，與實(shí)施例6中產(chǎn)生的monatin特征相同。丙氨酸是測(cè)試的最佳選擇之一，通過AspC酶轉(zhuǎn)氨。產(chǎn)生的monatin量通過加入色氨酸酶而增加，色氨酸酶能作為二級(jí)活性轉(zhuǎn)氨。通過加入色氨酸酶，用絲氨酸作為碳源產(chǎn)生的monatin量幾乎加倍，即使與轉(zhuǎn)氨酶相比僅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC可有一些單獨(dú)的β-消除活性的量。天冬氨酸的結(jié)果表明色氨酸酶對(duì)天冬氨酸的活性不隨著定點(diǎn)誘變?cè)黾?，定點(diǎn)誘變與前面β-酪氨酸酶提示的相同。預(yù)期突變體β-酪氨酸酶具有產(chǎn)生monatin的較高活性。
實(shí)施例9化學(xué)合成Monatin丙氨酸加入吲哚-3-丙酮酸生成monatin，此反應(yīng)能用Grignard或有機(jī)鋰試劑合成進(jìn)行。
例如，鎂在無水條件下加入3-氯-3-溴-丙氨酸，3-氯-3-溴-丙氨酸在羧基和氨基被適當(dāng)阻斷。隨后加入吲哚-3-丙酮酸(適當(dāng)阻斷)以形成偶聯(lián)產(chǎn)物，接著去除保護(hù)基團(tuán)以形成monatin。特別有用的保護(hù)基團(tuán)包括THP(四氫吡喃基醚)，它易附著和去除。
實(shí)施例10檢測(cè)Monatin和MP此例子描述的方法用于檢測(cè)monatin或其前體2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的存在。
LC/MS分析用于體外或體內(nèi)生化反應(yīng)獲得的monatinα-酮酸形式(monatin前體，MP)和monatin的混合物分析用Waters/Micromass液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)儀器進(jìn)行，包括Waters 2690液相色譜，裝有Waters 996光電二極管陣列(PDA)吸光度監(jiān)控器，串聯(lián)置于色譜與Micromass Quattro Ultima三重四極質(zhì)譜儀間。LC分離用Supelco Discovery C18反相色譜柱，2.1mm×150mm或Xterra MS C8反相色譜柱，2.1mm×250mm室溫進(jìn)行。LC流動(dòng)相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。
梯度洗脫是從5％B到35％B線性，0-9分鐘，從35％B到90％B線性，9-16分鐘，在90％B等度，16-120分鐘，從90％B到5％B線性，20-22分鐘，各運(yùn)行間有10分鐘再平衡階段。流速是0.25mL/分鐘，從200nm到4000nm監(jiān)控PDA吸光度。最優(yōu)化所有ESI-MS參數(shù)且在產(chǎn)生感興趣分析物的質(zhì)子化分子離子([M+H]+)、生成特征性片段離子基礎(chǔ)上選擇。
下列儀器參數(shù)用于LC/MS分析monatin毛細(xì)管3.5kV；圓錐40V；Hex 120V；孔徑0V；Hex 20V；來源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體50L/h；低質(zhì)量分辨(Q1)15.0；高質(zhì)量分辨(Q1)15.0；離子能量0.2；進(jìn)入50V；碰撞能量2；出口50V；低質(zhì)量分辨(Q2)15；高質(zhì)量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)3.5；倍增器650。報(bào)導(dǎo)的質(zhì)量/電荷比(m/z)和分子量的不確定性為±0.01％?；旌衔镏衜onatin α-酮酸形式(MP)和monatin的初始檢測(cè)用LC/MS監(jiān)控完成，收集m/z150-400區(qū)的質(zhì)譜。質(zhì)子化分子離子的所選離子色譜(用于MP的[M+H]+＝292，用于monatin的[M+H]+＝293)可直接鑒定混合物中的這些分析物。
MS/MS分析如下對(duì)monatin進(jìn)行LC/MS/MS子離子實(shí)驗(yàn)。子離子分析包括將感興趣的母離子(如對(duì)于monatin，m/z＝293)從第1個(gè)質(zhì)量分析器(Q1)傳送到質(zhì)譜的碰撞細(xì)胞，其中導(dǎo)入氬并使母離子化學(xué)解離成片段(子)離子。隨后用第2個(gè)質(zhì)量分析器(Q2)檢測(cè)這些片段離子，它們可用于確證母離子結(jié)構(gòu)分配。
下列儀器參數(shù)用于LC/MS/MS分析monatin毛細(xì)管3.5kV；圓錐40V；Hex120V；孔徑0V；Hex 20V；來源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐體氣體50L/h；低質(zhì)量分辨(Q1)13.0；高質(zhì)量分辨(Q1)13.0；離子能量0.2；進(jìn)入-5V；碰撞能量14；出口1V；低質(zhì)量分辨(Q2)15；高質(zhì)量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)3.5；倍增器650。
高通量測(cè)定Monatin高通量分析(＜5分鐘/樣品)monatin的混合物用上述儀器完成，monatin來源于體外和體內(nèi)反應(yīng)，參數(shù)與LC/MS/MS所述相同。用Waters Xterra MS C8(2.1mm×50mm)色譜室溫進(jìn)行LC分離，在15％含水MeOH、0.25％醋酸中等度洗脫，流速為0.3mL/分鐘。用選擇的反應(yīng)監(jiān)控(SRM)-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)混合物中的monatin。這包括監(jiān)控特定碰撞誘導(dǎo)的母離子([M+H]+＝293.1)轉(zhuǎn)變到子離子(如m/z＝168.1的片段離子，暫定為3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳離子)以最大敏感性、選擇性和通量用于檢測(cè)monatin。平行收集PDA吸光度以進(jìn)一步確定monatin特性。
實(shí)施例11在細(xì)菌中產(chǎn)生Monatin此例子描述的方法用于在大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生monatin。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解類似方法可用于在其它細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生monatin。此外，可使用含monatin合成途徑中其它基因(圖2)的載體。
極限培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基用于增加大腸桿菌細(xì)胞中的色氨酸產(chǎn)量(Zeman等Folica Microbiol.35200-4，1990)，此培養(yǎng)基如下制備。700mL納米純水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4、13.6g KH2PO4、0.2g MgSO4*7H2O、0.01gCaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O。pH調(diào)至7.0，體積增加到850mL，培養(yǎng)基高壓滅菌。單獨(dú)制備50％葡萄糖溶液并無菌過濾。40mL加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(850mL)，終體積1L。
10g/L L-色氨酸溶液在0.1M磷酸鈉pH7中制備并無菌過濾。通常加入十分之一體積到下面特定的培養(yǎng)物。也制備10％丙酮酸鈉溶液并無菌過濾。每升培養(yǎng)物通常使用10mL等分樣品。制備氨芐青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)貯存液，無菌過濾，使用前-20℃貯存。吐溫20(聚氧乙烯20-單月桂酸山梨聚糖)以0.2％(體積/體積)終濃度使用。氨芐青霉素以非致死濃度使用，通常為1-10μg/mL終濃度。
大腸桿菌BL21(DE3)睪丸酮叢毛單胞菌proA/pET30 Xa/LIC的新鮮平板(實(shí)施例4中描述)在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上制備。從單菌落中接種過夜培養(yǎng)物(5mL)且30℃生長(zhǎng)于有卡那霉素的LB培養(yǎng)基。通常，1到50接種物用于trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)。加入新鮮抗生素到50mg/L的終濃度。誘導(dǎo)前，搖瓶在37℃振蕩生長(zhǎng)。
每小時(shí)細(xì)胞取樣，直到獲得0.35-0.8的OD600。隨后用0.1mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞，溫度降到34℃。誘導(dǎo)前(零時(shí)間點(diǎn))收集樣品(1ml)并5000xg離心。上清在-20℃冷凍用于LC/MS分析。誘導(dǎo)后4小時(shí)，收集另外的1mL樣品，離心以從細(xì)胞沉淀中分離培養(yǎng)液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸鈉、氨芐青霉素和吐溫。
誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)48小時(shí)，另取1mL樣品且如上制備。在48小時(shí)時(shí)，加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生長(zhǎng)約70小時(shí)后(誘導(dǎo)后)，3500rpm 4℃離心整個(gè)培養(yǎng)物體積20分鐘。輕輕倒出上清，培養(yǎng)液和細(xì)胞都在-80℃冷凍。過濾培養(yǎng)液部分并通過LC/MS分析。如實(shí)施例10所述監(jiān)控[M+H]+＝293峰的高度和面積。減去培養(yǎng)基的背景水平。數(shù)據(jù)也對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)化，這是通過繪出[M+H]+＝293峰的高度圖，峰高除以培養(yǎng)物在600nm的光密度。
當(dāng)丙酮酸、氨芐青霉素和吐溫在誘導(dǎo)后4小時(shí)而不是誘導(dǎo)時(shí)加入時(shí)，產(chǎn)生較高水平的monatin。其它添加物如PLP、另外的磷酸鹽或MgCl2不增加monatin產(chǎn)量。當(dāng)使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸時(shí)且當(dāng)色氨酸在誘導(dǎo)后而不是接種或誘導(dǎo)時(shí)加入時(shí)，獲得較高效價(jià)的monatin。誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后4小時(shí)(底物加入時(shí))，發(fā)酵液或細(xì)胞提取物中通常沒有可檢測(cè)水平的monatin。負(fù)對(duì)照僅用有pET30a載體的細(xì)胞以及培養(yǎng)物進(jìn)行，培養(yǎng)物中不加入色氨酸和丙酮酸。親代MS掃描證明且(m+1)/z＝293的化合物不來源于較大分子，子掃描(如實(shí)施例10進(jìn)行)類似于體外產(chǎn)生的monatin。
用0、0.2％(體積/體積)和0.6％終濃度吐溫-20研究吐溫的效果。搖瓶產(chǎn)生的最高monatin量是0.2％吐溫。氨芐青霉素濃度在0和10μg/mL間變化。細(xì)胞培養(yǎng)液中的monatin量在0和1μg/mL間迅速增加(2.5×)，當(dāng)氨芐青霉素濃度從1增加到10μg/mL時(shí)，monatin量增加1.3X。
顯示典型結(jié)果的時(shí)程實(shí)驗(yàn)示于圖10。即使當(dāng)值對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液的monatin量增加。通過使用色氨酸的摩爾消光系數(shù)，培養(yǎng)液中的monatin量估計(jì)小于10μg/mL。重復(fù)相同實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞含載體沒有proA插入。許多數(shù)字為負(fù)，表明這些培養(yǎng)物中m/z＝293的峰高度小于單獨(dú)培養(yǎng)基中的峰高度(圖10)。當(dāng)色氨酸和丙酮酸缺乏時(shí)，數(shù)字一致地較低，證明monatin生成是醛縮酶催化酶反應(yīng)的結(jié)果。
細(xì)菌細(xì)胞中的monatin體內(nèi)生成在800mL搖瓶實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐中重復(fù)。通過陰離子交換層析和制備性反相液相色譜純化250mL monatin樣品(在無細(xì)胞的培養(yǎng)液中)。蒸發(fā)此樣品，用于高分辨質(zhì)量分析(如實(shí)施例6所述)。高分辨MS表明生成的代謝物是monatin。
體外測(cè)定說明轉(zhuǎn)氨酶需要以高于醛縮酶的水平存在(參見實(shí)施例6)，因此來自大腸桿菌的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超量表達(dá)，結(jié)合醛縮酶基因以增加產(chǎn)生的monatin量。設(shè)計(jì)引物以將睪丸酮叢毛單胞菌proA導(dǎo)入有aspC/pET30 Xa/LIC的操縱子，引物如下5’引物ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO67)和3’引物CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQID NO68)。5’引物包含BamHI位點(diǎn)，3’引物包含SalI位點(diǎn)用于克隆。PCR如實(shí)施例4所述進(jìn)行并凝膠純化。aspC/pET30 Xa/LIC構(gòu)建物用BamHI和SalI消化，PCR產(chǎn)物也如此。消化物用Qiagen自旋柱純化。根據(jù)廠商說明用Roche迅速DNA連接試劑盒(Indianapolis，IN)將proA PCR產(chǎn)物連接到載體。用NovabluesSingles(Novagen)進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，如實(shí)施例1所述。菌落在含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)且質(zhì)粒DNA用Qiagen spin miniprep試劑盒純化。通過限制酶切消化篩選克隆并由Seqwright(Houston，TX)確定序列。構(gòu)建物亞克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。ProA/pET30 Xa/LIC構(gòu)建物也轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)pLysS。
在上述標(biāo)準(zhǔn)條件下初始比較BLR(DE3)搖瓶樣品證明加入第2個(gè)基因(aspC)使產(chǎn)生的monatin量提高7倍。為加速生長(zhǎng)，使用BL21(DE3.)-衍生宿主菌株。proA克隆和2個(gè)基因操縱子克隆在上面的Trp-1培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，pLysS宿主也有加入培養(yǎng)基的氯霉素(34mg/L)。進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，有和沒有加入0.2％吐溫-20和1mg/L氨芐青霉素。用體外生成的純化monatin作為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算培養(yǎng)液中的monatin量。SRM分析如實(shí)施例10所述進(jìn)行。在零、4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞取樣。
結(jié)果示于表5，顯示培養(yǎng)液中生成的最大量。在大多數(shù)情況下，2個(gè)基因構(gòu)建物產(chǎn)生的值高于單獨(dú)proA構(gòu)建物。細(xì)胞膜更易滲漏的pLysS菌株分泌的monatin水平較高，盡管這些菌株通常以較慢的速度生長(zhǎng)。加入吐溫和氨芐青霉素有益。
表5大腸桿菌生成的Monatin量
實(shí)施例12酵母中生成Monatin此例子描述用于在真核細(xì)胞中生成monatin的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解類似方法可用于在任何感興趣細(xì)胞中生成monatin。此外，除了此例子所述或作為一個(gè)代替的辦法，可使用其它基因(例如圖2所列)。
pESC酵母抗原表位標(biāo)記載體系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA)用于克隆和表達(dá)大腸桿菌aspC和睪丸酮叢毛單胞菌proA基因入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。pESC載體包含相反鏈上的GAL1和GAL10啟動(dòng)子，有2個(gè)不同多克隆位點(diǎn)，可同時(shí)表達(dá)2個(gè)基因。pESC-His載體也包含His3基因用于互補(bǔ)宿主(YPH500)中的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。GAL1和GAL10啟動(dòng)子受葡萄糖抑制且由半乳糖誘導(dǎo)；Kozak序列用于在酵母中最佳表達(dá)。pESC載體是穿梭載體，能在大腸桿菌中產(chǎn)生初始構(gòu)建物(bla基因用于選擇)；然而，多克隆位點(diǎn)中沒有細(xì)菌核糖體結(jié)合部位。
設(shè)計(jì)下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位點(diǎn)加下劃線，Kozak序列粗體)
aspC(BamHI/SalI)，GAL15’-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’(SEQ ID NO69)和5’-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO70)。
proA(EcoRI/NotI)，GAL105’-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO71)和5’-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQ ID NO72)。
由于導(dǎo)入Kozak序列，2種成熟蛋白的第2個(gè)密碼子從芳族氨基酸變成纈氨酸。用來自實(shí)施例1和實(shí)施例4所述克隆的pET30 Xa/LIC miniprep DNA作為模板擴(kuò)增感興趣的基因。使用Eppendorf Master循環(huán)梯度熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR，和下列用于50μL反應(yīng)的操作1.0μL模板、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U擴(kuò)增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1X ExpandTM緩沖液。所用熱循環(huán)儀程序包括94℃ 5分鐘的熱啟動(dòng)，接著是29個(gè)下列步驟的重復(fù)94℃ 30秒，50℃ 1分鐘45秒，72℃ 2分鐘15秒。29個(gè)重復(fù)后，樣品在72℃維持10分鐘，隨后4℃貯存。純化PCR產(chǎn)物是通過在1％TAE-瓊脂糖凝膠上分離，接著用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。
pESC-His載體DNA(2.7μg)如上用BamHI/SalI消化并凝膠純化。aspC PCR產(chǎn)物用BamHI/SalI消化并用QIAquick PCR純化柱純化。用Roche迅速DNA連接試劑盒根據(jù)廠商的方案進(jìn)行連接。根據(jù)廠商的說明，在0.2cm Biorad一次性小杯中將脫鹽的連接物電穿孔入40μl Electromasx DH10B感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)，使用附加脈沖控制器的Biorad基因脈沖器II。在1mL SOC培養(yǎng)基中恢復(fù)1小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子平板培養(yǎng)于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。用于克隆的質(zhì)粒DNA制品用QIAprep Spin Miniprep試劑盒完成。質(zhì)粒DNA通過限制酶切消化篩選，用設(shè)計(jì)用于載體的引物測(cè)序(Sequwright)以確認(rèn)。
aspC/pESC-His克隆用EcoRI和NotI消化，proA PCR產(chǎn)物也如此。DNA如上純化和連接。2個(gè)基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入DH10B細(xì)胞中并通過限制酶切消化和DNA測(cè)序篩選。
構(gòu)建物轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株YPH500，使用S.c.EasyCompTM轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen)。轉(zhuǎn)化反應(yīng)在含2％葡萄糖的SC-His要限培養(yǎng)基(Invitrogen pYES2手冊(cè))上平板培養(yǎng)。通過菌落PCR用上面的PCR引物篩選單獨(dú)酵母菌落中proA和aspC基因的存在。沉淀細(xì)胞(2μl)懸浮于20μL含1μl消解酶的Y-裂解緩沖液(ZymoResearch)并37℃加熱10分鐘。隨后4μL此懸浮液用于50μL PCR反應(yīng)，使用上述PCR反應(yīng)混合物和程序。
5mL培養(yǎng)物在SC-His+葡萄糖中30℃和225rpm生長(zhǎng)過夜。逐步調(diào)整細(xì)胞在棉子糖上生長(zhǎng)以便將半乳糖誘導(dǎo)前的延滯期減至最小。生長(zhǎng)約12小時(shí)后，測(cè)量600nm的吸光度，旋下適當(dāng)體積的細(xì)胞且重懸浮于新鮮SC-His培養(yǎng)基中產(chǎn)生0.4的OD。連續(xù)使用下列碳源1％棉子糖+1％葡萄糖，0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖，2％棉子糖和最后的1％棉子糖+2％半乳糖用于誘導(dǎo)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)約16小時(shí)后，50mL培養(yǎng)物分成雙份25mL培養(yǎng)物，下列僅加入雙份之一(終濃度)1g/L L-色氨酸、5mM磷酸鈉pH7.1、1g/L丙酮酸鈉、1mM MgCl2。來自非誘導(dǎo)培養(yǎng)基和來自加入monatin途徑的底物之前16小時(shí)培養(yǎng)液和細(xì)胞沉淀的樣品保存作為負(fù)對(duì)照。此外，僅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的構(gòu)建物用作另一種負(fù)對(duì)照。細(xì)胞可在誘導(dǎo)后總共生長(zhǎng)69小時(shí)。酵母細(xì)胞偶爾在較低OD誘導(dǎo)，僅在加入色氨酸和丙酮酸前生長(zhǎng)4小時(shí)。然而，這些monatin底物似乎抑制生長(zhǎng)且在較高OD加入更有效。
來自培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀用5mL YeastBusterTM+50μl THP(Novagen)每克(濕重)細(xì)胞遵循廠商的方案裂解，加入前面例子所述的蛋白酶抑制劑和benzonase核酸酶。過濾培養(yǎng)液和細(xì)胞提取物并通過SRM分析，如實(shí)施例10所述。使用此方法，培養(yǎng)液樣品中沒有檢測(cè)到monatin，表明細(xì)胞不能在這些條件下分泌monatin。這些條件下的質(zhì)子動(dòng)力可能不足或一般的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子可用色氨酸飽和。蛋白表達(dá)水平不能用SDS-PAGE檢測(cè)變化。
當(dāng)色氨酸和丙酮酸加入培養(yǎng)基時(shí)，具有2個(gè)功能基因的培養(yǎng)物的細(xì)胞提取物中可短暫檢測(cè)到monatin(約60μg/mL)。任何負(fù)對(duì)照細(xì)胞提取物中不能檢測(cè)到monatin。用4.4mg/mL總蛋白(約為通常用于大腸桿菌細(xì)胞提取物的兩倍)進(jìn)行2次monatin的體外測(cè)定，使用實(shí)施例6所述最優(yōu)化測(cè)定。進(jìn)行其它測(cè)定，加入32μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶或400μg/mL AspC轉(zhuǎn)氨酶，用于確定哪個(gè)酶在細(xì)胞提取物中限制。負(fù)對(duì)照不加入酶或僅加入AspC轉(zhuǎn)氨酶(沒有酶時(shí)醛醇縮合能發(fā)生到一定程度)。正對(duì)照用部分純化的酶(30-40％)進(jìn)行，使用16μg/mL醛縮酶和400μg/mL轉(zhuǎn)氨酶。
體外結(jié)果通過SRM分析。細(xì)胞提取物分析顯示當(dāng)色氨酸在誘導(dǎo)后加入培養(yǎng)基時(shí)，它被有效轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞中，使色氨酸水平比沒有另外色氨酸加入的高2個(gè)數(shù)量級(jí)。體外monatin分析結(jié)果示于表6(數(shù)字表示ng/mL)。
表6酵母細(xì)胞提取物中的monatin生成
有和沒有底物加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基的全二基因構(gòu)建物細(xì)胞提取物獲得陽性結(jié)果。這些結(jié)果與正對(duì)照相比，表明酶表達(dá)水平接近酵母中1％的總蛋白。當(dāng)aspC構(gòu)建物(截短的proA)的細(xì)胞提取物用醛縮酶測(cè)定時(shí)，產(chǎn)生的monatin量顯著大于單獨(dú)細(xì)胞提取物測(cè)定，表明重組AspC轉(zhuǎn)氨酶包括約1-2％酵母總蛋白。由于細(xì)胞中存在天然轉(zhuǎn)氨酶，用醛縮酶測(cè)定時(shí)未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的細(xì)胞提取物有小量活性。當(dāng)用AspC轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定時(shí)，來自未誘導(dǎo)細(xì)胞的提取物活性增加到用AspC的(大約200ng/ml)的負(fù)對(duì)照生成的monatin量。相反，補(bǔ)充轉(zhuǎn)氨酶時(shí)二基因構(gòu)建物細(xì)胞提取物測(cè)定中觀察到的活性增加大于加入醛縮酶時(shí)觀察到的活性。由于2個(gè)基因都應(yīng)以相同水平表達(dá)，表明當(dāng)轉(zhuǎn)氨酶水平高于醛縮酶水平時(shí)，產(chǎn)生的monatin量最大，與實(shí)施例6所示結(jié)果一致。
加入丙酮酸和色氨酸不僅抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而且也明顯抑制蛋白表達(dá)。加入pESC-Trp質(zhì)?？捎糜诩m正YPH500宿主細(xì)胞的色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，是一種提供色氨酸而對(duì)生長(zhǎng)、表達(dá)和分泌效果更少的方法。
實(shí)施例13采用偶聯(lián)反應(yīng)改進(jìn)酶方法理論上，如果沒有副反應(yīng)或底物降解或產(chǎn)生中間物，從圖1所述酶反應(yīng)中形成的最大產(chǎn)物量直接與各反應(yīng)的平衡常數(shù)、色氨酸和丙酮酸的濃度成比例。色氨酸不是高度可溶的底物，大于200mM的丙酮酸濃度似乎對(duì)產(chǎn)量有負(fù)作用(參見實(shí)施例6)。
理想地，Monatin濃度相對(duì)于底物最大化以降低分離成本?？蛇M(jìn)行物理分離，這樣monatin可從反應(yīng)混合物中取出，防止逆反應(yīng)發(fā)生。原料和催化劑可隨后再生。由于monatin的大小、電荷和疏水性與一些試劑和中間物類似，物理分離困難，除非對(duì)monatin的親和性高(如親和層析技術(shù))。然而，monatin反應(yīng)可偶聯(lián)其它反應(yīng)，這樣系統(tǒng)的平衡移向monatin生成。下列是改進(jìn)monatin產(chǎn)量的方法例子，monatin獲得白色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
采用草酰乙酸脫羧酶(EC 4.1.1.3)的偶聯(lián)反應(yīng)圖11是反應(yīng)的說明。色氨酸氧化酶和過氧化氫酶用于將反應(yīng)推向吲哚-3-丙酮酸生成的方向。過氧化氫酶過量使用，因而過氧化氫不能在逆方向中起作用或者破壞酶或中間物。氧在過氧化氫酶反應(yīng)中再生。另外，吲哚-3-丙酮酸可用作底物。
天冬氨酸用作MP胺化的氨基供體，使用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。理想地，與MP對(duì)monatin反應(yīng)相比，使用對(duì)色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反應(yīng)特異性低的轉(zhuǎn)氨酶，這樣天冬氨酸不用于再胺化吲哚-3-丙酮酸?？杉尤氩蒗Ｒ宜崦擊让?來自假單胞菌屬)以將草酰乙酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸和二氧化碳。由于CO2是揮發(fā)性的，它不能用于與酶反應(yīng)，減少或甚至防止逆反應(yīng)。此步驟中產(chǎn)生的丙酮酸也能用于醛醇縮合反應(yīng)?？墒褂闷渌擊让福阎滴锎嬖谟诎榉啪€放線桿菌(A.actinomycetemcomitans)、風(fēng)產(chǎn)液菌(Aquifex aeolicus)、閃爍在生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棕色固氮菌、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、一些博德特氏菌屬(Bordetella)、突腸彎曲桿菌(C.jejuni)、微溫桿狀綠菌(Chlorobium tepidum)、橙色綠屈撓菌(Chloroflexusaurantiacus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、具核梭桿菌(F.nucleatum)、肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亞菌(Mannheimia haemolytica)、鞭毛甲基桿菌KT(Methylobacillus flagellatus KT)、多殺巴斯德氏菌(P.Multocida)Pm70、微熱石袍菌(Petrotoga miotherma)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、一些假單胞菌屬、一些火球菌屬(Pyrococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、一些沙門氏菌屬(Salmonella)、一些鏈球菌屬(Streptococcus)、微溫?zé)嶂?Thermochromatiumtepidum)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)和一些弧菌屬(Vibrio)種。
用來自大腸桿菌的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)、來自大腸桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TyrB)、來自碩大利什曼原蟲的廣底物轉(zhuǎn)氨酶(BSAT)和2個(gè)實(shí)施例1所述可商業(yè)購(gòu)買的豬谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行色氨酸轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作為氨基受體測(cè)試。比較用monatin的活性(實(shí)施例7)相對(duì)用色氨酸的活性的比例，用于確定哪一個(gè)酶對(duì)monatin轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)的特異性最高。這些結(jié)果表明相對(duì)色氨酸反應(yīng)對(duì)monatin反應(yīng)特異性最高的酶是豬II-A型谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶GOAT(Sigma G7005)。此特異性不取決于使用哪一個(gè)氨基受體。因此，此酶用于具有草酰乙酸脫羧酶的偶聯(lián)反應(yīng)。
從吲哚-3-丙酮酸起始的典型反應(yīng)包括(終濃度)50mM Tris-Cl pH7.3、6mM吲哚-3-丙酮酸、6mM丙酮酸鈉、6mM天冬氨酸、0.05mM PLP、3mM磷酸鉀、3mMMgCl2、25μg/mL轉(zhuǎn)氨酶、50μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶和3單位/mL脫羧酶(Sigma O4878)。反應(yīng)可在26℃進(jìn)行1小時(shí)。在一些情況中，省略脫羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作為負(fù)對(duì)照)。也測(cè)試上述取代GOAT的轉(zhuǎn)氨酶以證實(shí)早期特異性實(shí)驗(yàn)。過濾樣品并通過LC/MS分析，如實(shí)施例10所述。結(jié)果證明GOAT酶法生成最高量的monatin每mg蛋白，而產(chǎn)生的副產(chǎn)物色氨酸量最少。此外，加入脫羧酶可增加2-3倍。與其它轉(zhuǎn)氨酶相比，大腸桿菌AspC酶也生成大量monatin。
提高monatin產(chǎn)量是通過1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小時(shí)到1小時(shí))，2)在厭氧環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)或有脫氣緩沖液，3)允許反應(yīng)過夜進(jìn)行和4)使用沒有多次凍融的新鮮制備的脫羧酶。丙酮酸濃度＞12mM會(huì)抑制脫羧酶。吲哚-3-丙酮酸濃度高于4mM時(shí)，與吲哚-3-丙酮酸的副反應(yīng)加速。如果也增加醛縮酶量，用于反應(yīng)的吲哚-3-丙酮酸量可增大。發(fā)現(xiàn)高水平的磷酸鹽(50mM)和天冬氨酸(50mM)抑制脫羧酶。在1小時(shí)反應(yīng)中，加入的脫羧酶量能減少到0.5U/mL，而monatin產(chǎn)量沒有降低。當(dāng)溫度從26℃提高到30℃和從30℃提高到37℃時(shí)，產(chǎn)生的monatin量增加；然而，37℃時(shí)吲哚-3-丙酮酸的副反應(yīng)也加速。生成的monatin量隨著pH從7增加到7.3而增大，且從pH 7.3-7.8相對(duì)穩(wěn)定。
從色氨酸起始的典型反應(yīng)包括(終濃度)50mM Tris-Cl pH7.3、20mM色氨酸、6mM天冬氨酸、6mM丙酮酸鈉、0.05mM PLP、3mM磷酸鉀、3mM MgCl2、25μg/mL轉(zhuǎn)氨酶、50μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶和4單位/mL脫羧酶、5-200mU/mL L-氨基酸氧化酶(Sigma A-2805)、168U/mL過氧化氫酶(SigmaC-3515)和0.008mg FAD。反應(yīng)可在30℃進(jìn)30分鐘。加入脫羧酶觀察到改進(jìn)。當(dāng)使用50mU/mL氧化酶時(shí)，產(chǎn)生最大量的monatin。改進(jìn)類似于將吲哚-3-丙酮酸用作底物時(shí)所觀察到的。此外，當(dāng)1)色氨酸水平低(即低于轉(zhuǎn)氨酶的Km且因此不能與MP競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn))和2)氧化酶與醛縮酶和轉(zhuǎn)氨酶的比例維持的水平不能積聚吲哚-3-丙酮酸時(shí)，產(chǎn)生的monatin量增加。
無論從吲哚-3-丙酮酸還是色氨酸起始，當(dāng)使用2-4倍的所有酶量且同時(shí)維持相同酶比例時(shí)，孵育時(shí)間為1-2小時(shí)的測(cè)定中產(chǎn)生的monatin量增加。使用任一底物，達(dá)到約1mg/mL monatin濃度。如果從吲哚-3-丙酮酸起始，產(chǎn)生的色氨酸量通常低于20％的產(chǎn)物量，顯示出使用偶聯(lián)反應(yīng)的益處。隨著中間物濃度和副反應(yīng)的進(jìn)一步最優(yōu)化和控制，產(chǎn)率和產(chǎn)量能大幅提高。
采用賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.36)的偶聯(lián)反應(yīng)在一些生物體中發(fā)現(xiàn)賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶(L-賴氨酸6-轉(zhuǎn)氨酶)，包括紅球菌、分枝桿菌(Mycobacterium)、鏈霉菌(Streptomyces)、諾卡氏菌(Nocardia)、黃桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母(C.utilis)和鏈霉菌。生物體利用此酶作為生成一些β-內(nèi)酰胺抗生素中的和一步驟(Rius和Demain，J.Microbiol.Biotech.，795-100，1997)。此酶使賴氨酸轉(zhuǎn)變成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-)，這是通過PLP-調(diào)節(jié)的賴氨酸的C-6轉(zhuǎn)氨，α-酮戊二酸用作氨基受體。ε-醛賴氨酸不穩(wěn)定且自發(fā)經(jīng)歷分子內(nèi)脫水以形成環(huán)狀分子1-哌啶6-羧酸鹽。這有效抑制任何逆反應(yīng)發(fā)生。圖12描述反應(yīng)流程。也能使用另外的酶賴氨酸-丙酮酸6-轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.71)。
1mL典型反應(yīng)包含50mM Tris-Cl pH7.3、20mM吲哚-3-丙酮酸、0.05mM PLP、6mM磷酸鉀pH8、2-50mM丙酮酸鈉、1.5mM MgCl2、50mM賴氨酸、100μg轉(zhuǎn)氨酶(賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶LAT-101，BioCatalytics Pasadena，CA)和200μg睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶。產(chǎn)生的monatin量隨著丙酮酸濃度增加而增加。用這些反應(yīng)條件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脫羧酶(約0.1mg/mL)的偶聯(lián)反應(yīng)觀察到的低10倍。+＝293的峰在monatin預(yù)期時(shí)間洗脫且質(zhì)譜包含一些用其它酶方法觀察到的相同片段。第2個(gè)有正確質(zhì)量與電荷比(293)洗脫的峰稍早于實(shí)施例6中生成的S，S monatin通常觀察到的，可能表明存在另一種monatin的異構(gòu)體。此酶法生成的色氨酸很少。然而，可能對(duì)丙酮酸有一些活性(產(chǎn)生丙氨酸作為副產(chǎn)物)。同樣，已知酶不穩(wěn)定?？赏ㄟ^定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，用于增加穩(wěn)定性、減少與丙酮酸的活性并提高與MP的活性。這些反應(yīng)也能偶聯(lián)上述L-氨基酸氧化酶/過氧化氫酶。
其它偶聯(lián)反應(yīng)圖13顯示另一種能提高來自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的monatin產(chǎn)量的偶聯(lián)反應(yīng)。甲酸脫氫酶(EC 1.2.1.2或1.2.1.43)是普通酶。一些甲酸脫氫酶需要NADH而另一些能利用NADPH。谷氨酸脫氫酶在前面的例子中催化monatin前體和monatin間的互變，使用以銨為基礎(chǔ)的緩沖液。甲酸銨和甲酸脫氫酶的存在是輔因子再生的有效系統(tǒng)，二氧化碳生成是降低逆反應(yīng)速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalysis 1037，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.634651-6，1997)。此外，大量甲酸銨能溶于反應(yīng)緩沖液。加入甲酸脫氫酶和甲酸銨可改進(jìn)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)(或類似的還原性胺化)生成的monatin產(chǎn)量。
其它方法能用于推動(dòng)平衡趨向monatin生成。例如，如果氨丙烷在MP轉(zhuǎn)變成monatin中用作氨基酸供體，轉(zhuǎn)變用Ω-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.18)如美國(guó)專利5,360,724和5,300,437所述，所得產(chǎn)物之一或許是丙酮，它是比底物氨丙烷更易揮發(fā)的產(chǎn)物?？芍芷谛蕴岣叨唐诘臏囟纫约斌E蒸發(fā)揮丙酮，從而緩解平衡。丙酮的沸點(diǎn)為47℃，如果使用短時(shí)間段，此溫度不可能降解中間物。大部分對(duì)α-酮戊二酸有活性的轉(zhuǎn)氨酶也對(duì)monatin前體有活性。類似地，如果乙醛酸/芳族酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.60)與作為氨基供體的甘氨酸一起使用，生成的乙醛酸相對(duì)不穩(wěn)定且沸點(diǎn)比甘氨酸低很多。
實(shí)施例14重組表達(dá)具有可公開獲得的酶cDNA和氨基酸序列及本文所示酶和序列如SEQ IDNOS11和12以及其變體、多態(tài)性、突變體、片斷和融合，可通過標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)表達(dá)和純化任何蛋白如酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解酶和其片段可在任何感興趣細(xì)胞或生物體中重組生成，使用前純化，例如在生成SEQ ID NO12和其衍生物前。
生成重組蛋白的方法在本領(lǐng)域已知。因此，本發(fā)明范圍包括任何蛋白或其片段如酶的重組表達(dá)。例如參見Johnson等的美國(guó)專利號(hào)5,342,764；Pausch等的美國(guó)專利號(hào)5,846,819；Fleer等的美國(guó)專利號(hào)5,876,969和Sambrook等(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Cold Spring Harbor，New York，1989，第17章)。
簡(jiǎn)要地，編碼蛋白或肽的部分、全長(zhǎng)或變體cDNA序列能連接入表達(dá)載體，如細(xì)菌或真核表達(dá)載體。通過將啟動(dòng)子置于cDNA序列的上游能生成蛋白和/或肽。啟動(dòng)子的例子包括但不限于lac、trp、tac、trc、噬菌體λ的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)、fd外被蛋白的控制區(qū)、SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、來源于多瘤病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒和猴病毒的啟動(dòng)子、用于3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子、酵母酸性磷酸酶的啟動(dòng)子、酵母α-交配因子的啟動(dòng)子和它們的組合。
適用于產(chǎn)生完整天然蛋白的載體包括pKC30(Shimatake和Rosenberg，1981，Nature 292128)、pKK177-3(Amann和Brosius，1985，Gene 40183)和pET-3(Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.189113)。DNA序列可轉(zhuǎn)到其它克隆載體，如其它質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、動(dòng)物病毒和酵母人工染色體(YACs)(Burke等，1987，Science 236806-12)。這些載體可導(dǎo)入多種宿主，包括體細(xì)胞，簡(jiǎn)單或復(fù)雜生物體如細(xì)菌、真菌(Timberlake和Marshall，1989，Science 2441313-7)、無脊椎動(dòng)物、植物(Gasser和Fraley，1989，Science 2441293)和哺乳動(dòng)物(Pursel等，1989，Science2441281-8)，它們通過導(dǎo)入異源DNA產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因。
為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，cDNA序列可連接異源啟動(dòng)子，如猴病毒SV40、pSV2載體中的啟動(dòng)子(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072-6)，并導(dǎo)入細(xì)胞如猴COS-1細(xì)胞(Gluzman，1981，Cell 23175-82)以獲得瞬時(shí)或長(zhǎng)期表達(dá)。嵌合基因構(gòu)建物的穩(wěn)定整合可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中維持，這是通過生化選擇如新霉素(Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1327-41)和霉酚酸(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072-6)。
將DNA轉(zhuǎn)入真核生物如人或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞是一種常規(guī)技術(shù)。載體作為純DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)染)，通過例如磷酸鈣沉淀(Graham和vander Eb，1973，Virology 52466)、磷酸鍶沉淀(Brash等，1987，Mol.Cell Biol.72013)、電穿孔(Neumann等，1982，EMBO J.1841)、脂轉(zhuǎn)染(Felgner等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413)、DEAE葡聚糖(McCuthan等，1968，J.Natl.Cancer Inst.41351)、顯微注射(Mueller等，1978，Cell 15579)、原生質(zhì)體融合(Schafner，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA772163-7)或小丸槍(Klein等，1987，Nature 32770)。另外，能通過病毒載體感染導(dǎo)入eDNA，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒(Bernstein等，1985，Gen.Engrg.7235)如腺病毒(Ahmad等，1986，J.Virol.57267)或皰疹(Spaete等，1982，Cell 30295)。
鑒于本發(fā)明的原理可應(yīng)用于許多可能的實(shí)施方案，應(yīng)認(rèn)識(shí)到所述實(shí)施方案僅是本發(fā)明的特定例子且不應(yīng)作為對(duì)本本明范圍的限制。發(fā)明范圍與下列權(quán)利要求一致。因此我們要求本發(fā)明包括在這些權(quán)利要求的范圍和精神內(nèi)。
序列表<110>嘉吉有限公司(Cargill，Incorporated)<120>多肽和生物合成途徑<130>6682-65741<150>60/374,831<151>2002-04-23<160>74<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1170<212>DNA<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)<400>1atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc60aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc120ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag180gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa240ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc300tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg360ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc420gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc480gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg540accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc600ggcctgctgc cgctcgtcga tctcgcctat caggggttcg gccgcggcct cgaccaggat660gtcgcgggcc tccggcatct tctcggcgtg gtcccggaag cgctcgtcgc ggtttcctgc720tcgaagtcct tcgggcttta tcgcgagcgc gcgggcgcga tcttcgcgcg gaccagctcg780actgcctcgg cggacagggt gcgctcaaac ctcgcgggcc tcgcacgcac cagctattcc840atgccgccgg atcacggcgc agccgtcgtg cggacgatcc ttgacgaccc ggaactcagg900
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His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp130 135 140Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gln Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser145 150 155 160Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser165 170 175Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu180 185 190Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu195 200 205Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Val Ala Gly Leu210 215 220Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys225 230 235 240Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala245 250 255Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala260 265 270Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala275 280 285Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr290 295 300Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser305 310 315 320Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Val Ala325 330 335
Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val340 345 350Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg355 360 365Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly370 375 380Lys Phe Thr Ser Leu385<210>3<211>1260<212>DNA<213>類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>3atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga60aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa120ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc180tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg240ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat300gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc360gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg420cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa480tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat540gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac600ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc660gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc720gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg780ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg 1020acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc 1080ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag 1140cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg 1200ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga 1260<210>4<211>419<212>PRT<213>類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>4Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile1 5 10 15Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro20 25 30Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp35 40 45Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro50 55 60Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg65 70 75 80Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Asp Glu85 90 95Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val100 105 110Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
115 120 125Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr130 135 140Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys145 150 155 160Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr165 170 175Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Met Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys180 185 190Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly195 200 205Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Ile Cys Glu Ser Leu Ala210 215 220Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly225 230 235 240Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg245 250 255Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile260 265 270Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly275 280 285Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr290 295 300Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu305 310 315 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg325 330 335Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala340 345 350Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met355 360 365Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr370 375 380Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly385 390 395 400Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val405 410 415Leu Arg Gly<210>5<211>1260<212>DNA<213>類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>5atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga60aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa120ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc180tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggccgc cgagaagcgg240ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccggcgagcc cgcctacaat300gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcaggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc360gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg420cccgaggcca ctgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa480tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat540
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aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catctcgggc240taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag300aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg360ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc420aaccactacg gcgtcgtgaa ggctgctggc tggaagaaca tctgcacgta cgcctactac480gaccccaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg540gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg600caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc660gactccgcct accaaggcta tgcgagcggc agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc720ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt cgttctccaa gaacatgggc780ttgtacagcg agcgtgcagg cacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg840gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac900ggtgcccgct tagcccacct aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca960gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgcgcc gcaccgtgta cgacgagctg1020ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc1080ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca1140gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag1200acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga 1239<210>8<211>412<212>PRT<213>碩大利什曼原蟲(Leishmania major)<400>8Met Ser Met Gln Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gln Lys Ile1 5 10 15Gln Ala Gln Ala Pro Asp Val Ile Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala20 25 30
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Ile Arg Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Gln His Glu Asp Val Ile Ser20 25 30Leu Thr Ile Gly Gln Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Val Lys Ala35 40 45Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Glu Asn Val Thr Ser Tyr Thr Pro Asn50 55 60Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gln Ala Val Gln Leu Tyr Met Lys Lys65 70 75 80Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ile Ile Thr Thr85 90 95Gly Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ala Ala Phe Arg Thr Ile Leu Ser Pro100 105 110Gly Asp Glu Val Ile Met Pro Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro115 120 125Ile Ile Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Val Ile Val Asp Thr Thr Ser130 135 140His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu Ile Glu Asp Ala Leu Thr Pro145 150 155 160Asn Thr Lys Cys Val Val Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Val165 170 175Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Leu Leu Lys Gly180 185 190Arg Asn Val Phe Val Leu Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr195 200 205Asp Arg Pro His Tyr Ser Ile Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gln Thr Ile
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1 5 10 15Val Lys Ala Ser Gly Ile Arg Ile Phe Asp Asn Lys Val Ser Ala Ile20 25 30Pro Gly Ile Ile Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro35 40 45Glu His Val Lys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Ile Ala Asp Asn Asp Ser50 55 60His Tyr Ala Pro Gln Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala Ile Ser65 70 75 80Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Thr Gly Ile Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu85 90 95Ile Val Val Thr Val Gly Ala Thr Glu Ala Ile Asn Ala Thr Leu Phe100 105 110Ala Ile Thr Asn Pro Gly Asp Lys Val Ala Ile Pro Thr Pro Val Phe115 120 125Ser Leu Tyr Trp Pro Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Val Leu130 135 140Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu145 150 155 160Glu Thr Ile Lys Glu Asn Pro Thr Ile Lys Ala Val Ile Leu Asn Tyr165 170 175Pro Thr Asn Pro Thr Gly Val Glu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala180 185 190Leu Ala Lys Val Ile Lys Asp Asn His Leu Tyr Val Ile Thr Asp Glu195 200 205
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<213>類球紅細(xì)菌(R.sphaeroides)<400>13atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc 60atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg 120cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc 180tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg caccttcgtg 240gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg 300gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc 360gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga 420gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc 480gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag 540atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag 600gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc 660gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat 720ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgac cgtcaccatg 780ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc 840gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc 900cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc 960ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg 1020cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc 1080cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg 1140gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg 1200gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa 1260gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg 1320gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg 1380gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga1413
<210>14<21l>470<212>PRT<213>類球紅細(xì)菌(R.sphaeroides)<400>14Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Gly His Gly Gly Pro1 5 10 15Leu Phe Leu Ala Ile Ala Glu Ala Ile Thr Leu Asp Ile Thr Arg Gly20 25 30Arg Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Pro Gly Thr Arg Ala Leu Ala Arg35 40 45Ala Leu Gly Val His Arg Asn Thr Val Asp Ala Ala Tyr Gln Glu Leu50 55 60Leu Thr Gln Gly Trp Leu Gln Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Val65 70 75 80Ala Gln Asp Leu Pro Gln Gly Met Leu Val His Arg Pro Ala Pro Ala85 90 95Pro Val Glu Pro Val Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly100 105 110Ala Pro Asp Pro Glu Leu Val Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe115 120 125Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly130 135 140Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu145 150 155 160Ala Ser Asp Arg Gly Val Val Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu Ile Ala165 170 175
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Glu Arg Leu Thr Ala Gln Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Asp Leu Pro385 390 395 400Ala Gly Gly Leu Ala Leu Trp Leu Arg Cys Ala Gly Val Ser Ala Glu405 410 415Thr Trp Ala Glu Ala Ala Gly Gln Ala Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly420 425 430Thr Arg Phe Ala Leu Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ala Phe Arg Leu Gly435 440 445Tyr Ala Ala Leu Asp Glu Gly Gln Ile Ala Arg Ala Val Glu Ile Leu450 455 460Ala Arg Ser Phe Pro Gly465 470<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>30<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>30agaggagagt tagagcctta cagcactgcc acaatcg37<210>31<211>1194<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>31gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt60aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac120ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct180catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg240ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa300acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg360gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc gcgtagcaat attcgccggg420gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt480aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca540tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa600attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc660ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg720gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct780gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt840cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat900gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg960
gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat 1020tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac 1080cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg 1140ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa 1194<210>32<211>397<212>PRT<213>大腸桿菌(E.coli)<400>32Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu1 5 10 15Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser20 25 30Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala35 40 45Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser50 55 60Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala65 70 75 80Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val85 90 95Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala100 105 110Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp115 120 125Pro Thr Trp Glu Asn Arg Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu130 135 140
Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe145 150 155 160Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val165 170 175Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn180 185 190Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile195 200 205Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu210 215 220Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu225 230 235 240Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val245 250 255Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val260 265 270Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro275 280 285Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu290 295 300Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu305 310 315 320Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Lys Val Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu325 330 335Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr
340 345 350Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val355 360 365Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Thr Ala370 375 380Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met385 390 395<2l0>33<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33ggtattgagg gtcgcgtgtt tcaaaaagtt gacgc 35<210>34<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>34agaggagagt tagagcctta catcaccgca gcaaacg37<210>35<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>35ggtattgagg gtcgcatgga gtccaaagtc gttga 35
<210>36<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>36agaggagagt tagagcctta cact tggaaa acagcct 37<210>37<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>37ggtattgagg gtcgcatgaa aaactggaaa acaag 35<210>38<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>38agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta37<210>39<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>39ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa 35<210>40<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>40agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag 36<210>41<211>1416<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>41atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa60cgtaccaccc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg120ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg180cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac240tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac300cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa360aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag420ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat480acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt540gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca600ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac660gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag720cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat780gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg840tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg900caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta960ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat1020ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca1080
ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 1320catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta 1380ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416<210>42<211>1371<212>DNA<213>弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)<400>42atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg60cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg120aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag180tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg240gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt300ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat360atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc420gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt480aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg540gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg600cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa660aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc720gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg780gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag840ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa900gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag960
caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag 1080ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag 1140cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg 1260gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a1371<210>43<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>43ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35<210>44<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg37<210>45<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>45ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc 35
<210>46<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg37<210>47<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t 31<210>48<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt30<210>49<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>49tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt 32<210>50<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca30<210>51<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg 29<210>52<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at 32<210>53<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat 29<210>54<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54gtagacgcgg actaactctt tggcagaag 29<210>55<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt 35<210>56<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc37<210>57<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>57ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca 35<210>58<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>58
agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca37<210>59<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>59ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg 35<210>60<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>60agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca 37<210>61<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>61ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35<210>62<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>62agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37
<210>63<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>63ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35<210>64<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>64agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga37<210>65<211>684<212>DNA<213>睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni)<400>65atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac60ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc120aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg180ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc240gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg300gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac360gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc420acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc480acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt540gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc600aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag660
gccggcctga aatatattga ctaa 684<210>66<211>227<212>PRT<213>睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni)<400>66Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg1 5 10 15Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu20 25 30Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr35 40 45Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro50 55 60Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly65 70 75 80Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe85 90 95Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu100 105 110Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp115 120 125Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala130 135 140Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val145 150 155 160
Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val165 170 175Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu180 185 190Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly195 200 205Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys210 215 220Tyr Ile Asp225<210>67<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>67actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct 42<210>68<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc33<210>69<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>69cgcggatcca taatggttga gaacattacc g 31<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>70acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg30<210>71<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>71ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt 32<210>72<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>72gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc33<210>73<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>73ggtattgagg gtcgc15
<210>74<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>74agaggagagt tagagcc 1權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，所述方法包括將葡萄糖轉(zhuǎn)變成monatin。
2.一種產(chǎn)生monatin的方法，包括將色氨酸和/或吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成monatin，其特征在于，所述方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接觸第一種多肽，其中第一種多肽將色氨酸或吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸；吲哚-3-丙酮酸接觸第2種多肽和C3碳源，其中第2種多肽將吲哚-3-丙酮酸和C3碳源轉(zhuǎn)變成2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和
2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸接觸第3種多肽，其中第3種多肽將2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸轉(zhuǎn)變成monatin。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第一種多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)和它們的組合，其中第一種多肽將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第一種多肽選自吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)、3-(4)-羥苯基丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)或它們的組合，其中第一種多肽將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸。
5.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，第一種和/或第3種多肽包括氨基酸序列，示于SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、32，Genbank登錄號(hào)NP 388848.1，Genbank登錄號(hào)ZP00005082.1或Genbank登錄號(hào)AAC74014.1；氨基酸序列，與SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、32，Genbank登錄號(hào)NP388848.1，Genbank登錄號(hào)ZP00005082.1或Genbank登錄號(hào)AAC74014.1所示序列有至少90％序列同一性；或氨基酸序列，與SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、32，Genbank登錄號(hào)NP388848.1，Genbank登錄號(hào)ZP00005082.1或Genbank登錄號(hào)AAC74014.1的差異小于50個(gè)保守氨基酸取代，其中氨基酸序列將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第2種多肽是EC 4.1.2.-或EC 4.1.3.-酶。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，EC 4.1.3.-酶是4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶(EC 4.1.3.16)、4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶(EC 4.1.3.17)或其組合。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第3種多肽選自酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.21)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)和它們的組合。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第一種多肽包括氨基酸氧化酶(EC4.1.3.-)和過氧化氫酶(EC 1.11.1.6)，其中第一種多肽將色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，氨基酸氧化酶包括色氨酸氧化酶。
11.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，C3碳源選自丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸或它們的組合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生丙酮酸是通過丙氨酸和能使丙氨酸轉(zhuǎn)氨的多肽；絲氨酸和能β-消除絲氨酸的多肽；半胱氨酸和能β-消除半胱氨酸的多肽；天冬氨酸和能與二羧基氨基酸發(fā)生β-裂合酶反應(yīng)的多肽；乳酸和乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)或乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)；或它們的組合。
13.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括與色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚-3-丙酮酸時(shí)減少產(chǎn)生的過氧化氫量，這是通過使過氧化氫接觸過氧化氫酶。
14.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第2種多肽包括的氨基酸序列選自SEQ ID NO66，Genbank登錄號(hào)CAC46344，Genbank登錄號(hào)CAB14127.1，Genbank登錄號(hào)AAC74920.1或Genbank登錄號(hào)CAC47463.1；氨基酸序列，與SEQ ID NO66，Genbank登錄號(hào)CAC46344，Genbank登錄號(hào)CAB14127.1，Genbank登錄號(hào)AAC74920.1或Genbank登錄號(hào)CAC47463.1有至少90％序列同一性；或氨基酸序列，與SEQ ID NO66，Genbank登錄號(hào)CAC46344，Genbank登錄號(hào)CAB14127.1，Genbank登錄號(hào)AAC74920.1或Genbank登錄號(hào)CAC47463.1的差異小于50個(gè)保守氨基酸取代，其中氨基酸序列將吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸轉(zhuǎn)變成MP。
15.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，第3種多肽包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，其中2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸接觸天冬氨酸以產(chǎn)生草酰乙酸和monatin。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括使草酰乙酸接觸脫羧酶。
17.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第3種多肽包括賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶，其中2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸進(jìn)一步接觸賴氨酸。
18.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第3種多肽包括有還原性胺化活性的酶和能再循環(huán)NAD(P)H的多肽。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，有還原性胺化活性的酶選自谷氨酸脫氫酶、苯丙氨酸脫氫酶、色氨酸脫氫酶或它們的組合。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，能再循環(huán)NAD(P)H的多肽進(jìn)一步產(chǎn)生一種揮發(fā)性產(chǎn)物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，能再循環(huán)NAD(P)H和產(chǎn)生揮發(fā)性產(chǎn)物的多肽包括甲酸脫氫酶，其中產(chǎn)生的揮發(fā)性產(chǎn)物是二氧化碳。
22.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)變成monatin。
23.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生至少10g/L monatin。
24.一種產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，所述方法包括將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)變成monatin。
25.一種產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，所述方法包括將色氨酸轉(zhuǎn)變成monatin。
26.一種能產(chǎn)生monatin的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包括至少一個(gè)外源核酸序列，序列編碼至少一種多肽，其中至少一種多肽使monatin產(chǎn)生途徑中的第1個(gè)中間物轉(zhuǎn)變成第2個(gè)中間物或轉(zhuǎn)變或monatin。
27.如權(quán)利要求26所述的細(xì)胞，其特征在于，至少一種多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、色氨酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)、3-(4)-羥苯基丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.11 1)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(EC4.1.2.-)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)和它們的組合。
28.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其特征在于，至少一種多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)、合酶/裂合酶(EC 4.1.2.-)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)和它們的組合。
29.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其特征在于，至少一種多肽包括的活性選自吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)、3-(4)-羥苯基丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(EC 4.1.2.-)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)和它們的組合。
30.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其特征在于，合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)包括4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.16)或4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)。
31.如權(quán)利要求26所述的重組細(xì)胞，其特征在于，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求26所述的重組細(xì)胞，其特征在于，細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其特征在于，細(xì)胞進(jìn)一步包括一種或多種編碼至少1個(gè)外源核酸序列的多肽，其中多肽包括的活性選自過氧化氫酶、草酰乙酸脫羧酶、賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶和甲酸脫氫酶。
34.一種包括氨基酸序列的多肽，其特征在于，氨基酸序列選自Genbank登錄號(hào)P00913)、Genbank登錄號(hào)NP_290344、Genbank登錄號(hào)CAA34096、Genbank登錄號(hào)NP_246359、Genbank登錄號(hào)AAB96579、Genbank登錄號(hào)NP_232561、Genbank登錄號(hào)Q59342、Genbank登錄號(hào)P28796、Genbank登錄號(hào)1AX4_A、Genbank登錄號(hào)BAA34638、Genbank登錄號(hào)P31014、Genbank登錄號(hào)P31015、Genbank登錄號(hào)NP_280989、Genbank登錄號(hào)AAC33284、Genbank登錄號(hào)NP_147838、Genbank登錄號(hào)AAF63441或Genbank登錄號(hào)AAA24679，其中改變關(guān)于Genbank登錄號(hào)NP_418164的103位和299位的氨基酸殘基以擴(kuò)大多肽特異性以接受二羧酸氨基酸底物。
35.如權(quán)利要求34所述的多肽，其特征在于，氨基酸序列變化選自精氨酸103變?yōu)樘K氨酸，精氨酸103變?yōu)樘K氨酸且纈氨酸299變?yōu)榫彼幔缓屠i氨酸299變?yōu)榫彼帷?br> 36.一種包括氨基酸序列的多肽，其特征在于，氨基酸序列選自Genbank登錄號(hào)2TPL_A、Genbank登錄號(hào)P31012、Genbank登錄號(hào)P31013，A49493、Genbank登錄號(hào)P31011、Genbank登錄號(hào)AAB24234、Genbank登錄號(hào)1TPL_A、Genbank登錄號(hào)1TPL_B、Genbank登錄號(hào)NP_245748、Genbank登錄號(hào)AAB41499、Genbank登錄號(hào)Q08897、Genbank登錄號(hào)T45297和Genbank登錄號(hào)AAA71928，其中改變關(guān)于Genbank登錄號(hào)X66978的100位和283位的氨基酸殘基以擴(kuò)大多肽特異性以接受二羧酸氨基酸底物。
37.如權(quán)利要求36所述的多肽，其特征在于，氨基酸序列變化選自精氨酸100變?yōu)樘K氨酸，精氨酸100變?yōu)樘K氨酸且纈氨酸283變?yōu)榫彼?；和纈氨酸283變?yōu)榫彼帷?br> 38.如權(quán)利要求34或36所述的多肽，其特征在于，底物是天冬氨酸。
39.一種產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，所述方法包括作用至少1個(gè)在羧基和氨基阻斷的丙氨酸衍生物以及至少1個(gè)在羧基阻斷的吲哚-3-丙酮酸衍生物。
40.如權(quán)利要求39所述產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，丙氨酸衍生物是3-氯-丙氨酸或3-溴-丙氨酸，其中吲哚-3-丙酮酸在Grignard或有機(jī)鋰反應(yīng)中與丙氨酸衍生物反應(yīng)。
41.一種產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，所述方法包括將底物轉(zhuǎn)變成1個(gè)或多個(gè)中間物，底物選自色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸，其中產(chǎn)生monatin。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，至少1個(gè)中間產(chǎn)物經(jīng)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，至少1個(gè)中間產(chǎn)物經(jīng)多肽轉(zhuǎn)變。
44.一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸與SEQ ID NO11有至少90％的序列同一性。
45.如權(quán)利要求44所述的分離的核酸，其特征在于，核酸包括SEQ ID NO11。
46.如權(quán)利要求44所述的分離的核酸，其特征在于，核酸包括SEQ ID NO11的至少20個(gè)保守核苷酸。
47.一種載體，其特征在于，所述載體包括權(quán)利要求44所述的分離的核酸。
48.一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包括權(quán)利要求47所述的載體。
49.一種分離的蛋白，其特征在于，所述蛋白由權(quán)利要求44所述的分離的核酸編碼。
50.如權(quán)利要求49所述的分離的蛋白，其特征在于，蛋白與SEQ ID NO12有至少90％的序列同一性。
51.如權(quán)利要求50所述的分離的蛋白，其特征在于，蛋白包括SEQ ID NO12。
52.一種產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，所述方法包括將2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸轉(zhuǎn)變成monatin。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，方法進(jìn)一步包括通過質(zhì)譜檢測(cè)2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。
54.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。
55.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，色氨酸從吲哚中產(chǎn)生，使用來自EC 4.1.99.1的多肽。
56.一種產(chǎn)生monatin的方法，其特征在于，所述方法包括使色氨酸與一種或多種多肽反應(yīng)。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，一種或多種多肽選自色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)、合酶/裂合酶(EC 4.1.2.-)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)和它們的組合。
全文摘要
提供的方法和組合物可用于從葡萄糖、色氨酸、吲哚－3－乳酸、吲哚－3－丙酮酸和2－羥基－2－(吲哚－3－基甲基)－4－酮戊二酸中產(chǎn)生monatin。還公開了用于產(chǎn)生吲哚－3－丙酮酸和2－羥基－2－(吲哚－3－基甲基)－4－酮戊二酸中間物的方法。提供的組合物包括核酸分子、多肽、化學(xué)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。方法包括體外和體內(nèi)方法，體外方法包括化學(xué)反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12P17/10GK1656068SQ03812148
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月23日
發(fā)明者T·W·阿布拉罕, D·C·卡梅隆, J·達(dá)魯戈, P·M·西克斯, R·J·赫布森, S·C·麥克法蘭, J·米利斯, J·羅薩扎, L·趙, D·P·維那 申請(qǐng)人:嘉吉有限公司