專利名稱：編碼乙酰乳酸合酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼支鏈氨基酸生物合成途徑中的限速酶-乙酰乳酸合酶的基因。
背景技術(shù)：
乙酰乳酸合酶(此后稱為“ALS”)是支鏈氨基酸，如亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑中的限速酶，是已知的對于植物生長重要的酶。已知ALS存在于許多種高等植物中。此外，在多種微生物中發(fā)現(xiàn)了ALS，例如酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、大腸桿菌(Escherichia coli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。
已知在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中存在ALS的三種同工酶。每種同工酶都是雜寡聚體，其中由控制酶催化活性的大分子量的催化亞基和通過結(jié)合支鏈氨基酸而具有反饋抑制劑功能的小分子量調(diào)節(jié)亞基組成(Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998)。催化亞基分別位于IIv IH、IIv GM和IIv BN操縱子上。另外，酵母中的ALS是單體酶，同細(xì)菌中的一樣，其中包括催化亞基和調(diào)節(jié)亞基(Pang等，Biochemitry，38，5222-5231，1999)。催化蛋白亞基位于ILV2基因座。
已知在植物中的ALS同上述微生物中一樣由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成(Hershey等，Plant Molecular Biology.40，795-806，1999)。例如，煙草(雙子葉植物)中的ALS的催化亞基由兩個基因座，SuRA和SuRB編碼(Lee等，EMBO J.7，1241-1248，1988)；玉米中的由兩個基因座，a1s1和a1s2編碼(Burr等，Trends in Genetics 7，55-61，1991；Lawrence等，Plant Mol.Biol.18，1185-1187，1992)。雙子葉植物包括煙草、擬南芥、油菜籽、棉花、蒼耳屬、莧屬和地膚屬中編碼催化亞基的基因的核苷酸序列已經(jīng)完全測定(見Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998和專利申請WO97/08327的PCT國際公開的國內(nèi)再公開)。但是，單子葉植物中只有玉米和水稻的該核苷酸序列被完全測定(Kaku等，the 26thConference of Pesticide Science Society of Japan，LectureAbstract，p101，2001)。
同時，除草劑例如磺酰脲除草劑、咪唑啉酮除草劑、三唑嘧啶除草劑和嘧啶羧基除草劑(此后稱之為“PC除草劑”)已知是通過抑制ALS來抑制植物生長的(Ray，Plant Physiol.75，827-831，1984；Shaner等，Plant Physiol.76，545-546，1984；Subramanian等，Plant Physiol.96，310-313，1991；Shimizu等，J.Pestic Sci.19，59-67，1994)。
如表1和表2所示，已知的對這些除草劑抗性的植物包含的編碼ALS的基因中有一個或兩個核苷酸被取代，該取代能誘導(dǎo)不同物種的保守區(qū)域中一個或兩個氨基酸的取代。
表1造成對ALS抑制型除草劑抗性的植物ALS突變(1)
表2造成對ALS抑制型除草劑抗性的植物ALS突變(2)
這種基因的實例包括編碼特異性抗磺酰脲除草劑的ALS的基因(見Kathleen等，EMBO J，7，1241-1248，1988；Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Guttieri等，Weed Sci.43，175-178，1995；Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995；和日本公開專利(未審查申請)No.63-71184)；編碼特異性抗咪唑啉酮除草劑的ALS的基因(見Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Lee等，F(xiàn)EBS Lett.452，341-345，1999；和日本公開專利(未審查申請)No.5-227964)；編碼同時特異性抗磺酰脲除草劑和咪唑啉酮除草劑的ALS的基因(見Kathleen等，EMBO J，7，1241-1248，1988；Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995；Hattori等，Mol.Gen.Genet.246，419-425，1995；Alison等，PlantPhysiol.111，1353，1996；Rajasekarau等，Plant Sci.119，115-124，1996；日本公開專利(未審查申請)No.63-71184；日本公開專利(未審查申請)No.4-311392；和Bernasconi等，美國專利5633437，1997)；以及編碼高水平抗PC除草劑的ALS的基因(Kaku等，the 26thConference of Pesticide Science Society of Japan，Lecture Abstracts，p101，2001)。嘗試通過將含有特異性抗磺酰脲除草劑的ALS植物和含有特異性抗咪唑啉酮除草劑的ALS的植物雜交得到如下植物體，其顯示出對磺酰脲除草劑和咪唑啉酮除草劑都抗(Mourad等，Mol.Gen.Genet，243，178-184，1994)。此外，也嘗試著將編碼ALS的基因人工改變成除草劑抗性基因(見Ott等，J.Mol.Biol.263，359-368，1996，日本公開專利(未審查申請)No.63-71184，日本公開專利(未審查申請)No.5-227964，日本公開專利(PCT譯文)No.11-504213)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個氨基酸的缺失會使ALS顯示出同時抗磺酰脲除草劑和咪唑啉酮除草劑(見日本公開專利(未審查申請)No.5-227964)。
如上所述，具有抗除草劑的ALS和編碼ALS的基因得到深入的研究。然而，只有少數(shù)一些關(guān)于利用抗PC除草劑作為指示的ALS突變基因具有特異性抗PC除草劑的報道。此外，也只有少數(shù)一些有關(guān)于抗PC除草劑和其它除草劑的研究的報道。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種編碼顯示以非常高水平抗PC除草劑或磺酰脲除草劑的ALS蛋白的基因，一種由該基因編碼的ALS蛋白，一種帶有該基因的重組載體，一種帶有該重組載體的轉(zhuǎn)化體，一種帶有該基因的植物，一個培養(yǎng)該植物的方法，以及一種利用該基因作為篩選標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的方法。
作為實現(xiàn)上述目的而進(jìn)行徹底研究的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了一種來源于野生型ALS的ALS突變體，它是通過用一個特定氨基酸將野生型ALS的一個特定氨基酸殘基替換而得到的，其顯示出非常高的對PC除草劑的抗性能力，從而完成了本發(fā)明。
(1)具體而言，本發(fā)明是一種編碼下列蛋白(a)或(b)的基因(a)一種由SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一種氨基酸序列組成的蛋白；(b)一種由通過SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一種氨基酸序列進(jìn)行替換、缺失或添加至少一個或多個氨基酸而衍生得到的氨基酸序列組成的蛋白，該蛋白具有對嘧啶羧基除草劑的抗性和乙酰乳酸合酶的活性。
(2)進(jìn)一步，本發(fā)明是一種由基因(1)編碼的乙酰乳酸合酶蛋白。
(3)進(jìn)一步，本發(fā)明是一種帶有基因(1)重組載體。
(4)進(jìn)一步，本發(fā)明是一種帶有重組載體(3)轉(zhuǎn)化體。
(5)進(jìn)一步，本發(fā)明是一種帶有基因(1)并且對PC除草劑有抗性的植物。
(6)進(jìn)一步，本發(fā)明是一種包含在PC除草劑存在時培養(yǎng)植物(5)的方法。
(7)更進(jìn)一步，本發(fā)明是一種利用基因(1)作為篩選標(biāo)記篩選具有基因(1)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的方法。
以下對本發(fā)明作出更詳細(xì)的說明。
編碼本發(fā)明中乙酰乳酸合酶的基因(此后稱為“突變ALS基因”)編碼一種乙酰乳酸合酶蛋白(此后稱為“突變ALS蛋白”)，該蛋白具有不同于野生型的乙酰乳酸合酶蛋白(此后稱為“野生型ALS蛋白”)的氨基酸序列。突變的ALS蛋白可通過突變水稻植物中表達(dá)的野生型ALS蛋白一個特定位點而得到。本發(fā)明中的突變ALS蛋白由任何一種SEQ ID NO2、4、6和8的氨基酸序列組成。
氨基酸序列SEQ ID NO2是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由組氨酸替換，精氨酸172由絲氨酸替換而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO2的突變ALS蛋白被稱為“P171H/R172S突變ALS蛋白”或“P171H/R172S突變體”。
氨基酸序列SEQ ID NO4是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由組氨酸替換，色氨酸548由亮氨酸替換而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO4的突變ALS蛋白被稱為“P171H/W548L突變ALS蛋白”或“P171H/W548L突變體”。
氨基酸序列SEQ ID NO6是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由組氨酸替換，絲氨酸627由異亮氨酸替換而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO6的突變ALS蛋白被稱為“P171H/S627I突變ALS蛋白”或“P171H/S627I突變體”。
氨基酸序列SEQ ID NO8是由野生型ALS蛋白的氨基酸序列中的脯氨酸171由組氨酸替換，色氨酸548由亮氨酸替換，絲氨酸627由異亮氨酸替換而衍生的。含有氨基酸序列SEQ ID NO8的突變ALS蛋白被稱為“P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白”或“P171H/W548L/S627I突變體”。


圖1A和1B顯示出四種突變體ALS蛋白和野生型ALS蛋白氨基酸序列的對比結(jié)果。此外在圖1A和1B中，第一排氨基酸序列代表野生型ALS蛋白，第二排氨基酸序列代表P171H/R172S突變ALS蛋白，第三排氨基酸序列代表P171H/W548L突變ALS蛋白，第四排氨基酸序列代表P171H/S627I突變ALS蛋白，第五排氨基酸序列代表P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白。
和野生型ALS蛋白相比，這些突變ALS蛋白不僅對PC除草劑有良好抗性，而且對磺酰脲除草劑和咪唑啉酮除草劑都有良好的抗性。這是通過將編碼突變ALS蛋白的基因亞克隆到pGEX2T，用pGEX2T轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，然后檢測表達(dá)的突變ALS蛋白對除草劑的敏感性來證明的。
PC除草劑的例子包括雙嘧苯甲酸鈉、嘧硫苯甲酸鈉、2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亞氨基)乙基]苯甲酸，如下列化學(xué)式1所示 雙嘧苯甲酸鈉 嘧硫苯甲酸鈉 2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亞氨基)乙基]苯甲酸磺酰脲除草劑的例子是綠黃隆，如下列化學(xué)式2所示
綠黃隆咪唑啉酮除草劑的例子是滅草喹，如下列化學(xué)式3所示 滅草喹特別要指出的是，P171H/R172S突變ALS蛋白顯示出對某些的除草劑在一定水平上的抗性，其不僅優(yōu)于單獨具有P171H或R172S的突變ALS蛋白，而且優(yōu)于預(yù)期的使用單獨具有P171H或R172S的突變ALS蛋白的組合抗性。此外，單獨具有R172S的突變ALS蛋白沒有顯示出對任何除草劑有抗性，因此R172S突變是一個沉默突變。換句話說，在P171H/R172S突變ALS蛋白中，R172S突變本身是一個沉默突變，改善了P171H突變ALS蛋白的抗性。
此外，P171H/W548L突變ALS蛋白顯示出對某些的除草劑在一定水平上的抗性，其不僅優(yōu)于單獨具有P171H或W548L的突變ALS蛋白，而且優(yōu)于預(yù)期的使用單獨具有P171H或W548L的突變ALS蛋白的組合抗性。換句話說，P171H/W548L突變ALS蛋白顯示出的抗性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于預(yù)期的P171H突變蛋白和W548L突變蛋白抗性的協(xié)同作用。
此外，特別要指出的是，P171H/S627I突變ALS蛋白顯示出對某些的除草劑在一定水平上的抗性，其不僅優(yōu)于單獨具有P171H或S627I的突變ALS蛋白，而且優(yōu)于預(yù)期的使用單獨具有P171H或S627I的突變ALS蛋白的組合抗性。換句話說，P171H/S627I突變ALS蛋白顯示出的抗性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于預(yù)期的P171H突變蛋白和S627I突變蛋白抗性的協(xié)同作用。
此外，特別要指出的是，P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白顯示出對某些的除草劑的抗性要優(yōu)于單獨具有P171H，W548L或S627I的突變ALS蛋白。
而且，本發(fā)明中突變ALS蛋白由對任何一個SEQ ID NO2、4、6和8氨基酸序列進(jìn)行替換、缺失或添加至少一個或多個氨基酸得到的氨基酸序列組成，只要該序列具有對PC除草劑的抗性和乙酰乳酸合酶的活性。在此，“一個或多個氨基酸”優(yōu)選是指1到30個氨基酸，更優(yōu)選1到20個氨基酸，更優(yōu)選1到10個氨基酸。
特別的是，在氨基酸序列SEQ ID NO2中，“至少一個或多個氨基酸”優(yōu)選為除了第171和172氨基酸以外的一個或多個氨基酸。在氨基酸序列SEQ ID NO4中，“至少一個或多個氨基酸”優(yōu)選為除了第171和548氨基酸以外的一個或多個氨基酸。在氨基酸序列SEQ IDNO6中，“至少一個或多個氨基酸”優(yōu)選為除了第171和627氨基酸以外的一個或多個氨基酸。在氨基酸序列SEQ ID NO8中，“至少一個或多個氨基酸”優(yōu)選為除了第171、627和548氨基酸以外的一個或多個氨基酸。
本發(fā)明中突變ALS基因沒有被特別限定，只要它含有編碼上述突變ALS蛋白的核苷酸序列。核苷酸序列的例子包括任何一個SEQ IDNO1、3、5和7中的核苷酸序列。核苷酸序列SEQ ID NO1編碼氨基酸序列SEQ ID NO2，核苷酸序列SEQ ID NO3編碼氨基酸序列SEQID NO4，核苷酸序列SEQ ID NO5編碼氨基酸序列SEQ ID NO6，核苷酸序列SEQ ID NO7編碼氨基酸序列SEQ ID NO8。突變ALS基因可以含有來源于通過用簡并密碼子替換編碼特定氨基酸的密碼子而得到的SEQ ID NO1、3、5和7中任何一個的核苷酸序列。
圖2A、B、C和D顯示出編碼這四種突變ALS蛋白的核苷酸序列和編碼野生型ALS蛋白的核苷酸序列的對比結(jié)果。在圖2A、B、C和D中，第一排核苷酸序列代表野生型ALS蛋白，第二排核苷酸序列代表P171H/R172S突變ALS蛋白，第三排核苷酸序列代表P171H/W548L突變ALS蛋白，第四排核苷酸序列代表P171H/S627I突變ALS蛋白，第五排核苷酸序列代表P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白。
此外，本發(fā)明中突變ALS基因由一個核苷酸序列組成，它可以在嚴(yán)格的條件下與任何一個SEQ ID NO1、3、5和7中的核苷酸序列互補的核苷酸序列雜交，其能夠編碼具有乙酰乳酸合酶活性的氨基酸序列?！皣?yán)格條件”是指其中所謂的特異性雜交形成，而非特異性的雜交不能形成的條件。具有這樣嚴(yán)格條件的例子包括彼此之間具有高度同源性的DNA(例如DNA彼此之間有50％或者更多的同源性)雜交，彼此之間具有低同源性的DNA不雜交的條件?？赡苓M(jìn)行雜交的嚴(yán)格條件的特定例子包括在常規(guī)的60℃Southern雜交中的漂洗條件，以及相應(yīng)的1×SSC，0.1％SDS，或優(yōu)選的0.1×SSC，0.1％SDS的鹽濃度。
編碼這些突變ALS蛋白的基因可通過將上述的突變引入到編碼野生型ALS蛋白的基因中獲得，后者存在于日本產(chǎn)水稻品種Kinmaze的基因組DNA中。任何已知的技術(shù)都可以用于引入突變。例如，可以使用定點誘變。定點誘變可以使用一種商業(yè)化的試劑盒來完成，例如，Mutan-K(Takara Shuzo)、Gene Editor(Promega)或ExSite(Stratagene)。
此外，編碼突變ALS蛋白的基因可以通過在有PC除草劑存在時培養(yǎng)對PC除草劑敏感的野生型培養(yǎng)細(xì)胞，然后從顯示出具有對PC除草劑有抗性的突變培養(yǎng)細(xì)胞中得到基因。然后，編碼具有新的突變組合的ALS蛋白的基因可以根據(jù)已有的突變，通過PCR方法和SPR(自體聚合酶反應(yīng))方法用酶合成。
特別要指出的是，首先，mRNA是從抗PC除草劑的突變培養(yǎng)細(xì)胞中制備的，接著合成cDNA，然后構(gòu)建了λgt 11噬菌體的cDNA文庫。然后，利用含有編碼野生型ALS蛋白的基因部分的核酸探針篩選此文庫。接著，將由此得到的陽性克隆的插入DNA亞克隆到pBluescriptII SK+來測定核苷酸序列。對于已顯示出有突變的cDNA插入片段來說，含有突變的片段可以利用保留有插入DNA的pBluescript II SK+作為模板，通過PCR和SPR方法合成，引物是根據(jù)野生型水稻ALS基因而設(shè)計的。同時，由PC除草劑抗性水稻培養(yǎng)細(xì)胞制備基因組DNA，根據(jù)水稻ALS基因設(shè)計各種不同的引物。然后，采用引物步移法使存在于制備好的基因組DNA中的ALS基因序列得到測定，從而找到突變位點。當(dāng)突變被發(fā)現(xiàn)時，利用PCR和SPR方法合成含有突變的片段。將由克隆到pBluescript II SK+中的突變ALS cDNA(包括含有這些突變的片段)合成的含有突變的片段亞克隆到pGEX2T，然后利用此載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
隨后篩選含有編碼由SEQ ID NO2、4、6和8所表示的氨基酸序列的插入DNA的克隆，從而得到編碼突變ALS蛋白的基因。此外，在2002年3月8日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，這樣得到的編碼含有SEQ IDNO2中表示的氨基酸序列的突變ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的質(zhì)粒作為水稻突變ALS cDNA1(FERM BP-7944)而被保存，編碼含有SEQID NO4中表示的氨基酸序列的突變ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的質(zhì)粒作為水稻突變ALS cDNA2(FERM BP-7945)而被保存，編碼含有SEQ ID NO6中表示的氨基酸序列的突變ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的質(zhì)粒作為水稻突變ALS cDNA3(FERM BP-7946)而被保存，含有編碼SEQ ID NO8中表示的氨基酸序列的突變ALS蛋白的基因整合入pGEX2T中的質(zhì)粒作為水稻突變ALS cDNA4(FERM BP-7947)而被保存在國立高級工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究所專利和生物資源中心(Chuo-6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，JAPAN)。
另一方面，利用編碼突變ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化靶植物，可以使植物對各種不同的除草劑產(chǎn)生抗性，例如PC除草劑?？梢允褂萌魏我阎牡募夹g(shù)來轉(zhuǎn)化植物。舉例來說，一個外源基因可以通過使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)而被導(dǎo)入到靶植物細(xì)胞中。
更具體而言，將編碼突變ALS蛋白的基因插入到含有農(nóng)桿菌的一個Ti質(zhì)粒T-DNA序列的二元載體中。將此Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌等。然后，將通過如大腸桿菌復(fù)制的保留了編碼突變ALS蛋白的基因的二元載體轉(zhuǎn)化到含有輔助質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中。用農(nóng)桿菌感染靶植物，然后鑒定轉(zhuǎn)化的植物。當(dāng)鑒定的轉(zhuǎn)化植物是一個培養(yǎng)細(xì)胞時，植物細(xì)胞可通過任何已知的技術(shù)再生成完整的植株。
為了用編碼突變ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化靶植物，基因可利用已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入。轉(zhuǎn)化含有編碼突變ALS蛋白的基因的表達(dá)載體的方法的例子包括聚乙二醇方法，電穿法和基因槍法。
編碼突變ALS蛋白的基因可被轉(zhuǎn)化到任何一種類型的植物中，例如單子葉植物和雙子葉植物。編碼突變ALS蛋白的基因可以轉(zhuǎn)化到的靶農(nóng)作物例子包括水稻，玉米，小麥，大麥，大豆，棉花，油菜籽，糖用甜菜和煙草。此外，也可以通過引入編碼突變ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化草坪用草，樹木等。
在上述任何一個例子中，將編碼突變ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化植物可以給予植物對PC除草劑、磺酰脲除草劑和咪唑啉酮除草劑的抗性。
此外，在轉(zhuǎn)化植物的實驗中，編碼突變ALS蛋白的基因可以作為篩選標(biāo)記使用。例如，利用靶基因轉(zhuǎn)化植物時，帶有編碼突變ALS蛋白的基因和靶基因的載體被引入到植物細(xì)胞中，接著在PC除草劑或者其它除草劑的存在下培養(yǎng)植物細(xì)胞。如果植物細(xì)胞在除草劑的存在下能存活，表示此植物細(xì)胞含有編碼突變ALS蛋白的基因和引入到那里的靶基因。此外，可以通過觀察植物的表型，然后利用基因組southern雜交或PCR檢查基因組上這些基因的存在，來證實靶基因和編碼突變ALS蛋白的基因是否被插入到植物細(xì)胞的染色體上。
附圖簡述圖1A顯示突變ALS蛋白和野生型ALS蛋白之間的氨基酸序列的比較。
圖1B續(xù)圖1A，顯示突變ALS蛋白和野生型ALS蛋白之間的氨基酸序列比較。
圖2A顯示突變ALS基因和野生型ALS基因之間的核苷酸序列的比較。
圖2B續(xù)圖2A，顯示突變ALS基因和野生型ALS基因之間的核苷酸序列的比較。
圖2C續(xù)圖2B，顯示突變ALS基因和野生型ALS基因之間的核苷酸序列的比較。
圖2D續(xù)圖2C，顯示突變ALS基因和野生型ALS基因之間的核苷酸序列的比較。
圖3是顯示Rb系對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性特征圖。
圖4是顯示Sr系對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性特征圖。
圖5是顯示Ga系對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性特征圖。
圖6是顯示Vg系對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性特征圖。
圖7是顯示野生型對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性特征圖。
圖8是顯示野生型對綠黃隆的敏感性特征圖。
圖9是顯示Rb系對綠黃隆的敏感性特征圖。
圖10是顯示Sr系對綠黃隆的敏感性特征圖。
圖11是顯示Ga系對綠黃隆的敏感性特征圖。
圖12是顯示Vg系對綠黃隆的敏感性特征圖。
圖13是顯示用陰離子交換柱色譜分離抗性突變ALS蛋白時，組分編號和525nm下OD吸收值之間的關(guān)系的特征圖。
圖14是顯示用陰離子交換柱色譜分離抗性野生型ALS蛋白時，組分編號和525nm下OD吸收值之間的關(guān)系的特征圖。
圖15是野生型ALS蛋白和突變ALS蛋白對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性特征圖。
圖16是野生型ALS蛋白和突變ALS蛋白對綠黃隆的敏感性特征圖。
圖17是野生型ALS蛋白和突變ALS蛋白對滅草喹的敏感性特征圖。
圖18A顯示Nippon-bare EST和玉米ALS基因之間的核苷酸序列比較。
圖18B續(xù)圖18A，顯示Nippon-bare EST和玉米ALS基因之間的核苷酸序列比較。
圖19A是來自于Sr系和來自于野生型cDNA1的全長cDNA之間的核苷酸序列比較。
圖19B續(xù)圖19A，顯示來自于Sr系和來自于野生型cDNA1的全長cDNA之間的核苷酸序列比較。
圖19C續(xù)圖19B，顯示來自于Sr系和來自于野生型cDNA1的全長cDNA之間的核苷酸序列比較。
圖20顯示合成單獨帶有G1643T(W548L)突變或G1880T(S627I)突變的ALS cDNA的過程，以及構(gòu)建帶有ALS cDNA的質(zhì)粒pGEX 2T的過程。箭頭表示引物，星號表示突變位點。
圖21顯示制備C512A(P171H)突變DNA片段和C514A(R172S)突變DNA片段的過程。箭頭表示引物，星號表示突變位點。
圖22顯示合成單獨帶有G512A(P171H)突變或C514A(R172S)突變的ALS cDNA的過程，以及構(gòu)建帶有ALS cDNA的質(zhì)粒pGEX 2T的過程。星號表示突變位點。
圖23顯示制備具有C512A(P171H)/C514A(R172S)DNA片段的過程。箭頭表示引物，星號表示突變位點。
圖24顯示合成P171H/W548L突變ALS cDNA和P171H/S627I突變ALS cDNA的過程，以及構(gòu)建帶有ALS cDNA的質(zhì)粒pGEX 2T的過程。星號表示突變位點。
圖25顯示合成帶有P171H/W548L/S627I突變的ALS cDNA的過程，以及構(gòu)建帶有ALS cDNA的質(zhì)粒pGEX 2T的過程。星號表示突變位點。
圖26顯示由1點突變ALS基因編碼的突變ALS蛋白和野生型ALS蛋白之間對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性的比較。
圖27顯示由2點和3點突變ALS基因編碼的突變ALS蛋白和野生型ALS蛋白之間對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性的比較。
實施本發(fā)明的最好方式現(xiàn)在，通過下列實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但這些例子不限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。
實施例1抗PC除草劑的水稻(Kinmaze)培養(yǎng)細(xì)胞的制備除去水稻種子上的谷殼(品種Kinmaze，學(xué)名Oryza sativa var.Kinmaze)。將種子在70％乙醇中浸泡5分鐘，然后在5％安替佛民中浸泡20分鐘，接著用無菌蒸餾水洗滌幾次。然后將種子在含有表3中所顯示的組成的培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)。
表3
在上述培養(yǎng)基組成中，2，4-D是合成的生長素。為了制備培養(yǎng)基，首先將含有上述組成的培養(yǎng)基放到一個1升的燒杯中，將蒸餾水加到此燒杯中至1000毫升。接著，將此溶液調(diào)節(jié)至pH 5.7，補加3克脫乙酰吉蘭糖膠。通過將此溶液在微波爐中加熱以使脫乙酰吉蘭糖膠充分溶解，然后每次用移液器將30毫升混合物加入到培養(yǎng)燒瓶中。接著，將三張鋁箔覆蓋到培養(yǎng)燒瓶上，接著，在高壓滅菌器中121℃加熱殺菌15分鐘到20分鐘。最后，將溶液冷卻至室溫以制備靜置培養(yǎng)上述種子的培養(yǎng)基。
接著，將培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈合組織中移去胚乳部分，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。然后將得到的愈傷組織部分進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即在液體培養(yǎng)基(組成和表3中所示相同，但不補加脫乙酰吉蘭糖膠)中每2周補加1μM雙嘧苯甲酸鈉(一種PC除草劑)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。2到6周后培養(yǎng)的細(xì)胞開始衰退。大約2個月后，從培養(yǎng)細(xì)胞群體中得到被認(rèn)為是進(jìn)行細(xì)胞分裂的許多不褪色的細(xì)胞團，此培養(yǎng)細(xì)胞群體中大多數(shù)細(xì)胞已死亡并變成褐色。將這些細(xì)胞團分離，進(jìn)行培養(yǎng)，以得到在2μM雙嘧苯甲酸鈉存在時可以增殖的許多細(xì)胞系。將得到的細(xì)胞系分別命名為Rb系，Sr系，Ga系和Vg系。
接著，將產(chǎn)生的許多細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，并以有序的方式提升雙嘧苯甲酸鈉濃度。結(jié)果，得到在100μM雙嘧苯甲酸鈉存在時可以增殖的細(xì)胞系。雙嘧苯甲酸鈉抗性的培養(yǎng)細(xì)胞(此后稱為“抗性突變體”)在補加1到10μM雙嘧苯甲酸鈉的MS-2，4-D固體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將傳代培養(yǎng)的抗性突變體部分取樣，加入不補加雙嘧苯甲酸鈉的MS-2，4-D液體培養(yǎng)基中，然后在8到10天的周期中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。
將大約1.5克(濕重)抗性突變體移植至一個200毫升的錐形瓶中，其中已補加了50毫升MS-2，4-D液體培養(yǎng)基和一定濃度的雙嘧苯甲酸鈉，接著在約27℃下培養(yǎng)一定時間。定期測量愈合組織的濕重。相對的增加量可根據(jù)移植的抗性突變體的濕重來測定。此外，將實驗以不同的雙嘧苯甲酸鈉濃度做三次，計算標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3到6顯示雙嘧苯甲酸鈉濃度變化和第8天或12天時抗性突變體的相對重量之間的關(guān)系。利用野生型(Kinmaze)做相似的實驗作為對照。圖7顯示對雙嘧苯甲酸鈉濃度變化和第8天野生型(Kinmaze)相對重量之間的關(guān)系進(jìn)行測定的結(jié)果。
如圖7所示，在補加1nM雙嘧苯甲酸鈉的一組中，野生型的生長不受抑制，但在補加10nM或更多的雙嘧苯甲酸鈉的一組中，野生型的生長受到抑制。另一方面，如圖3至6所示，除了Vg系外，即使在補加10μM雙嘧苯甲酸鈉的一組中，幾乎沒有一種抗性突變體(Rb系，Sr系，Ga系和Vg系)的生長受到影響。即使在Vg系中，雙嘧苯甲酸鈉對生長的影響也要比野生型的還要小。
在使用綠黃隆代替雙嘧苯甲酸鈉的實驗中，野生型和抗性突變體的生長率也如上所述方法測定。圖8顯示綠黃隆濃度變化和第9天野生型的相對重量之間的關(guān)系。此外，圖9至12顯示綠黃隆濃度變化和第8天或第10天抗性突變體，即Rb系，Sr系，Ga系和Vg系的相對重量之間的關(guān)系。
如圖8所示，在加入1nM綠黃隆時野生型的生長被抑制，表明野生型對綠黃隆的敏感度要比對雙嘧苯甲酸鈉高。然而，如圖9至12所示，Rb系，Sr系，Ga系和Vg系在敏感度方面不同，但其生長并不因加入綠黃隆而受到顯著的抑制，顯示出它們對綠黃隆有抗性。野生型和抗性突變體對雙嘧苯甲酸鈉和綠黃隆的敏感度在甚至更長的培養(yǎng)時間內(nèi)幾乎保持不變。野生型和抗性突變體的生長率幾乎是相同的。
這些結(jié)果表明抗性突變體對雙嘧苯甲酸鈉有高的抗性。此外，和野生型相比，抗性突變體對綠黃隆的抗性有所提高。
實施例2從抗性突變體中部分純化的ALS蛋白對除草劑敏感性在該實施例中，從實施例1中所得到的抗性突變體(Rb系，Sr系和Vg系，Ga系除外)中部分純化突變ALS蛋白，然后測定得到的突變ALS蛋白對除草劑的敏感性。如下所示部分純化突變ALS蛋白。
首先，使用表3所示但不包括脫乙酰吉蘭糖膠的組合物，通過液體培養(yǎng)的方法制備200克或更多的抗性突變體(不補加雙嘧苯甲酸鈉)。然后，使用Hiscotron在比組織體積大3倍的緩沖溶液-1[100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，其中含有20％(v/v)的甘油，0.5mM硫胺素焦磷酸(TPP)，10μM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，0.5mM氯化鎂和十分之一組織體積的的聚乙烯聚吡咯烷酮]中將約150克的抗性突變體勻漿。將此勻漿用尼龍紗布過濾，然后在15000×g的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。在離心上清液中加入硫酸銨至50％的飽和，然后冰浴大約1小時。將混合物再次在15000×g的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘。然后將沉淀部分在大約30毫升緩沖溶液-2[10mMTris鹽酸緩沖液(pH7.5)，其中含有20％(v/v)的甘油，0.5mM TPP，0.5mM氯化鎂]中溶解。將此混合物再次在15000×g的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，然后將上清部分加載于SephadexG-25(Amersham Bioscience)。大約40ml通過柱的組分被作為粗酶溶液收集。
接著，根據(jù)Bio-Rad蛋白測定的手冊用Bradford方法對粗酶溶液的蛋白濃度進(jìn)行測定。然后將粗酶溶液經(jīng)Whatman過濾器(Whatman)過濾，然后將適當(dāng)?shù)牡鞍琢康拇置溉芤?10到15毫升)加載于使用FPLC裝置(Amersham Bioscience)的3個垂直相連的HiTrap Q柱中(Amersham Biosccience)。在蛋白組分用HiTrap Q吸附后，沒有吸附的組分用比多于3至5倍柱床體積的緩沖溶液-2洗出。然后，用多于10倍柱床體積(150毫升)的洗脫溶液將吸附的蛋白組分洗脫下來。在此洗脫液是將氯化鉀以線性濃度梯度(0至0.4M)溶解到緩沖溶液-2中制備的。將含有洗脫蛋白組分的洗脫液以每份5毫升分配到多個試管中。此外，為了使洗脫蛋白組分中的ALS蛋白保持穩(wěn)定，事先在每個分配用的試管中加入0.5毫升含有20mM丙酮酸鈉的緩沖溶液-2。
分配到每個分配用試管中的洗脫組分所含有的突變ALS蛋白的ALS活性通過下述方法測定。將要測定的洗脫組分和含有20mM丙酮酸鈉，0.5mM TPP，0.5mM MgCl2，10μM FAD和20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)的溶液混合，制得用于測定反應(yīng)的反應(yīng)溶液。此反應(yīng)液的用量為1毫升。在加入要測定的洗脫組分后，測定反應(yīng)在30℃下進(jìn)行40到60分鐘。然后，加入0.1毫升6N硫酸(或0.25N氫氧化鈉)終止反應(yīng)。
在反應(yīng)終止后，將反應(yīng)溶液在60℃下溫育10分鐘，從而將反應(yīng)溶液中含有的乙酰乳酸轉(zhuǎn)變成3-羥基丁酮。
然后為了確定反應(yīng)液中的3-羥基丁酮的量，在反應(yīng)液中加入在2.5N氫氧化鈉中溶解的1毫升0.5％(w/v)肌氨酸和1毫升5％(w/v)α-萘酚，接著在37℃下溫育10分鐘。通過比色法對比反應(yīng)液的吸收值(在525nm)而對3-羥基丁酮定量，從而評價ALS活性。此外，由于反應(yīng)液含有少量的丙酮酸鈉，將反應(yīng)時間為0作為對照。
結(jié)果，每0.2毫升反應(yīng)液在525nm處的OD吸收值約為7。然而，當(dāng)用氫氧化鈉終止上述測定反應(yīng)，且測定的是歸因于除ALS活性之外的活性產(chǎn)生時，將近80％的表觀ALS活性來自于直接的3-羥基丁酮的產(chǎn)生活性，而該活性不歸因于突變ALS蛋白的活性。因此，可根據(jù)3-羥基丁酮的產(chǎn)生活性，通過FPLC使用陰離子交換樹脂將突變ALS蛋白和其它蛋白分離。圖13顯示利用Sr系作為抗性突變體得到的結(jié)果。如圖13所示，結(jié)果檢測到3個活性峰。
為了確定3個活性峰中與突變ALS蛋白相對應(yīng)的峰，測定了每個峰的3-羥基丁酮的產(chǎn)生活性。這樣發(fā)現(xiàn)初始洗脫峰所示的組分與突變ALS蛋白相應(yīng)。
利用含突變ALS蛋白的酶溶液測定了突變ALS蛋白對雙嘧苯甲酸鈉、綠黃隆和滅草喹的敏感性。除了在加入酶溶液之前要加入一定濃度的除草劑之外，采用和上述測定反應(yīng)同樣的方式測定ALS活性以評價其對這些除草劑的敏感性。作為對照，野生型ALS蛋白也以同樣的方式進(jìn)行分離和純化(圖14)并用于實驗。此外，將雙嘧苯甲酸鈉制成水溶液，將綠黃隆和滅草喹制成丙酮溶液。反應(yīng)混合物中的丙酮終濃度為1％。
圖15顯示ALS活性抑制率和雙嘧苯甲酸鈉濃度之間的關(guān)系。圖16顯示ALS活性抑制率和綠黃隆濃度之間的關(guān)系。圖17顯示ALS活性抑制率和滅草喹濃度之間的關(guān)系。在圖15至17中，虛線表示野生型ALS蛋白，長短劃雙點虛線表示突變ALS蛋白的Sr系，實線表示突變ALS蛋白的Rb系，長短劃點虛線表示突變ALS蛋白的Vg系。
根據(jù)概率分析計算得到抑制50％ALS活性(I50)的除草劑濃度，從而計算突變ALS蛋白I50對野生型ALS蛋白I50的比率。表4顯示結(jié)果。
表4
此外，根據(jù)表4的結(jié)果，抗每種除草劑的突變體的I50除以野生型的I50計算出RS。結(jié)果如表5所示。
表5
如圖15至17、表4和表5所示，和野生型ALS蛋白相比，突變ALS蛋白即使在除草劑的存在下也顯示出相對高的ALS活性。特別是，來源于Rb系和Sr系的突變ALS蛋白顯示出對雙嘧苯甲酸鈉的敏感性要比對其它除草劑的敏感性顯著提高。即，Rb系和Sr系擁有特別對雙嘧苯甲酸鈉良好的抗性。
實施例3野生型和突變ALS基因的克隆在本實施例中，編碼野生型ALS蛋白的基因(野生型ALS基因)從野生型克隆，而編碼突變ALS蛋白的基因(突變ALS基因)從抗性突變體克隆。
用于克隆野生型ALS基因和突變ALS基因的探針通過如下所述的方法制備。從水稻(Nippon-bare)得到的部分cDNA顯示出與玉米ALS基因的高度同源性，并將其作為本實施例的探針。
(1)顯示出與玉米ALS基因高度同源性的來自于水稻(Nippon-bare)部分cDNA的核苷酸序列的測定作為農(nóng)業(yè)、林業(yè)和漁業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新學(xué)會和國家農(nóng)業(yè)生物學(xué)科學(xué)研究所實施的水稻基因組計劃的一部分，水稻(Nippon-bare)的部分cDNA的核苷酸序列已經(jīng)測定，已經(jīng)建立起cDNA的部分核苷酸序列數(shù)據(jù)庫。在這個數(shù)據(jù)庫中一個已知的大約350bp的核苷酸序列的cDNA克隆(登記號C72411)顯示出與玉米ALS基因的高度同源性。玉米ALS基因序列已經(jīng)被完全測定。
這個cDNA克隆(登記號C72411)從國家農(nóng)業(yè)生物學(xué)科學(xué)研究所獲得，核苷酸序列如下所述的方法測定。在此，cDNA克隆含有一個ALS同系物基因插入到pBluescript II SK+，它可以在大腸桿菌中自主復(fù)制。
首先，將保留有ALS同系物的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(DH5α)。將平皿上的白色克隆在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細(xì)胞中提取質(zhì)粒。由于插入DNA已被插入到Sal I和Not I(在質(zhì)粒載體中多克隆位點的限制性內(nèi)切酶)之間，將此載體用這兩個酶消化。通過瓊脂糖凝膠電泳確定插入片段。然后用如RNaseA、PEG和LiCl的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將得到的保留有ALS同系物的質(zhì)粒載體進(jìn)行純化，接著用引物和ABI BigDyeTerminator循環(huán)測序試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件遵循生產(chǎn)廠商的說明書。在此使用的引物是M13引物和根據(jù)測定的核苷酸序列設(shè)計的合成引物。得到的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀純化，然后其中的核苷酸序列通過ABI PRISM310測序儀來確定。
已知保留有ALS同系物的質(zhì)粒載體含有長1.6kb的插入DNA。得到的保留有ALS同系物的質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I消化，然后進(jìn)行電泳。結(jié)果，檢測到對應(yīng)于pBluescript II SK+的約3kb的條帶和對應(yīng)于插入DNA片段的約1.6kb的條帶(沒有顯示數(shù)據(jù))。測定了插入DNA部分的全部核苷酸序列，并檢查其與玉米的核苷酸序列的同源性。如圖18A和18B所示，發(fā)現(xiàn)84.7％的同源性。由于ALS同系物確定為Nippon-bare變種的ALS基因的部分cDNA，所以用Sal I和Not I消化后的插入DNA作為探針。此外在圖18A和18B中，第一排是Nippon-bare變種的ALS基因的cDNA核苷酸序列；第二排是玉米的ALS基因的cDNA核苷酸序列。
(2)抗性突變體和野生型的mRNA的制備首先，用液氮冷凍的抗性突變體用研缽和杵壓碎，然后用混合器充分碾碎30秒。將碾碎的粉末用提取緩沖液[(100mM Tris-HClpH9.0，100mM NaCl，1重量％SDS，5mM EDTA)∶(β-巰基乙醇)∶(Tris飽和酚)＝15∶3∶20]懸浮，然后充分?jǐn)嚢?。將此溶液?2000×g轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，然后收集上清液。將200毫升PCI[(Tris飽和酚)∶(氯仿)∶(異戊醇)＝25∶24∶1]加入到上清液中，4℃振搖10分鐘，12000×g轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，然后收集上清液。重復(fù)上述步驟2次。將1/20體積的5M NaCl和2.2倍體積的乙醇加入到所得到的上清液中，將此混合物在-80℃下放置30分鐘。12000×g轉(zhuǎn)速下離心5分鐘收集沉淀。將沉淀用70％乙醇洗滌，干燥，然后溶解在10mM β-巰基乙醇溶液中。接著，將此溶液在27000×g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘除去不溶組分。將1/4體積的10M LiCl加入到此溶液中，然后冰浴1小時。接著將溶液在27000×g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘收集沉淀，溶解在4毫升水中，然后測定260nm下的吸收值來確定RNA濃度。將1/20體積的5M NaCl和2.2倍體積的乙醇加入到溶液中，在-80℃下放置30分鐘。接著將溶液在27000×g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘收集沉淀，將沉淀用70％乙醇洗滌，干燥。將得到的產(chǎn)物溶解到適量的水中獲得總RNA溶液。在此離心都是在4℃進(jìn)行。
mRNA是根據(jù)下列方法從總RNA中分離和純化的。將與提取的總RNA體積相同的2X結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM EDTA，1M NaCl)加入到提取的總RNA溶液中。用0.1克寡脫氧胸苷酸纖維素(Amersham Bioscience)填充的柱子用1X結(jié)合緩沖液洗滌，然后將總RNA溶液加入到此柱中。在柱子用1X結(jié)合緩沖液洗滌以后，加入洗脫緩沖液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA)，每次收集0.5毫升洗脫液。將過柱的組分加入到另一個寡脫氧胸苷酸纖維素(Amersham Bioscience)柱，以同樣的方式處理。在根據(jù)每組分的吸收值計算洗脫的mRNA的濃度后，1/10體積的10MLiCl和2.5倍體積的乙醇加入到產(chǎn)物中，然后將混合物在-80℃下放置30分鐘。接著，將混合物離心，干燥沉淀組分，在100μl水中溶解。這樣得到的mRNA進(jìn)行蔗糖密度梯度離心按大小分級分離。
將分離純化后的mRNA放入到由25％蔗糖溶液和5％蔗糖溶液形成的密度梯度的離心管中，用旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子在4℃下以27000rpm轉(zhuǎn)速超高速離心15小時。離心后，按密度梯度的順序，每組分收集0.5毫升。測定每組分的吸收，計算收集的mRNA濃度，ALS mRNA的存在通過應(yīng)用ECL試劑盒(ECL直接核酸標(biāo)記檢測系統(tǒng)，Amersham Bioscience)的雜交來確定。使用上述(1)中制備的探針在42℃下雜交16小時。雜交后，用試劑盒中提供的基本洗滌緩沖液在42℃下洗滌5分鐘，洗滌兩次后用2X SSC溶液在42℃下洗滌5分鐘，洗滌一次。洗滌過的膜用一個透明的塑料膜包裹使之浸沒在試劑盒提供的附帶的發(fā)光試劑中，然后在X射線膠片上曝光。
當(dāng)Sr系用作為抗性突變體時，經(jīng)過上述過程，提取了大約35毫克總RNA和約4毫克mRNA。接著，在蔗糖密度梯度離心中，在一個預(yù)期陽性的組分中發(fā)現(xiàn)了一個雜交陽性的點。
當(dāng)使用野生型時，除了7毫克mRNA以外，提取了大約95毫克總RNA。當(dāng)從野生型提取mRNA時，除了使用野生型代替抗性突變體以外，都應(yīng)用上述方法進(jìn)行提取。
(3)從抗性突變體和野生型構(gòu)建cDNA庫用2微克的上述(2)中純化的mRNA和cDNA合成試劑盒(AmershamBioscience)，合成cDNA，以此構(gòu)建抗性突變體的cDNA庫。
首先，用試劑盒提供的RTase進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；隨后用試劑盒提供的T4 DNA聚合酶進(jìn)行互補鏈延長反應(yīng)。在互補鏈進(jìn)行延長反應(yīng)時，加入32P-dCTP來計算cDNA合成的產(chǎn)量。加入接頭后，合成的cDNA通過體外包裝方法整合入到λ噬菌體中。
cDNA上加入的接頭是一個Eco RI-Not I-BamH I接頭(TakaraShuzo)。將摩爾濃度比cDNA大50倍的接頭加入到含有cDNA的溶液中。然后，在混合液中加入T4 DNA連接酶(Pharmacia)之后在4℃下連接過夜。將反應(yīng)液用一個AsahiPak GS710柱(Asahi ChemicalIndustry Co.，Ltd.)進(jìn)行HPLC，接著用波長為260nm的紫外線監(jiān)控洗脫液。洗脫液分級分離成25個組分，每個組分0.5毫升。每個組分用一個Cerenkov計數(shù)器測定，收集3到4份顯示高計數(shù)的組分。用T4多核苷酸激酶(Takara Shuzo)將組分中含有的接頭5’端磷酸化，然后加入λgt 11Eco RI臂進(jìn)行連接反應(yīng)。將GigaPack GoldIII(Stratagene)加入到溶液中，然后在室溫進(jìn)行2小時連接反應(yīng)。反應(yīng)后，將200μl的SM緩沖液和8μl氯仿加入到反應(yīng)液中，從而制備噬菌體溶液。將此噬菌體溶液稀釋10倍。1μl稀釋的溶液用大腸桿菌(Y-1088)感染，加入0.7％頂層瓊脂，然后將此溶液在一個LB平板上接種。4到8小時后將出現(xiàn)在平板上的噬菌斑計數(shù)，從而測定滴度。
大約74納克的來自Sr系的cDNA的合成通過DE81paper和Cerenkov計數(shù)結(jié)果而確定。載體和加入到那里的接頭連接后的Cerenkov計數(shù)結(jié)果顯示從Sr系得到大約22納克含有插入片段的λDNA。將λDNA包裝入噬菌體中，從而制備抗性突變體細(xì)胞的cDNA庫。文庫溶液的滴度是16600pfu/μl。
當(dāng)使用根據(jù)上述方法從野生型提取的mRNA構(gòu)建cDNA文庫時，顯示合成了大約38納克來自野生的型cDNA。此外，從野生型得到大約5納克含有插入片段的λDNA。另外，野生型cDNA文庫的滴度時18160pfu/μl。
(4)含有ALS基因的cDNA的篩選為了在平板上形成約20,000個噬菌斑，將上述(3)中制備的文庫溶液稀釋，然后來自于野生型的噬菌體和來自于Sr系的噬菌體各自分別在10個平板上接種。然后將噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Schleicher & Schnell，PROTORAN BA85，孔徑0.45μm)，將硝酸纖維素膜用變性溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)浸泡，然后在中和溶液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA)中放置大約20秒。用濾紙將硝酸纖維素膜上多余的水除去，然后將硝酸纖維素膜在80℃下烤2小時。在此，當(dāng)使用Hybond-N+(Amersham Biotech)代替硝酸纖維素膜時，可省略烘烤步驟，并用0.4M NaOH固定20分鐘。
上述(1)中制備的插入DNA用兩種方法標(biāo)記，RI和非RI法，然后當(dāng)作DNA探針使用。通過以下方法進(jìn)行RI標(biāo)記和雜交。首先，將大約200到500納克的探針DNA進(jìn)行熱變性，然后用一個BcaBEST DNA標(biāo)記試劑盒(Takara Shuzo)標(biāo)記。在該標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行時，加入試劑盒提供的緩沖液，隨機引物和32P-dCTP。接著，加入BcaBEST，接著在65℃下溫育30分鐘。隨后，加入EDTA終止反應(yīng)。將反應(yīng)液加入到硝酸纖維素膜上，這樣8張膜含有大約100納克探針。在42℃輕微振搖的條件下雜交過夜。雜交后，用2X SSC，0.1％的SDS溶液洗3次膜，接著在一個BAS2000成像分析器(Fuji Photo Film)的成像板上曝光約1個小時。曝光后用成像分析器檢測陽性克隆。
用下列方法進(jìn)行非RI的標(biāo)記。大約200到500納克的探針DNA進(jìn)行熱變性后，加入一種ECL直接DNA/RNA標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(AmershamBioscience)提供的DNA標(biāo)記試劑(過氧化物酶)和戊二醛，接著在37℃下溫育。在此實驗中，將標(biāo)記好的探針DNA加入到硝酸纖維素膜上，這樣的8張膜含有大約100納克探針。在42℃輕微振搖的條件下雜交過夜。雜交后，在室溫下用基本洗滌緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，然后在室溫下用2X SSC洗滌一次達(dá)10分鐘。將膜浸沒在一個ECL試劑盒提供的發(fā)光溶液中，然后在一個X射線膠片上曝光30分鐘到3小時。
用無菌牙簽將雜交所得的陽性噬菌體(初次篩選)和頂層瓊脂一起刮下來，然后在200μl的SM緩沖液中懸浮，從而獲得噬菌體溶液。每個克隆的噬菌體溶液都進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用大腸桿菌Y-1088感染，然后在LB平板上接種。使用這些新鮮制備的平板，進(jìn)行類似的雜交(二次篩選)。將陽性噬菌體在200μl的SM緩沖液中懸浮，從而獲得單個噬菌體。如果通過二次篩選沒有分離到單個噬菌體，則再進(jìn)行稀釋，接著在LB平板上接種。隨后進(jìn)行雜交(三次篩選)，這樣得到單個噬菌體。
接著，用下述方法從單個噬菌體制備λDNA。用竹叉或牙簽從陽性克隆的噬菌斑中收集λ噬菌體，將其在200μl的含有5μl新鮮的大腸桿菌宿主(Y1088)懸浮液的2×YT培養(yǎng)基(含有10mM MgCl2和0.2％麥芽糖)中接種。將產(chǎn)物在42℃下靜置培養(yǎng)過夜。然后，將此培養(yǎng)液在1毫升含有25μl宿主大腸桿菌(Y1088)的懸浮液的2×YT培養(yǎng)基(含有10mM MgCl2和0.2％麥芽糖)中再次接種，然后振搖培養(yǎng)過夜(這些步驟包括一個預(yù)培養(yǎng)過程)。將預(yù)培養(yǎng)溶液(10至50μl)在12毫升含有10mM的MgCl2和0.5毫升大腸桿菌Y1088懸浮液的2×YT培養(yǎng)基中接種。然后，在42℃下以較強的振搖培養(yǎng)過夜，直到裂解后濁度增加。培養(yǎng)后，加入50μl氯仿和1.2毫升5M的NaCl，然后在42℃下振搖培養(yǎng)10分鐘。將產(chǎn)物在27000×g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，然后將上清液重新轉(zhuǎn)入到離心管中。在上清液中加入5毫升50％PEG，然后在冰上放置1個小時或更多時間。將產(chǎn)物在27000×g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，然后將上清液棄去。接著，在27000×g轉(zhuǎn)速下再次離心，棄去液體部分。將沉淀組分用300μl含有4μg的DNaseI，20μg的RNase A和10mM的MgCl2的30mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.5)懸浮。將懸浮液轉(zhuǎn)移至一個1.5毫升的試管。在37℃下將此懸浮液培養(yǎng)30分鐘后，向懸浮液中加入7.5μl的20％SDS，3μl蛋白酶K(10毫克/毫升)和12μl的0.5M的EDTA，接著在55℃下進(jìn)一步培養(yǎng)15分鐘。緊接著，在產(chǎn)物中加入150μl酚，然后劇烈攪拌。然后用TOMYMicrocentrifuge MR-150(TOMY DIGITAL BIOLOGY)將混合物在15000rpm下離心3分鐘，收集水層。在收集的水層中加入800μl乙醚(加入蒸餾水以除去過氧化物)。將混合物劇烈攪拌，然后在15000rpm下離心10秒，棄去乙醚層。重復(fù)乙醚提取步驟，之后用氮氣除去水層中殘留的乙醚。在水層中加入30μl的5M的NaCl和875μl乙醇，這樣快速收集沉淀的λDNA。將收集的λDNA用大約1毫升70％乙醇漂洗，然后在減壓條件下干燥約1分鐘，從而除去乙醇。將產(chǎn)物在20μl至50μl的TE緩沖液(pH8.0)溶解，從而制備λDNA溶液。
通過下述方法對獲得的λDNA進(jìn)行插入DNA的亞克隆和測序。將獲得的λDNA溶液(1μl)用Not I消化以剪切插入DNA。反應(yīng)液(用于切割反應(yīng))的組成根據(jù)限制酶所附的手冊上的步驟進(jìn)行。在37℃下反應(yīng)大約2小時后，通過用1％瓊脂糖凝膠電泳確定插入片段大小。含有插入DNA的λDNA(10μl到20μl)用Not I消化以剪切插入DNA。用分配瓊脂糖凝膠分離插入DNA，將相應(yīng)的條帶從凝膠上切下來，然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化插入DNA。將插入DNA以摩爾比為1∶1和經(jīng)BAP處理(用來源于蝦的堿性磷酸化酶去磷酸化)的載體混合，接著用T4DNA連接酶在16℃下連接2小時或更多的時間。在此，由于用Not I剪切的插入DNA作為材料，Not I剪切的載體用BAP處理。連接后，部分溶液和感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)混合，然后在冰上靜置30分鐘。接著，將混合物在42℃下熱激30秒，然后在冰上再次靜置2分鐘。然后，向混合物中加入SOC，在37℃下培養(yǎng)1小時，接種在事先均勻加入100μl的2×YT(含有50微克/毫升氨芐青霉素)、30μl的3％X-Gal和3μl的1M的IPTG混合物的LB培養(yǎng)基平板上，然后在37℃下培養(yǎng)10小時或更長時間。將每個轉(zhuǎn)化的白色克隆接種到2毫升含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基或2×YT培養(yǎng)基中，然后在37℃下培養(yǎng)過夜。根據(jù)常規(guī)技術(shù)從培養(yǎng)液中制備質(zhì)粒溶解到水中。定量測定其中的DNA濃度，然后將此質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)來測序。根據(jù)上述方法進(jìn)行PCR反應(yīng)和測序反應(yīng)。
上述實驗的結(jié)果顯示，從每個野生型和Sr系培養(yǎng)細(xì)胞獲得了約2.2kb長的不完全長度的ALS cDNA。由于距DNA的5’端約250bp處的位置上有一個Sma I位點，所以通過下列方法制備新的探針。保留有來自野生型約2.2kbp長的不完全長度的ALS cDNA的pBluescriptII SK+用宿主大腸桿菌JM109擴增，然后用一個自動分離系統(tǒng)(KURABO PI-100)提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒直接用Sma I消化。將產(chǎn)生的大約250bp的片段用1％瓊脂糖凝膠電泳分離純化，然后計算濃度，從而制備探針。利用探針，用上述方法利用上述RI再次篩選文庫。從由此得到的單個噬菌體中制備λDNA，用Eco RI消化λDNA溶液(1μl)，通過電泳確定大小，然后其被固定在一個硝酸纖維素膜上。電泳后，將膠浸入含有1.5M NaCl的0.5M NaOH溶液中，然后輕微搖晃15分鐘。然后將膠用水洗滌，浸沒在含3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH7.5)中，然后邊搖邊中和約15分鐘。將大約5張厚的工業(yè)用的濾紙疊起來作為底座。將底座放在不銹鋼棒上涂布的20×SSC。緊接著，將中和的凝膠，硝酸纖維素膜(已被剪成一定大小，在蒸餾水中浸沒，然后在20×SSC中浸沒10分鐘)，二層濾紙依次放在底座上，接著又將3厘米到4厘米厚的紙巾塔放到上面。先將一個玻璃板再將一個輕質(zhì)物體放到上述物品上，接著印跡約5分鐘。確認(rèn)膠和膜之間沒有氣泡后，印跡約10分鐘。印跡后，將膜用透射照明器進(jìn)行紫外處理，然后在80℃下烘烤約15到30分鐘。烘烤后，用上述32P標(biāo)記的250bp探針DNA進(jìn)行雜交(雜交緩沖液組成5×SSPE，0.5％SDS，5×Denharlts，solum精子DNA，50％甲酰胺)。將雜交后條帶的放射性轉(zhuǎn)移至一個成像板上，用BAS-2000分析結(jié)果。在雜交中，將顯示相對大分子量的陽性插入片段大量制備，然后亞克隆到用EcoRI消化然后用上述方法進(jìn)行BAP處理的pBluescript II SK+中。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(JM105)。將得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備質(zhì)粒。這樣可通過上述方法測定核苷酸序列。
結(jié)果，全長ALS cDNA基因可從野生型和Sr系的培養(yǎng)細(xì)胞中獲得。野生型和突變ALS基因間的同源比對結(jié)果如圖19A、B和C顯示。如圖19A、B和C顯示，和野生型相比，在Sr系中觀察到2點突變，這2點是從作為轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG的起始點的第一個堿基A起的第1643和1880位。在Sr系，野生型中第1643位的G突變?yōu)門(用G1643T表示)，野生型中第1880位的G突變?yōu)門(用G1880T表示)。當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)榘被釙r，這些突變表現(xiàn)為在Sr系的突變ALS蛋白的氨基酸序列中由野生型ALS蛋白中第548位的色氨酸突變?yōu)榱涟彼?即，“W548L突變”)，野生型ALS蛋白第627位的絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?即“S627I突變”)。
(5)將克隆到pBluescript II SK+中的野生型ALS cDNA亞克隆到pGEX2T在含有上述(4)中獲得的全長的野生型ALS cDNA的質(zhì)粒pBluescript II SK+用Eco RI消化，含有野生型ALS基因的cDNA被剪切下來。然后，cDNA被整合到pGEX-2T(Amersham Bioscience)的Eco RI位點，pGEX-2T是一個大腸桿菌表達(dá)載體。在下文中，含全長的整合到pGEX-2T的Eco RI位點的野生型ALS cDNA的表達(dá)載體被稱為“pGEX-2T(ALS-野生型)?！睂GEX-2T(ALS-野生型)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(JM109)。將轉(zhuǎn)化所得的克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，然后通過測序確定插入DNA的插入方向。這樣，制備了pGEX-2T(ALS-野生型)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(JM109)。
實施例4抗PC除草劑的水稻培養(yǎng)細(xì)胞的ALS基因中突變位點的說明(1)從抗性突變體(Sr，Rb，Vg，和Ga系)提取基因組DNA使用一個植物DNA提取試劑盒ISOPLANT II(Nippon Gene)，根據(jù)試劑盒附帶的手冊從0.1克每個Sr，Rb，Vg，和Ga系的培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA。在用上述試劑盒提取基因組DNA后，將RNA變性并用RNaseA除去。然后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA。
(2)用基因組DNA為模板對ALS基因進(jìn)行PCR如下所示用每個基因組DNA為模板，一個“ALS-Rsp3”引物和一個“4-83-3”引物進(jìn)行PCR。用Ready to Go PCR Beads(AmershamBioscience)在25μl的終體積中進(jìn)行PCR。反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)條件由一個初始在94℃下5分鐘的變性步驟，接著在94℃下30秒的變性步驟，在55℃下1分鐘的退火步驟和在72℃下2分鐘的延伸步驟組成。此外，最后一個循環(huán)的延伸步驟是在72℃下延伸9分鐘。
接著，PCR反應(yīng)溶液進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳(100V，1×TBE緩沖液)。切下含PCR產(chǎn)物的膠，然后將切下的膠切成小片段。將所得的凝膠片段用無菌離子交換水漂洗兩到三次，加入500μl無菌離子交換水，然后重復(fù)冷凍和溶解3次。這樣，PCR產(chǎn)物可以洗脫在水中。
接著，用溶解PCR產(chǎn)物的洗脫液再次進(jìn)行PCR。特別要指出的是，這次是在100μl的終體積中，以溶液中的PCR產(chǎn)物為模板，以相同的一套引物或嵌套引物進(jìn)行PCR。反應(yīng)后，反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1％)分離。切下含有目標(biāo)條帶的膠，然后，用一個GEX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Bioscience)進(jìn)行純化。最后，用75μl無菌去離子水將PCR產(chǎn)物洗脫下來。
(3)測序用PCR擴增的DNA片段為模板和ABI PRISM BigDye ver.2(Applied Biosystem)進(jìn)行測序反應(yīng)。在測序反應(yīng)中，將11μl模板DNA，1μl引物(3.2皮摩爾/微升)和8μl預(yù)混合物混合起來，這樣總體積為20μl。測序反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)條件包含一個初始在96℃下5分鐘的變性步驟，接著在96℃下5秒的變性步驟，在50℃下5分鐘的退火步驟和在60℃下4分鐘的延伸步驟。此外，最后一個循環(huán)的延伸步驟是在60℃下延伸9分鐘。測序反應(yīng)之后，用AutoSeq G-50柱(Amersham Biotech)進(jìn)行凝膠過濾除去反應(yīng)液中的熒光核苷酸。然后用ABI PRISM 310 DNA測序儀讀出核苷酸序列。
(4)在此使用的引物和核苷酸序列的名稱上述(2)中使用的引物以及下列例子中使用的引物的名稱核苷酸序列等在表6中列出。
表6
在表6中，相應(yīng)的ALS位點是轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG作為開始位點時相應(yīng)的堿基序號。此外，ALS-Rsp1的核苷酸序列如SEQ ID NO9中所示，ALS-Rsp2的核苷酸序列如SEQ ID NO10中所示，ALS-Rsp3的核苷酸序列如SEQ ID NO11中所示，ALS-Rsp4的核苷酸序列如SEQID NO12中所示，ALS-Rsp6的核苷酸序列如SEQ ID NO13中所示，ALS-Rsp7的核苷酸序列如SEQ ID NO14中所示，ALS-RspA的核苷酸序列如SEQ ID NO15中所示，ALS-RspB的核苷酸序列如SEQ IDNO16中所示，ALS-RspC的核苷酸序列如SEQ ID NO17中所示，ALS-RspD的核苷酸序列如SEQ ID NO18中所示，ALS-RspF的核苷酸序列如SEQ ID NO19中所示，ALS-RspE的核苷酸序列如SEQ IDNO20中所示，3-1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO21中所示，3-1-2的核苷酸序列如SEQ ID NO22中所示，3-1-3的核苷酸序列如SEQ IDNO23中所示，3-1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO24中所示，4-83-1的核苷酸序列如SEQ ID NO25中所示，4-83-3的核苷酸序列如SEQ IDNO26中所示，83-10的核苷酸序列如SEQ ID NO27中所示，83-15的核苷酸序列如SEQ ID NO28中所示，ALS-DG7的核苷酸序列如SEQID NO29中所示。
(5)作為測序結(jié)果揭示的每個系的突變作為上述(3)中確定的核苷酸序列分析的結(jié)果，顯示了Rb，Vg，Ga，和Sr系中的突變。每個系的突變位點在表7中列出。
表7
如圖7所示，在Rb系的核苷酸序列中，第512位C突變成A(同型)，第1643位G突變成T(異型)。這就意味著在氨基酸水平上，第171位脯氨酸和第548位色氨酸(W)分別突變成組氨酸(H)和亮氨酸(L)。在Vg系細(xì)胞株的核苷酸序列中，第1643位G突變成T(異型)，這就意味著在氨基酸水平上，第548位色氨酸(W)突變成亮氨酸(L)。在Ga系細(xì)胞株中的核苷酸序列中，第512位和第514位C突變成A(同型或異型)(這些型根據(jù)獲得的PCR產(chǎn)物不同而不同)，第1643位G突變成T(異型)。這就意味著在氨基酸水平上，第171位脯氨酸(P)，第172位精氨酸(R)和第548位色氨酸(W)分別突變成組氨酸(H)，絲氨酸(S)和亮氨酸(L)。此外，在Sr系細(xì)胞株的核苷酸序列中，第1643位和第1880位G突變成T(異型)。
當(dāng)通過上面的方法從Sr系的cDNA文庫中篩選分離ALS基因時，不僅分離到2個位點的突變基因而且也分離了一個野生型的基因。這樣，可以設(shè)想在基因組DNA水平上，發(fā)生了異源的突變，基因組PCR獲得的結(jié)果也支持了這一設(shè)想。
如上所述，在所有抗性突變體中，第548位色氨酸(W)突變成亮氨酸(L)(異型)，且只發(fā)生在Vg系中。如上所述，Vg系顯示出對高達(dá)10μM的雙嘧苯甲酸鈉具有敏感性，而Sr、Rb和Ga系顯示出對高達(dá)100μM的雙嘧苯甲酸鈉具有相同的敏感性。因此，這表明隨選擇壓力的強度增加，從Vg系開始獲得抗性，然后再分支到其它系并且發(fā)生突變。
例5單獨含有G1643T(W548L)突變或G1880T(S627I)突變的ALScDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX2T的構(gòu)建以及用載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌首先，單獨含有G1643T(W548L)突變或G1880T(S627I)突變的ALScDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX2T的構(gòu)建用圖20描述。
用1μl(分別用585納克/微升和554納克/微升)pBluescript IISK+(ALS-2位點突變體)或pBluescript II SK+(ALS-野生型)為模板，和1μl的LA Taq DNA聚合酶(Takara)在100μl的終反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR。反應(yīng)進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)條件包括在95℃下30秒，在55℃下30秒和在72℃下2分鐘。此外，pBluescript II SK+(ALS-2位點突變體)含有2位點突變的ALS基因，G1643T(W548L)和G1880T(S627I)。pBluescript II SK+(ALS-野生型)含有沒有突變的野生型ALS基因。在PCR中，組合使用了ALS-Rsp6和ALS-RspF引物以及ALS-RspE和M13R引物。用ALS基因為模板擴增的片段和特定的引物組合的名稱在表8中列出。此外，引物M13R是在pBluescriptII SK+T3啟動子附近的反義引物。此外，M13R的核苷酸序列是5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’(SEQ ID NO30)。
表8
通過PCR得到的PCR-1、PCR-2、PCR-3和PCR-4分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，然后以上述方法類似的方式從瓊脂糖凝膠中收集產(chǎn)物，然后將產(chǎn)物用50μl無菌水洗脫。
接著，用一套PCR-1和PCR-4、一套PCR-2和PCR-3進(jìn)行SPR(自身聚合酶反應(yīng))。加入23.5μl的PCR-1和PCR-4組合或PCR-2和PCR-3組合、1μl的LA Taq DNA聚合酶至終體積為75微升進(jìn)行SPR反應(yīng)，反應(yīng)25次循環(huán)，每個循環(huán)由在95℃下1分鐘的變性步驟，在55℃下30秒的退火步驟和在72℃下2分鐘的延伸步驟組成。利用一套PCR-1和PCR-4通過SPR獲得的DNA片段作為SPR-1，利用一套PCR-2和PCR-3通過SPR獲得的DNA片段作為SPR-2。
此外，在本實施例中，為確保得到足夠量的SPR-1和SPR-2，分別在100μl的終反應(yīng)體積中用純化的SPR-1或SPR-2作為模板，再加入ALS-Rsp6，M13R和LA Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR。在此實驗中，PCR重復(fù)25次，每個循環(huán)由在95℃下30秒的變性步驟，在55℃下30秒的退火步驟和在72℃下2分鐘的延伸步驟組成。PCR后，將反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠中收集了大約2kbp的單一條帶(PCR產(chǎn)物)，然后用100μl無菌水洗脫。
接著，由PCR擴增的SPR-1和SPR-2分別用Acc I和Eco RI消化，從而得到SPR-1(Acc I/Eco RI消化片段)和SPR-2(Acc I/Eco RI消化片段)。特別指出的是，將50μl含有溶解的PCR產(chǎn)物的無菌水(總體積100μl)在10×M緩沖液(Takara)存在時與1μl Acc I(12u/μl)、1μl Eco RI(12u/μl)混合，接著在60μl終體積中在37℃下溫育1小時。之后，將反應(yīng)溶液總體積進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后用一個GFXPCR和凝膠純化試劑盒收集1.5kbp的靶片段。收集的1.5kbp片段用50μl無菌水洗脫，這樣制備了含有SPR-1(Acc I/Eco RI消化片段)的溶液和含有SPR-2(Acc I/Eco RI消化片段)的溶液。
同時，150μl含有野生型ALS基因插入的蛋白表達(dá)載體，pGEX-2T(ALS-野生型)質(zhì)粒(濃度大約為50納克/微升)在10×M緩沖液存在時與1μl Acc I(12u/μl，Takara)混合，接著在37℃下溫育2小時。反應(yīng)后，通過1％瓊脂糖凝膠電泳確定7.2kbp的線性條帶。根據(jù)GFX PCR和凝膠純化試劑盒手冊，從瓊脂糖凝膠收集相應(yīng)于7.2kbp條帶的DNA，然后將產(chǎn)物在180μl無菌水中洗脫。將89μl洗脫的產(chǎn)物和10μl的10×H緩沖液(Takara)，1μl Eco RI(12u/μl)混合，然后在37℃下反應(yīng)1分鐘，從而用Eco RI部分消化收集的DNA。反應(yīng)后，加入10×加樣緩沖液，然后進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳。4.9kbp，5.7kbp和6.5kbp條帶以及沒有切割的7.2kbp條帶都個別地出現(xiàn)了，然后從凝膠中切下5.7kbp的靶條帶。包括在切下的凝膠中的大約5.7kbp的DNA片段用GFX PCR和凝膠純化試劑盒收集，然后用50μl無菌水洗脫產(chǎn)物。
緊接著，3μl用Acc I消化和Eco RI部分消化pGEX-2T(ALS-野生型)獲得的片段和3μl SPR-1(Acc I/Eco RI消化片段)或SPR-2(Acc I/Eco RI消化片段)分別在6μl Takara連接緩沖液中(ver.2，溶液I)于16℃下反應(yīng)過夜。
然后，根據(jù)所附的手冊將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(菌株JM109，Takara)。將細(xì)胞接種在含有50ppm的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，然后在37℃下培養(yǎng)過夜。結(jié)果，挑選了幾個出現(xiàn)的克隆。用這些克隆為模板，以及表6中列出的一組ALS-RspE和PGEX-3(5’-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3’SEQ ID NO31)，一組PGEX-5(5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’SEQ ID NO32)和PGEX-3，一組PGEX-5和表6列出的ALS-RspA，直接進(jìn)行PCR。此外，PGEX-3具有一個與位于用作載體的pGEX-2T 3’端的反義鏈的一部分相同的序列。PGEX-5有一個與用作載體pGEX-2T的5’端的有義鏈的一部分相同的序列。ALS-RspE/PGEX-3組合的反應(yīng)條件包括，每1μM引物和1個PCR珠子溶解在25μl的總體積中，反應(yīng)通過重復(fù)40次來完成，每個循環(huán)由在95℃下30秒的變性步驟，在55℃下1分鐘的退火步驟和在72℃下2分鐘的延伸步驟組成。在PGEX-5/PGEX-3組合，PGEX-5/ALS-RspA組合的實驗中，由于在上游部分有大約75％的GC含量的區(qū)域，所以在上述溶液中進(jìn)一步加入終濃度為5％的DMSO。此PCR結(jié)果證實了想得到的插入片段的插入。
挑選出一個證實了的想得到的插入片段的插入的菌落，然后在含有50ppm氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(每個菌落3毫升，共10個)中在37℃下振搖培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)后，用一個質(zhì)粒提取系統(tǒng)(TOMYDP-480)從培養(yǎng)基提取質(zhì)粒(400到500μl)，然后通過離心濃縮到約200μl。然后，將此濃縮液用GFX PCR和凝膠純化試劑盒純化和脫鹽，最后用約130μl無菌水洗脫。
用ABI PRISM BigDye ver.2對這些質(zhì)粒進(jìn)行測序反應(yīng)，這樣分析了質(zhì)粒中插入片段的核苷酸序列。在測序反應(yīng)中，通過將11μl模板DNA，1μl引物(3.2皮摩爾/微升)和8μl預(yù)混合液混合制備了總體積為20μl的反應(yīng)液。測序反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)條件由一個初始在96℃下5分鐘的變性步驟，在96℃下5秒的變性步驟，在50℃下5秒的退火步驟和在60℃下4分鐘的延伸步驟組成，以及在60℃下9分鐘的最后一個循環(huán)的延伸步驟。測序反應(yīng)結(jié)束后，用AutoSeq G-50柱進(jìn)行凝膠過濾除去反應(yīng)液中的熒光核苷酸，然后用ABI PRISM 310DNA測序儀確定核苷酸序列。
此外，表6中列出測序反應(yīng)中的引物，PGEX-5，ALS-RspC，ALS-Rsp3，ALS-Rsp1，3-1-4和ALS-RspB作為有義引物使用，4-83-3，PGEX-3，ALS-Rsp2，4-83-10和ALS-Rsp7作為反義引物使用。
分析結(jié)果證實得到了包含了具有W548L突變的突變ALS基因的pGEX 2T載體(在圖20中被描述為“pGEX 2T(ALS-W54L突變體)”)和包含了具有S627I突變的突變ALS基因的pGEX2T載體(在圖20中被描述為“pGEX 2T(ALS-S627I突變體)”)。接著，將這些pGEX 2T(ALS-W548L突變體)和pGEX 2T(ALS-S627I突變體)轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
例6單獨含有通過Rb系基因組PCR發(fā)現(xiàn)的C512A(P171H)突變或通過Ga系基因組PCR發(fā)現(xiàn)的C514A(R172S)突變的ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX 2T的構(gòu)建，用該載體對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化首先，單獨含有C512A(P171H)突變或C514A(R172S)突變的ALScDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX 2T的構(gòu)建如圖21和圖22所述。
為了得到C512A(P171H)突變DNA片段，用Rb系基因組DNA為模板，表6中列出的一組ALS-Rsp6和ALS-Rsp4引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。特別指出的是，使用Ready to Go PCR Beads，加入5μl基因組DNA模板和每個引物1μl(25皮摩爾/微升)在一個25μl的終體積中進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件由一個初始在95℃下5分鐘的變性步驟，接著一個循環(huán)(重復(fù)40次)包括在95℃下30秒的變性步驟，在55℃下1分鐘的退火步驟和在72℃下2分鐘的延伸步驟組成。此外，最后一個循環(huán)的延伸步驟是在72℃下延伸9分鐘。
PCR反應(yīng)后，反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖膠中切下PCR產(chǎn)物條帶(在圖21中描述為“PCR-5”)，然后，用一個GEXPCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒進(jìn)行純化。接著，純化的PCR-5被整合到pT7Blue T-載體(Novagen)，此載體(TA克隆載體)用來克隆PCR產(chǎn)物。特別的是，將1μl純化的PCR產(chǎn)物和1μl的pT7 Blue T-載體(50納克/微升)，3μl無菌去離子水和5μl連接緩沖液(ver 2，溶液I，Takara Shuzo)混合，然后，在16℃下反應(yīng)過夜。
反應(yīng)后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將反應(yīng)液總體積轉(zhuǎn)化大腸桿菌(菌株JM109)。在含有50ppm的氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌后，從培養(yǎng)基上出現(xiàn)的單個克隆以與實施例5類似的方式挑選含靶序列的菌落。將挑選的單個菌落在含有50ppm氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基溶液(每個菌落3毫升，共10個)中37℃振搖培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)后，用一個質(zhì)粒提取系統(tǒng)(TOMY DP-480)提取(400到500μl)質(zhì)粒。將質(zhì)粒通過離心濃縮到約200μl，將此濃縮液用GFX PCR和凝膠純化試劑盒純化和脫鹽，然后用約80μl無菌水洗脫。
將55μl洗脫液在10μl的10×T緩沖液和10μl的0.1％BSA存在時與1μl Acc I(12u/μl)和1μl Sma I(10u/μl)混合，總體積為100μl，然后將混合物在37℃下溫育2小時。反應(yīng)后，反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下并且收集靶條帶，然后根據(jù)GFX PCR和凝膠純化試劑盒手冊收集DNA片段。這樣，獲得了末端帶有Sma I位點和AccI位點的C512A(P171H)突變DNA片段。
另一方面，由于C514A和C512A突變彼此接近，利用提取的Gb系的基因組DNA為模板進(jìn)行的PCR不能獲得只帶有C514A(R172S)突變的DNA片段。這樣，如圖21所示，只帶有C514A(R172S)突變的DNA片段用一對事先引入突變位點的引物來制備。即，分別應(yīng)用了引入突變位點的引物ALS-M1(5’-CCCCAGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTT-3’SEQ ID NO33，下劃線A是一個突變位點)和ALS-M2(5’-CGGTGCCGATCATGCGGCTGGGGACCT-3’SEQ ID NO34，下劃線T是一個突變位點)，用帶有插入的野生型ALS cDNA的pBluescript II SK+作為模板；以及應(yīng)用一組引物ALS-Rsp6和ALS-M2，一組引物ALS-M1和ALS-Rsp4進(jìn)行PCR。此外，互補部分是ALS-M1的核苷酸序列(第1至23位核苷酸)和ALS-M2的的核苷酸序列(第1至23位核苷酸)。當(dāng)使用一組引物ALS-Rsp6和ALS-M2時，擴增了圖21中描述的“PCR-6”DNA片段；當(dāng)使用一組引物ALS-M1和ALS-Rsp4時，擴增了圖21中描述的“PCR-7”DNA片段。
通過將1μl的LA Taq DNA聚合酶(5單位/微升，TAKARA)，10μ1 10×LA緩沖液、10μl的25mM MgCl2、16μl的dNTPs(分別由25mM的dATP，dGTP，dCTP和dTTP組成)、1μl模板DNA 及各4μl的有義和反義引物(分別為25皮摩爾/微升)溶解，制備總體積為100μl PCR反應(yīng)溶液。反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次，每個循環(huán)由一個初始在95℃下5分鐘的變性步驟，在95℃下30秒的變性步驟，在55℃下1分鐘的退火步驟和在72℃下2分鐘的延伸步驟組成，最后一個循環(huán)的延伸步驟是在72℃下延伸9分鐘。
反應(yīng)后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，切下213bp(PCR-6)和377bp(PCR-7)的靶條帶，用一個GEX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒進(jìn)行純化，然后分別將得到的DNA片段用100μl無菌去離子水洗脫。
接著，用這樣得到的PCR-6和PCR-7進(jìn)行SPR。SPR時，通過將30μl得到的洗脫液與1μl的LA TaqDNA多聚酶(5單位/微升)、10μl的10×LA緩沖液，10μl的25mM的MgCl2以及16μl的dNTPs(分別25mM dATP，dGTP，dCTP和dTTP組成)混合制備總體積為100μl的反應(yīng)液。重復(fù)40次進(jìn)行SPR，每個循環(huán)由一個初始在95℃下5分鐘的變性步驟，在95℃下30秒的變性步驟，在55℃下1分鐘的退火步驟和在72℃下2分鐘的延伸步驟組成，最后一個循環(huán)的延伸步驟是在72℃下延伸9分鐘。
反應(yīng)后，反應(yīng)溶液進(jìn)行(1.5％)瓊脂糖凝膠電泳分離，切下560bp的靶條帶(在圖21中所述“SPR-3”)的膠，用GEX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒進(jìn)行純化，然后將得到的DNA片段(SPR-3)用100μl無菌去離子水洗脫。和上述方法類似，將洗脫的片段整合到pT7BlueT-載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(JM109)。培養(yǎng)大腸桿菌，然后由其提取的質(zhì)粒用Sma I和Acc I消化，這樣獲得了末端帶有Sma I位點和Acc I位點的C514A(R171S)突變DNA片段。
同時，大腸桿菌(菌株JM109)用帶有野生型ALS基因插入的質(zhì)粒pGEX-2T(ALS-野生型)轉(zhuǎn)化，并在含有50ppm的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(2毫升×15份)中在37℃下振搖培養(yǎng)過夜。在用一個質(zhì)粒提取體系(DP-480)提取質(zhì)粒后，用真空離心濃縮器將提取物(約750μl)濃縮至約200μl。然后用GEX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒對濃縮物進(jìn)行脫鹽，最后再將質(zhì)粒用200μl無菌去離子水進(jìn)行最終洗脫。
接著，將這樣得到的質(zhì)粒pGEX-2T(ALS-野生型)用AccI消化。特別指出的是，將75μl洗脫液與9μl的10×M緩沖液、3μl Acc I(12u/μl)和3μl無菌去離子水混合，然后將此混合液在37℃下反應(yīng)3小時。反應(yīng)后，反應(yīng)溶液進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，切下并收集靶條帶，然后用GEX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒進(jìn)行純化，最后再將得到的DNA片段用100μl無菌去離子水進(jìn)行最終洗脫。
緊接著，用Acc I消化的質(zhì)粒pGEX-2T(ALS-野生型)再用Sma I部分消化。特別指出的是，將79μl洗脫液與10μl的10×T緩沖液、10μl的0.1％BSA和1μl的Sma I(10u/μl)混合，其總體積為100μl，然后將混合物在30℃下溫育1分鐘。此外，由于pGEX-2T(ALS-野生型)含有位于分離的3個位置的Sma I識別序列(在pGEX-2T中與Thrombin切割位點相鄰的多克隆位點上，ALS基因的第276位和第430位序列)，所以可在短時間內(nèi)進(jìn)行部分消化。反應(yīng)后，將溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，只有其中ALS基因中第430位的Sma I識別序列被消化的質(zhì)粒相應(yīng)的條帶被切下并收集，然后用GEX PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒進(jìn)行純化以除去酶和蛋白。最后，將純化的產(chǎn)物用50μl無菌去離子水洗脫。將這個Acc I消化/Sma I部分消化的pGEX-2T-野生型ALS cDNA片段、通過上述方法得到的末端帶有SmaI位點和Acc I位點的C512A(P171H)突變DNA片段和C514A(R172S)突變DNA片段通過標(biāo)準(zhǔn)方法連接。在圖22中，僅單獨含有由此方法得到的C512A(P171H)突變的突變ALS基因的質(zhì)粒被稱為“pGEX-2T(ALS P171H突變體)”，僅單獨含有由此方法得到的C514A(R172S)突變的突變ALS基因的質(zhì)粒被稱為“pGEX-2T(ALS R171S突變體)”。
之后，用總體積的反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(菌株JM109)。將在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上出現(xiàn)的單個菌落用PCR以上述方法中類似的方式進(jìn)行篩選，這樣挑選出帶有pGEX-2T(ALS P171H突變體)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體和帶有pGEX-2T(ALS R172S突變體)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。
例72-位點突變(C512A(P171H)/C514A(R172S))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的構(gòu)建，用該載體對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化2-位點突變(C512A(P171H)/C514A(R172S))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的構(gòu)建用圖23所述。
根據(jù)上述實施例6中描述的方法，以Ga系中提取的基因組DNA為模板利用PCR合成2-位點突變(C512A(P171H)/C514A(R172S))ALS cDNA。特別的是，PCR是使用Ga系中提取的基因組DNA為模板，一組引物ALS-Rsp6和ALS-Rsp4而進(jìn)行的，擴增的DNA片段在圖23中被稱為“PCR-8”。然后，將擴增的DNA片段連接入pT7B1ue-T-載體，接著用Acc I和Sma I消化，因此得到C512A(P171H)/C514A(R172S)突變DNA片段。接著，如圖22所示，將Acc I消化/SmaI部分消化的pGEX-2T-野生型ALS cDNA片段和C512A(P171H)/C514A(R172S)突變DNA用標(biāo)準(zhǔn)方法連接。這樣，構(gòu)建了pGEX-2T(ALSP171H，R172S突變體)質(zhì)粒。此外，和實施例6相似的是，制備了用pGEX-2T(ALS P171H，R172S突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。
例82-位點突變(C512A(P171H)/G1643T(W548L)和C512A(P171H)/G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的構(gòu)建，用該載體對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化2-位點突變(C512A(P171H)/G1643T(W548L)和C512A(P171H)/G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的構(gòu)建如圖24所述。
首先，根據(jù)實施例6中的方法，將實施例5中獲得的pGEX-2T(ALS-W548L突變體)用Acc I消化，然后用Sma I部分消化，這樣可以使ALS基因中第430位Sma I識別序列到Acc I的識別序列間的部分缺失。接著，將此產(chǎn)物和實施例6中制備的C512A(P171H)突變片段連接，這樣構(gòu)建了含有2-位點突變(C512A(P171H)/G1643T(W548L)ALS cDNA的質(zhì)粒(在圖24中被稱為pGEX-2T(ALS-P171H，W548L突變體))。
同時利用實施例5中得到的pGEX-2T(ALS-S627I突變體)代替pGEX-2T(ALS-W548L突變體)，同樣構(gòu)建了含有2-位點突變(C512A(P171H)/G1880T(S627I))ALS cDNA的質(zhì)粒(在圖24中被稱為pGEX-2T(ALS-P171H，S627I突變體))。
此外，以例6中相似的方式，用這些pGEX-2T(ALS-P171H，W548L突變)和pGEX-2T(ALS-P171H，S627I突變)轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
例93-位點突變(C512A(P171H)/G1643T(W548L)/G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的構(gòu)建，用該載體對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化3-位點突變(C512A(P171H)/G1643T(W548L)G1880T(S627I))ALS cDNA的合成，保留有ALS cDNA的pGEX-2T的構(gòu)建用圖25所述。
首先，實施例5中得到的pGEX-2T(ALS-S627I突變體)用XhoI消化后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行BAP處理。接著，根據(jù)上述方法，從瓊脂糖凝膠分離純化靶基因片段(載體一側(cè)的)。此外，實施例5中得到的pGEX-2T(ALS-W548L突變)用Xho I消化，然后根據(jù)上述方法從瓊脂糖凝膠分離純化含突變的片段。
其次，為了構(gòu)建含2-點突變，G1880T(S627I)和G1643T(W548L)的構(gòu)建體“pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突變體)”，將分別獲得的DNA片段進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)后，將總體積反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(菌株JM109)。根據(jù)上述方法，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上出現(xiàn)的單個克隆用PCR進(jìn)行篩選，然后挑選出帶有靶質(zhì)粒(pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突變體))的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。
將篩選的大腸桿菌培養(yǎng)后，根據(jù)上述方法構(gòu)建了質(zhì)粒pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突變體)。將pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突變)用Acc I消化，然后用Sma I部分消化，從而可以構(gòu)建pGEX-2T(ALS-W548L，S627I突變體)，其中ALS基因的第430位Sma I識別序列到Acc I的識別序列間的部分缺失。接著，將此pGEX-2T和實施例6中得到的C512A(P171H)突變片段連接，這樣構(gòu)建了含有3-位點突變(C512A(P171H)/G1643T(W548L)/G1880T(S627I))ALS cDNA的質(zhì)粒(在圖25中被稱為“pGEX-2T(ALS-P171H，W548L，S627I突變體”))。
此外，以與實施例6中相似的方式，用pGEX-2T(ALS-P171H，W548L，S627I突變體”)轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
實施例10突變ALS蛋白的表達(dá)用實施例3(5)中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-野生型)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例5中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-W548L突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例5中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-S627I突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例6中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-P171H突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例6中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-R172S突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例7中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-P171H，R172S突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例8中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-P171H，W548L突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例8中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-P171H，S627I突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，實施例9中構(gòu)建的pGEX-2T(ALS-P171H，W548L，S627I突變體)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，分別在27℃下含氨芐青霉素的2毫升LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振搖培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng))。取1毫升預(yù)培養(yǎng)液，將這些種類的大腸桿菌分別在含氨芐青霉素的的250毫升LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，在培養(yǎng)基中加入1mM的IPTG，然后進(jìn)一步培養(yǎng)3到4小時，來誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá)。此外，細(xì)胞在洗滌后于-80℃下貯藏。
通過下述方法由大腸桿菌制備和純化ALS。首先，將在-80℃下貯藏的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞沉淀在ALS提取緩沖液(磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，含30％甘油和0.5mM的MgCl2)中懸浮。特別的是，向從50毫升培養(yǎng)液中獲得的沉淀中加入2.5毫升上述緩沖液。將懸浮液進(jìn)行超聲波處理(Heat Systems-Ultrasonics，超聲儀W-225R，微芯片，輸出控制8，間隔約1秒，兩次(每次40秒))，并在4℃下進(jìn)行15000×g離心20分鐘，由此得到的上清作為粗酶溶液。
這樣制備了含任何一個GST融合的野生型ALS蛋白，GST融合W548L突變ALS蛋白，GST融合S627I突變ALS蛋白，GST融合P171H突變ALS蛋白，GST融合R172S突變ALS蛋白，GST融合P171H/R172S突變ALS蛋白，GST融合P171H/W548L突變ALS蛋白，GST融合P171H/S627I突變ALS蛋白，GST融合P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白的9種粗酶溶液。
實施例11突變ALS蛋白的除草劑敏感性用實施例10中獲得的9種粗酶溶液檢查野生型ALS蛋白和突變ALS蛋白對除草劑的敏感性。根據(jù)實施例2中幾乎一樣的步驟進(jìn)行除草劑敏感性實驗。然而，在此實施例中，反應(yīng)溫度是37℃，反應(yīng)時間是30分鐘，在反應(yīng)液中加入10mM纈氨酸以抑制大腸桿菌中的ALS活性。此外，在三種除草劑中，雙嘧苯甲酸鈉，嘧硫苯甲酸鈉和2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亞氨基)乙基]苯甲酸用作PC除草劑；綠黃隆用作磺酰脲除草劑；滅草喹用作咪唑啉酮除草劑。在加入突變ALS蛋白之前，將一定濃度的這些除草劑溶液(雙嘧苯甲酸鈉和嘧硫苯甲酸鈉是水溶液，其它除草劑為丙酮溶液)加入到反應(yīng)液中。丙酮的終濃度是1％。
對于9種粗酶溶液，圖26和圖27以及表9中顯示雙嘧苯甲酸鈉的抑制活性，表10中顯示嘧硫苯甲酸鈉的抑制活性，表11顯示2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亞氨基)乙基]苯甲酸的抑制活性，表12顯示綠黃隆的抑制活性，表13顯示滅草喹的抑制活性。
在表9到13中，當(dāng)在測試濃度獲得50％抑制時，每一種除草劑的抑制活性由造成50％抑制的除草劑濃度(I50)表示。當(dāng)沒有得到50％抑制時，由測試濃度中在最高濃度的抑制百分比表示每一種除草劑的抑制活性。此外，在表9至13中，預(yù)期的RS比率指的是帶有多重突變的突變ALS蛋白的RS比率，這通常是從每個單獨帶有一個突變的突變ALS蛋白的RS比率中預(yù)期的組合RS比率。即，預(yù)期的RS比率通常指從單獨帶有一個突變的突變ALS蛋白的組合RS比率中預(yù)期的協(xié)同效應(yīng)。特別的是，帶有多重突變的突變ALS蛋白的預(yù)期RS比率是通過選擇各自僅帶有一個突變的突變ALS蛋白的RS比率(相應(yīng)于這個蛋白多重突變的所有突變)，然后乘以選擇的RS比率而計算的。當(dāng)一個帶有多重突變的突變ALS蛋白實際的RS比率超過預(yù)期RS比率，這個蛋白的抗性要超過從單獨帶有一個突變的突變ALS蛋白的組合抗性所預(yù)期的協(xié)同效應(yīng)(抗性)。
表9
表10
表11
表12
表13
上述表9到13中的數(shù)據(jù)在下面依次進(jìn)行說明。
首先，雙嘧苯甲酸鈉的抑制活性(表9)說明如下在由1點突變基因(P171H，R172S，W548L和S627I)編碼的突變ALS蛋白中，W548L突變ALS蛋白顯示出最高的對雙嘧苯甲酸鈉的抗性(RS比率520)。S627I突變ALS蛋白或P171H突變ALS蛋白也顯示出高的抗性(RS比率分別為41和8.7)，但R172S突變ALS蛋白僅顯示出相當(dāng)于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.98)。這些結(jié)果表明在ALS蛋白中P171H突變，W548L突變和S627I突變是增強對雙嘧苯甲酸鈉抗性的有效突變。此外，在ALS蛋白中R172S突變顯示出是一個沉默突變。
另一方面，在由2點突變基因編碼的突變ALS蛋白中，P171H/W548L突變ALS蛋白顯示出最強的對雙嘧苯甲酸鈉抗性(在100μM時為5.5％抑制率，RS比率為＞15000)。P171H/S627I突變ALS蛋白也顯示出對雙嘧苯甲酸鈉強的抗性(RS比率為3700)。P171H/R172S突變ALS蛋白的抗性程度和P171H突變ALS蛋白的幾乎相同。此外，由3點突變基因編碼的P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白也顯示出具有對雙嘧苯甲酸鈉強的抗性(在100μM時為1.1％抑制率，RS比率大于15000)。此外，在圖26和27中顯示作為上述結(jié)果基礎(chǔ)的除草劑劑量反應(yīng)的實際結(jié)果。
對于2點突變和3點突變，比較了預(yù)期的RS比率和實際的RS比率。P171H/W548L突變ALS蛋白和P171H/S627I突變ALS蛋白的RS比率要比預(yù)期的RS比率高的多(RS比率和預(yù)期的RS比率的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1)。這些結(jié)果顯示這些兩個2點突變基因(編碼P171H/W548L突變ALS蛋白的基因和編碼P171H/S627I突變ALS蛋白的基因)賦予ALS蛋白的對雙嘧苯甲酸鈉的抗性要強于預(yù)期的每個1點突變基因得到的抗性程度的加和結(jié)果。
接著，對嘧硫苯甲酸鈉的抑制活性(表10)的說明如下在由1點突變基因(P171H，R172S，W548L，S627I)編碼的突變ALS蛋白中，W548L突變ALS蛋白顯示出最高的對嘧硫苯甲酸鈉的抗性(在100μM時為41％抑制率，RS比率大于9100)。S627I突變ALS蛋白也顯示出抗性(RS比率200)，但P171H突變ALS蛋白的抗性程度很低(RS比率3.4)。R172S突變ALS蛋白僅顯示出相當(dāng)于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.85)。這些結(jié)果表明在ALS蛋白中P171H突變，W548L突變和S627I突變是增強對嘧硫苯甲酸鈉耐受的有效突變。此外，在ALS蛋白中R172S突變顯示出是一個沉默突變。
另一方面，在由2點突變基因編碼的突變ALS蛋白中，P171H/W548L突變ALS蛋白給予了最強抗性(在100μM為2 0％抑制率，RS比率大于9100)，其次是P171H/S627I突變ALS蛋白(RS比率為850)。和表9顯示的雙嘧苯甲酸鈉抑制活性數(shù)據(jù)不同的是，對于嘧硫苯甲酸鈉，P171H/R172S突變ALS蛋白顯示出的抗性程度比P171H突變ALS蛋白要高(RS比率為13)。這樣，證實了R172S突變本身是一個沉默突變，但可增強P171H突變ALS蛋白的抗性程度。
此外，對于2點突變ALS蛋白，當(dāng)把從每個1點突變ALS蛋白的RS比率而預(yù)期的組合RS比率和實際的RS比率比較時，發(fā)現(xiàn)P171H/R172S突變ALS蛋白的RS比率要比預(yù)期的RS比率高的多(實際RS比率和預(yù)期的RS比率的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1)。這些結(jié)果揭示P171H/R172S突變ALS蛋白顯示出對嘧硫苯甲酸鈉的抗性要強于由1點突變基因預(yù)期的抗性程度。
接著，對2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亞氨基)乙基]苯甲酸的抑制活性(表11)的說明如下
在由1點突變基因(P171H，R172S，W548L和S627I)編碼的突變ALS蛋白中，W548L突變ALS蛋白顯示出最高的對2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亞氨基)乙基]苯甲酸的抗性(RS比率為4500)。S627I突變ALS蛋白也顯示出高的抗性(RS比率2800)，但P171H突變ALS蛋白的抗性程度低(RS比率5)。R172S突變ALS蛋白僅顯示出相當(dāng)于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率1.2)。這些結(jié)果表明在ALS蛋白中P171H突變，W548L突變和S627I突變是增強對2-[(4，6-二甲基氧基嘧啶-2基)氧]-6-[1-(甲氧基亞氨基)乙基]苯甲酸耐受的有效突變。此外，在ALS蛋白中R172S突變顯示出是一個沉默突變。
在由2點突變基因編碼的突變ALS蛋白中，P171H/W548L突變ALS蛋白給予了最強抗性(在100μM為11％抑制率，RS比率大于13000)，其次是P171H/S627I突變ALS蛋白(在100μM為21％抑制率，RS比率大于13000)。對于這些P171H/W548L突變ALS蛋白和P171H/S627I突變ALS蛋白，比較了預(yù)期的RS比率和實際的RS比率。然而，不能證實實際的抗性是否強于從每個1點突變基因預(yù)期的抗性程度。
接著，對綠黃隆的抑制活性(表12)的說明如下在由1點突變基因(P171H，R172S，W548L和S627I)編碼的突變ALS蛋白中，W548L突變ALS蛋白顯示出最高的對綠黃隆的抗性(RS比率520)。P171H突變ALS蛋白顯示出相對高的抗性(RS比率85)，但S627I突變ALS蛋白的抗性程度低(RS比率2.4)。R172S突變ALS蛋白僅顯示出相當(dāng)于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.85)。這些結(jié)果表明在ALS蛋白中P171H突變，W548L突變是增強對綠黃隆抗性的有效突變。此外，在ALS蛋白中R172S突變顯示出是一個沉默突變。
在由2點突變基因編碼的突變ALS蛋白中，P171H/W548L突變ALS蛋白顯示了最強抗性(在100μM為16％抑制率，RS比率大于7700)，其次是P171H/S627I突變ALS蛋白(RS比率為760)。和表9顯示的雙嘧苯甲酸鈉抑制活性數(shù)據(jù)不同的是，在綠黃隆的例子中，P171H/R172S突變ALS蛋白顯示出的抗性程度(RS比率為420)比P171H突變ALS蛋白要高。這樣，證實了R172S突變本身是一個沉默突變，但可增強P171H突變ALS蛋白的抗性程度。此外，P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白也顯示出強的抗性(在500μM為30％抑制率，RS比率大于3800)。
對于P171H/R172S突變ALS蛋白和P171H/S627I突變ALS蛋白，比較了預(yù)期的RS比率和實際的RS比率。對于兩種蛋白，實際RS比率都要比預(yù)期的RS比率高的多。這些結(jié)果表明P171H/R172S突變ALS蛋白和P171H/S627I突變ALS蛋白對綠黃隆的抗性要強于每個1點突變基因預(yù)期的抗性程度。
接著，對滅草喹(表13)的抑制活性數(shù)據(jù)的說明如下在由1點突變基因(P171H，R172S，W548L和S627I)編碼的突變ALS蛋白中，W548L突變ALS蛋白顯示出最高的對滅草喹的抗性(在100μM為14％抑制率，RS比率大于45)。S627I突變ALS蛋白也顯示出抗性(RS比率41)，但P171H突變ALS蛋白幾乎沒有顯示出抗性(RS比率1.5)。R172S突變ALS蛋白僅顯示出相當(dāng)于野生型ALS蛋白的抗性(RS比率0.98)。這些結(jié)果表明在ALS蛋白中W548L突變和S627I突變是增強對滅草喹抗性的有效突變。此外，在ALS蛋白中P171H突變和R172S突變顯示出是一個沉默突變。
在2點突變基因編碼的突變基因中，P171H/W548L突變ALS蛋白顯示了最強抗性(在100μM為13％抑制率，RS比率大于45)，其次是P171H/S627I突變ALS蛋白(RS比率為32)。P171H/R172S突變ALS蛋白的抗性程度和P171H的1點突變基因的抗性程度幾乎一樣。此外，P171H/W548L/S627I突變ALS蛋白也顯示出強的抗性性(在100μM為15％抑制率，RS比率大于45)。
對于2點ALS突變蛋白和3點ALS突變蛋白，比較了預(yù)期的RS比率和實際的RS比率。P171H/S627I突變ALS蛋白的RS比率要比預(yù)期的RS比率高的多(實際的RS比率和預(yù)期的RS比率的比值明顯大于1)。這些結(jié)果顯示P171H/S627I突變ALS蛋白顯示出的對滅草喹抗性要強于預(yù)期的每個1點突變基因的抗性程度。
工業(yè)適用性如上面詳細(xì)描述，本發(fā)明可提供一種編碼對各種除草劑具有良好抗性的乙酰乳酸合酶基因，一種由此基因編碼的乙酰乳酸合酶蛋白，一種帶有此基因的重組載體，一種帶有此重組載體的轉(zhuǎn)化體，一種帶有此基因的植物，一種培養(yǎng)此植物的方法，以及一種利用此基因作為選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的方法。
序列表無格式文本SEQ ID NO9到34代表引物。
在SEQ ID NO29中第15個n代表a，c，g或t。
序列表<110>KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO..LTD國家農(nóng)業(yè)生物學(xué)科學(xué)研究所<120>編碼乙酰乳酸合酶的基因<130>PH-1733-PCT<150>JP 2002-95721<151>2002-03-29<160>34<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2301<212>DNA<213>水稻kinmaze品種<220>
<221>CDS<222>(48)..(1979)<400>1cccaaaccca gaaaccctcg ccgccgccgc cgccgccacc acccacc atg gct acg56Met Ala Thr1acc gcc gcg gcc gcg gcc gcc gcc ctg tcc gcc gcc gcg acg gcc aag104Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Thr Ala Lys5 10 15acc ggc cgt aag aac cac cag cga cac cac gtc ctt ccc gct cga ggc152Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro Ala Arg Gly20 25 30 35cgg gtg ggg gcg gcg gcg gtc agg tgc tcg gcg gtg tcc ccg gtc acc200Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser Pro Val Thr40 45 50ccg ccg tcc ccg gcg ccg ccg gcc acg ccg ctc cgg ccg tgg ggg ccg248Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro
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<210>7<211>2294<212>DNA<213>水稻kinmaze品種<220>
<221>CDS<222>(48)..(1979)<400>7cccaaaccca gaaaccctcg ccgccgccgc cgccgccacc acccacc atg gct acg56Met Ala Thr1acc gcc gcg gcc gcg gcc gcc gcc ctg tcc gcc gcc gcg acg gcc aag104Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Thr Ala Lys5 10 15acc ggc cgt aag aac cac cag cga cac cac gtc ctt ccc gct cga ggc152Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro Ala Arg Gly20 25 30 35cgg gtg ggg gcg gcg gcg gtc agg tgc tcg gcg gtg tcc ccg gtc acc200Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser Pro Val Thr40 45 50ccg ccg tcc ccg gcg ccg ccg gcc acg ccg ctc cgg ccg tgg ggg ccg248Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro55 60 65gcc gag ccc cgc aag ggc gcg gac atc ctc gtg gag gcg ctg gag cgg296Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg70 75 80tgc ggc gtc agc gac gtg ttc gcc tac ccg ggc ggc gcg tcc atg gag344Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu85 90 95atc cac cag gcg ctg acg cgc tcc ccg gtc atc acc aac cac ctc ttc392Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn His Leu Phe100 105 110 115
cgc cac gag cag ggc gag gcg ttc gcg gcg tcc ggg tac gcg cgc gcg440Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ala120 125 130tcc ggc cgc gtc ggg gtc tgc gtc gcc acc tcc ggc ccc ggg gca acc488Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr135 140 145aac ctc gtg tcc gcg ctc gcc gac gcg ctg ctc gac tcc gtc ccg atg536Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met150 155 160gtc gcc atc acg ggc cag gtc cac cgc cgc atg atc ggc acc gac gcc584Val Ala Ile Thr Gly Gln Val His Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala165 170 175ttc cag gag acg ccc ata gtc gag gtc acc cgc tcc atc acc aag cac632Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His180 185 190 195aat tac ctt gtc ctt gat gtg gag gac atc ccc cgc gtc ata cag gaa680Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val Ile Gln Glu200 205 210gcc ttc ttc ctc gcg tcc tcg ggc cgt cct ggc ccg gtg ctg gtc gac728Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp215 220 225atc ccc aag gac atc cag cag cag atg gcc gtg ccg gtc tgg gac acc776Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val Trp Asp Thr230 235 240tcg atg aat cta cca ggg tac atc gca cgc ctg ccc aag cca ccc gcg824Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro Ala245 250 255aca gaa ttg ctt gag cag gtc ttg cgt ctg gtt ggc gag tca cgg cgc872Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu Ser Arg Arg260 265 270 275ccg att ctc tat gtc ggt ggt ggc tgc tct gca tct ggt gac gaa ttg920Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly Asp Glu Leu280 285 290
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Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro130 135 140Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser145 150 155 160Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val His Arg Arg Met Ile Gly165 170 175Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile180 185 190Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val195 200 205Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val210 215 220Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val225 230 235 240Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys245 250 255Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu260 265 270Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly275 280 285Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr290 295 300Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu305 310 315 320Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp325 330 335Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val340 345 350Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile355 360 365
Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser370 375 380Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu385 390 395 400Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn405 410 415Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe420 425 430Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu435 440 445Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met450 455 460Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser465 470 475 480Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly485 490 495Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp500 505 510Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu515 520 525Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met530 535 540Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr545 550 555 560Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val565 570 575Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys580 585 590Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro
595 600 605Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met610 615 620Ile Pro Ile Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly625 630 635 640Arg Thr Val Tyr<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>9gctctgctac aacagagcac a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>10agtcctgcca tcaccatcca g 21<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>11ctgggacacc tcgatgaat 19<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12caacaaacca gcgcaattcg tcacc 25<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>人工序列描述引物<400>15tgtgcttggt gatgga 16<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>16tcaaggacat gatcctggat gg 22<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>17cagcgacgtg ttcgccta 18<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>18ccaccgacat agagaatc 18
<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>19acacggactg caggaata 18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>21gcatcttctt gatggcg17<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>22atgcatggca cggtgtac 18<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>23gattgcctca cctttcg17<210>24<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>人工序列描述引物<220>
<221>variation<222>15<223>n代表a，c，g或t
<400>29gtttygctay ccggngg17<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>32gggctggcaa gccacgtttg gtg 23<210>33<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>33ccccagccgc atgatcggca ccgacgcctt 30<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>34cggtgccgat catgcggctg gggacct 2權(quán)利要求
1.編碼下列蛋白(a)或(b)的基因(a)由SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一種氨基酸序列組成的蛋白；(b)由通過對SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一種氨基酸序列進(jìn)行替換、缺失或添加至少一個或多個氨基酸而衍生得到的氨基酸序列組成的蛋白，該蛋白具有對嘧啶羧基除草劑的抗性和乙酰乳酸合酶活性。
2.一種由權(quán)利要求1所述基因編碼的乙酰乳酸合酶蛋白。
3.一種具有權(quán)利要求1所述基因的重組載體。
4.一種具有權(quán)利要求3所述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
5.一種植物，其具有權(quán)利要求1所述基因，并且具有對嘧啶羧基除草劑的抗性。
6.一種培養(yǎng)權(quán)利要求5所述植物的方法，其包括在嘧啶羧基除草劑存在下對植物進(jìn)行培養(yǎng)。
7.一種選擇具有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的方法，其以所述基因作為選擇標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明提供一個編碼下列蛋白(a)或(b)的基因，該蛋白顯示高水平的對PC除草劑或磺酰脲除草劑的抗性(a)由SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一種氨基酸序列組成的蛋白；(b)由通過對SEQ ID NOS2、4、6和8中任意一種氨基酸序列進(jìn)行替換、缺失或添加至少一個或多個氨基酸而衍生得到的氨基酸序列組成的蛋白，該蛋白具有對嘧啶羧基除草劑的抗性和乙酰乳酸合酶活性。
文檔編號C12N15/60GK1656224SQ0381219
公開日2005年8月17日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者角康一郎, 清水力, 河合清, 永山孝三, 福田篤德, 田中喜之 申請人:組合化學(xué)工業(yè)株式會社, 獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所