專利名稱：作為抗凝劑的新的靶向組織因子的抗體的制作方法
背景技術(shù)：
保持血管內(nèi)促凝血和抗凝血活性之間的適當(dāng)平衡對于正常的止血是必要的(Davie，E.W.et al.(1991)Biochemistry，30(43)10363-10370)。擾亂該平衡使之傾向于凝血將造成血栓形成，這會引起心臟病發(fā)作、卒中、肺栓塞和靜脈血栓形成。需要更有效和更安全的抗凝血?jiǎng)﹣碇委熖厥獾难ㄐ约膊　?br> 組織因子(“TF”)是一種跨膜糖蛋白，它是凝血級聯(lián)系統(tǒng)的主要啟動(dòng)物(Nemerson，Y.(1995)Thromb.Haemost.74(1)180-184)。在正常的生理?xiàng)l件下，活性TF不和血液接觸。在血管受損期間，暴露于血液的內(nèi)皮下TF及膠原導(dǎo)致凝血因子和血小板的活化并隨后形成止血栓子。所暴露的TF作為因子VIIa(“FVIIa”)催化激活因子IX(“FIX”)和因子X(“FX”)的輔因子(cofactor)，這兩種因子分別是內(nèi)源性tenase和凝血酶原酶復(fù)合物的關(guān)鍵成分。這導(dǎo)致FXa和凝血酶的快速形成。然后凝血酶將纖維蛋白原降解為纖維蛋白，纖維蛋白隨后聚合形成纖維蛋白凝塊。在多種臨床情況中，對TF表達(dá)的不正確的誘導(dǎo)將造成威脅生命的血栓形成和/或引起病理性并發(fā)癥。相信斑塊破裂后的TF的暴露是造成引起急性心肌梗死和卒中的血栓性阻塞的原因。在這些情況中，凝血因子所激活的促炎信號途徑也引起水腫形成以及增加梗死面積。與血管成形術(shù)相關(guān)的血管損傷造成SMC上TF的上調(diào)，相信這誘導(dǎo)了與再狹窄所相關(guān)的細(xì)胞信號途徑。在癌癥和革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥中，TF的過度表達(dá)造成威脅生命的血栓形成以及炎癥途徑的激活。
FVIIa/TF復(fù)合物涉及于多種血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制，TF的循環(huán)水平是某些患者的危險(xiǎn)因素。FVIIa和TF在血管損傷中保持止血以及觸發(fā)血栓形成上發(fā)揮著獨(dú)特的作用。TF正常地表達(dá)于外膜，但TF的表達(dá)在血管性疾病中被上調(diào)并被不適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)于中膜及新生內(nèi)膜。TF在動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊中的表達(dá)增加，并且被一薄層的纖維帽將其與血液分隔，該纖維帽可以破裂并暴露TF。例如球囊血管成形術(shù)、支架植入或動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的外科手術(shù)破壞血管壁并暴露出其下的TF。在動(dòng)脈粥樣硬化的、富脂薄壁的斑塊中，自發(fā)性破裂或內(nèi)皮侵蝕造成TF的暴露和血栓形成，引起不穩(wěn)定型心絞痛和心肌梗死。TF可以在細(xì)胞來源的微粒中循環(huán)，在不穩(wěn)定型心絞痛中循環(huán)TF的水平是增高的，這說明這種循環(huán)TF可以引起血栓形成(Soejima，H.et al.(1999)Circulation 99(22)2908-2913)。癌癥通常與高凝狀態(tài)相關(guān)，這是因?yàn)門F在腫瘤細(xì)胞上的過度表達(dá)，這使得腫瘤患者容易發(fā)生深靜脈血栓形成，肺栓塞和低度彌漫性血管內(nèi)凝血(“DIC”)。DIC造成了引起多器官衰竭的微血管纖維素的沉積。
靶向TF的基于蛋白質(zhì)的抗凝劑包括TF中和抗體、活性位點(diǎn)抑制因子VIIa(“FVIIai”)、組織因子途徑抑制物(“TFPI”)以及線蟲抗凝蛋白(“NAPC2”)。來自血栓形成的急性動(dòng)脈損傷模型的結(jié)果表明基于蛋白的FVIIa/TF抑制劑是有效的抗血栓物質(zhì)，而且與肝素、直接凝血酶抑制物、血小板抑制物和FXa抑制物比較，它的出血更少(Himber，J.et al.(2001)Thromb.Haemost.85475-481；Harker，L.A.etal.(1995)Thromb.Haemost.74(1)464-472)。另外，F(xiàn)VIIa/TF的抑制在預(yù)防球囊損傷后的新生內(nèi)膜增厚以及血管狹窄上優(yōu)于其它的抗凝劑(例如肝素，F(xiàn)Xa抑制物)(Jang，Y.et al.(1995)Circulation 92(10)3041-3050)。
在膿毒癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，對TF、FVIIa或FVIIa/TF復(fù)合物的抑制是預(yù)防DIC和減少死亡率的有效的抗血栓方法。TFPI類似物預(yù)防了兔的組織促凝血酶原激酶和內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的DIC(Day，K.C.et al.(1990)Blood 761538-1545；Bregengard，C.et al.(1993)Blood CoagulFibrinolysis 4699-706)。抗FVIIa單克隆抗體(Biemond，B.J.et al.(1995)Thromb.Haemost.73223-230)或(Levi，M.etal.(1994)J.Clin.Invest.93114-120)預(yù)防了猴的內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的DIC。在E.coli誘導(dǎo)的狒狒的膿毒癥模型中，TF中和抗體、FVIIai和TFPI抑制了DIC并減少了死亡率(Creasey，A.A.etal.(1993)J.Clin.Invest.912850-2860；Taylor，F(xiàn).B.et al.(1991a)Blood 78364-368；Taylor，F(xiàn).B.et al.(1991b)Circ.Shock 33127-134；Taylor，F(xiàn).B.(1996)Haemostasis Suppl.12683-91)。已知游離的FXa和FVIIa/TF/FXa復(fù)合物都誘導(dǎo)了與膿毒癥患者的死亡率增加所相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子的生成(Riewald，M.et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 987742-7747)。令人感興趣的是，F(xiàn)VIIai表明能降低狒狒模型中的血漿IL-6和IL-8的水平(Taylor，F(xiàn).B.et al.(1998)Blood 911609-1615)，這說明FVIIa/TF抑制物可能具有其它抗凝機(jī)制所不具備的其它的抗炎作用。
一些能作為有效抗凝劑的并能結(jié)合并中和TF或FVIIa/TF復(fù)合物或這兩者的抗體已經(jīng)被描述(見，例如，Carson，S.D.et，al.(1985)Blood 66(1)152-156；Tanaka，H.et al.(1985)Thromb.Res.40(6)745-756；Kirchhofer，D.et al.(2000)Throomb Haemost.84(6)1072-1081；Kirchhofer，D.et al.(2001)Biochemistry 40(3)675-682；Faelber，K.et al.(2001)J.Mol.Biol.31383-97；以及美國專利Nos.5,506,134，5,986,065和6,274,142)。本發(fā)明的TF靶向抗體是有效的抗凝劑，它具有超出以往描述的TF抗體的改良的特性。特別的，本發(fā)明的抗體與FVIIa/TF復(fù)合物的結(jié)合比與單獨(dú)TF的結(jié)合具有更強(qiáng)的親和力，并且不與FVII或FX競爭性結(jié)合TF。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了作用為抗凝劑的抗體，其與因子VIIa/組織因子(FVIIa/TF)復(fù)合物的結(jié)合比與單獨(dú)組織因子(TF)的結(jié)合的親和力更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在微量量熱法測試中與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF的結(jié)合的親和力至少高2倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF的結(jié)合的親和力至少高5倍。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF結(jié)合的親和力至少高10倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不與一種或多種選自由因子VII(“FVII”)、IX(“FIX”)和X(“FX”)組成的一組中的凝血因子競爭結(jié)合TF。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不與FVII以及FX競爭結(jié)合TF。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF結(jié)合的親和力更高且不與FVII及FX競爭結(jié)合TF。
本發(fā)明的抗凝血抗體在損傷部位靶向并結(jié)合FVIIa/TF復(fù)合物，以及抑制因子X(“FX”)的激活，從而阻止血栓形成，從而有效地作為治療某些疾病的抗凝劑，這些疾病包括但不限于膿毒癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、缺血性卒中、深靜脈血栓形成、急性冠脈綜合征、血管成形術(shù)后血栓并發(fā)癥以及進(jìn)行癌的凝血病。另外，抗體也可應(yīng)用于微血管手術(shù)、皮膚和靜脈移植物，以及器官移植。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括目標(biāo)抗體的藥物組合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防患者血栓形成的方法，包括對上述患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體，從而抑制凝血酶的形成而不直接影響其它的凝血參數(shù)，例如血小板的活化和聚集。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于減少及治療患者的深靜脈血栓(“DVT”)或彌漫性血管內(nèi)凝血(“DIC”)或急性冠脈綜合征或具有凝血病表現(xiàn)的癌癥的方法，包括對上述患者施用治療有效劑量的本發(fā)明的抗體。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)患者的炎癥反應(yīng)的方法，包括對上述患者施用治療有效劑量的本發(fā)明的抗體。
仍在另一方面，可用本發(fā)明的抗體在與血液接觸的醫(yī)學(xué)器械表面形成一層非成血栓性(thrombogenic)的包膜。
仍在另一方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含有與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的本發(fā)明的抗體?；蛘撸撛噭┖锌梢园ň幋a抗體成分的DNA序列。
本發(fā)明還闡述了制備本發(fā)明的重組的及合成的抗體的方法。


圖1.TF結(jié)合單鏈抗體在sTF/FVIIa肽水解檢測中的活性。依照FVIIa對sTF的親和力(KD(app)＝～10nM)，如實(shí)施例4中所描述的，利用FVIIa(5nM)和sTF(10nM)平衡混合液進(jìn)行sTF/FVIIa肽水解檢測。按所述監(jiān)測顯色肽底物S2266的水解。顯示了細(xì)菌表達(dá)的單鏈抗體和對照蛋白FVIIai(被氯甲基酮肽(chloromethylketone peptide)所失活的FVIIa，PPACK)及Mab#4504(American Diagnostica)的終濃度。
圖2.scFv(TF)3e10與sTF的結(jié)合增加了sTF與FVIIa的表觀親和力(apparent affinity)。在有或無800nM細(xì)菌表達(dá)的scFv(TF)3e10時(shí)，利用2nM FVIIa如實(shí)施例4中所述進(jìn)行sTF/FVIIa肽水解檢測。將sTF滴定到測定物并測定顯色肽底物S2266的裂解速度。用標(biāo)準(zhǔn)4-parameter fit計(jì)算出sTF的表觀KD。
圖3.TF結(jié)合單鏈抗體在凝血酶原時(shí)間(PT)檢測中的活性。利用在磷脂小泡(phospholipid vesicle)中含有全長人TF的重組人組織促凝血激原激酶(Dade，Inc.)如實(shí)施例4所述進(jìn)行PT檢測。顯示了細(xì)菌表達(dá)的單鏈抗體以及對照蛋白FVIIai的終濃度。
圖4.scFv(TF)3e10對sTF的表觀結(jié)合親和力的測定。利用3nMsTF和2nM FVIIa如實(shí)施例4中所述進(jìn)行sTF/FVIIa肽水解檢測。所使用的sTF濃度低于與FVIIa結(jié)合的KD。加入逐漸增加濃度的細(xì)菌表達(dá)的scFv(TF)3e10，并利用標(biāo)準(zhǔn)4-parameter fit用所增加的反應(yīng)速度確定出該抗體對sTF的表觀KD。scFv(TF)3e10對sTF/FVIIa復(fù)合物的親和力(KD(app)＝65nM)要高于用BIAcore所測定的scFv(TF)3e10對sTF的親和力(KD(app)＝470nM)。
圖5.scFv(TF)3e10對TF和對FVIIa/TF復(fù)合物的結(jié)合親和力的測定。利用在CHO細(xì)胞中所表達(dá)的scFv(TF)3e10如實(shí)施例4中所述進(jìn)行微量量熱法檢測。該檢測顯示scFv(TF)3e10對sTF/FVIIa復(fù)合物(“復(fù)合物”)比對sTF(“游離TF”)具有高～20倍的親和力。
圖6.scFv(TF)3e10劑量依賴性地抑制FX活化。利用逐漸增加濃度的細(xì)菌表達(dá)的scFv(TF)3e10、250nM FX以及磷脂表面的FVIIa/TF復(fù)合物(10pM FVIIa)如實(shí)施例4中所示進(jìn)行FX活化檢測。IC50代表達(dá)到50％最大抑制所需的劑量。
圖7.scFv(TF)3e10通過FVIIa/TF復(fù)合物非競爭性抑制FX活化。利用細(xì)菌表達(dá)的scFv(TF)3e10、250nM到400nM FX以及磷脂表面的FVIIa/TF復(fù)合物(10pM FVIIa)如實(shí)施例4中所示進(jìn)行FX活化檢測。將逐漸增加濃度的scFv(TF)3e10滴定到測定物中(0nM，空心正方形；0.25nM，空菱形；0.74nM，空心三角形；2.2nM，空圓形；6.7nM，實(shí)心菱形；20nM，實(shí)心三角形)。該Lineweaver-Burk曲線(1/[S]，其中S(底物)＝因子X(μM)；對1/v，其中v(速度)＝在5分鐘間隔內(nèi)所生成的FXa對S2222的水解的mOD/min)表明scFv(TF)3e10對于底物FX是非競爭性的抑制劑。預(yù)期相交在(或鄰近于)x軸的所有線代表非競爭性抑制劑(對于競爭性抑制劑，所有線相交在y軸)。
圖8.scFv(TF)3e10在彌漫性血管內(nèi)凝血(“DIC”)的體內(nèi)模型中是有效的。如實(shí)施例6中所述，在兔的血栓栓塞模型中評價(jià)CHO細(xì)胞表達(dá)的TF抗體scFv(TF)3e10的(A)死亡率百分比，以及(B)發(fā)病率-死亡率積分。(A)在載體治療組，所用的TF劑量造成了60％的致死率(LD60)。0.7nmol/kg scFv(TF)3e10對死亡沒有影響，但在7.0nmol/kg時(shí)將致死率減少到＜40％。(B)在載體治療組，體內(nèi)劑量的TF造成的平均發(fā)病率-死亡率積分為2.6。0.7nmol/kg scFv(TF)3e10對死亡沒有影響并對呼吸窘迫只有很小的或沒有作用，但在14nmol/kg時(shí)，平均發(fā)病率-死亡率積分被減少到～1.5。
發(fā)明詳述本發(fā)明的抗凝血抗體是一種與因子VIIa/組織因子(FVIIa/TF)復(fù)合物的結(jié)合比與單獨(dú)組織因子(TF)的結(jié)合的親和力更高的抗體。本發(fā)明的抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)結(jié)合TF的親和力至少高2倍，優(yōu)選至少高5倍，以及更優(yōu)選至少高10倍。本發(fā)明的抗體也不與一種或多種選自由因子VII(“FVII”)、因子IX(“FIX”)和因子X(“FX”)組成的一組中的凝血因子競爭結(jié)合TF。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體不與FVII及FX競爭結(jié)合TF。
定義在描述本發(fā)明時(shí)，如下定義下面的術(shù)語。
“重組蛋白或多肽”指通過重組DNA技術(shù)生成的蛋白或多肽，即從被編碼所需多肽的外源性DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞所生成的蛋白或多肽。在大多數(shù)的細(xì)菌培養(yǎng)物中表達(dá)的蛋白或多肽不帶聚糖。在酵母中表達(dá)的蛋白或多肽可能有著不同于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所表達(dá)的糖基化形式。
“天然”蛋白或多肽指從天然存在的資源中回收的蛋白或多肽。術(shù)語“天然抗體”包括天然存在的抗體及其片段。
DNA“編碼序列”為當(dāng)置于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下在宿主細(xì)胞中能被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成多肽的DNA序列。編碼序列的范圍由5’N-末端的起始密碼子以及3’C-末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核DNA的基因組DNA序列以及合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
“核苷酸序列”是脫氧核糖核苷酸(堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的雜聚物。用源自合成cDNA的DNA片段以及短寡核苷酸接頭(linker)可以裝配成編碼本發(fā)明的抗體的DNA序列，并生成一個(gè)能在重組表達(dá)載體中表達(dá)的合成基因。在討論特殊的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，根據(jù)只給定cDNA的非轉(zhuǎn)錄鏈的5’到3’方向的序列的正常慣例來描述序列。
“重組表達(dá)載體”是用于擴(kuò)增或表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體的DNA的可復(fù)制的DNA構(gòu)建體。一個(gè)表達(dá)載體含有DNA控制序列和編碼序列。DNA控制序列包括啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及增強(qiáng)子。本文所定義的重組表達(dá)系統(tǒng)將在調(diào)節(jié)元件的誘導(dǎo)下表達(dá)抗體。
“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”指已經(jīng)被外源DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。外源DNA可以是或可以不是整合到(共價(jià)連接于)構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA。例如在原核細(xì)胞和酵母中，外源DNA可以保持于例如質(zhì)粒的附加型元件(episomal element)中或穩(wěn)定地整合到染色體DNA中。對于真核細(xì)胞，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是外源DNA已經(jīng)整合到染色體復(fù)制體的細(xì)胞。通過真核細(xì)胞株或克隆生成含有外源DNA的子代細(xì)胞群的能力來驗(yàn)證這種穩(wěn)定性。
當(dāng)提及本發(fā)明的抗體時(shí)，如下面進(jìn)一步描述術(shù)語“類似物”、“片段”、“衍生物”和“變體”指基本上保留有相同的生物學(xué)功能或活性的抗體的類似物、片段、衍生物和變體。
“類似物”包括其內(nèi)包括有本發(fā)明的抗體的氨基酸序列的多肽原(pro-polypeptide)。通過天然的體內(nèi)方法或通過例如酶或化學(xué)降解的本領(lǐng)域熟知的方法可以將本發(fā)明的活性抗體和構(gòu)成前抗體(pro-antibody)分子的其它氨基酸分離開來。例如，重組scFV(TF)3e10多肽(SEQ ID NO1)被表達(dá)為282個(gè)氨基酸的多肽原，然后其在體內(nèi)被處理釋放出264個(gè)氨基酸的活性的成熟多肽。
“片段”為基本上保留了相似的功能活性的抗體的一部分，如下面進(jìn)一步描述的本文闡述的體外檢測中所顯示的。
“衍生物”包括對本發(fā)明的抗體的所有的修飾物，其基本上保留了本文所闡述的功能并包括其它的結(jié)構(gòu)和附加功能，例如PEG化抗體具有更長的半衰期，以及生物素化抗體，如下進(jìn)一步描述。衍生物也包括N-或O-連接的糖基化抗體，其可以利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)通過將N-或O-糖基化位點(diǎn)插入到抗體序列中生成。
“基本上相似的功能活性”以及“基本上相同的生物學(xué)功能或活性”都意味著當(dāng)用相同的方法或檢測法確定每個(gè)多肽的生物學(xué)活性時(shí)，生物學(xué)活性的程度是被比較的多肽所表現(xiàn)出的生物學(xué)活性約30％到100％或更多。例如，具有與實(shí)施例1的抗體(SEQ ID NO1)基本上相似的功能活性的抗體為當(dāng)在實(shí)施例4所述的TF/FVIIa肽水解及FX活化檢測時(shí)表現(xiàn)出結(jié)合并中和FVIIa/TF復(fù)合物的能力的抗體。
確定兩個(gè)多肽之間的“相似性”通過將一個(gè)多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與第二個(gè)多肽序列進(jìn)行比較來確定。這些保守取代包括在The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 by Dayhoff(1978)和Argos(1989)EMBO J.8779-785中所描述的取代。例如，屬于下面組之一的氨基酸表示著保守變化-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；及-Asp、Glu。
本文“抗體”包括完整的免疫球蛋白(“Ig”)分子，及其片段，例如Fab、F(ab’)2和Fv，其能結(jié)合于所選的靶向蛋白的一個(gè)抗原表位，例如可溶性TF(“sTF”)。典型地，形成一個(gè)表位需要至少6、8、10或12個(gè)連續(xù)的氨基酸。然而，涉及非連續(xù)氨基酸的表位可能需要更多的，例如至少15、25或50個(gè)氨基酸。
本文所用的所有其它技術(shù)術(shù)語和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所使用的術(shù)語具有相同的含義。
本發(fā)明的抗體及其產(chǎn)生本發(fā)明的抗凝血抗體與因子FVIIa/組織因子(FVIIa/TF)復(fù)合物的結(jié)合比與單獨(dú)組織因子(TF)的結(jié)合的親和力更高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如在微量量熱法檢測中所測定的，本發(fā)明的抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF結(jié)合的親和力至少高2倍，更優(yōu)選至少高5倍，以及更優(yōu)選至少高10倍。在另一個(gè)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體也不與一種或多種選自由因子VII(“FVII”)、IX(“FIX”)和X(“FX”)組成的一組中的凝血因子競爭結(jié)合TF。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不與FVII及FX競爭結(jié)合TF。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比單獨(dú)結(jié)合TF的更高并不與FVII及FX競爭結(jié)合TF。
一般來說，在免疫化學(xué)檢測法中，特異結(jié)合于一種所選的靶向蛋白(例如，F(xiàn)VIIa/TF復(fù)合物或TF)的抗體所提供的檢測信號比其它蛋白所提供的檢測信號至少高5、10或20倍。優(yōu)選地，與所選的靶向蛋白特異結(jié)合的抗體在免疫化學(xué)檢測中不能檢測出其它蛋白，并可以從溶液中免疫沉淀出靶向蛋白。
可以用所選的靶向蛋白免疫哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人以生成多克隆抗體。如果需要，可以將靶向蛋白綴合到載體蛋白上，例如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白以及匙孔血藍(lán)蛋白。根據(jù)宿主的物種，可以用不同的佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)。這些佐劑包括但不限于Freund佐劑、無機(jī)膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚)。在應(yīng)用于人的佐劑中，BCG(卡介苗) 和小棒桿菌(Cornybacterium parvum)是特別有用的。
利用任何能通過培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞株生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)可以制備與所選的靶向蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Kohler et al.(1985)Nature 256495-497；Kozbor et al.(1985)J.Immunol.Methods8131-42；Cote et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030；和Cote et al.(1984)Mol.Cell Biol.62109-120)。
此外，可以使用生成“嵌合抗體”所發(fā)展的技術(shù)，將鼠抗體基因剪接到人抗體基因中并獲得具有適宜的抗原特異性和生物學(xué)活性的分子(Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312604-608；Takeda et al.(1985)Nature314452-454)。單克隆和其它抗體也可以被“人源化”以阻止患者在治療性應(yīng)用抗體時(shí)觸發(fā)針對該抗體的免疫反應(yīng)。這些抗體與直接應(yīng)用的人抗體在序列上是足夠相似的或可能需要改變一些關(guān)鍵的殘基。通過用單個(gè)殘基的定點(diǎn)突變?nèi)〈煌谌诵蛄械臍埢蛲ㄟ^移植完整的互補(bǔ)決定區(qū)可以將嚙齒動(dòng)物抗體和人序列之間的序列差異最小化?；蛘撸萌鏕B2188638B所述的重組方法可以生成人源化抗體。與所選的靶向蛋白特異結(jié)合的抗體可以含有部分或完全人源化的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如在美國專利5,565,332中所述。
或者，利用本領(lǐng)域已知的方法可以采用所述用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)生產(chǎn)與所選的靶向蛋白特異結(jié)合的單鏈抗體(“scFv”)。通過從隨機(jī)組合Ig文庫的鏈替換(chain shuffling)可以生成具有相對特異性但不同獨(dú)特型組成的抗體(Burton(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8811120-11123)。
利用例如PCR的DNA擴(kuò)增方法用雜交瘤cDNA做為模板也可以構(gòu)建單鏈抗體(Thirion et al(1996)Eur.J.Cancer Prev.5507-511)。單鏈抗體可以是單或雙特異性的，以及可以是二價(jià)或四價(jià)的。例如，在Coloma and Morrison(1997)Natl.Biotechnol.15159-163中說明了四價(jià)、雙特異單鏈抗體的構(gòu)建。在Mallendar and Voss(1994)J.Biol.Chem.269199-216中說明了二價(jià)、雙特異單鏈抗體的構(gòu)建。
利用人工或自動(dòng)的核苷酸合成可以構(gòu)建編碼單鏈抗體的核苷酸序列，利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法可以將核苷酸序列克隆進(jìn)表達(dá)構(gòu)建體中，并將其導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼序列。或者，用例如絲狀噬菌體展示技術(shù)可以直接生成單鏈抗體(Verhaar et al.(1995)Int.J.Cancer 61497-501；和Nicholls et al.(1993)J.Immunol.Meth.16581-91)。
如文獻(xiàn)中所闡述的，通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞群的體內(nèi)生產(chǎn)或篩選Ig庫或高度特異結(jié)合試劑組(panel)也可以生成與所選的靶向蛋白特異結(jié)合的抗體(Orlandi et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833-3837；Winter et al.(1991)Nature 349293-299)。
用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆方法可以以cDNA或基因組的形式克隆出編碼本發(fā)明的抗體的DNA。見例如，Sambrook，J.F.et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)，在此并入?yún)⒖?。
對于所述抗體是單克隆抗體的情況，一旦識別出編碼Fv區(qū)域的DNA序列，當(dāng)Fv序列被表達(dá)時(shí)，其表現(xiàn)出特異的結(jié)合活性，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以制備包含該Fv區(qū)域的抗體。因此，例如Chaudhary，V.K.et al.(1989)Nature 339(6223)394-397；Batra，J.K.etal.(1990)J.Biol.Chem.265(25)15198-15202；Batra，J.K.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(21)8545-8549；Chaudhary，V.K.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(3)1066-1070，在此一同并入?yún)⒖?，它們描述了對多種單鏈抗體蛋白的制備。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的TF結(jié)合抗體是利用噬菌體展示文庫制備的單鏈抗體。單鏈抗體的表位結(jié)合區(qū)域由兩個(gè)可變區(qū)域結(jié)構(gòu)域構(gòu)成一個(gè)來自重鏈以及另一個(gè)來自輕鏈。在構(gòu)建噬菌體展示文庫的第一個(gè)步驟中，利用一組家族特異性引物從人骨髓、淋巴結(jié)和脾臟的合并的mRNA(pooled mRNA)中PCR克隆出可變區(qū)基因(VH(來自IgM)、Vκ和VL)。所得的pCITE-VH(3.8×109個(gè))、pZ604-Vκ(1.6×107)和pZ604-VL(3.2×107)文庫代表了永久性及高多樣性的V基因。從pCITE-VH文庫中擴(kuò)增出VH基因。從pZ604-Vκ和pZ604-VL文庫中PCR擴(kuò)增出在5’末端具有反向JH和接頭序列的Vκ和VL基因。然后將凝膠純化的含有VH、Vκ和VL的PCR產(chǎn)物一起剪接生成scFv基因庫(gene repertoire)。將scFv基因庫克隆進(jìn)噬粒載體pZ603，并將連接產(chǎn)物電穿孔到感受態(tài)TG1大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中生成具有5.2×109個(gè)轉(zhuǎn)化體的scFv噬菌體展示文庫HuPhabL3(Kay，B.K.et al.(1996)Phage Display of Peptides and ProteinsA Laboratory Manual，AcademicPress，San Diego CA；Marks，J.D.et al.(1991)J.Mol.Biol.222(3)581-597；Sheets，M.D.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(11)6157-6162)。
從scFv噬菌體展示文庫中選擇并擴(kuò)增TF結(jié)合噬菌體，然后用本領(lǐng)域熟知的淘選技術(shù)進(jìn)行鑒定。將可溶性TF固定于塑料管內(nèi)，可用無脂奶粉減少與塑料的非特異性結(jié)合。將scFv噬菌體群暴露于塑料管內(nèi)所固定的sTF，并充分洗滌以除去未結(jié)合的噬菌體。從塑料管中洗脫出TF結(jié)合scFv噬菌體，然后在溶液內(nèi)通過感染TG1大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。重復(fù)該淘選過程三次，并通過轉(zhuǎn)化TG1細(xì)胞分離出所得到的TF結(jié)合scFv噬菌體。用將sTF固定于塑料的96孔皿使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA表達(dá)TF結(jié)合抗體的轉(zhuǎn)化體。測序ELISA陽性轉(zhuǎn)化體的單鏈抗體插入體的DNA。根據(jù)DNA測序，在此鑒定出6種獨(dú)特的單鏈抗體，scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、scFv(TF)3e10和scFv(TF)3h2，將其表達(dá)并從大腸桿菌中純化出來，以及如實(shí)施例5中所述將其特征化。
本發(fā)明抗體的表達(dá)和純化體外表達(dá)本發(fā)明重組抗體的方法，包括大腸桿菌、桿狀病毒、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它表達(dá)系統(tǒng)。在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)所克隆的基因的方法是熟知的。為了在原核系統(tǒng)內(nèi)得到所克隆的基因的高水平表達(dá)，必須要構(gòu)建至少要含有指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄終止的強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體。適合于這個(gè)目的的調(diào)節(jié)區(qū)域的實(shí)例為大腸桿菌的色氨酸生物合成途徑的大腸桿菌β-葡糖苷酶基因的啟動(dòng)子和操縱子區(qū)域，或λ噬菌體的左側(cè)啟動(dòng)子。在轉(zhuǎn)化大腸桿菌的DNA載體內(nèi)包含選擇標(biāo)記是有用的。這些標(biāo)記的實(shí)例包括特異抗氨卡青霉素、四環(huán)素或氯霉素的基因。
從能用于表達(dá)本發(fā)明抗體及其類似物、片段、衍生物或變體的更高級的真核細(xì)胞系統(tǒng)中可選擇出多種細(xì)胞系統(tǒng)。所列舉的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株包括但不限于RPMI 7932、VERO和HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞株、W138、BHK、COS-7、C127或MDCK細(xì)胞株。一個(gè)優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株是CHL-1。當(dāng)使用CHL-1時(shí)，所含的潮霉素作為真核選擇標(biāo)記。CHL-1細(xì)胞來源于RPMI 7032黑素瘤細(xì)胞，這是一種容易獲得的人細(xì)胞株。根據(jù)布達(dá)佩斯條約約定，CHL-1細(xì)胞株已經(jīng)于1987年6月18日被保藏于ATCC，保藏號#CRL 9446。在本發(fā)明中適合使用的細(xì)胞可從ATCC商業(yè)化獲得。所列舉的細(xì)胞株包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蠶(Bombyx mori)。
原核系統(tǒng)大腸桿菌不能進(jìn)行翻譯后修飾，例如糖基化。另外，當(dāng)具有復(fù)雜二硫鍵形式的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白經(jīng)常地被錯(cuò)誤地折疊。在原核系統(tǒng)中，所表達(dá)的蛋白或以所謂的包涵體的非可溶性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)于在細(xì)胞裂解后的可溶性組分中，或通過添加適宜的分泌信號序列被直接地分泌到周質(zhì)中。如果所表達(dá)的蛋白位于非可溶的包涵體內(nèi)，那么通常需要對包涵體進(jìn)行可溶性化以及之后的再折疊。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多原核表達(dá)載體，如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pKK233-2(Clontech，Palo Alto，CA，USA)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)，這些都是可商業(yè)化獲得的。
在重組微生物表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang，A.C.et al.(1978)Nature 275(5681)617-624；Goeddel，D.V.et al.(1979)Nature 281(5732)544-548)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，D.V.et al.(1980)Nucl.Acids Res.8(18)4057-4074)以及tac啟動(dòng)子(Maniatis，T.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982))。另一種有用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)采用了λ噬菌體pL啟動(dòng)子和clts857熱誘導(dǎo)阻抑物(Bernard，H.U.et al.(1979)Gene 5(1)59-76；Love，C.A.et al.(1996)Gene 176(1-2)49-53)。也可以在例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的酵母宿主中表達(dá)重組抗體。這通常具有進(jìn)行各種翻譯后修飾的能力。所表達(dá)的抗體可以被分泌到?jīng)]有許多其它蛋白質(zhì)存在的培養(yǎng)上清中，使得純化更為容易。用于表達(dá)本發(fā)明抗體的酵母載體具有某些必需的特性。載體的元件通常來源于酵母和細(xì)菌，以容許質(zhì)粒在兩者中擴(kuò)增。細(xì)菌元件包括復(fù)制起點(diǎn)以及選擇標(biāo)記。酵母元件包括復(fù)制序列起點(diǎn)(ARS)、選擇標(biāo)記、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。
在酵母載體中用于表達(dá)的適宜啟動(dòng)子包括TRP1基因、ADH1或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH03或PH05)基因、異細(xì)胞色素(isocytochrome)基因啟動(dòng)子或糖酵解途徑中所包含的啟動(dòng)子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶和磷酸葡糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子(Hitzeman，R.A.et al.(1980)J.Biol.Chem.255(24)12073-12080；Hess，B.et al.(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7149-167；和Holland，M.J.and Holland，J.P.(1978)Biochemistry 17(23)4900-4907)。
商業(yè)化可獲得的酵母載體包括pYES2、pPIC9(Invitrogen，SanDiego，CA)、Yepc-pADH2a、pYcDE-1(Washington Research，Seattle，WA)、pBC102-K22(ATCC#67255)和YpGX265GAL4(ATCC#67233)?？梢圆捎冒ǖ幌抻贑OS-7、L細(xì)胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、HeLa、BHK、CHL-1、NSO和HEK293的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株表達(dá)本發(fā)明的重組抗體。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)生成的重組蛋白質(zhì)正常地是可溶的并被糖基化的，以及具有真實(shí)的N末端。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包括非轉(zhuǎn)錄元件，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及5’或3’非翻譯序列，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、受體位點(diǎn)和剪接供體以及轉(zhuǎn)錄終止序列。在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中所用的啟動(dòng)子通常是例如病毒啟動(dòng)子，如多形瘤、腺病毒、HTLV、猿猴病毒40(SV40)和人巨細(xì)胞病毒(CMV)。
根據(jù)所選擇的表達(dá)系統(tǒng)以及宿主，通過使用不同組合的用于蛋白質(zhì)純化的傳統(tǒng)層析可以獲得均一的重組抗體。這些層析包括免疫親和層析、反相層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析以及HPLC，如果表達(dá)系統(tǒng)將抗體分泌到生長培養(yǎng)基中，就可以從培養(yǎng)基中直接純化蛋白質(zhì)。如果抗體是非分泌的，就從細(xì)胞裂解物中分離。用任何傳統(tǒng)的方法包括凍融循環(huán)、超聲波、機(jī)械裂解或使用細(xì)胞裂解試劑，可以進(jìn)行細(xì)胞裂解。
將基于pCANTAB5(Pharmacia)的質(zhì)粒構(gòu)建體用于本發(fā)明單鏈抗體的細(xì)菌表達(dá)。例如，含有單鏈抗體scFV(TF)3e10的質(zhì)粒為pZ612/3e10，它編碼附有e-tag序列的單鏈抗體序列，e-tag序列可用于純化蛋白。scFV(TF)3e10抗體的氨基酸序列對應(yīng)于SEQ ID NO1(實(shí)施例1)，以及編碼scFV(TF)3e10的DNA序列對應(yīng)于SEQ IDNO2。
將基于pTHR525的質(zhì)粒構(gòu)建體(見美國專利No.5,827,824)用于本發(fā)明單鏈抗體的哺乳動(dòng)物表達(dá)。例如，設(shè)計(jì)引物使得在細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)生成橫跨pro-scFv(TF)3e10氨基酸序列的DNA片段，包括N末端信號序列以及C末端e-tag序列。進(jìn)行PCR生成插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)的DNA片段，其含有氨芐青霉素抗性基因以及潮霉素和DHFR選擇標(biāo)記。用MPSV LTR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)本發(fā)明單鏈抗體的表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用哺乳動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CHO DXB11細(xì)胞。用400μg/ml潮霉素B的HAMS/F12培養(yǎng)基選擇穩(wěn)定群。表達(dá)水平大約500μg/L。為了增加表達(dá)水平，用100nM氨甲蝶呤的αMEM培養(yǎng)基選擇群。該群的大約表達(dá)水平是5mg/L。
可以用本領(lǐng)域熟知的方法純化本發(fā)明的抗體。例如，通過流過結(jié)合有TF的柱可以親和純化抗體。然后用具有高濃度鹽的緩沖液可以將結(jié)合TF的抗體從柱上洗脫下來。
本文所述的單鏈抗體在蛋白質(zhì)的C末端含有e-tag序列?？筫-tag親和柱購自American/Pharmacia Biotech。用0.22μm濾膜濾過細(xì)胞培養(yǎng)基，并以2ml/min速度裝入到5ml的e-tag柱中。用0.2M磷酸緩沖液0.05％NaN3，pH7.0沖洗柱，然后收集到含有0.1體積的1M Tris緩沖液，pH8.2的試管內(nèi)以中和洗脫緩沖液。或者，將濾過后的培養(yǎng)基裝入到蛋白質(zhì)A柱中。在這種情況中，用50mM檸檬酸，300mMNaCl，pH6.5洗滌柱子并用pH3.0的相同緩沖液洗脫。在兩種情況中，之后都將純化的樣品裝入到Sephadex 200柱中，將抗體的單體與二聚體形式分離開來。
本發(fā)明抗體的選擇一旦抗體被生成、表達(dá)以及純化，為了鑒定本發(fā)明的抗體，可以用實(shí)施例4中所述的BIAcore、sTF依賴性因子VIIa檢測(sTF/FVIIa肽水解檢測)、FX活化檢測以及PT檢測進(jìn)一步地將抗體特征化。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用TF/FVIIa肽水解檢測選擇以比單獨(dú)結(jié)合TF更高的親和力與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的TF結(jié)合scFv抗體。在這個(gè)檢測中，預(yù)計(jì)與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與TF結(jié)合的更高的TF抗體能增加KD(app)。圖2顯示單鏈抗體scFv(TF)3e10增加KD(app)約5倍。用微量量熱法檢測測定與單獨(dú)結(jié)合TF相比，TF抗體對FVIIa/TF復(fù)合物的親和力。圖5顯示單鏈抗體scFv(TF)3e10與FVIIa/TF復(fù)合物以及游離TF結(jié)合的KD分別是600nM和33nM，這對應(yīng)的是與單獨(dú)結(jié)合TF比較，抗體與FVIIa/TF復(fù)合物具有高大約20倍的親和力。本發(fā)明的抗體對FVIIa/TF復(fù)合物比對TF有高至少2倍、優(yōu)選至少5倍以及更優(yōu)選至少10倍的親和力。
用sTF/FVIIa肽水解檢測選擇出不與FVII競爭結(jié)合TF的TF結(jié)合scFv抗體。在這個(gè)檢測中，預(yù)計(jì)與FVIIa競爭結(jié)合TF的TF抗體能抑制顯色底物S2266的水解。圖1顯示單鏈抗體scFv(TF)3e10沒有抑制并且事實(shí)上增加了FVIIa活性。
用PT檢測和FX活化檢測選擇出抑制FX活化的TF結(jié)合scFv抗體。在PT檢測中，預(yù)計(jì)延長PT的TF抗體能抑制FX活化。圖3顯示單鏈抗體scFv(TF)3e10延長了PT，這說明該抗體抑制了FX活化。在FX活化檢測中，預(yù)計(jì)抑制FXa活性的TF抗體能抑制顯色底物S2222的水解。圖6顯示單鏈抗體scFv(TF)3e10抑制了FXa活性。
用FX活化檢測選擇出不與FX競爭結(jié)合TF的TF結(jié)合scFv抗體。在這個(gè)檢測中，預(yù)計(jì)不與FX競爭的TF抗體能不依賴所應(yīng)用的FX濃度抑制FX活化。圖7顯示單鏈抗體scFv(TF)3e10以FX濃度非依賴性方式抑制FXa活性。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，鑒定出的單鏈抗體scFv(TF)3e10具有對TF的單個(gè)VH/VL結(jié)合位點(diǎn)。scFv(TF)3e10的氨基酸序列顯示在實(shí)施例1中并對應(yīng)于SEQ ID NO1。編碼scFv(TF)3e10的DNA序列對應(yīng)于SEQ ID NO2。
本發(fā)明抗體的類似物、片段、衍生物以及變體本發(fā)明抗體的類似物、片段、衍生物或變體可以是(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被一個(gè)保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)所取代，以及這些取代的氨基酸殘基可以是或可以不是遺傳密碼子所編碼的；或(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括一個(gè)取代基團(tuán)；或(iii)其中成熟的抗體與另外一種化合物融合，例如一種提高抗體的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸被融合進(jìn)成熟的抗體中，例如前導(dǎo)或分泌序列或用于純化成熟抗體的序列。這些類似物、片段、衍生物和變體被認(rèn)為根據(jù)本說明是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的衍生物將包含在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的，優(yōu)選非必需氨基酸殘基上進(jìn)行的保守氨基酸取代(下面進(jìn)一步定義)?！胺潜匦琛卑被釟埢窃谝吧偷鞍踪|(zhì)的序列上可以被改變但不改變生物學(xué)活性的殘基，其中“必需”氨基酸對于生物學(xué)活性是必需的?！氨Ｊ匕被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基所取代。在本領(lǐng)域已經(jīng)識別了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)、具有非帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。對保守氨基酸殘基或?qū)τ谠诒Ｊ氐鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基不能進(jìn)行非保守取代，除非進(jìn)行所述取代是為了選擇變體抗體，如下進(jìn)一步描述。片段或生物學(xué)活性部分包括適于用作藥物、研究試劑等的多肽片段。片段包括包含足夠類似于或衍生自本發(fā)明抗體的氨基酸序列的氨基酸序列并表現(xiàn)出多肽的至少一種活性的肽，但其包括比本文所述的全長多肽更少的氨基酸。
另外，本發(fā)明優(yōu)選的衍生物包括已經(jīng)與另一種化合物融合的成熟抗體，例如這種化合物可以提高多肽的半衰期和/或減少多肽潛在的免疫原性(例如，聚乙二醇，“PEG”)。PEG可用于增加水溶性、大小、減慢腎臟清除(kidney clearance)率以及減少對抗體的免疫原性。見例如美國專利6,214,966。對于PEG化，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法都可以完成抗體與PEG的融合。例如，首先通過將一個(gè)半胱氨酸突變引入到抗體內(nèi)，隨后通過PEG-馬來酰亞胺的位點(diǎn)特異性衍生可以完成PEG化?？梢詫腚装彼崽砑拥诫牡腃末端，見例如Tsutsumi et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(15)8548-8553。可以對抗體進(jìn)行的另一個(gè)修飾涉及生物素化。在某些情況下，將抗體生物素化可能是有用的，使得它容易與鏈霉親和素相互作用。蛋白生物素化的方法在本領(lǐng)域是熟知的。此外，可以將N-或O-糖基化位點(diǎn)引入到抗體序列中，使得體內(nèi)可以進(jìn)行抗體的轉(zhuǎn)錄后N-或O-連接的糖基化。
本發(fā)明抗體的變體包括具有與原始抗體的氨基酸序列足夠相似的氨基酸序列的多肽。術(shù)語“足夠相似”指相對于第二個(gè)氨基酸序列，第一個(gè)氨基酸序列含有足夠的或最小數(shù)目的相同或等價(jià)的氨基酸殘基，使得第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸序列具有共同結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。例如，本文將含有至少約45％，優(yōu)選約75％到98％相同的共同結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列定義為足夠相似。優(yōu)選地，變體與本發(fā)明優(yōu)選的抗體的氨基酸序列足夠相似。變體包括在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸或其互補(bǔ)物雜交的多核苷酸所編碼的抗體變體。這些變體通常保留了本發(fā)明抗體的功能活性。可以用多核苷酸的片段文庫生成用于篩選和隨后選擇的片段的多樣化群(variegatedpopulation)。例如，在其中每分子只發(fā)生約1次缺口的條件下，通過用核酸酶處理多核苷酸的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA和復(fù)性DNA形成可以形成包括來自不同缺口產(chǎn)物的有義/反義對的雙鏈DNA、通過用S1核酸酶處理從新形成的雙鏈體中去除單鏈部分并將所生成的片段文庫連接到表達(dá)載體中從而可以生成片段文庫。通過這個(gè)方法，可以生成編碼本發(fā)明抗體的不同大小的N末端和內(nèi)部片段(internalfragment)的表達(dá)文庫。
變體包括因?yàn)檎T變而在氨基酸序列上有所不同的抗體。例如，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)可以進(jìn)行誘變以修飾Ig輕鏈和重鏈的VL及VH結(jié)構(gòu)域以生成變體，該變體與FVIIa/TF復(fù)合物的結(jié)合比與游離TF的結(jié)合具有更高的結(jié)合親和力。特別優(yōu)選的變體包括在VL和VH結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾的抗體。
變體還包括因誘變引起的氨基酸殘基的插入或缺失而在氨基酸序列上有所不同的抗體。例如，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)可以進(jìn)行誘變以在Ig輕鏈和重鏈的VH或VL結(jié)構(gòu)域的N-末端或C-末端部分插入或缺失氨基酸以生成保持了基本上相似的功能活性的變體。特別優(yōu)選的變體包括在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的VH-VL接頭內(nèi)插入或缺失氨基酸殘基的單鏈抗體。實(shí)施例1中所描述的單鏈抗體中的VH-VL接頭序列的長度為5個(gè)氨基酸殘基。顯而易見的是也可以使用其它的從0到20個(gè)氨基酸長度的短的接頭序列，其中抗體保留了基本上相似的功能活性。對現(xiàn)有的VH-VL接頭的修飾可以針對于提高二聚體形式的單鏈抗體的穩(wěn)定性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在核酸水平的組合誘變生成變體的多樣化文庫(variegated library)并通過多樣化基因文庫將其編碼。例如通過將合成寡核苷酸的混合物酶連接到基因序列使得潛在的變體氨基酸序列的簡并組(degenerate set)表達(dá)為獨(dú)立的多肽，或一組含有一組在此的序列的更大的融合蛋白質(zhì)(例如噬菌體展示)，這樣可生成變體的多樣化文庫。有多種方法可用于從簡并寡核苷酸序列生成潛在變體文庫?？梢栽谧詣?dòng)DNA合成儀中進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成基因連接到合適的表達(dá)載體中。應(yīng)用基因的簡并組可以提供編碼所需的潛在變序列組的所有序列的混合物。合成簡并寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域是已知的(見，例如Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura et al.(1984a)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura et al.(1984b)Science 1981056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
在本領(lǐng)域已知有一些技術(shù)可用于篩選通過點(diǎn)突變或截短所形成的組合文庫的基因產(chǎn)物，以及用于篩選cDNA文庫的具有所選擇的性能的基因產(chǎn)物。這些技術(shù)適于快速篩選通過抗體的組合誘變所形成的基因文庫的TF-或FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合活性或FX活化抑制活性。通常用于篩選大基因文庫的最廣泛使用的能進(jìn)行高通量分析的技術(shù)典型地包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用所形成的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞并在對所需活性的檢測有助于分離編碼所檢測的產(chǎn)物的基因的載體的條件下表達(dá)組合基因。遞歸整體誘變(recursiveensemble mutagenesis，REM)，一種增強(qiáng)文庫內(nèi)功能性突變頻率的技術(shù)，可以和篩選檢測一起用于鑒定所需的變體。
實(shí)施例1描述了一個(gè)TF結(jié)合單鏈抗體scFv(TF)3e10(SEQ IDNO1)的氨基酸序列，并描繪了VH-VL接頭以及VH和VL結(jié)構(gòu)域。利用實(shí)施例4中所描述的sTF/FVIIa肽水解或FX活化檢測通過篩選本發(fā)明抗體的例如插入、截短或點(diǎn)突變的突變體組合文庫可以鑒定具有TF或FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合活性或抑制FX活化的變體。本發(fā)明抗體包括實(shí)施例1和3的抗體(SEQ ID NOs1和3)，以及那些在序列上與它們有著非實(shí)質(zhì)性差異的抗體?！胺菍?shí)質(zhì)性差變”包括基本上保持了本發(fā)明抗體的至少一種生物學(xué)功能，例如抑制FX活化的能力的任何的序列、取代或缺失變體。這些功能等價(jià)物可以優(yōu)選包括與SEQID NO1或SEQ ID NO3的單鏈抗體的VL或VH區(qū)域結(jié)構(gòu)域有著至少約90％相同性的抗體，以及更優(yōu)選與SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的單鏈抗體的VL或VH區(qū)域結(jié)構(gòu)域有著至少95％的相同性，以及仍更優(yōu)選與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的單鏈抗體的VL或VH區(qū)域結(jié)構(gòu)域有著至少97％的相同性，以及還包括這些具有基本上相同的生物學(xué)活性的抗體的部分。然而，本發(fā)明說明書中包括的表現(xiàn)出如本文進(jìn)一步描述的功能等加性的在氨基酸序列上具有與SEQID NO1或SEQ ID NO3的抗體非實(shí)質(zhì)性差異的任何抗體。
藥物組合物本發(fā)明還提供了能給予患者以達(dá)到治療作用的藥物組合物。通過組合具有所需純化程度的本發(fā)明抗體以及藥物治療有效量的生理可接受的載體可以制備用于施用的本發(fā)明的藥物組合物。
本發(fā)明抗體可以用于進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥或皮下給藥或鞘內(nèi)(intrathecal)給藥的藥物組合物。因此，上述抗體優(yōu)選與可接受的無菌藥物載體組合，如5％葡萄糖、乳酸林格液、生理鹽水、無菌水或設(shè)計(jì)用于靜脈內(nèi)注入的其它任何商業(yè)化制備的生理性緩沖溶液?？梢岳斫?，載體溶液和組合物的劑量及給予的選擇會因?yàn)橹委煂ο蠛吞厥獾呐R床背景的不同而有所不同，并為標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)操作所決定。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以給予有效量的這些藥物組合物抑制對象中與凝血酶的過度生成相關(guān)的病理性后果。
可以丸式靜脈內(nèi)注射(bolus intravenous injection)、持續(xù)靜脈內(nèi)注射或聯(lián)合兩種途徑施與抗體?；蛘?，或另外，可以從肌內(nèi)部位將與適宜的賦形劑相混合的抗體帶入到循環(huán)中。通過測定取自患者的一系列血液樣本的活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(activated partialthromboplastin time，PT)可以監(jiān)測抗體的全身治療。當(dāng)抗體在循環(huán)中達(dá)到了足夠的水平時(shí)，在這個(gè)檢測中觀察到凝血時(shí)間延長了。
本發(fā)明的重組抗體和藥物組合物可用于腸外、局部、靜脈內(nèi)、口服或局灶給藥。依照給藥的方法，可以以多種單位劑量的形式給予藥物組合物。例如，可以以包括但不限于片劑、膠囊、粉末、溶液和乳劑的形式給予單位劑量形式。
本發(fā)明的重組抗體和藥物組合物對于靜脈內(nèi)給藥是特別有效的。用于給藥的組合物常包括溶解于藥物可接受的載體，優(yōu)選水溶液載體中的單鏈抗體溶液?？梢允褂枚喾N水溶液載體，例如緩沖鹽水等等。這些溶液是無菌的并且通常不含非所需的物質(zhì)?？梢杂脗鹘y(tǒng)的、熟知的消毒技術(shù)消毒組合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地確定用于靜脈內(nèi)給藥的常用的藥物組合物。給予的量明顯是蛋白質(zhì)特異性的并且依賴于它的療效以及藥物動(dòng)力學(xué)的情況。用于制備腸外給予的組合物的實(shí)際方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的或顯而易見的，并且在例如Remington′sPharmaceutical Science，15thed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa(1980)的出版物中被更為詳細(xì)地描述。
含有本發(fā)明抗體的組合物或它的雞尾酒配方(也就是組合有其它蛋白質(zhì))可以用作為治療性處理。在治療性應(yīng)用中，將能治愈或至少部分地阻止出血的有效量的組合物給予患出血異?；蚣膊〉幕颊摺Ｄ苓_(dá)到這一點(diǎn)的足夠量被定義為“治療有效量”。對此應(yīng)用的有效量將依賴于疾病的嚴(yán)重程度以及患者的一般健康狀況。
組合物的單次或多次給藥依賴于所需的及患者所耐受的劑量和頻率。在任何時(shí)候，組合物應(yīng)當(dāng)提供能有效地治療患者的足夠量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
以治療有效量給予本發(fā)明抗體或它們的藥物可接受的組合物，治療有效量依賴于多種因素而變化，包括所采用的特異抗體的活性；抗體作用的代謝穩(wěn)定性及時(shí)間長短；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；給藥的方式和時(shí)間；排泄速率；藥物組合；特殊疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度；以及患者正進(jìn)行的治療。通常，每天的治療有效量為每天從約0.14mg到約14.3mg/kg體重的本發(fā)明抗體或其藥物可接受的組合物；優(yōu)選為每天約0.7mg到約10mg/kg體重；以及最優(yōu)選每天約1.4mg到約7.2mg/kg體重。例如，給予一個(gè)70kg的人，劑量范圍為每天從約10mg到約1g的本發(fā)明抗體或其藥物可接受的組合物；優(yōu)選每天約50mg到約700mg；以及最優(yōu)選每天約100mg到約500mg。
細(xì)胞和基因治療依照本發(fā)明也可以利用被稱為“細(xì)胞治療”的方法通過體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的抗體來利用這些抗體。因此，例如，可以用編碼抗體的多核苷酸(DNA或RNA)體外(ex vivo)工程化細(xì)胞，然后將工程化的細(xì)胞提供給需要用抗體治療的患者。這些方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，利用本領(lǐng)域已知的方法通過使用含有編碼本發(fā)明抗體的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？梢怨こ袒?xì)胞。
依照本發(fā)明也可以利用被稱為“基因治療”的方法通過體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的抗體來利用這些抗體。因此，例如，可以用編碼抗體的多核苷酸(DNA或RNA)工程化病毒，然后將工程化的病毒提供給需要用抗體治療的患者。這些方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，利用本領(lǐng)域已知的方法可以工程化含有編碼本發(fā)明抗體的DNA的重組腺病毒。
使用細(xì)胞或基因治療局部給予本發(fā)明的抗凝血抗體可以將治療藥物提供給位于血管內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞的靶向部位。
體外和體內(nèi)細(xì)胞及基因治療的方法學(xué)都是被關(guān)注的。已知一些用于將潛在的治療基因轉(zhuǎn)移到特定的細(xì)胞群的方法。見，例如Mulligan(1993)Science 260926-931。這些方法包括1)直接基因轉(zhuǎn)移。見，例如Wolff et al.(1990)Science 2471465-1468；2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。見，例如Caplen et al.(1995)Nature Med.339-46；Crystal(1995)Nature Med.115-17；Gao andHuang(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179280-285；3)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。見，例如Kay et al.(1993)Science 262117-119；Anderson(1992)Science 256808-813；
4)DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這些DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad2或Ad5的載體)、皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)、細(xì)小病毒(優(yōu)選基于“缺陷的”或非自主的細(xì)小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺相關(guān)病毒的載體，最優(yōu)選基于AVV-2的載體)。見，例如Ali et al.(1994)Gene Therapy 1367-384；美國專利4,797,368，在此一起并入?yún)⒖迹约懊绹鴮＠?,139,941，在此并入?yún)⒖肌?br> 對用于轉(zhuǎn)移感興趣的基因的特殊載體系統(tǒng)的選擇依賴于多種因素。一個(gè)重要的因素是靶細(xì)胞群的性能。盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被廣泛地研究并用于許多基因治療應(yīng)用，但這些載體通常不適合用于感染非分裂細(xì)胞。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有致癌的潛能。然而，最近在慢病毒領(lǐng)域的進(jìn)展可以克服這些局限中的一些局限。見Naldini et al.(1996)Science 272263-267。
可能衍生上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病毒、脾臟壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)以及乳癌病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來源于Moloney鼠白血病毒。
腺病毒的優(yōu)點(diǎn)是它們具有廣泛的宿主范圍，能感染靜止的或終末分化的細(xì)胞，例如神經(jīng)元或肝細(xì)胞，以及基本上表現(xiàn)為非致癌性。見，例如Ali et al.(1994)，supra，p.367。腺病毒不整合到宿主基因組中。因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌旧w外，極大地減少了插入誘變的危險(xiǎn)。Ali et al.(1994)，supra，p.373。
腺相關(guān)病毒具有與基于腺病毒的載體相似的優(yōu)點(diǎn)。然而，AAV定點(diǎn)整合到人的19號染色體(Ali et al.(1994)，supra，p.377)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用編碼本發(fā)明抗體的DNA進(jìn)行細(xì)胞或基因治療的疾病包括但不限于深靜脈血栓形成、彌漫性血管內(nèi)凝血、急性冠脈綜合征或具有凝血病表現(xiàn)的癌癥。
根據(jù)該實(shí)施方案，在疾病診斷的同時(shí)或診斷后即刻，用編碼本發(fā)明抗體的DNA的細(xì)胞或基因治療提供給所需的患者。
根據(jù)該實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以使用任何合適的含有編碼本發(fā)明抗體的DNA或編碼本發(fā)明抗體的類似物、片段、衍生物或變體的DNA的基因治療載體。構(gòu)建這樣載體的技術(shù)是已知的。見，例如Anderson，W.F.(1998)Nature 39225-30；Verma I.M.and Somia，N.(1998)Nature 389239-242。用已知的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)將含有抗體DNA的載體導(dǎo)入到靶向位點(diǎn)。
細(xì)胞或基因治療載體包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？梢圆捎玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV 40啟動(dòng)子和在Milleret al.(1989)Biotechniques 7(9)980-990中所描述的人巨細(xì)胞病毒(CVM)啟動(dòng)子或其它任何的啟動(dòng)子(例如，細(xì)胞啟動(dòng)子例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。可以采用的其它病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子以及B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。根據(jù)本文所包含的教導(dǎo)，選擇合適的啟動(dòng)子對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
編碼本發(fā)明抗體的核酸序列是在適宜的啟動(dòng)子的控制下。可以采用的適宜的啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，例如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人球蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，例如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上述修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及人生長激素啟動(dòng)子。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞株形成生產(chǎn)細(xì)胞株?？梢员晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的實(shí)例包括，但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X；如在Miller(1990)Human Gene Therapy 15-14中所描述的VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+#-86、GP+envAm12和DAN細(xì)胞株，在此將其全部內(nèi)容一同并入?yún)⒖?。載體可以通過本領(lǐng)域任何已知的手段轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些手段包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體以及CaPO4沉淀。在一個(gè)方法中，可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體裝入脂質(zhì)體內(nèi)，或與脂質(zhì)偶聯(lián)，然后給予宿主。生產(chǎn)細(xì)胞株生產(chǎn)感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，其包括編碼多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列。然后可以用這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)化的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
一種不同于基因治療的方法是“經(jīng)核治療(transkaryotictherapy)”，其中體外(ex vivo)處理患者的細(xì)胞以誘導(dǎo)靜止的染色體基因在重新導(dǎo)入到患者體內(nèi)后生產(chǎn)感興趣的蛋白。經(jīng)核治療假定個(gè)體具有活化所需的基因的正?；パa(bǔ)體(normal complement)。經(jīng)核治療包括將能激活新生基因的啟動(dòng)子或其它外源調(diào)節(jié)序列體外(ex vivo)導(dǎo)入到患者細(xì)胞的染色體DNA內(nèi)，培養(yǎng)并選擇出活化的蛋白生產(chǎn)細(xì)胞，然后將活化的細(xì)胞重新導(dǎo)入到患者體內(nèi)，目的是之后這些細(xì)胞在體內(nèi)被完全地建立。然后“基因活化”細(xì)胞生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)顯著長的一段時(shí)間，可能是患者的終生。美國專利5,641,670和5,733,761詳細(xì)闡述了這個(gè)概念，在此將其全部內(nèi)容一起并入?yún)⒖肌?br> 試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于研究或診斷目的的試劑盒。試劑盒通常包括一個(gè)或多個(gè)含有本發(fā)明抗體的容器(container)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含有適合于用第二種分子衍生化的形式的單鏈抗體的容器。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含有SEQID NO1或SEQ ID NO3的抗體的容器。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可以含有編碼本發(fā)明抗體的DNA序列。優(yōu)選在適于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并被宿主細(xì)胞所表達(dá)的質(zhì)粒中提供編碼這些抗體的DNA序列。質(zhì)?？梢院姓{(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)DNA表達(dá)的啟動(dòng)子(通常是可誘導(dǎo)啟動(dòng)子)。質(zhì)粒也可以含有適宜的限制性位點(diǎn)以有助于其它DNA序列插入到質(zhì)粒內(nèi)以生成多種抗體。質(zhì)粒也可以含有許多其它的有助于所編碼的蛋白質(zhì)克隆與表達(dá)的元件。這些元件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，包括例如選擇標(biāo)記、起始密碼子、終止密碼子等等。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包含有SEQ IDNO2或SEQID NO4的DNA序列的容器。
治療適應(yīng)癥血栓形成起重要的致病作用的疾病包括心肌梗死、彌漫性血管內(nèi)凝血、深靜脈血栓形成、肺栓塞、缺血性卒中、感染性休克、急性呼吸窘迫綜合征、不穩(wěn)定絞痛和其它的動(dòng)脈和靜脈阻塞性病變。本發(fā)明的抗體在所有的這些情況以及病理性血栓形成的其它疾病中都是有用的。本發(fā)明的抗體可能有用的其它病理性病變包括具有凝血病表現(xiàn)的癌癥以及炎癥。也可以發(fā)現(xiàn)抗體可以用于皮膚和靜脈移植物和器官移植。有用的意思是抗體能用于治療，或預(yù)防疾病或阻止它進(jìn)展到更嚴(yán)重的狀態(tài)。本發(fā)明的抗體也給例如接受如心瓣膜的生物假體的患者提供了一種安全和有效的抗凝劑。這些抗體可以取代肝素和華法林治療例如肺栓塞或急性心肌梗死。本發(fā)明的抗體也可以用于包被凝血是相關(guān)問題的醫(yī)療器械。
檢測多種用于測定本發(fā)明抗體的體外抗凝活性的實(shí)驗(yàn)室檢測是可利用的。利用例如活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(“APTT”)、凝血酶凝血時(shí)間(“TCT”)和/或凝血酶原時(shí)間(“PT”)的血漿凝血時(shí)間檢測可以測定抗體的抗凝作用。這些檢測區(qū)分了凝血抑制的不同機(jī)制并涉及蛋白C的活化。在任何一個(gè)檢測中，凝血時(shí)間的延長都說明分子能抑制血漿內(nèi)凝血。
用上述的檢測鑒定具有抗凝劑活性的抗體，它們在純化系統(tǒng)和血漿介質(zhì)中都能結(jié)合TF。然后用進(jìn)一步的檢測法評價(jià)本發(fā)明抗體的其它活性，如對凝血酶催化的纖維蛋白原生成纖維蛋白的抑制(Jakubowski，H.V.et al.(1986)J.Biol.Chem.261(8)3876-3882)、對凝血酶活化因子V抑制(Esmon，C.T.et al.(1982).J.Biol.Chem.257(14)7944-7947)、促進(jìn)抗凝血酶III和肝素輔因子II對凝血酶的抑制(Esmon，N.L.et al.(1983)J.Biol.Chem.258(20)12238-12242)、對凝血酶活化因子XIII的抑制(Polgar，J.et al.(1987)Thromb.Haemost.58(1)140)、對凝血酶介導(dǎo)的蛋白S的失活的抑制(Thompson，E.A.andSalem，H.H.(1986)J.Clin.Inv.78(1)13-17)以及對凝血酶介導(dǎo)的血小板的活化和聚集的抑制(Esmon，N.L.et al.(1983)，supra)。
用在實(shí)施例4中詳細(xì)描述的以下檢測法測定本發(fā)明抗體的體外效價(jià)或體外結(jié)合親和力1)sTF/FVIIa肽水解檢測；2)因子X活化檢測；3)PT檢測；及4)微量量熱法檢測。
在進(jìn)行本發(fā)明的操作時(shí)，當(dāng)然要明白所引述的特定的緩沖液、培養(yǎng)基、試劑、細(xì)胞、培養(yǎng)條件等均是非限制性的，而是應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀任一所討論的特定上下文中時(shí)能認(rèn)識到的所有感興趣的或有價(jià)值的相關(guān)材料。例如，用一種緩沖體系或培養(yǎng)基取代另一種經(jīng)常是可能的，并仍能取得即使不相同也是相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員有著這些系統(tǒng)和方法學(xué)的足夠多的知識，使得他們不進(jìn)行過多的試驗(yàn)就能進(jìn)行這樣的取代并最優(yōu)化在此所描述的方法和操作。
用下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，以幫助實(shí)施本發(fā)明。在應(yīng)用實(shí)施例的闡述時(shí)，應(yīng)理解的是相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識到本發(fā)明方法的其它不同的實(shí)施方案。
在先前的和下面的實(shí)施例中，除非有特殊的說明，所有的溫度被非修正地設(shè)定為攝氏度，所有的部分和百分比為重量百分比。
一同參考上面所引用的所有申請、專利和出版物的全部闡述。
實(shí)施例1單鏈抗TF抗體構(gòu)建體scFv(TF)3e10(-18)MLGVLVLGALALAGLVFPEMAQVNLRESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFSFTDAWMSWVRQAPGKELEWVSSISGSGGSTYYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLSLTDYYWYGMDVWGQGTLVTVSAGGGGSGAPNFMLTQPHSVSASPGKTVTISCTRSSGSVASYYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNHRPSGVPDRFSGSIDTSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSNNLVVFGGGTKLTVLGAAAGAPVPYPDPLEPRAA(264)單鏈抗TF抗體scFv(TF)3e10(SEQ ID NO1)由信號肽(-18到-1)、VH結(jié)構(gòu)域(1到126)、VH-VL接頭(127到131)、VL結(jié)構(gòu)域(132到246)以及e-tag序列(247到264)組成。scFv(TF)3e10 DNA序列(SEQ ID NO2)編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列。
實(shí)施例2單鏈抗TF抗體構(gòu)建體scFv(TF)3e10Δ(-18)MLGVLVLGALALAGLVFPEMAQVNLRESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFSFTDAWMSWVRQAPGKELEWVSSISGSGGSTYYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLSLTDYYWYGMDVWGQGTLVTVSAGGGGSNFMLTQPHSVSASPGKTVTISCTRSSGSVASYYVQWYQQRPGSSP
TTVIYEDNHRPSGVPDRFSGSIDTSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSNNLVVFGGGTKLTVLGAAAGAPVPYPDPLEPRAA(243)單鏈抗TF抗體scFv(TF)3e10Δ(SEQ ID NO3)由信號肽(-18到-1)、VH結(jié)構(gòu)域(1到126)、VH-VL接頭(127到131)和VL結(jié)構(gòu)域132到243)組成。scFv(TF)3e10Δ不同于scFv(TF)3e10的是在VL結(jié)構(gòu)域的N末端有3個(gè)氨基酸(GAP)的缺失以及缺失了C末端的e-tag序列。scFv(TF)3e10ΔDNA序列(SEQ ID NO4)編碼SEQ IDNO3的氨基酸序列。
實(shí)施例3抗TF抗體在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)從TF結(jié)合噬菌體中鑒定出6種不同的單鏈抗體scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、scFv(TF)3e10以及scFv(TF)3h2，將其在大腸桿菌內(nèi)過表達(dá)，并如上述用抗e-tag親和柱將其親和純化。用BIAcore測定6種純化的抗體對sTF的親和力，并在實(shí)施例4中所述的sTF/FVIIa肽水解檢測、FX活化檢測、PT以及微量量熱法檢測中將這些抗體特征化，結(jié)果顯示在實(shí)施例5中。
也在CHO細(xì)胞中表達(dá)scFv(TF)3e10抗體(SEQ ID NO1)。表達(dá)質(zhì)粒含有編碼scFv(TF)3e10的DNA序列(SEQ ID NO2)以及潮霉素B和DHFR選擇標(biāo)記。初始選擇在400μg/ml潮霉素中進(jìn)行以選擇出一個(gè)群。然后對所得到的群進(jìn)行100nM氨甲蝶呤選擇。在這個(gè)選擇期間，從群中選擇出具有包含選擇標(biāo)記和靶向基因的DNA區(qū)域的擴(kuò)增拷貝的細(xì)胞。作為選擇結(jié)果，表達(dá)水平從近0.3mg/L增加到6mg/L。
實(shí)施例4體外效力(potency)和結(jié)合親和力檢測1.sTF/FVIIa肽水解檢測下面描述本檢測的原理。底物三肽p-nitroanilide的酰胺鍵被sTF/FVIIa復(fù)合物水解。在405nm監(jiān)測所釋放的生色產(chǎn)物p-nitroanilide，用摩爾消光系數(shù)9920M-1cm-1計(jì)算出每單位時(shí)間所形成的產(chǎn)物濃度。將初始速率加入到4參數(shù)方程Y＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+D可確定IC50值(C)。
H-D-Val-Leu-Arg-p-NA→H-D-Val-Leu-Arg+p-NA；S2266底物 三肽 生色團(tuán)試劑和溶液1.檢測緩沖液50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA，pH7.52.人FVIIa(HCVIIA-0060，Haematologic Technologies Inc)10x工作溶液-在使用前配成20nM檢測緩沖液溶液。
3.可溶性TF(Berlex)10x工作溶液-在使用前配成30nM檢測緩沖液溶液。
4.顯色底物S2266(Kabi Pharmacia Hepar Inc.)儲存溶液10mM H2O溶液，4℃下儲存。2.5x工作溶液-在使用前配成2.5mM檢測緩沖液溶液。
5.抗體在使用前配成2.5x檢測緩沖液稀釋液。
檢測條件室溫下在96孔微量滴度板內(nèi)進(jìn)行檢測。各種成分的最終濃度如下sTF 3nM；抗體 從1000到0.625nM不等；FVIIa2nM；S22661mM；檢測步驟1.將0.1ml 2.5xAB(或緩沖液對照)吸入到每個(gè)孔內(nèi)。
2.加入0.025ml 10xsTF，在室溫下輕晃孵育10min。
3.加入0.025ml 10xFVIIa，在室溫下輕晃孵育10min。
4.加入0.1ml 2.5xS2266底物，馬上將滴度板轉(zhuǎn)移到讀板器并在405nm每隔10秒鐘測定酶動(dòng)力學(xué)共15分鐘。
該檢測可用于測定本發(fā)明抗體與sTF或FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的表觀KD，以及測定本發(fā)明抗體是否與FVII競爭結(jié)合TF。
2.因子X活化檢測下面描述本檢測的原理。將FVIIa與重組人TF小泡(vesicle)一起孵育形成能活化底物FX的蛋白酶復(fù)合物。在存在(或不存在)不同濃度的抗體時(shí)形成該復(fù)合物，然后引入底物FX，可以進(jìn)行反應(yīng)以形成產(chǎn)物，活化的蛋白酶FXa，它能水解顯色底物S2222的p-nitroanilide酰胺鍵。在405nm監(jiān)測所釋放出的生色團(tuán)產(chǎn)物p-nitroanilide，用摩爾消光系數(shù)9920M-1cm-1計(jì)算出每單位時(shí)間所形成的產(chǎn)物濃度。將初始速率加入到4參數(shù)方程Y＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+D可確定IC50值(C)Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA→Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH+p-NAS2222底物生色團(tuán)試劑和溶液1.檢測緩沖液50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA，pH7.52.人FVIIa(HCVIIA-0031，Haematologic Technologies Inc.)4x工作溶液-在使用前配成100pM檢測緩沖液溶液。
3.重組人TF(來自Innovin，Dade，在我們實(shí)驗(yàn)室重構(gòu))工作溶液-在使用前配成1∶480檢測緩沖液稀釋液。
4.人因子X(HCX-0060，Haematologic Technologies Inc.)4x工作溶液-在使用前配成1000nM檢測緩沖液溶液。
5.顯色底物S2222(Kabi Pharmacia Hepar Inc.)儲存溶液6mM H2O溶液，4℃儲存。
工作溶液-在使用前配成0.78mM底物的3.57mM EDTA(用于終止反應(yīng))、150mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH7.5的溶液。
6.抗體在使用前配成4x檢測緩沖液稀釋液。
檢測條件在室溫下96孔微量滴度板內(nèi)進(jìn)行檢測。各種成分的最終濃度如下rTF小泡 1/4的1∶480稀釋液；抗體 從1000到0.625nM不等；FVIIa 25pM；FX250nM；S2222 0.546mM；檢測步驟1.將0.015ml 4xAB(或緩沖液對照)吸入到每個(gè)孔內(nèi)。
2.加入0.015ml 4xrTF小泡。
3.加入0.015ml 4xFVIIa，在室溫下輕晃孵育10min。
4.加入0.015ml 4xFX，在室溫下輕晃孵育5min。
5.加入0.14ml S2222底物，馬上將滴度板轉(zhuǎn)移到讀板器并在405nm每隔10秒鐘測定酶動(dòng)力學(xué)共15分鐘。
本檢測可以用于確定本發(fā)明抗體是否抑制FVIIa/TF復(fù)合物激活FX，以及確定本發(fā)明抗體是否與FX競爭結(jié)合FVIIa/TF復(fù)合物。
3.凝血酶原時(shí)間(PT)檢測對于標(biāo)準(zhǔn)的PT反應(yīng)，將90μl適宜濃度的抗體或PBS添加到含有20μl促凝血酶原激酶IS(Dade)以及90μl 25mM CaCl2的比色杯中。將混合物在37℃孵育1分鐘，然后加入100μl檸檬酸化的血漿(Helena Laboratories)?；蛘撸瑢⑦m宜體積的濃縮抗體加入到100μl重組的人促凝血酶原激酶(Ortho Recombiplastin)中，并在近2分鐘后，加入100μl重構(gòu)的人血漿。通過用Electra 900C凝血測定儀(coagulometer)(Hemoliance)進(jìn)行的兩次測定的平均值以及來自重復(fù)測定(n＝3或4)的平均值可測定每個(gè)凝血檢測的凝血時(shí)間。生成每個(gè)抑制物的量效曲線(dose response curve)，然后用回歸分析計(jì)算出延長凝血時(shí)間兩倍所必需的濃度(nM)。
該檢測可以用于評價(jià)本發(fā)明抗體對外源性凝血途徑的作用。測定了雙倍PT所需的抗體量，以及可以與其它抗凝劑比較以評價(jià)本發(fā)明抗體的相對效力。
4.微量量熱法檢測用微量量熱法(等溫滴定量熱法)檢測測定本發(fā)明抗體單獨(dú)與TF或與FVIIa/TF復(fù)合物的結(jié)合親和力(KD)。利用MicroCal VP-ITC裝置進(jìn)行本檢測。通過將2.3倍摩爾過量的FVIIai加入到sTF中形成FVIIa/TF復(fù)合物。用大小排阻層析確認(rèn)sTF被完全結(jié)合。對于抗體對復(fù)合物的親和力的測定，將1.2μM VIIa/TF復(fù)合物加入到微量量熱孔中并將65μM抗體加入到注射器中。對于抗體單獨(dú)對sTF的親和力的測定，將10μM sTF加入到孔內(nèi)并將141μM抗體加入到注射器中。用MicroCal Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)適合于單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例5本發(fā)明抗TF抗體的體外特性從完整的人單鏈抗體噬菌體展示文庫中分離得到六種不同的TF結(jié)合抗體scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6、scFv(TF)3e10和scFv(TF)3h2。用BIAcore測定的在大腸桿菌中表達(dá)的這些sTF結(jié)合抗體的親和力在35和470nM之間。用實(shí)施例4中所述的sTF/VIIa肽水解檢測確定這些抗體是否能阻斷活性VIIa/TF復(fù)合物的形成。在這個(gè)檢測中，VIIa與sTF的結(jié)合所加快的對顯色肽底物S2266的裂解速率大于20倍。抑制FVIIa與TF結(jié)合的抗體阻斷了這種加速。五種單鏈抗體scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6和scFv(TF)3h2抑制了S2266的水解，說明它們抑制了FVIIa與sTF的結(jié)合(圖1)。相反，單鏈抗體scFv(TF)3e10不能抑制sTF/VIIa肽水解檢測，而且事實(shí)上該抗體增加了S2266的水解速度，說明scFv(TF)3e10增加了sTF與FVIIa的親和力。利用sTF/VIIa肽水解檢測，scFv(TF)3e10抗體增加了FVIIa對sTF的親和力，使表觀KD降低5倍(圖2)。在缺乏sTF時(shí)，scFv(TF)3e10不影響FVIIa的水解速度，說明該抗體不與FVIIa單獨(dú)相互作用。利用sTF/FVIIa肽水解檢測測定的scFv(TF)3e10抗體對sTF的KD為65.4nM(圖4)。用微量量熱法檢測比較了scFv(TF)3e10對TF與對FVIIa/TF復(fù)合物的親和力。這些實(shí)驗(yàn)揭示哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的scFv(TF)3e10與TF/FVIIa復(fù)合物的親和力比與游離的sTF的親和力高約20倍(33nM對600nM，圖5)。
用FX活化檢測以及PT檢測比較了6種表達(dá)于細(xì)菌的TF結(jié)合單鏈抗體。五種抑制了sTF/FVIIa復(fù)合物對S2266水解速度的抗體scFv(TF)2c1、scFv(TF)2c11、scFv(TF)2d3、scFv(TF)2h6及scFv(TF)3h2中沒有一種抗體延長了PT超過PBS緩沖液對照(圖3)。相反，盡管scFv(TF)3e10抗體沒有BIAcore所測定的最高親和力，以及它增強(qiáng)了FVIIa對sTF的親和力，但scFv(TF)3e10是該組中唯一能抑制FX活化(圖6以及數(shù)據(jù)未示出)并在PT檢測中延長凝血時(shí)間的抗體(圖3)。scFv(TF)3e10(二聚體)抗體在FX活化檢測中的抑制作用的IC50為0.44nM(圖6)。最后，用FX活化檢測確定scFv(TF)3e10抗體是否與FX競爭結(jié)合FVIIa/TF復(fù)合物。在底物FX的所有濃度下，scFv(TF)3e10以相同的KD(app)劑量依賴性地抑制FX活化，說明scFv(TF)3e10與FX是非競爭性的并且不結(jié)合與FX所結(jié)合的TF或FVIIa/TF復(fù)合物的同一位點(diǎn)(圖7)。
根據(jù)與重組人可溶性TF的結(jié)合可以鑒定scFv(TF)3e10抗體。人與鼠或人與兔的TF之間的序列同源性分別為58％和71％?？贵w與人TF的獨(dú)特性表位結(jié)合干擾了FVIIa/TF復(fù)合物對FX的活化。這種抗體在生理上比與FVII或FVIIa競爭結(jié)合TF的抗體具有優(yōu)越性。FVIIa對可溶性TF的KD為～10nM(圖2)，該數(shù)值與已經(jīng)發(fā)表的FVIIa與sTF結(jié)合(4.8nM，Neuenschwander，P.F.和Morrissey，J.H.(1994)J.Biol.Chem.269(11)8007-8013)或FVII、FVIIa及DIP失活的FVIIai與重建于中性磷脂酰膽堿小泡的全長TF結(jié)合(Bach R.et al.(1986)Biochemistry 254007-4020)的數(shù)值一致。當(dāng)磷脂小泡含有帶電荷的磷脂酰絲氨酸時(shí)，極大地增加了FVII或FVIIa與全長TF結(jié)合的親和力(Bach R.et al(1986)supra)，這是由于FVII或FVIIa的GLA結(jié)構(gòu)域與帶電荷的膜表面的相互作用的結(jié)果(Neuenschwander，P.F.andMorrissey，J.H.(1994)supra)。在這些最理想的條件下，F(xiàn)VIIa與全長TF的結(jié)合具有非常高的親和力(41pM)。與FVII或FVIIa競爭結(jié)合的TF抗體將很難與這種高親和力的FVIIa/TF復(fù)合物競爭。相反，scFv(TF)3e10抗體不僅與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與TF結(jié)合的更高，而且它不與FVIIa競爭結(jié)合TF。不與FVIIa競爭的例如scFv(TF)3e10抗體抑制FX的活化不依賴于血漿的FVII濃度，該濃度為～10nM。
scFv(TF)3e10也優(yōu)于與FX競爭結(jié)合TF的抗體。依照于圖7所示的數(shù)據(jù)，F(xiàn)X與VIIa/TF復(fù)合物的Km在0.061和0.099μM之間，與已發(fā)表的數(shù)值一致(0.1μM，Baugh，R.J.et al.(2000)J.Biol.Chem.275(37)28826-28833)。人血漿中FX的濃度為140nM(1.4到2倍Km)。如圖7所示不與FX競爭例如scFv(TF)3e10的抗體抑制FX的活化不依賴于血漿的FX濃度。
實(shí)施例6體內(nèi)大鼠血栓栓塞模型
TF結(jié)合單鏈抗體scFv(TF)3e10特異于靈長類TF。在清醒的雄性Sprague-Dawley大鼠(350-400g，n＞7/組)上用人TF(含有人重組TF的促凝血酶原激酶試劑，Ortho)觸發(fā)形成了血栓栓塞模型。在這個(gè)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)模型中，通過促凝血酶原激酶注射，TF誘導(dǎo)了肺內(nèi)纖維素沉積(pulmonary fibrin deposition)、呼吸衰竭和死亡。將的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的scFv(TF)3e10或載體(vehicle)注射到尾靜脈內(nèi)，15分鐘后接著丸式注射促凝血酶原激酶(0.5ml/kg)。在載體治療組中，這種劑量的TF造成了60％的死亡率(LD60)，通常發(fā)生在促凝血酶原激酶注射后的5分鐘內(nèi)。根據(jù)下面的發(fā)病率-死亡率評分系統(tǒng)對大鼠評分0＝不受影響；1＝輕微呼吸窘迫(在30min內(nèi)恢復(fù))；2＝嚴(yán)重呼吸窘迫(垂死的，恢復(fù)需要超過60min)；以及3＝死亡。用平均分?jǐn)?shù)比較不同治療組的效果。在圖8中描述了應(yīng)用這種體內(nèi)檢測的結(jié)果。本發(fā)明抗體在這個(gè)檢測中能降低死亡和呼吸窘迫。
用通?；蛱厥饷枋龅姆磻?yīng)物和/或本發(fā)明的操作條件取代在上述實(shí)施例中所使用的反應(yīng)物和/或操作條件可以重復(fù)出具有相似成功率的上述實(shí)施例。
雖然本發(fā)明已經(jīng)通過生成的某些抗體構(gòu)建體而舉例說明，但顯而易見在不脫離本發(fā)明的精神和范圍時(shí)可以對本發(fā)明進(jìn)行變化和修飾。
序列表<110>舍林股份公司<120>作為抗凝劑的新的靶向組織因子的抗體<130>52295AWOM2<150>US 60/376,566<151>2002-05-01<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>282<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Amino acid sequence of scFv(TF)3e10 antibody<400>1Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val1 5 10 15Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu20 25 30Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe35 40 45Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys50 55 60Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr65 70 75 80Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser85 90 95Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr100 105 110Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp115 120 125Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His145 150 155 160Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg165 170 175Ser Ser Gly Ser Val ALa Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg180 185 190Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro195 200 205Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn210 215 220Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp225 230 235 240Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly245 250 255Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro260 265 270Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala275 280<210>2<211>849<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>DNA sequence encoding scFv(TF)3e10 antibody<400>2atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggcag gcctggtctt ccccgagatg 60gcccaggtca acttaaggga gtctggggga accttggtcc agcctggggg gtccctgaga120ctctcctgtg cagcctctgg attcagtttc actgacgcct ggatgagctg ggtccgccag180gctccaggga aggagctgga gtgggtctca agtattagtg gtagtggtgg aagcacatac240tacgcaggct ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg300tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagta360ttatcgctga ccgattacta ctggtacggc atggacgtct ggggccaagg caccctggtc420accgtctcgg ccggtggcgg cggatctggc gcgccaaatt ttatgctgac tcagccccac480tctgtgtcgg cgtctccggg gaagacggta accatctcct gcacccgcag cagtggcagc540gttgccagct actatgtgca gtggtaccag cagcgcccgg gcagttcccc caccactgtg600atctatgagg ataaccacag accctctggg gtccctgatc ggttctctgg ctccatcgac660
acctcctcca actctgcctc cctcaccatc tctggactga agactgagga cgaggctgac720tactactgtc agtcttatga tagcaacaac cttgtggttt tcggcggagg gaccaagctg780accgtcctag gtgcggccgc aggagctccg gtgccggatc cggatccgct ggaaccgcgt840gccgcatga849<210>3<211>261<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Amino acid sequence of scFv(TF)3e10delta antibody<400>3Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val1 5 10 15Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu20 25 30Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe35 40 45Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys50 55 60Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr65 70 75 80Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser85 90 95Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr100 105 110Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp115 120 125Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser145 150 155 160Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly165 170 175Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser180 185 190Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val195 200 205Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser210 215 220
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys225 230 235 240Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys245 250 255Leu Thr Val Leu Gly260<210>4<211>783<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>DNA sequence encoding scFv(TF)3e10delta antibody<400>4atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggcag gcctggtctt ccccgagatg 60gcccaggtca acttaaggga gtctggggga accttggtcc agcctggggg gtccctgaga120ctctcctgtg cagcctctgg attcagtttc actgacgcct ggatgagctg ggtccgccag180gctccaggga aggagctgga gtgggtctca agtattagtg gtagtggtgg aagcacatac240tacgcaggct ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg300tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagta360ttatcgctga ccgattacta ctggtacggc atggacgtct ggggccaagg caccctggtc420accgtctcgg ccggtggcgg cggatctaat tttatgctga ctcagcccca ctctgtgtcg480gcgtctccgg ggaagacggt aaccatctcc tgcacccgca gcagtggcag cgttgccagc540tactatgtgc agtggtacca gcagcgcccg ggcagttccc ccaccactgt gatctatgag600gataaccaca gaccctctgg ggtccctgat cggttctctg gctccatcga cacctcctcc660aactctgcct ccctcaccat ctctggactg aagactgagg acgaggctga ctactactgt720cagtcttatg atagcaacaa ccttgtggtt ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta780ggt 78權(quán)利要求
1.一種抗凝血抗體，其與因子VIIa/組織因子(FVIIa/TF)復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)組織因子(TF)結(jié)合的親和力更高。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中如在微量量熱法檢測中所測定的，所述抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF結(jié)合的親和力至少高2倍。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF結(jié)合的親和力至少高5倍。
4.權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF結(jié)合的親和力至少高10倍。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是一種單克隆抗體。
6.權(quán)利要求5的抗體，其中所述抗體是一種單鏈抗體、Fab聚體抗體或IgG抗體。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體是一種單鏈抗體。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體不與一種或多種選自由因子VII(FVII)、因子IX(FIX)及因子X(FX)組成的組中的凝血因子競爭結(jié)合TF。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述凝血因子是FVII和FX。
10.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是糖基化的。
11.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體通過加入聚乙二醇而修飾。
12.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是用于結(jié)合鏈霉親和素的生物素化的抗體。
13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的抗體，該組合物包含藥物可接受的賦形劑以及治療有效量的所述抗體。
14.一種預(yù)防血栓形成的方法，包括施與治療有效量的權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體抑制凝血酶的形成而不直接影響其它的凝血參數(shù)，如血小板的活化和聚集。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述方法將預(yù)防缺血性卒中、血管成形術(shù)后的血栓并發(fā)癥或微血管手術(shù)中的血栓形成。
16.一種減少和治療患者的深靜脈血栓形成(DVT)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、急性冠脈綜合征或具有凝血病表現(xiàn)的癌癥的方法，包括將治療有效量的權(quán)利要求1的抗體給予所述患者。
17.一種調(diào)節(jié)患者的炎癥反應(yīng)的方法，包括將治療有效量的權(quán)利要求1的抗體給予所述患者。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述炎癥反應(yīng)選自由膿毒癥、皮膚和靜脈移植物，以及器官移植組成的組中。
19.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體可用于在醫(yī)療器械表面形成非成血栓性包膜，其中所述醫(yī)療器械與血液接觸。
20.一種試劑盒，包括權(quán)利要求1的抗體。
21.一種試劑盒，包括編碼權(quán)利要求1的抗體的DNA序列。
22.一種基因治療組合物，包含與治療有效量的基因治療載體組合的SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多核苷酸序列，其編碼由SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的氨基酸序列組成的抗體。
23.一種抗凝抗體，其中所述抗體是與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的親和力比與單獨(dú)TF結(jié)合的親和力更高的單鏈抗體，且其中所述抗體不與FVII及FX競爭結(jié)合TF。
24.權(quán)利要求23的抗體，其中所述抗體包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的氨基酸序列。
25.一種編碼權(quán)利要求23的抗體的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的抗體，其與因子VIIa/組織因子(FVIIa/TF)復(fù)合物的結(jié)合比與單獨(dú)組織因子(TF)的結(jié)合的親和力更高，其不與FVII及FX競爭性地結(jié)合TF，并抑制FX活化。抗體結(jié)合于受傷部位并阻止血栓形成的啟動(dòng)?？贵w可用于治療多種血栓性病變，包括但不限定于深靜脈血栓、彌漫性血管內(nèi)凝血以及急性冠脈綜合征。
文檔編號C12P21/08GK1665534SQ03815703
公開日2005年9月7日 申請日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月1日
發(fā)明者戴維·萊特, 柯克·麥克萊恩 申請人:舍林股份公司