專(zhuān)利名稱(chēng)：具有修飾的蛋白酶依賴(lài)向性的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有經(jīng)修飾的蛋白酶依賴(lài)向性的細(xì)胞融合載體，以及制備所述載體的方法。本發(fā)明的載體可用作顯示癌癥特異性感染的基因治療載體。
背景技術(shù)：
癌癥基因治療的開(kāi)發(fā)近年來(lái)取得了進(jìn)展。目前，本發(fā)明人已經(jīng)使用仙臺(tái)病毒(SeV)開(kāi)發(fā)出基因治療載體。SeV是副粘病毒科的病毒，屬于包含非分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒作為其基因組的一組病毒。副粘病毒載體可獲得高轉(zhuǎn)染率以及異源基因的過(guò)度表達(dá)，并且預(yù)期其可作為癌癥的基因治療載體。目前一些使用副粘病毒進(jìn)行的癌癥治療。例如，腮腺炎病毒感染的BHK21細(xì)胞據(jù)觀察在患腫瘤的裸鼠中顯示抗腫瘤效應(yīng)(Minato，N.等，J.Exp.Med.149，1117-1133，1979)。類(lèi)似地，在其它副粘病毒中也報(bào)道了抗腫瘤效應(yīng)。最近，致融合蛋白(fusogenic)的抗腫瘤效應(yīng)吸引了人們的注意。Galanis等，報(bào)道了用攜帶麻疹病毒F和HN蛋白的腺病毒載體感染的癌癥細(xì)胞形成合胞體，從而在體內(nèi)產(chǎn)生了抗腫瘤效應(yīng)(Galanis，E.等，Hum.Gene Ther.12，811-821，2001)。
顯然，不發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥可以通過(guò)手術(shù)去除該部分進(jìn)行治療，且轉(zhuǎn)移癌和惡性癌癥被認(rèn)為是同義的。浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)移癌已知過(guò)度表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和/或纖溶酶原激活物(uPA，tPA)(Cox，G.，and O’Byrne，K.J.，Anticancer Res.21，4207-4219，2001；Andreasen，P.A.等，Cell Mol.Life.Sci.57，25-40，2000)。該過(guò)度表達(dá)的出現(xiàn)據(jù)信是因?yàn)閮H在周?chē)募?xì)胞外基質(zhì)(ECM)由于癌癥表達(dá)降解ECM的酶(MMP，uPA，tPA)而被降解以后，才可能發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移這一事實(shí)，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)是在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)過(guò)程中防止細(xì)胞易位的屏障。
另一方面，就癌癥的基因治療而言已經(jīng)出現(xiàn)了3個(gè)問(wèn)題。首先，由于基因轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞中的效率較低，且將基因轉(zhuǎn)移到實(shí)體癌癥的核心不能輕易實(shí)現(xiàn)，故基因不能被轉(zhuǎn)染到整個(gè)癌癥。相應(yīng)地，余下的癌細(xì)胞開(kāi)始再次增殖，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。其次，基因不僅轉(zhuǎn)染到癌細(xì)胞中還轉(zhuǎn)染到正常細(xì)胞中。毒性基因損傷正常細(xì)胞，從而導(dǎo)致副作用增加。第三，隨著癌癥變?yōu)閻盒裕霈F(xiàn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，這成為所有類(lèi)型的癌癥治療中的一個(gè)問(wèn)題。目前，還沒(méi)開(kāi)發(fā)出可解決這些問(wèn)題的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供具有經(jīng)修飾的蛋白酶依賴(lài)向性(protease-dependent tropism)的新的細(xì)胞融合載體以及用于制備該載體的方法，該載體只在特定蛋白酶存在的條件下才浸潤(rùn)到周?chē)募?xì)胞中。
病毒的副粘病毒家族(包括仙臺(tái)病毒)，其包膜中含有兩種蛋白。融合(F)蛋白實(shí)現(xiàn)了該病毒與其宿主細(xì)胞之間的膜融合，從而導(dǎo)致核殼釋放到細(xì)胞質(zhì)中。血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白具有血細(xì)胞凝集活性和神經(jīng)氨酸酶活性，并在與宿主受體結(jié)合中起作用。F和HN蛋白也稱(chēng)為刺突蛋白，這是由于它們存在病毒包膜表面?；|(zhì)(M)蛋白沿包膜排列，并使得病毒顆粒具有剛性。本發(fā)明載體的特點(diǎn)是，與已有的載體相比，它們非常高效地將基因轉(zhuǎn)移到廣泛多種細(xì)胞和動(dòng)物組織中，并且獲得了高水平的表達(dá)。
F蛋白(F0)不顯示細(xì)胞融合活性。其融合活性只能通過(guò)宿主來(lái)源的蛋白酶的切割顯示，所述切割使F0降解為F1和F2。因此，攜帶野生型F蛋白的病毒的增殖被限制在表達(dá)可切割該蛋白的胰蛋白酶樣蛋白酶的組織類(lèi)型中，例如呼吸粘液上皮中。有多項(xiàng)研究涉及在副粘病毒中通過(guò)修飾F蛋白來(lái)修飾感染或致融合力(fusogenecity)的向性。就SeV而言，包含只被α-胰凝乳蛋白酶切割的F的變體喪失胰蛋白酶敏感性，從而改變了其特異于F切割序列的向性(Tashiro，M.等，J.Gen.Virol.73(Pt 6)，1575-1579，1992)。此外，在新城疫病毒和麻疹病毒中，已顯示由于對(duì)F的切割序列的修飾導(dǎo)致合胞體形成能力以胰蛋白酶依賴(lài)的方式發(fā)生改變(Li，Z.等，J.Virol.72，3789-3795，1998；Maisner，A.等，J.Gen.Virol.81，441-449，2000)。
通過(guò)如上述修飾F蛋白的切割序列，載體可感染表達(dá)特定蛋白酶的特定組織并在其中增殖。然而，副粘病毒載體的一個(gè)問(wèn)題是從細(xì)胞中二次釋放病毒，這出現(xiàn)在載體被導(dǎo)入靶細(xì)胞以后。在用可復(fù)制的病毒感染的細(xì)胞中，形成病毒粒子并釋放子代病毒。因此，病毒顆粒還擴(kuò)散到除靶組織以外的位點(diǎn)。盡管上述包含野生型F蛋白的病毒顆粒在缺乏胰蛋白酶樣酶時(shí)不顯示感染性，病毒顆粒本身從細(xì)胞中釋放。對(duì)于體內(nèi)給藥，關(guān)心的是擴(kuò)散到血液中的病毒將擴(kuò)散到整個(gè)身體。此外，病毒樣顆粒(VLP)的釋放在F基因缺陷型SeV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到(Li，H.O.等，J.Virol.74，6564-6569，2000；WO 00/70055；WO 00/70070)，所述VLP缺乏復(fù)制能力。對(duì)靶組織以外的組織的感染以及對(duì)免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)都是人們對(duì)二次釋放的顆粒的擔(dān)心。
因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，缺乏病毒包膜基因中M基因的副粘病毒不形成顆粒，但其可通過(guò)感染的細(xì)胞與和這些感染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞發(fā)生融合，形成合胞體而進(jìn)行細(xì)胞融合型感染(WO 00/09700)。這些M缺陷型病毒在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中復(fù)制，并在存在胰蛋白酶的條件下遞送到鄰近細(xì)胞中。然而，這種現(xiàn)象只在F被切割并活化的條件下出現(xiàn)。在包含野生型F蛋白的病毒中，病毒的轉(zhuǎn)移不會(huì)出現(xiàn)在沒(méi)有胰蛋白酶樣蛋白酶的條件下。因此，本發(fā)明人推定不產(chǎn)生二次釋放的顆粒，而且僅可在特定組織中傳播感染的新載體，可以通過(guò)修飾這種M缺陷病毒中的F蛋白向性而產(chǎn)生。具體地，許多浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)移癌已知具有增強(qiáng)的蛋白酶(如MMP，uPA，和tPA)活性，所述蛋白酶可降解ECM。因此，本發(fā)明人利用該M缺陷型SeV的蛋白酶依賴(lài)性細(xì)胞融合型感染，并結(jié)合在癌癥中過(guò)度表達(dá)MMP，uPA，和tPA的現(xiàn)象，來(lái)制備特異性感染并擴(kuò)散到侵襲性轉(zhuǎn)移癌的SeV載體。
M缺陷病毒缺乏顆粒形成所需的M基因。因此，病毒顆粒或者不被釋放，或者在該病毒中被極度抑制。當(dāng)傳統(tǒng)的重構(gòu)法用于制備具有復(fù)制能力的重組病毒(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)時(shí)，能制備M缺陷病毒的RNP但不可制備感染性病毒顆粒(WO 00/09700)。當(dāng)使用M缺陷載體作為癌癥治療劑時(shí)，極其有用的是將M缺陷病毒制備為感染性病毒顆粒。因此，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了將M缺陷病毒制備為病毒顆粒的新制備法。
為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)，即構(gòu)建VLP釋放受抑制的載體，本發(fā)明人考慮在病毒基因中使用溫度敏感性突變。已報(bào)道了可在低溫生長(zhǎng)但不能在高溫生長(zhǎng)的突變病毒株。本發(fā)明人設(shè)想在高溫抑制病毒顆粒形成的突變蛋白，尤其是突變的M蛋白可用來(lái)抑制VLP形成，使得病毒的產(chǎn)生可在低溫(例如32℃)下進(jìn)行，但病毒的實(shí)際應(yīng)用例如基因治療可在較高的溫度(例如37℃)進(jìn)行。為此，本發(fā)明人構(gòu)建了F基因缺陷型重組仙臺(tái)病毒載體，其編碼突變的M和突變的HN蛋白，所述蛋白具有報(bào)道的M和HN蛋白中的全部六種溫度敏感突變(M蛋白有三種，HN蛋白有三種)。檢測(cè)了該病毒的VLP釋放，并且該水平經(jīng)測(cè)定為野生型病毒的約1/10或更低。此外在細(xì)胞中導(dǎo)入具有抑制的VLP釋放的仙臺(tái)病毒載體，使用抗M抗體進(jìn)行免疫染色來(lái)分析細(xì)胞中的M蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，與導(dǎo)入野生型病毒的細(xì)胞相比，導(dǎo)入具有抑制的VLP釋放的病毒可顯著降低M蛋白在細(xì)胞表面的聚集。具體地，M蛋白的濃縮模式(condensation pattern)在高溫(38℃)極大減少。M和HN蛋白在由含有溫度敏感突變M基因的SeV感染的細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位用共聚焦激光顯微鏡精密地檢測(cè)。M蛋白在細(xì)胞表面的定位明顯減少(即使在低溫(32℃))，并且觀察到具有與微管相似的形態(tài)。在高溫(37℃)，M蛋白定位在中心體附近的微管上，即靠近高爾基體。加入微管解聚劑導(dǎo)致M蛋白定位結(jié)構(gòu)被破壞。這種情況見(jiàn)于包含溫度敏感性M基因的SeV和包含野生型M基因的SeV。從而使得M蛋白可能實(shí)際上通過(guò)沿微管定位發(fā)揮作用。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了具有溫度敏感突變的病毒中的二次病毒釋放水平降低是由于M蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位不足，該定位步驟據(jù)信在顆粒形成中具有核心作用。因此，VLP形成可通過(guò)防止M蛋白的正常細(xì)胞內(nèi)定位而被有效抑制。此外，與微管的相互作用對(duì)M蛋白的功能可能是重要的。例如，二次顆粒釋放可通過(guò)M蛋白亞細(xì)胞定位的破壞被降低，該步驟可使用基因突變或用來(lái)抑制M蛋白沿微管從高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的藥劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。具體地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，降低或消除了顆粒形成能力的重組病毒載體可以通過(guò)制備包含使M蛋白定位發(fā)生缺陷的突變的病毒載體來(lái)提供。
通過(guò)從病毒中消除M基因，本發(fā)明人構(gòu)建了一種病毒，其中M蛋白在細(xì)胞表面上的聚集在該病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中被完全抑制。為此，本發(fā)明人構(gòu)建了誘導(dǎo)性表達(dá)野生型M蛋白的輔助細(xì)胞，其可用于制備M基因缺陷型病毒。通過(guò)使用這些細(xì)胞，首次回收了下述病毒顆粒，所述病毒顆粒中F修飾的M基因缺陷病毒的RNP包含在含有野生型M蛋白的包膜中。本發(fā)明的方法使得可以產(chǎn)生濃度為1×108PFU/mL或更高的病毒顆粒，且因此首次提供足以實(shí)際使用，尤其是用于臨床的重組病毒。此外，本發(fā)明的病毒制備體系避免了被其它病毒污染的可能，并可產(chǎn)生出高度安全，高滴度的載體用于基因治療。通過(guò)使用本發(fā)明的M缺陷型SeV制備系統(tǒng)，首次提供了實(shí)用的、F修飾M缺陷型副粘病毒，其利用表達(dá)M的細(xì)胞反式提供M蛋白。
本發(fā)明人使用如上述構(gòu)建的感染性病毒顆粒，證實(shí)了體內(nèi)實(shí)際抗腫瘤效果。將基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)(其在癌癥中活性增強(qiáng))活化的M缺陷病毒給藥使用癌細(xì)胞移植的小鼠，并且證實(shí)該病毒通過(guò)細(xì)胞融合型感染在整個(gè)癌組織中擴(kuò)散。在給藥野生型病毒的癌癥中，所述病毒甚至在數(shù)天后還被限制在注射位點(diǎn)。反之，本發(fā)明的載體顯示對(duì)癌組織的高穿透力，并且所述載體在整個(gè)癌組織中擴(kuò)散。本發(fā)明載體對(duì)癌癥增生的抑制作用與對(duì)照(沒(méi)有給藥病毒或給藥野生型病毒)相比是明顯的。靶向表達(dá)MMP的細(xì)胞的載體目前也已經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生(Peng，K.-W.等，Human Gene Therapy 8，729-738，1997；Peng，K.-W.等，Gene Therapy 6，1552-1557，1999；Martin，F(xiàn).等，J.Virol.73，6923-6929，1999)。然而，它們利用與本發(fā)明的識(shí)別序列完全不同的設(shè)計(jì)。此外，這些報(bào)告的目標(biāo)是特異性感染癌組織，即只靶向癌組織。因此，通過(guò)本發(fā)明首次提供了在癌組織中特異性(在細(xì)胞內(nèi))擴(kuò)散感染的載體。
此外，本發(fā)明人通過(guò)在病毒顆粒形成過(guò)程中控制蛋白酶的加入而成功制備了位于病毒表面具有未切割的F蛋白的病毒顆粒F-未切割型病毒。如此這般，這些病毒不具有感染力；但是，它們?cè)谟们懈畈《颈砻鍲蛋白的蛋白酶處理或者在這種蛋白存在時(shí)將病毒加入到細(xì)胞的情況下，顯示特異性感染力。這種可誘導(dǎo)的感染性病毒載體能使載體特異性感染產(chǎn)生特定蛋白酶的癌癥細(xì)胞。
此外，本發(fā)明人成功將野生型F蛋白用于制備包含修飾型F基因的載體，以開(kāi)發(fā)出在載體制備過(guò)程中利用切割野生型F蛋白的蛋白酶來(lái)制備病毒顆粒的方法。根據(jù)該方法，可使用表達(dá)野生型F蛋白的輔助細(xì)胞和切割野生型F蛋白的酶例如胰蛋白酶來(lái)進(jìn)行病毒擴(kuò)增。獲得的病毒顆粒的包膜中包含切割后的野生型F蛋白，并具有感染力。然而，由于修飾后的F基因(其中病毒基因組編碼的F蛋白的切割位點(diǎn)被修飾)，所述感染僅在特定蛋白酶存在下擴(kuò)散。這種使用野生型F蛋白制備病毒的方法具有優(yōu)點(diǎn)，這是由于其允許不依賴(lài)將修飾的F基因而被整合到載體基因組中以產(chǎn)生病毒顆粒。
如上所述，本發(fā)明提供了一種載體，其感染僅在存在表達(dá)于特定組織(如癌組織)中的蛋白酶時(shí)擴(kuò)散。本發(fā)明的載體不產(chǎn)生顯著量的病毒顆粒，但可通過(guò)細(xì)胞融合將載體轉(zhuǎn)移到周?chē)?xì)胞中。本發(fā)明的載體通過(guò)其活性在癌癥中尤其增強(qiáng)的蛋白酶獲得感染力，該載體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有強(qiáng)抑制效果。因此，使用這些載體對(duì)癌癥進(jìn)行基因治療被認(rèn)為非常有效。
因此，本發(fā)明涉及蛋白酶依賴(lài)向性被修飾的細(xì)胞融合型載體，以及制備該載體的方法。具體地，本發(fā)明涉及[1]包含副粘病毒基因組RNA的復(fù)合物，其中(a)編碼M蛋白的核酸被突變或缺失，且(b)編碼了一種修飾過(guò)的F蛋白，其切割位點(diǎn)序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述復(fù)合物還包括以下特性(1)在已導(dǎo)入所述復(fù)合物的細(xì)胞中復(fù)制所述基因組RNA的能力；(2)在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少或缺乏；和(3)在所述蛋白酶存在的條件下，將所述RNA導(dǎo)入細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞是與由復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞。
[1]的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物是病毒顆粒。
[2]的復(fù)合物，還包含野生型F蛋白。
[1]-[3]之一的復(fù)合物，其中所述副粘病毒是仙臺(tái)病毒。
[1]-[4]之一的復(fù)合物，其中所述蛋白酶是其活性在癌癥中增強(qiáng)的蛋白酶。
[1]-[5]之一的復(fù)合物，其中所述蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶或纖溶酶原激活物。
[1]-[6]之一的復(fù)合物，其中由蛋白酶切割的序列包括Pro-Leu-Gly，Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg。
[1]-[7]之一的復(fù)合物，其中野生型F蛋白的胞質(zhì)區(qū)在修飾后的F蛋白中部分缺失。
[1]-[8]之一的復(fù)合物，其中修飾后的F蛋白與HN蛋白融合。
制備包含副粘病毒基因組RNA的方法，在該病毒顆粒中(a)編碼M蛋白的核酸被突變或缺失，且(b)編碼了一種修飾過(guò)的F蛋白，其切割位點(diǎn)序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述病毒顆粒(1)具有在已導(dǎo)入所述病毒顆粒的細(xì)胞中復(fù)制所述基因組RNA的能力；(2)顯示在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少或缺乏；和(3)在所述蛋白酶存在的條件下，將所述基因組RNA導(dǎo)入細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞是與由包含基因組RNA的病毒顆粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞；所述方法包括以下步驟
(i)在表達(dá)副粘病毒野生型M蛋白的細(xì)胞中，擴(kuò)增包含副粘病毒N，P，和L蛋白以及基因組RNA的RNP；和(ii)收集釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒。
制備包含副粘病毒基因組RNA的病毒顆粒的方法，在該病毒顆粒中(a)編碼了條件突變性M蛋白，和(b)編碼修飾過(guò)的F蛋白，其切割位點(diǎn)序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述病毒顆粒(1)具有在已導(dǎo)入所述病毒顆粒的細(xì)胞中復(fù)制所述基因組RNA的能力；(2)顯示在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少或缺乏；和(3)在所述蛋白酶存在的條件下，將所述基因組RNA導(dǎo)入細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞是與由包含基因組RNA的病毒顆粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞；所述方法包括以下步驟i)在突變型M蛋白的容許條件下，在細(xì)胞中擴(kuò)增包含副粘病毒N，P，和L蛋白以及基因組RNA的RNP；和(ii)收集釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒。
[10]或[11]的方法，其中步驟(i)在小于等于35℃的溫度進(jìn)行。
[10]或[11]的方法，還包括在至少步驟(i)或(ii)之一中提供切割修飾后的F蛋白的蛋白酶的步驟；或者使用所述蛋白酶處理步驟(ii)中收集的病毒顆粒的步驟。
用于癌癥的治療性組合物，其包含[5]的復(fù)合物和可藥用的載體。
重組修飾后副粘病毒F蛋白，其在切割位點(diǎn)包含Pro-Leu-Gly，Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg，并在存在基質(zhì)金屬蛋白酶或纖溶酶原激活物的條件下顯示致細(xì)胞融合力。
編碼[16]的蛋白的核酸。
一種病毒顆粒，其包含[16]的蛋白或編碼該蛋白的核酸。
一種具有細(xì)胞致融合活性的融合蛋白，其包含副粘病毒F和HN蛋白的跨膜區(qū)，其中所述F和HN蛋白在胞質(zhì)側(cè)互相結(jié)合。
[19]的融合蛋白，其中該蛋白的切割位點(diǎn)序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶所切割的序列取代。
編碼[19]的蛋白的核酸。
包含[21]的核酸的載體。
一種病毒顆粒，其包含[19]的蛋白或者編碼該蛋白的核酸。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“副粘病毒”指屬于副粘病毒科的病毒，及其衍生病毒。副粘病毒是以非分節(jié)負(fù)鏈RNA基因組為特征的一組病毒，包括副粘病毒亞科(包括副粘病毒屬(也稱(chēng)為呼吸道病毒屬，腮腺炎病毒(Rubulavirus)屬和麻疹病毒(Morbillivirus)屬)，以及肺病毒亞科(包括肺病毒屬和間質(zhì)肺病毒(Metapneumovirus)屬)。具體地，本發(fā)明可利用的副粘病毒包括仙臺(tái)病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒，瘟熱病毒(distemper virus)，猴副流感病毒(SV5)，和人副流感病毒1，2，和3型，等等。更具體地例如，仙臺(tái)病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，犬瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)，小反芻獸疫病毒(peste-des-petits-ruminant)(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒(Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2)，猴副流感病毒5(SV5)，人副流感病毒-4a(HPIV-4a)，人副流感病毒-4b(HPIV-4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫病毒(NDV)。更優(yōu)選的實(shí)例包括選自以下組的病毒仙臺(tái)病毒(SeV)，人副流感病毒-1(HPIV-1)，人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟熱病毒(PDV)，犬瘟熱病毒(CDV)，海豚麻疹病毒(DMV)，小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，和立百病毒(NipahVirus)。本發(fā)明的病毒優(yōu)選屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬，腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬)，且更優(yōu)選呼吸道病毒屬(也稱(chēng)副粘病毒屬)。本發(fā)明可利用的呼吸道病毒屬的病包括人副流感病毒1型(HPIV-1)，人副流感病毒3型(HPIV-3)，牛副流感病毒牛副流感病毒3型(BPIV-3)，仙臺(tái)病毒(也稱(chēng)小鼠副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本發(fā)明的副粘病毒最優(yōu)選仙臺(tái)病毒。這些病毒可源自天然毒株，野生型毒株，突變株，實(shí)驗(yàn)室傳代株，人工構(gòu)建的毒株等。
術(shù)語(yǔ)“重組蛋白”和“重組病毒”分別指通過(guò)重組多核苷酸產(chǎn)生的蛋白和病毒。術(shù)語(yǔ)“重組多核苷酸”指在自然狀態(tài)下未結(jié)合的多核苷酸。具體地，重組多核苷酸包含其多核苷酸鏈已被人工重組的多核苷酸，以及合成的多核苷酸。重組多核苷酸可使用傳統(tǒng)的基因重組法通過(guò)將多核苷酸合成，核酶處理，連接酶處理等步驟來(lái)制備。重組蛋白可以通過(guò)表達(dá)編碼該蛋白的重組多核苷酸組合來(lái)制備。重組病毒可以通過(guò)以下步驟制備表達(dá)編碼病毒基因組的多核苷酸，所述多核苷酸是通過(guò)遺傳工程構(gòu)建的；然后重構(gòu)所述病毒。
本文術(shù)語(yǔ)“基因”指遺傳物質(zhì)，其包括核酸例如RNA，DNA等。本發(fā)明中，編碼蛋白的核酸稱(chēng)為蛋白基因。但是，基因并非必需編碼蛋白，例如其可編碼功能型RNA例如核酶，反義RNA等?；蚩梢允翘烊粊?lái)源或人工設(shè)計(jì)的序列。本文術(shù)語(yǔ)“DNA”包括單鏈DNA和雙鏈DNA。術(shù)語(yǔ)“編碼蛋白”指多核苷酸，包含反義或有義ORF，所述ORF編碼蛋白氨基酸序列，使得該多核苷酸能夠在適宜的條件下表達(dá)。
本發(fā)明提供了具有復(fù)制能力的細(xì)胞融合載體，其蛋白酶依賴(lài)向性已經(jīng)被修飾。在宿主內(nèi)環(huán)境中，這種載體在轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后不釋放顯著量的病毒樣顆粒，并且只在存在特定蛋白酶時(shí)浸潤(rùn)到周?chē)?xì)胞中。具體地，本發(fā)明的載體包括一種復(fù)合物，其包含副粘病毒基因組RNA，其中(a)編碼M蛋白的核酸被突變或缺失，且其中(b)編碼修飾過(guò)的F蛋白，所述蛋白的切割位點(diǎn)序列被替換為不切割野生型F蛋白的蛋白酶所能切割的序列所取代，且所述復(fù)合物還包括以下特性(1)在已導(dǎo)入所述復(fù)合物的細(xì)胞中復(fù)制所述基因組RNA的能力；(2)在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少或缺乏；和(3)在所述蛋白酶存在的條件下，將所述RNA導(dǎo)入與轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞接觸的細(xì)胞種的能力。這種復(fù)合物由于具有復(fù)制基因組RNA并將其轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞的功能，在本發(fā)明也稱(chēng)載體。術(shù)語(yǔ)“載體”指將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的載體。
更具體地，上述復(fù)合物包含副粘病毒的基因組RNA和與該RNA結(jié)合的病毒蛋白。本發(fā)明的復(fù)合物可由例如副粘病毒基因組RNA以及病毒蛋白即核糖核蛋白(RNP)組成。RNP可以導(dǎo)入靶細(xì)胞，例如與所需的轉(zhuǎn)染試劑組合。更具體地，這種RNP是包含副粘病毒基因組RNA，N蛋白，P蛋白和L蛋白的復(fù)合物。當(dāng)RNP被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，病毒蛋白的作用導(dǎo)致從基因組RNA轉(zhuǎn)錄編碼病毒蛋白的順?lè)醋?；此外，基因組本身可復(fù)制，并產(chǎn)生子代RNP。基因組RNA的復(fù)制可通過(guò)使用RT-PCR，Northern雜交等檢測(cè)RNA拷貝數(shù)的增加而證實(shí)。
更優(yōu)選，上述復(fù)合物使副粘病毒病毒顆粒。術(shù)語(yǔ)“病毒顆?！敝竿ㄟ^(guò)病毒蛋白的作用從細(xì)胞中釋放的含有核酸的小顆粒。病毒顆?？梢允歉鞣N形式，例如球形或桿狀，根據(jù)病毒種類(lèi)而不同。它們比細(xì)胞小得多，通常大約10nm到約800nm。副粘病毒顆粒的結(jié)構(gòu)使得上述RNP包含基因組RNA和病毒蛋白，并且由脂質(zhì)膜(或包膜)封閉。病毒顆?？娠@示或不顯示感染性(見(jiàn)下文)。例如，一些病毒顆粒本來(lái)不顯示感染性，但經(jīng)過(guò)特殊處理后獲得感染性。
術(shù)語(yǔ)“副粘病毒基因組RNA”指能夠與副粘病毒蛋白形成RNP并使用這些蛋白從基因組表達(dá)基因，以復(fù)制核酸并形成子代RNP的RNA。副粘病毒的基因組是負(fù)鏈單鏈RNA，是一種以反義模式編碼基因的RNA。通常，副粘病毒基因組包含位于3’前導(dǎo)區(qū)和5’尾隨區(qū)之間包含反義系列的病毒基因。在每種基因的開(kāi)放閱讀框架(ORFs)之間，存在一系列序列轉(zhuǎn)錄終止序列(E序列)，間插序列(I序列)，以及轉(zhuǎn)錄起始序列(S序列)。因此，編碼每種基因ORF的RNA被轉(zhuǎn)錄為分離的順?lè)醋?。本發(fā)明載體中包含的基因組RNA編碼(以反義模式)核殼(N)，磷光體(phosphor)(P)，和大(L)蛋白。這些蛋白是RNA編碼的基因表達(dá)以及所述RNA自身自主表達(dá)所必須的。此外，所述RNA以反義方向編碼融合(F)蛋白，其誘導(dǎo)RNA擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞所必須的細(xì)胞膜融合。優(yōu)選，基因組RNA進(jìn)一步以反義方向編碼血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN或H)蛋白。然而，在一些細(xì)胞中，HN蛋白不是感染所必須的(Markwell，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(4)，978-982，1985)，并且感染可以通過(guò)單獨(dú)的F蛋白而實(shí)現(xiàn)。此外，載體可使用除HN以外的與細(xì)胞結(jié)合的蛋白以及F蛋白來(lái)感染細(xì)胞。因此，本發(fā)明的載體可以使用不編碼HN基因的基因組RNA來(lái)構(gòu)建。
副粘病毒亞科病毒的基因通常如下表示N基因通常也稱(chēng)“NP”。
呼吸道病毒屬NP P/C/V M F HN - L腮腺炎病毒屬NP P/V M F HN(SH)L麻疹病毒屬 NP P/C/V M F H - L例如，分類(lèi)為副粘病毒科呼吸道病毒屬的仙臺(tái)病毒的基因核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)是NP基因?yàn)镸29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；P基因?yàn)镸30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；M基因?yàn)镈11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056；F基因?yàn)镈00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；HN基因?yàn)镈26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808和X56131；以及L基因?yàn)镈00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。其它病毒編碼的病毒基因的登錄號(hào)如下N基因?yàn)锳F014953(CDV)，X75961(DMV)，D01070(HPIV-1)，M55320(HPIV-2)，D10025(HPIV-3)，X85128(Mapuera)，D86172(腮腺炎病毒)，K01711(MV)，AF064091(NDV)，X74443(PDPR)，X75717(PDV)，X68311(RPV)，X00087(SeV)，M81442(SV5)，和AF079780(Tupaia)；P基因?yàn)閄51869(CDV)，Z47758(DMV)，M74081(HPIV-1)，X04721(HPIV-3)，M55975(HPIV-4a)，M55976(HPIV-4b)，D86173(腮腺炎病毒)，M89920(MV)，M20302(NDV)，X75960(PDV)，X68311(RPV)，M30202(SeV)，AF052755(SV5)，和AF079780(Tupaia)；C基因?yàn)锳F014953(CDV)，Z47758(DMV)，M74081(HPIV-1)，D00047(HPIV-3)，ABO16162(MV)，X68311(RPV)，AB005796(SeV)，和AF079780(Tupaia)；M基因?yàn)镸12669(CDV)，Z30087(DMV)，S38067(HPIV-1)，M62734(HPIV-2)，D00130(HPIV-3)，D10241(HPIV-4a)，D10242(HPIV-4b)，D86171(腮腺炎病毒)，AB012948(MV)，AF089819(NDV)，Z47977(PDPR)，X75717(PDV)，M34018(RPV)，U31956(SeV)，和M32248(SV5)；F基因?yàn)镸21849(CDV)，AJ224704(DMV)，M22347(HPN-1)，M60182(HPIV-2)，X05303(HPIV-3)，D49821(HPIV-4a)，D49822(HPIV-4b)，D86169(腮腺炎病毒)，AB003178(MV)，AF048763(NDV)，Z37017(PDPR)，AJ224706(PDV)，M21514(RPV)，D17334(SeV)，和AB021962(SV5)；HN(H或G)為AF112189(CDV)，AJ224705(DMV)，U709498(HPIV-1)，D000865(HPIV-2)，AB012132(HPIV-3)，M34033(HPIV-4A)，AB006954(HPIV-4B)，X99040(腮腺炎病毒)，K01711(MV)，AF204872(NDV)，Z81358(PDPR)，Z36979(PDV)，AF132934(RPV)，U06433(SeV)，和S76876(SV-5)。每種病毒已知有一種以上毒株，且不同毒株可具有包含除以上所示序列以外的序列的基因。
這些病毒蛋白的ORF通過(guò)基因組RNA上的上述E-I-S被置于反義方向。在基因組RNA上，離3’端最近的ORF僅需要位于3’前導(dǎo)序列區(qū)和ORF之間的S序列，而不需E和I序列。另一方面，離基因組RNA5’端最近的ORF僅需要位于5’尾隨區(qū)和ORF之間的E序列，而不需I和S序列。使用例如IRES序列可以將兩種ORF轉(zhuǎn)錄成相同的順?lè)醋?。，在這種情況下，這兩個(gè)ORF之間不需要E-I-S序列。在野生型副粘病毒中，典型的RNA基因組具有3’前導(dǎo)序列，接著是反義方向依次編碼N，P，M，F(xiàn)，HN，和L蛋白的六種ORF的序列，在接下來(lái)在另一端是5’尾隨區(qū)。在本發(fā)明的基因組RNA上，病毒基因的結(jié)構(gòu)不限于此；然而，優(yōu)選將依次編碼N，P，(M，)F，HN，和L蛋白的ORF置于3’前導(dǎo)區(qū)之后，然后是5’尾隨區(qū)，這與野生型病毒相似。在特定類(lèi)型的副粘病毒中，病毒基因的數(shù)目不是6個(gè)。然而，即使在這種情況下，每種病毒基因的位置可以與上述野生型的相似，或可以作適宜的改變。M蛋白的ORF將在下文描述。然而，根據(jù)本發(fā)明載體的一個(gè)實(shí)施方案，該ORF可被排除或者可編碼突變M蛋白。此外，在本發(fā)明載體的另一實(shí)施方案中，基因組編碼的F蛋白的切割位點(diǎn)被修飾成一種序列，其可被不能切割野生型F蛋白的蛋白酶切割(下文)。本發(fā)明的基因組RNA還可編碼一或多種異源基因。需要在靶細(xì)胞中表達(dá)的任何目的基因也可用作異源基因。所述異源基因優(yōu)選插入基因組非編碼區(qū)中的位點(diǎn)。例如，其可插入3’前導(dǎo)序列和離3’末端最近的病毒蛋白ORF之間，插入各病毒蛋白ORF之間，和/或插入離5’末端最近的病毒蛋白ORF和5’尾隨區(qū)之間。在M基因缺陷型基因組中，可以插入缺陷區(qū)。當(dāng)將異源基因轉(zhuǎn)移到副粘病毒時(shí)，優(yōu)選置于基因組中的插入片段的多核苷酸具有的鏈長(zhǎng)度是6的倍數(shù)(Journal ofVirology 67(8)，4822-4830，1993)。E-I-S序列位于插入的異源基因和病毒ORF之間?？蛇x地，異源基因可通過(guò)IRES插入。
異源基因的表達(dá)水平可通過(guò)添加在基因上游(負(fù)鏈3’側(cè))的轉(zhuǎn)錄起始序列的類(lèi)型而調(diào)節(jié)(WO 01/18223)。此外，表達(dá)水平可根據(jù)異源基因插入基因組中的位置而調(diào)節(jié)。異源基因離負(fù)鏈3’端越近，該異源基因的表達(dá)水平就越高；類(lèi)似地，異源基因離5’端越近，其表達(dá)水平就越低。因此，異源基因的插入位點(diǎn)可被適宜地調(diào)節(jié)，以獲得所需的異源基因表達(dá)水平以及與編碼病毒蛋白的上游和下游基因的最佳組合。通常，高表達(dá)水平被認(rèn)為對(duì)異源基因有利。因此，異源基因優(yōu)選與高效轉(zhuǎn)錄起始序列相連，并且插入負(fù)鏈基因組3’端附近。更具體地，其優(yōu)選插入3’前導(dǎo)區(qū)和離3’端最近的病毒蛋白ORF之間。可選，異源基因可以插入離3’端最近D的病毒基因ORF和次最接近基因的ORF之間。反之，當(dāng)不優(yōu)選轉(zhuǎn)移基因高表達(dá)水平時(shí)，從病毒載體中表達(dá)的水平可通過(guò)以下方法降低例如將載體中基因的插入位置設(shè)計(jì)為盡可能接近負(fù)鏈基因組的5’側(cè)，或者使用具有低效率的轉(zhuǎn)錄起始序列，以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)男Ч?br> 任何包含在本發(fā)明載體中的病毒基因可從對(duì)野生型基因進(jìn)行修飾而來(lái)，從而例如降低病毒蛋白的免疫原性，或者增強(qiáng)RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制效率。具體地，在副粘病毒載體中，例如轉(zhuǎn)錄或復(fù)制功能可以通過(guò)修飾至少一種以下復(fù)制因子而增強(qiáng)N，P，和L基因。結(jié)構(gòu)蛋白HN包含血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性。如果，例如血凝素活性可被降低，血液中病毒的穩(wěn)定性可增強(qiáng)。另一方面，如果例如神經(jīng)氨酸酶的活性可修飾，可調(diào)節(jié)感染力。此外，膜融合和/或顆粒形成能力可通過(guò)修飾F蛋白及其除切割位點(diǎn)以外的結(jié)構(gòu)域而調(diào)節(jié)。例如，通過(guò)對(duì)可能的細(xì)胞表面抗原分子(例如F和HN蛋白)的抗原呈遞表位進(jìn)行分析，可產(chǎn)生對(duì)這些蛋白具有減弱的抗原呈遞能力的病毒載體。
具有缺陷輔助基因的載體可用作本發(fā)明的載體。例如，通過(guò)敲除V基因，SeV輔助基因，SeV對(duì)宿主例如小鼠的致病性可明顯降低而不損害基因在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)和復(fù)制(Kato，A.等，J.Virol.71，7266-7272，1997；Kato，A.等EMBO J.16，578-587，1997，；Curran，J.等，WO 01/04272，EP 1067179)。這種減毒載體優(yōu)選作為病毒載體用于體內(nèi)和回體(ex vivo)非毒性基因轉(zhuǎn)移。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)合物實(shí)質(zhì)上是均一的。術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上均一”的復(fù)合物是指與并非本發(fā)明復(fù)合物的副粘病毒RNP或病毒顆粒分離的復(fù)合物，其不是本發(fā)明的復(fù)合物。即，本發(fā)明實(shí)質(zhì)上均一的復(fù)合物不包含具有顆粒形成能力的其它副粘病毒RNP或病毒顆粒。本文術(shù)語(yǔ)“顆粒形成能力”是指載體在用該病毒載體感染的細(xì)胞中釋放感染性和/或非感染性病毒顆粒(稱(chēng)為病毒樣顆粒)的能力，該過(guò)程為“二次釋放”。此外，具有修飾的F蛋白切割位點(diǎn)的本發(fā)明復(fù)合物不包含下述病毒RNP，所述病毒RNP基因組中包含編碼野生型F蛋白或具有與野生型相似的融合活性的F蛋白的基因，且所述復(fù)合物也不包含含有該基因組的病毒顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，上述基因組RNA編碼的F蛋白的切割位點(diǎn)序列被由另一種蛋白酶切割的序列所取代。副粘病毒F蛋白(F0)本身在原始形式不顯示細(xì)胞膜融合活性。然而，當(dāng)切割F0片段的細(xì)胞外區(qū)(或病毒顆粒的外結(jié)構(gòu)域)時(shí)，其顯示融合活性。切割產(chǎn)生的兩種F蛋白片段，即N末端側(cè)和C末端側(cè)片段，分別為F1和F2，其通過(guò)二硫鍵相連。切割F蛋白涉及在細(xì)胞膜外側(cè)的結(jié)構(gòu)域切割膜F蛋白，從而導(dǎo)致具有細(xì)胞融合力的片段產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“切割位點(diǎn)序列”指蛋白酶進(jìn)行切割所需的氨基酸序列或其中的必要?dú)埢?。副粘病毒F蛋白的切割位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的，并且可以被胰蛋白酶樣細(xì)胞內(nèi)蛋白酶例如弗林蛋白酶(furin)切割。
弗林蛋白酶通常存在于大多細(xì)胞的高爾基體內(nèi)。弗林蛋白酶的識(shí)別基序是Arg-X-Lys/Arg-Arg(RXK/RR)(通過(guò)“/”分隔的兩種氨基酸表示任一氨基酸)。高致病性人PIV3(RTKR)，SV5(RRRR)，腮腺炎病毒(RHKR)，NDV(毒性株)高毒性株(RQR/KR)，麻疹病毒(RHKR)，RS病毒(RKRR)等的切割位點(diǎn)包括這些基序的序列。高毒性株的F蛋白對(duì)所有細(xì)胞中的蛋白酶敏感，并且該毒株的病毒在所有器官中通過(guò)切割F蛋白進(jìn)行多步增殖。因此，這些病毒的感染是致命的。另一方面，具有低毒性的仙臺(tái)病毒(PQSR)，人PIV1(PQSR)，和NDV(無(wú)毒性株)弱毒性株(K/RQG/SR)不含有該基序，只含Arg(其是絲氨酸蛋白酶識(shí)別序列)。副粘病毒F蛋白切割位點(diǎn)的序列已經(jīng)徹底分析，且本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可根據(jù)文獻(xiàn)識(shí)別它們(見(jiàn)例如，“Uirusu-gaku(Virology)”，Hatanaka，M.ed.，Tokyo，Asakura Shoten，247-248，1997)。
此外，切割位點(diǎn)可通過(guò)鑒定在可使副粘病毒生長(zhǎng)的細(xì)胞，組織，個(gè)體等中生長(zhǎng)的病毒的F蛋白的切割位點(diǎn)或者通過(guò)鑒定在這些細(xì)胞，個(gè)體等中表達(dá)它們而收集的F蛋白的切割位點(diǎn)而證實(shí)?？蛇x地，F(xiàn)蛋白可通過(guò)用切割該蛋白的切割位點(diǎn)的蛋白酶例如胰蛋白酶處理細(xì)胞表面表達(dá)的F蛋白來(lái)人工切割或者鑒定。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，F(xiàn)蛋白包含可以被另一種蛋白酶切割的修飾型F蛋白切割位點(diǎn)。為此，F(xiàn)蛋白的天然切割序列可以通過(guò)取代，缺失，和/或插入一或多個(gè)氨基酸來(lái)進(jìn)行修飾，以便重構(gòu)可以被另一種蛋白酶切割的序列。對(duì)氨基酸序列的修飾可以通過(guò)傳統(tǒng)的定點(diǎn)誘變法來(lái)進(jìn)行。此外，修飾的F蛋白可保持被可切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的特性(見(jiàn)實(shí)施例)。編碼這種修飾F蛋白的載體與野生型F蛋白相比具有增強(qiáng)的蛋白酶依賴(lài)向性。
由另一種蛋白酶切割的序列可以是被優(yōu)選蛋白酶切割的那些序列。例如，可以使用可被在作為載體導(dǎo)入的優(yōu)選靶的組織或者細(xì)胞中選擇性表達(dá)的蛋白酶切割的序列(WO 01/20989)。通過(guò)使用包含可被蛋白酶(如上述在靶組織中有活性)切割的序列的F蛋白基因設(shè)計(jì)載體，可在具有該蛋白酶活性的條件下，載體進(jìn)行增殖和特異性轉(zhuǎn)移到周?chē)?xì)胞的良好特性。例如通過(guò)使用在特定組織中特異性表達(dá)或活化的蛋白酶的切割序列，可構(gòu)建僅在所述組織中特異性浸潤(rùn)的載體。此外，通過(guò)利用在特定條件下(例如疾病)特異性表達(dá)或活化的蛋白酶的切割序列，可構(gòu)建在這種條件下(例如僅在特定疾病損傷中)特異性浸潤(rùn)的載體。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的蛋白酶都可利用。例如，分泌到細(xì)胞外的蛋白酶，以及在膜表面表達(dá)的蛋白酶是優(yōu)選的?？蛇x地，所選蛋白酶可以是任何存在于F蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中(從細(xì)胞內(nèi)翻譯到在細(xì)胞表面分泌)的適宜蛋白酶。
許多疾病是由蛋白酶基因的異常表達(dá)導(dǎo)致的，包括，例如屬于所有類(lèi)型常見(jiàn)病的疾病，例如代謝疾病，循環(huán)疾病，炎癥和免疫疾病，感染，和惡性腫瘤。具體例子包括肌肉萎縮癥中的鈣蛋白酶，自身免疫病以及神經(jīng)疾病中的泛素蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)的破壞，，老年癡呆癥中neprilysin的表達(dá)降低，癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的MMP表達(dá)增強(qiáng)，來(lái)自病原體微生物的病原體來(lái)源蛋白酶，止血機(jī)制中的絲氨酸蛋白酶，以及胎盤(pán)中的氨基肽酶。
鈣蛋白酶是鈣依賴(lài)的半胱氨酸蛋白酶，其是作為參與肌肉萎縮的肌肉蛋白水解的一種酶而研究的。鈣蛋白酶經(jīng)過(guò)特定的活化機(jī)制，即其由于和鈣結(jié)合而被活化，且鈣蛋白酶被認(rèn)為通過(guò)對(duì)蛋白進(jìn)行有限的細(xì)胞內(nèi)降解激發(fā)肌肉的蛋白水解，所述蛋白，例如α-肌動(dòng)蛋白，肌鈣蛋白，和肌聯(lián)蛋白對(duì)于骨骼肌結(jié)構(gòu)保持很重要。對(duì)于鈣蛋白酶的切割序列(Karlsson，J.O.等，Cell Biol.Int.24，235-243，2000)，Leu-Leu-Val-Tyr用作降解底物。
泛素蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)是選擇性且有活性的細(xì)胞內(nèi)蛋白水解機(jī)制，并且是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞循環(huán)等的重要細(xì)胞功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)。泛素蛋白由76個(gè)氨基酸組成，并且通過(guò)泛素蛋白活化酶(E1)，泛素蛋白結(jié)合酶(E2)，和泛素蛋白連接酶(E3)進(jìn)行連續(xù)催化反應(yīng)從而與蛋白共價(jià)結(jié)合。泛素蛋白化的蛋白由26S蛋白酶體降解。已知存在幾百種E3酶，并且可粗分為HECT型和RING指型。大量疾病表明其中的這些酶具有異?；钚?。例如Leu-Leu-Val-Tyr被用作26S蛋白酶體的降解底物(Reinheckel，T.等，Arch.Biochem.Biophys.377，65-68，2000)。
關(guān)節(jié)疾病，例如慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，通過(guò)破壞關(guān)節(jié)軟骨組織從而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙。關(guān)節(jié)軟骨的再生能力非常低，并且由于細(xì)胞外基質(zhì)降解使軟骨構(gòu)造破壞導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞。在這種軟骨細(xì)胞外基質(zhì)破壞中，MMP和相關(guān)基因家族的“分解蛋白(disintegrin)和金屬蛋白酶”(ADAM)分子之間的關(guān)系最近得到關(guān)注。具體地，ADAMTS(具有血小板反應(yīng)蛋白基序的ADAM)分子被認(rèn)為是降解軟骨蛋白多糖(聚集蛋白聚糖)的必要酶(Tortorella，M.D.等，Science 284，1664-1666，1999)。已經(jīng)鑒定了通過(guò)ADAMTS導(dǎo)致聚集蛋白聚糖的降解的序列(Tortorella，M.D.等，J.Biol.Chem.275，18566-18573，2000)。
使用這些蛋白酶的識(shí)別序列，可以制備對(duì)表達(dá)這些蛋白酶的組織特異的載體。
本發(fā)明尤其優(yōu)選的蛋白酶切割序列包括其活性在癌癥中增強(qiáng)的那些蛋白酶。通過(guò)構(gòu)建使用這種序列的載體，可構(gòu)建特異性感染癌組織的載體。這種載體在作為用于癌癥治療的基因轉(zhuǎn)移載體中非常有用。在癌癥中具有“增強(qiáng)的活性”的蛋白酶是在與相應(yīng)的正常組織或正常細(xì)胞中的活性相比，在特定癌組織或癌細(xì)胞中顯示增強(qiáng)的活性的蛋白酶。其中術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)的活性”包括蛋白酶表達(dá)水平和/或其自身活性升高。蛋白酶表達(dá)可通過(guò)如下方法測(cè)定例如Northern雜交(使用蛋白酶基因片段作為探針)，RT-PCR(使用特異性擴(kuò)增蛋白酶基因的引物)，或者Western印跡，ELISA，以及免疫印跡(使用蛋白酶抗體)。蛋白酶的活性可以通過(guò)使用蛋白酶底物由降解實(shí)驗(yàn)測(cè)定。已知體內(nèi)的許多蛋白酶的活性由各種已知因子調(diào)節(jié)。蛋白酶的活性水平可通過(guò)測(cè)定這些抑制因子的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定。
例如，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解酶活性在轉(zhuǎn)移癌中尤其增強(qiáng)(Nakajima，M.and Chop，A.M.，Semin.Cancer Biol.2，115-127，1991；Duffy，M.J.，Clin.Exp.Metastasis 10，145-155，1992；Nakajima，M.“Extracellular matrix degradationenzyme(Japanese)”，Seiki，M.ed.，“Malignant transformation and metastasis ofcancer”，Chugai Igaku，124-136，1993)。在動(dòng)物中，包含蛋白例如膠原蛋白和蛋白多糖的基質(zhì)在細(xì)胞間隙中形成。細(xì)胞外基質(zhì)具體已知的成分包括，膠原蛋白，纖連蛋白，層粘連蛋白，腱生蛋白，彈性蛋白，蛋白多糖等。這些ECM具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附，發(fā)育，轉(zhuǎn)移等的功能，以及通過(guò)與可溶因子結(jié)合調(diào)節(jié)其分布和活性的功能。ECM降解酶對(duì)ECM的浸潤(rùn)在癌轉(zhuǎn)移中起重要作用，并且許多報(bào)告顯示ECM降解酶抑制物可以抑制對(duì)基底膜的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。特異性感染病浸潤(rùn)癌組織的載體可以通過(guò)編碼修飾F蛋白而構(gòu)建，所述F蛋白具有ECM降解酶在其切割位點(diǎn)上進(jìn)行切割的識(shí)別序列。
根據(jù)其活性中心的催化性殘基的種類(lèi)，ECM降解酶分類(lèi)成天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，和金屬蛋白酶。具體地，對(duì)于體內(nèi)的ECM降解，絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶(其是神經(jīng)蛋白酶)起重要作用。絲氨酸蛋白酶廣泛分布于微生物，動(dòng)物，植物中。在高等動(dòng)物中，它們參與多種生物反應(yīng)，包括例如食物的消化，血液凝固，纖維蛋白溶解，免疫補(bǔ)體反應(yīng)，細(xì)胞增殖，個(gè)體發(fā)生，分化，衰老，癌轉(zhuǎn)移等。此外，絲氨酸蛋白酶的活性通常由絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)(通常存在于血漿和組織中)調(diào)節(jié)，并且該抑制物的定量或定性異常已知可導(dǎo)致炎癥。
降解ECM的絲氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶G，彈性蛋白，纖溶酶，纖溶酶原激活物，腫瘤胰蛋白酶，糜蛋白酶樣神經(jīng)蛋白酶，凝血酶等。纖溶酶通過(guò)對(duì)以非活性形式存在體內(nèi)的纖溶酶原進(jìn)行有限降解而產(chǎn)生。所述有限降解通過(guò)纖溶酶原激活物(PA)及其抑制物，纖溶酶原激活物抑制物(PAI)調(diào)節(jié)。PA包含組織PA(tPA)，其參與血液凝固，以及尿激酶PA(uPA)，其參與ECM降解(Blasi，F(xiàn).and Verde，P.，Semin.Cancer Bio.1，117-126，1990)。這兩種PA的功能通過(guò)與PAI結(jié)合而被抑制(Cajot，J.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6939-6943，1990；Baker，M.S.等，Cancer Res.50，4676-4684，1990)。uPA在與細(xì)胞表面的uPA受體(uPAR)結(jié)合時(shí)起作用。纖溶酶降解纖連蛋白，腱生蛋白，層粘連蛋白等，但不能直接降解膠原蛋白。然而，其通過(guò)切割該酶的前體的一部分，來(lái)活化膠原蛋白降解酶，從而間接降解膠原蛋白。這些酶在癌癥細(xì)胞中通常顯示增強(qiáng)的活性，并且與轉(zhuǎn)移能力很好地相關(guān)(Tanaka，N.等，Int.J.Cancer 48，481-484，1991；Boyd，D.等，Cancer Res.48，3112-3116，1988；Hollas，W.等，Cancer Res.51，3690-3695，1991；Correc，P等，Int.J.Cancer 50，767-771，1992；Ohkoshi，M.等，J.Natl.Cancer Inst.71，1053-1057，1983；Sakaki，Y.等，New Horizon for Medicine(Japanese)17，1815-1821，1985)。
對(duì)uPA和tPA的切割序列已進(jìn)行了許多研究(Rijken，D.C.等，J.Biol.Chem.257，2920-2925，1982；Wallen，P.等，Biochim.Biophys.Acta 719，318-328，1982；Tate，K.M.等，Biochemistry 26，338-343，1987)通常使用的底物序列包括VGR(Dooijewaard，G，and KLUFT，C.，Adv.Exp.Med.Biol.156，115-120，1983)和底物S-2288(Ile-Pro-Arg)(Matsuo，O.等，Jpn.J.Physiol.33，1031-1037，1983)。Butenas等使用54種熒光底物來(lái)鑒定對(duì)tPA高度特異的序列(Butenas，S.等，Biochemistry 36，2123-2131，1997)，并顯示tPA對(duì)兩種序列FPR和VPR具有高降解活性。因此，這些序列是本發(fā)明尤其優(yōu)選的。
其它ECM降解酶分類(lèi)為半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶。它們也參與癌癥的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。具體例子包括組織蛋白酶B(Sloane，B.F.，Semin.Cancer Biol.1，137-152，1990)，其利用層粘連蛋白，蛋白多糖，纖連蛋白，膠原蛋白，原膠原蛋白酶(通過(guò)降解活化)等作為底物；組織蛋白酶L(Kane，S.E.and Gottesman，M.M.，Semin.Cancer Biol.1，127-136，1990)其利用彈性蛋白，蛋白多糖，纖連蛋白，層粘連蛋白，彈性蛋白酶(活化的)等作為底物；以及組織蛋白酶D(Rochefort，H.，Semin.Cancer Biol.1，153-160，1990)，其利用層粘連蛋白，纖連蛋白，蛋白多糖，以及組織蛋白酶B和L(活化的)作為底物。組織蛋白酶B和L在乳腺癌(Spyratos，F(xiàn).等，Lancet ii，1115-1118，1989；Lah，T.T.等，Int.J.Cancer 50，36-44，1992)，和結(jié)腸癌肉瘤(Shuja，S.等，Int.J.Cancer 49，341-346，1991)中尤其高表達(dá)。據(jù)提示它們與其抑制因子之間的平衡的破壞與癌的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)(Sloane，B.F.，Semin.Cancer Biol.1，137-152，1990；Kane，S.E.and Gottesman，M.M.，Semin.Cancer Biol.1，127-136，1990)。
金屬蛋白酶是金屬酶，其活性中心包含金屬元素例如Zn。報(bào)道的金屬蛋白酶包括caspase，氨基肽酶，血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶，和膠原酶。對(duì)于降解ECM的金屬蛋白酶報(bào)道了16種或更多基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。代表性MMP包括膠原酶-1，-2，和-3(MMP-1，-8，和-13)，明膠酶A和B(MMP-2和-9)，溶基質(zhì)素(stromelysin)1，2和3(MMP-3，-10，和-11)，matrilysin(MMP-7)，以及膜金屬蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。通常，MMP的活性中心為Zn2+，且其顯示酶活性需要Ca2+。此外，MMP作為潛在的酶而被分泌(稱(chēng)為潛在MMP或ProMMP)，其在細(xì)胞外活化，并且降解體內(nèi)存在的多種ECM。此外，MMP的活性由常見(jiàn)抑制物抑制，即金屬蛋白酶的組織抑制物(TIMP)。ECM降解性金屬蛋白酶的其它實(shí)例包括降解ECM成分蛋白的氨基肽酶，例如氨基肽酶N/CD13和氨基肽酶B。根據(jù)使用抑制物的實(shí)驗(yàn)，報(bào)道所有這些蛋白酶與癌癥有很大關(guān)系。
在這些蛋白酶中，膠原酶(例如，MMP-1，-8，和-13)在特定位點(diǎn)切割纖維膠原，即I，II，和III型膠原分子。已知兩種明膠酶，即明膠酶A (MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)。明膠酶也稱(chēng)IV型膠原酶，并且除了降解IV型膠原蛋白(基底膜的主要成分)以外，還降解V型膠原和彈性蛋白。此外，還已知MMP-2在與MMP-1相同的位置切割I(lǐng)型膠原。MMP-9不降解層粘連蛋白和纖連蛋白；但MMP-2降解上述蛋白。溶基質(zhì)素(MMP-3和-10)接受并降解廣泛的底物并降解蛋白多糖；III，IV，和IX型膠原；層粘連蛋白；和纖連蛋白。溶基質(zhì)素(MMP-7)是缺乏血紅素結(jié)合蛋白(hemopexin)結(jié)構(gòu)域的分子，其與MMP-3具有相同的底物特異性，并具有特別高的降解蛋白多糖和彈性蛋白的活性。膜型金屬蛋白酶(MT-MMPs)(MT1-MMP，MT2-MMP，MT3-MMP，MT4-MMP，MT5-MMP，和MT6-MMP)包含跨膜結(jié)構(gòu)。MT-MMP具有位于前肽區(qū)和活性位點(diǎn)之間的插入序列(大約十個(gè)氨基酸)。所述插入序列包含Arg-Xaa-Lys-Arg(Xaa是氨基酸)，且在向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，所述插入序列通過(guò)弗林蛋白酶(細(xì)胞內(nèi)加工酶)的切割而活化。已知的MT-MPP包括MT1-MMP(MMP-14)，MT2-MMP(MMP-15)，MT3-MMP(MMP-16)，MT4-MMP(MMP-17)，MT5-MMP(MMP-23)，和MT-6-MMP(MMP-25)。例如，MT1-MMP降解I，II和III型膠原，且MT3-MMP降解III型膠原。
已知MMP的過(guò)度表達(dá)廣泛見(jiàn)于癌細(xì)胞中。它們分類(lèi)成由癌癥自身導(dǎo)致的和由癌癥間質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致的。例如，間質(zhì)膠原降解性膠原酶(MMP-1)參與癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，并且其活性水平與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移性相關(guān)(Wooley，D.E.，CancerMetastasis Rev.3，361-372，1984；Tarin，D.等，Br.J.Cancer 46，266-278，1982)。此外IV型膠原酶(MMP-2和MMP-9)的活性與各種上皮癌的轉(zhuǎn)移能力高度相關(guān)(Liotta，LA.and Stetler-Stevenson，W.G.，Semin.Cancer Biol.1，99-106，1990；Nakajima，M.Experimental Medicine 10，246-255，1992)。此外，還已知溶基質(zhì)素(MMP-3)與皮膚上皮瘤(dermal epithelial tumor)的惡性改變相關(guān)(Matrisian，L.M.and Bowden，G.T.，Semi.Cancer Biol.1，107-115，1990)。Stromelysin-3(MMP-11)據(jù)觀察在乳腺癌和結(jié)腸癌中高表達(dá)(Basset，T.等，Nature 348，699-704，1990；Porte，H.等，Clin.Exp.Metastasis 10(Suppl.1)，114，1992)。
已知MMP的許多切割底物?？杀凰蠱MP降解的底物序列的實(shí)例包括PLGLWAR(Bickett，D.M.等，Anal.Biochem.212，58-64，1993)，GPLGMRGL(Deng，S.J.等，J.Biol.Chem.275，31422-31427，2000)，PQGLEAK(Beekman，B.等，F(xiàn)EBS Lett.390，221-225，1996)，RPKPVEWREAK(Beekman，B.等，F(xiàn)EBS Lett.418，305-309，1997)，和PLALWAR(Jacobsen，E.J.等，J.Med.Chem.42，1525-1536，1999)。MMP-2和-9的切割底物包括PLGMWS(Netzel-Arnett，S.等，Anal.Biochem.195，86-92，1991)和PLGLG(Weingarten，H.等，Biochemistry 24，6730-6734，1985)。
最近，噬菌體展示的肽文庫(kù)掃描說(shuō)明了MMP-9(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276，20572-20578，2001)，MMP-2(Chen，E.I.等，J.Biol.Chem.277，4485-4491，2002)，和MTl-MMP(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.In JBC Papersin Press，April 16，2002，Manuscript M111574200)的降解底物序列。在這些文章中，鑒定的氨基酸序列根據(jù)被三種MMP的降解能力的存在或缺失分成四組。第IV組包括可由MTl-MMP特異性降解的序列，并且對(duì)于缺乏Arg的序列而言， VFSIPL和IKYHS序列被認(rèn)為是不被MMP-9和MMP-2降解，但可以被單獨(dú)的MT-MMP降解的底物。
例如，MMP-9的切割序列是Pro-X-X-Hy(其中，X代表任意殘基；Hy，疏水殘基)，尤其優(yōu)選Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)。非特異性實(shí)例包括Pro-Arg-(Ser/Thr)-Hy-(Ser/Thr)(切割出現(xiàn)在X和Hy殘基之間)。Hy(疏水殘基)的例子包括Leu，Val，Tyr，Ile，Phe，Trp，和Met，但不限于此。還鑒定了其它切割序列(例如，見(jiàn)下列文獻(xiàn)中的組I，II，IIIA，和IIIB；Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276，20572-20578，2001)，且任意理想序列均可使用。上述Pro-X-X-Hy可用于MMP-2，且此外，也可使用(Ile/Leu)-X-X-Hy，Hy-Ser-X-Leu，和His-X-X-Hy(見(jiàn)例如以下文獻(xiàn)中的組I，II，III，和IVChen，E.I.等，J.Biol.Chem.277，4485-4491，2002)。MMP家族包括MMP-7，MMP-1，MMP-2，MMP-9，MMP-3，和MT1-MMP(MMP-14)的切割位點(diǎn)可以通過(guò)參考天然底物蛋白的序列或者篩選肽文庫(kù)來(lái)適宜選擇(Turk，B.E.等，Nature Biotech.19，661-667，2001；Woessner，J.F.and Nagase，H.，Matrix metalloproteinases andTIMPs.(Oxford University Press，Oxford，UK，2000)；Fernandez-Patron，C.等，Circ.Res.85，906-911，1999；Nakamura，H.等，J.Biol.Chem.275，38885-38890，2000；McQuibban，G.A.等，Science 289，1202-1206，2000；Sasaki，T.等，J.Biol.Chem.272，9237-9243，1997)。切割位點(diǎn)的8氨基酸序列P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’(切割出現(xiàn)在P1和P1’之間)實(shí)例包括VPMS-MRGG(對(duì)應(yīng)MMP-1)，RPFS-MIMG(對(duì)應(yīng)MMP-3)，VPLS-LTMG(對(duì)應(yīng)MMP-7)，和IPES-LRAG(對(duì)應(yīng)MT1-MMP)，但不限于此。PLAYWAR(Nezel-Amett，S.等，Anal.Biochem.195，86，1991)是MMP-8的切割序列的一個(gè)例子。MMP的各種合成底物可得，并且可互相比較(見(jiàn)，例如Calbiochemcatalog，Merck中的每種MMP底物)。
通常，組織中的MMP活性通過(guò)以下過(guò)程調(diào)節(jié)潛在酶產(chǎn)生，潛在酶活化，以及抑制物對(duì)活性酶的抑制。MMP活性參與各種生理現(xiàn)象，例如發(fā)育和排卵，受精，植入子宮內(nèi)膜，以及傷口愈合。MMP活性調(diào)節(jié)失常導(dǎo)致各種病理，包括例如癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，關(guān)節(jié)炎，齒齦炎，動(dòng)脈硬化，腫瘤和纖維化。例如，已知降解基底膜成分的明膠酶(MMP-2和-9)對(duì)于癌癥轉(zhuǎn)移很重要。MMP-2通過(guò)MT1-MMP對(duì)原MMP-2(pro MMP-2)進(jìn)行切割而活化。另一方面，存在MMP-9的另一活化途徑，其中第一纖溶酶從纖溶酶原的產(chǎn)生是通過(guò)uPA激活原MMP-3，然后活化的MMP-3活化原MMP-9。該途徑參與癌轉(zhuǎn)移。為將本發(fā)明的載體開(kāi)發(fā)成靶向癌癥的載體，尤其可導(dǎo)入由所述參與癌轉(zhuǎn)移的蛋白酶切割的序列，作為F蛋白的切割位點(diǎn)。這種蛋白酶的實(shí)例包括MMP-2，MMP-9，uPA，MMP-3，和MT1-MMP，更具體為MMP-2，MMP-9和uPA。
將蛋白酶切割序列并入F蛋白時(shí)，目的蛋白酶切割序列被插入F蛋白的切割位點(diǎn)，并且優(yōu)選以前存在的胰蛋白酶樣蛋白酶切割位點(diǎn)優(yōu)選被簡(jiǎn)并。為實(shí)現(xiàn)該目的，原來(lái)的胰蛋白酶樣蛋白酶的切割位點(diǎn)周?chē)陌被峥梢员荒康牡鞍酌盖懈钚蛄?識(shí)別序列)替代。修飾的F蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)被目的蛋白酶切割，并且保持F蛋白的細(xì)胞膜融合活性。與F1片段(通過(guò)對(duì)F蛋白進(jìn)行切割產(chǎn)生)的N末端接近的氨基酸被認(rèn)為在細(xì)胞膜融合中起重要作用。因此，除非切割被抑制，切割序列的設(shè)計(jì)優(yōu)選使得切割后的F1片段的N末端序列與野生型F蛋白的相同。此外，為將接頭插入切割位點(diǎn)來(lái)誘導(dǎo)有效的切割反應(yīng)，與野生型F1相比，優(yōu)選需要將最小量的氨基酸加入切割后F1片段的N末端。例如，與野生型F1相比，在切割以后，有五個(gè)氨基酸以下，優(yōu)選四個(gè)氨基酸以下，或更優(yōu)選三個(gè)氨基酸以下(例如一個(gè)，兩個(gè)，或三個(gè)氨基酸)被加入N末端。例如，本發(fā)明說(shuō)明了在切割以后，將Met-Thr-Ser(SEQ ID NO1)加入修飾后F蛋白的F1片段的N末端不損害MMP的切割功能或細(xì)胞膜融合反應(yīng)。因此，所述切割序列優(yōu)選設(shè)計(jì)成使得Met-Thr-Ser，或其保守取代序列或包含其部分序列的氨基酸，在切割以后被加入F1的N末端。術(shù)語(yǔ)“保守取代”指其氨基酸側(cè)鏈具有相似的化學(xué)性質(zhì)的氨基酸之間的取代。具體地，Met可用Ile或Val取代，Thr可用Ser或Ala取代，且Ser可用Ala，Asn，或Thr取代。在各位置上氨基酸的取代可獨(dú)立進(jìn)行。
MMP-2和MMP-9的優(yōu)選切割序列的更具體地實(shí)例包括包含Pro-Leu/Gln-Gly(SEQ ID NO2)的序列。該序列是合成底物中常用作底物的序列(Netzel-Arnett，S.等，Anal.Biochem.195，86-92，1991)，并且將F蛋白設(shè)計(jì)成使得在切割修飾的F蛋白以后，該序列位于F2片段的C末端。為此，在野生型F蛋白切割以后，包含F(xiàn)2片段C末端氨基酸的序列被包含Pro-Leu/Gln-Gly的序列取代。對(duì)應(yīng)F蛋白的F2片段的C末端的一或多個(gè)氨基酸的初始序列被適當(dāng)?shù)厝笔В⑶译S后將Pro-Leu/Gln-Gly插入(即，進(jìn)行取代)。被缺失的氨基酸數(shù)目與被插入的氨基酸數(shù)目相等(例如三個(gè)氨基酸)，或者可以在0-10個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)選擇。只要蛋白酶的切割步驟和膜融合不被削弱，可制備F蛋白使得F1的N末端直接連在Pro-Leu/Gln-Gly下游。然而，在仙臺(tái)病毒的F蛋白中，切割序列和F1片段優(yōu)選通過(guò)適宜的間隔區(qū)相連。尤其優(yōu)選的包含這種間隔區(qū)的切割序列的例子是包括Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO3)或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ ID NO4)的那些序列。Met，Thr，和Ser可用其它氨基酸保守地取代。更優(yōu)選的蛋白的例子包括修飾的F蛋白，其中從切割后的F2的C末端氨基酸到N末端方向序貫連接的1-10個(gè)殘基(例如1，2，3，4，5或6個(gè)殘基)，被包含Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr的序列取代。例如，對(duì)仙臺(tái)病毒F蛋白而言，優(yōu)選蛋白可以是一種F蛋白，其中的對(duì)應(yīng)野生型F蛋白(SEQ ID NO5)中的F2片段的四個(gè)C末端氨基酸的序列(盡管不同毒株的序列不同，通常是113Pro-Gln-Ser-Arg116↓)被Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser取代。
本發(fā)明所述任何其它所需序列可用作MMP的切割序列。使用肽文庫(kù)分析各種MMP的底物特異性(Turk，B.E.等，Nature Biotech.19，661-667，2001)。對(duì)MMP-2(Chen，E.I.等，J.Biol.Chem.277(6)，4485-4491，2002)和MMP-9(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276(8)，20572-20578，2001)進(jìn)行了詳細(xì)分析。尤其是對(duì)MMP-9而言，從P3到P2’(P3-P2-P1-P1’-P2’；切割發(fā)生在P1-P1’之間)的共有序列建議為Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)(X＝任何殘基；Hy＝疏水殘基)。該共有序列也與推薦作為MMP-2的共有序列(Pro-X-X-Hy)之一匹配，從而被認(rèn)為是獲得對(duì)MMP-2和MMP-9的特異性的良好設(shè)計(jì)。因此，從該方面來(lái)看，支持上述序列(Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr)作為優(yōu)選實(shí)施例。具體地，F(xiàn)蛋白切割位點(diǎn)的序列優(yōu)選包含Pro-X-X-Hy-Thr/Ser，并更優(yōu)選包含Pro-X-X-Hy-Thr/Ser-Thr/Ser(“Thr/Ser”指Thr或Ser)。例如，不優(yōu)選不與Pro-X-X-Hy-Thr/Ser配對(duì)的Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala和Pro-Gln-Gly-Leu-Tyr-Ala(圖44)。通過(guò)將與Pro-X-X-Hy-Thr/Ser序列配對(duì)的肽插入F蛋白切割位點(diǎn)，可構(gòu)建存在MMP下顯示高浸潤(rùn)力的載體。
優(yōu)選切割序列的另一實(shí)例包括可被纖溶酶原激活物切割的那些序列。uPA和tPA的切割序列的具體實(shí)例包括含有Val-Gly-Arg的序列。F蛋白被設(shè)計(jì)成使得該序列位于切割后修飾的F蛋白的F2片段的C末端。為此，切割野生型F蛋白以后，包含F(xiàn)2片段的C末端氨基酸的序列可以由包含Val-Gly-Arg(SEQ ID NO6)的序列取代。優(yōu)選蛋白的更優(yōu)選的實(shí)例包括修飾的F蛋白，其中從切割后的F2的C末端氨基酸到N末端方向序貫連接的1-10個(gè)殘基(例如1，2，3，4，5或6個(gè)殘基)被Val-Gly-Arg或包含該序列的序列取代。例如，在仙臺(tái)病毒F蛋白中，實(shí)例包括一種F蛋白，其中對(duì)應(yīng)野生型F蛋白(SEQ ID NO5)中的F2片段的三個(gè)C末端氨基酸的序列(盡管不同毒株的序列不同，通常是114Gln-Ser-Arg116↓(SEQ ID NO7))被Val-Gly-Arg取代。
為有效鑒定存在特定蛋白酶時(shí)顯示致融合力的修飾后F蛋白，可利用任何使用質(zhì)粒載體的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(實(shí)施例31)。具體地，表達(dá)修飾后F蛋白的質(zhì)粒載體被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，并且將產(chǎn)生的細(xì)胞在蛋白酶存在下進(jìn)行培養(yǎng)以檢測(cè)合胞體形成。用蛋白酶切割該質(zhì)粒編碼的修飾后F蛋白(其導(dǎo)致合胞體形成)以檢測(cè)其是否顯示融合活性。例如，為測(cè)定MMP切割的F蛋白，使用表達(dá)MMP的HT1080細(xì)胞。可選地，可將MMP加入培養(yǎng)系統(tǒng)。使用本發(fā)明開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，可輕易獲得具有致融合力的修飾的F蛋白。
編碼修飾的F蛋白的載體可將該載體中所含的基因組RNA導(dǎo)入與被該載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞解除的細(xì)胞中，所述過(guò)程依賴(lài)于切割修飾F蛋白的蛋白酶的存在。切割的F蛋白的行為導(dǎo)致接觸細(xì)胞之間的細(xì)胞融合，并且使RNP擴(kuò)散到融合的細(xì)胞。即，本發(fā)明的載體不形成病毒顆粒，然而，由于載體浸潤(rùn)到例如上述的接觸細(xì)胞中，它可將載體轉(zhuǎn)移到定位的區(qū)域。所述蛋白酶可以在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)，或可以外源性添加。
本發(fā)明提供的修飾的F蛋白顯示依賴(lài)具體蛋白酶的細(xì)胞致融合力。通過(guò)利用該蛋白，可構(gòu)建僅在蛋白酶存在下導(dǎo)致細(xì)胞融合或特異性感染的病毒載體，藥物-和基因-遞送載體例如脂質(zhì)體。例如，通過(guò)將可被癌細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白酶切割的修飾F蛋白的基因與含有F和HN基因的腺病毒載體的F基因(Galanis，E.等，Hum.Gene Ther.12，811-821，2001)裝配在一起，可開(kāi)發(fā)出可在特定蛋白酶存在下導(dǎo)致細(xì)胞融合的載體。此外，例如，當(dāng)用F和HN蛋白將逆轉(zhuǎn)錄病毒假型化(pseudotyping)時(shí)(Spiegel，M.等，J Virol.72(6)，5296-5302，1998)，靶向癌細(xì)胞的載體(特異性感染癌癥)可使用修飾的F蛋白(該蛋白由在癌癥中表達(dá)的蛋白酶切割)在構(gòu)建過(guò)程中產(chǎn)生。如上述，除了本發(fā)明的載體以外，本發(fā)明提供的修飾的F蛋白和編碼它們的核酸可用來(lái)開(kāi)發(fā)各種依賴(lài)蛋白酶的載體。
此外，本發(fā)明提供包含修飾的F蛋白(通過(guò)缺失細(xì)胞質(zhì)區(qū)增加了細(xì)胞致融合力)的副粘病毒載體。胞質(zhì)區(qū)的部分氨基酸被缺失，使得0-28，優(yōu)選1-27，更優(yōu)選4-27位基酸存在于修飾后F蛋白的胞質(zhì)區(qū)中。術(shù)語(yǔ)“胞質(zhì)區(qū)”指膜蛋白的胞質(zhì)側(cè)，且在F蛋白中，其對(duì)應(yīng)膜(TM)區(qū)的C末端區(qū)(見(jiàn)圖42)。例如，F(xiàn)蛋白的胞質(zhì)區(qū)包含6-20位，優(yōu)選10-16位，且更優(yōu)選13-15位氨基酸，其與野生型F蛋白相比，顯示明顯高水平的細(xì)胞融合力。因此，制備包含修飾的F蛋白(其胞質(zhì)區(qū)包含大約14個(gè)氨基酸)的副粘病毒載體，從而獲得與用野生型F蛋白獲得的載體相比具有更高的細(xì)胞致融合力的載體。優(yōu)選，所述缺失的F蛋白缺乏10個(gè)或更多，更優(yōu)選20個(gè)以上，更優(yōu)選25個(gè)以上，且更優(yōu)選28個(gè)以上的野生型F蛋白的C末端氨基酸。根據(jù)最優(yōu)選的方面，胞質(zhì)區(qū)缺失的F蛋白缺乏大約28個(gè)野生型F蛋白的C末端氨基酸?；蚪M包含編碼這些胞質(zhì)區(qū)缺失的F蛋白的基因的副粘病毒載體與傳統(tǒng)的載體相比，具有更高的細(xì)胞融合力，并因此，能更強(qiáng)有力地浸潤(rùn)到周?chē)募?xì)胞中。如本文所述對(duì)F蛋白切割位點(diǎn)進(jìn)行修飾可產(chǎn)生僅在存在特定蛋白酶時(shí)顯示高浸潤(rùn)能力的載體。
本發(fā)明還涉及由副粘病毒所攜帶的兩種刺突蛋白構(gòu)成的融合蛋白。副粘病毒具有在細(xì)胞融合中起作用的蛋白(稱(chēng)“F”蛋白)和在細(xì)胞粘附中起作用地蛋白(稱(chēng)“HN”或“H”蛋白)。本文中，前者通常稱(chēng)為F蛋白，后者稱(chēng)HN蛋白。這兩種蛋白表達(dá)為融合蛋白，其與所述蛋白分開(kāi)表達(dá)相比，顯示極強(qiáng)的致融合力。在所述融合蛋白中，蛋白通過(guò)其胞質(zhì)區(qū)的一部分相結(jié)合。具體地，所述融合蛋白包含位于N末端的F蛋白，和位于其C末端的HN(或H)蛋白。當(dāng)融合這些蛋白時(shí)，所有蛋白都互相融合，或可選地，缺乏部分或全部胞質(zhì)區(qū)的F蛋白可以和HN(或N)融合。在后一種情況下，從F蛋白TM區(qū)的下游到HN(或H)蛋白的氨基酸殘基數(shù)目是5個(gè)以上，優(yōu)選10個(gè)以上，更優(yōu)選14個(gè)以上，且更優(yōu)選20個(gè)以上。例如當(dāng)將缺乏胞質(zhì)區(qū)的F蛋白與HN(或H)蛋白融合時(shí)，優(yōu)選通過(guò)將長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)慕宇^肽加入F蛋白部分的C末端來(lái)調(diào)節(jié)長(zhǎng)度。具體地，優(yōu)選使用通過(guò)任何接頭肽與HN(或H)蛋白融合的胞質(zhì)區(qū)缺失的F蛋白(包含胞質(zhì)區(qū)的14個(gè)殘基)。接頭肽的氨基酸序列沒(méi)有特別的限制；但優(yōu)選采用不具有顯著生理活性的多肽，包括該多肽的適宜實(shí)施例見(jiàn)圖43(SEQ ID NO80)。
本發(fā)明還涉及編碼這些融合蛋白的核酸，以及包含這些核酸的表達(dá)載體。由這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示強(qiáng)致融合力，并通過(guò)與周?chē)?xì)胞進(jìn)行融合形成合胞體。表達(dá)載體沒(méi)有特別的限制，并且包括，例如質(zhì)粒載體和病毒載體。對(duì)于DNA載體而言，優(yōu)選與強(qiáng)啟動(dòng)子例如CAG啟動(dòng)子(包含雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子的嵌合啟動(dòng)子)聯(lián)用(Niwa，H.等，Gene 108，193-199，1991)。表達(dá)本發(fā)明蛋白的病毒載體在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中產(chǎn)生強(qiáng)融合。適宜病毒載體的實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，負(fù)鏈RNA病毒載體，單純皰疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，Semliki森林(Semliki forest)病毒載體，新培斯病毒載體，痘苗病毒載體，禽痘病毒載體，以及其它優(yōu)選病毒載體。表達(dá)本發(fā)明蛋白的副粘病毒載體對(duì)多種組織都顯示高浸潤(rùn)力。具體地，使用M基因缺失的副粘病毒載體(其編碼具有修飾的F蛋白切割位點(diǎn)的本發(fā)明的融合蛋白)，可以產(chǎn)生出在特定組織中誘導(dǎo)強(qiáng)細(xì)胞融合的載體。
這些重組病毒載體可根據(jù)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法制備。例如，最常用于基因治療的腺病毒載體可以通過(guò)Saito等的方法和其它方法(Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，1320-24，1996；Kanegae等，ActaPaediatr.Jpn.，38，182-188，1996；Kanegae等，“Baiomanyuaru shiriizu4-Idenshi-donyu to Hatsugen·Kaisekiho (Biomanual Series 4Methods forgene transfection，expression，and analysis)”，Yodosha，43-58，1994；Kanegae等，Cell Engineering，13(8)，757-763，1994)構(gòu)建。此外，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Wakimoto等，Protein Nucleic acid and Enzyme(Japanese)40，2508-2513，1995)，腺伴隨病毒載體(Tamaki等，Protein Nucleic acid and Enzyme(Japanese)40，2532-2538，1995)可通過(guò)傳統(tǒng)方法制備。作為制備其它能夠?qū)⒒蜣D(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物中的病毒載體的具體方法，已知制備重組痘苗病毒的方法，其在公開(kāi)的日文翻譯版的國(guó)際公開(kāi)Hei 6-502069，審查過(guò)的
公開(kāi)日本專(zhuān)利申請(qǐng)(JP-B)Hei 6-95937，和JP-B Hei 6-71429中均有描述。制備重組乳頭瘤病毒的已知方法包括JP-B Hei 6-34727，和公開(kāi)的日文翻譯版國(guó)際公開(kāi)Hei6-505626中描述。此外，制備重組腺相關(guān)病毒和重組腺病毒的已知方法在包括未審查的
公開(kāi)日本專(zhuān)利申請(qǐng)(JP-A)Hei 5-308975和公開(kāi)的日文翻譯版國(guó)際公開(kāi)Hei 6-508039中分別描述。
在RNA基因組(其包含在本發(fā)明一方面提供的載體中)中，編碼基質(zhì)(M)蛋白的基因(即M基因)被突變或缺失。根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)蛋白的切割位點(diǎn)被修飾成可被另一種蛋白酶切割的序列，并且M汲引被突變或缺失以抑制顆粒形成能力。因此，具有完整新性質(zhì)的載體(其不釋放病毒顆粒，且僅浸潤(rùn)一組表達(dá)特定蛋白酶的細(xì)胞)被成功地反展出來(lái)。M基因的突變消除或顯著降低了宿主內(nèi)環(huán)境中的顆粒形成活性。表達(dá)該M蛋白的細(xì)胞中的這種突變可通過(guò)檢測(cè)到該蛋白在細(xì)胞表面的聚集降低來(lái)鑒定(見(jiàn)實(shí)施例)。
根據(jù)本發(fā)明，已知顆粒的二次釋放(即釋放VLP)的最有效的修飾，證實(shí)是M蛋白的缺失。該事實(shí)由對(duì)仙臺(tái)病毒(SeV)和其它負(fù)(-)鏈RNA病毒中M蛋白在病毒粒子形成中的作用的研究報(bào)告支持。例如，發(fā)現(xiàn)皰疹性口炎病毒(VSV)中M蛋白的強(qiáng)表達(dá)導(dǎo)致VLP出芽(Justice，P.A.等，J.Virol.69，3156-3160，1995)；同樣，副流感病毒VLP形成據(jù)報(bào)道也僅在M蛋白過(guò)度表達(dá)時(shí)出現(xiàn)(Coronel，E.C.等，J.Virol.73，7035-7038，1999)。雖然這種僅由M蛋白導(dǎo)致的VLP形成不能在所有(-)鏈RNA病毒中觀察到，認(rèn)識(shí)到M蛋白是作為(-)鏈RNA病毒中的病毒粒子形成核心(Garoff，H.等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62，1171-1190，1998)。
M蛋白在病毒粒子形成中的具體作用總結(jié)如下病毒粒子在細(xì)胞膜上所謂的脂筏(lipid raft)中形成(Simons，K.and Ikonen，E.，Nature 387，569-572，1997)。這些最初被鑒定為不溶于非離子清潔劑(例如Triton X-100)的脂質(zhì)片段(Brown，D.A.and Rose，J.K.，Cell 68，533-544，1992)。已顯示了以下病毒的病毒粒子在脂筏中的形成流感病毒(Ali，A.等，J.Virol.74，8709-8719，2000)，麻疹病毒(MeV；Manie，S.N.等，J.Virol.74，305-311，2000)，SeV(Ali，A.andNayak，D.P.，Virology 276，289-303，2000)等。在這些脂筏位點(diǎn)，M蛋白增強(qiáng)病毒粒子形成，濃縮包膜蛋白(也稱(chēng)刺突蛋白)和核糖核蛋白(RNP)。換言之，M蛋白可對(duì)病毒裝配和出芽器驅(qū)動(dòng)作用(Cathomen，T.等，EMBO J.17，3899-3908，1998；Mebatsion，T.等，J.Virol.73，242-250，1999)。實(shí)際上，顯示M蛋白與流感病毒刺突蛋白(Zhang，J.等，J.Virol.74，4634-4644，2000)，SeV(Sanderson，C.M.等，J.Virol.67，651-663，1993)的胞質(zhì)尾結(jié)合。它還結(jié)合流感病毒的RNP(Ruigrok，R.W.等，Virology 173，311-316，1989)，副流感病毒，SeV(Coronel，E.C.等，J.Virol.75，1117-1123，2001)等。此外，對(duì)于SeV(Heggeness，M.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，6232-6236，1982)和皰疹性口炎病毒等(VSV；Gaudin，Y.等，Virology 206，28-37，1995；Gaudin，Y.等，J.Mol.Biol.274，816-825，1997)，據(jù)報(bào)道M蛋白與其自身形成寡聚物。因此，由于M蛋白與許多病毒成分和脂質(zhì)結(jié)合起作用的能力，該蛋白被認(rèn)為作為病毒組裝和出芽的驅(qū)動(dòng)力而起作用。
此外，一些報(bào)道提示對(duì)包膜蛋白(刺突蛋白)的修飾也可抑制VLP的釋放。以下實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例是具體的報(bào)道，其中病毒粒子形成確實(shí)被抑制狂犬病毒(RV)中G蛋白缺陷導(dǎo)致VLP形成降低了1/30(Mebatsion，T.等，Cell 84，941-951，1996)。當(dāng)M蛋白缺陷時(shí)，該水平降低到1/500,000或更低(Mebatsion，T.等，J.Virol.73，242-250，1999)，此外，對(duì)麻疹病毒(MeV)而言，細(xì)胞-細(xì)胞融合在M蛋白缺陷時(shí)增強(qiáng)(Cathomen，T.等，EMBO J.17，3899-3908，1998)。推定這是由于病毒粒子形成受到抑制(Li，Z.等，J.Virol.72，3789-3795，1998)。此外，F(xiàn)或H蛋白胞質(zhì)尾(胞質(zhì)側(cè)的尾)中發(fā)生突變時(shí)，類(lèi)似的融合增強(qiáng)出現(xiàn)(Cathomen，T.等，J.Virol.72，1224-1234，1998)。因此，導(dǎo)入導(dǎo)致僅F和/或HN蛋白的胞質(zhì)尾缺失的突變可抑制顆粒形成。然而，由于許多VLP據(jù)報(bào)道以F缺陷的形式(WO 00/70070)或HN缺陷的形式(Stricker，R.andRoux，L.，J.Gen.Virol.72，1703-1707，1991)存在，尤其是在SeV中，修飾這些刺突蛋白的效果受到限制。此外，對(duì)SeV進(jìn)行以下說(shuō)明當(dāng)SeV蛋白F和HN在分泌途徑上時(shí)(具體地，當(dāng)它們位于高爾基體中時(shí)等)，胞質(zhì)尾(F和HN蛋白的)與M蛋白結(jié)合(Sanderson，C.M.等，J.Virol.67，651-663，1993；Sanderson，C.M.等，J.Virol.68，69-76，1994)。因此，認(rèn)為該結(jié)合對(duì)有效地將M蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜脂筏(病毒粒子在其中形成)中很重要。認(rèn)為所述M蛋白與胞質(zhì)中的F和HN蛋白結(jié)合，并導(dǎo)致通過(guò)F和HN分泌途徑轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜。如上述，M蛋白在病毒顆粒形成中起重要作用。使用修飾的M蛋白基因(其消除M蛋白在細(xì)胞表面的聚集)可產(chǎn)生不具有病毒粒子形成能力的載體。
M蛋白的亞細(xì)胞定位可通過(guò)細(xì)胞分級(jí)測(cè)定，或者使用免疫染色直接檢測(cè)M蛋白的定位。在免疫染色中，例如，由熒光標(biāo)記抗體染色的M蛋白可在共聚焦激光顯微鏡下觀察?？蛇x地，細(xì)胞被裂解后，可通過(guò)使用已知的細(xì)胞分級(jí)法制備細(xì)胞級(jí)分，并且可隨后通過(guò)使用例如免疫沉淀或Western印跡，利用M蛋白抗體，通過(guò)鑒定含M蛋白的級(jí)分來(lái)進(jìn)行定位。病毒粒子在所謂的細(xì)胞膜脂筏中形成，即不溶于非離子清潔劑例如Triton X-100的脂質(zhì)片段。由于M蛋白結(jié)合刺突蛋白R(shí)NP，以及M蛋白本身，且進(jìn)一步結(jié)合脂質(zhì)的能力，據(jù)信其參與病毒成分在脂筏中的聚集。因此，推定M蛋白(通過(guò)電泳利用脂筏片段檢測(cè))反映了聚集的M蛋白。即，當(dāng)可檢測(cè)到的M蛋白的量降低時(shí)，細(xì)胞表面的M蛋白聚集也降低。M蛋白在細(xì)胞表面的聚集可使用本發(fā)明人用來(lái)檢測(cè)亞細(xì)胞定位的免疫細(xì)胞學(xué)染色法直接觀察。該方法利用了可用于免疫細(xì)胞學(xué)染色的抗M抗體。使用該方法進(jìn)行研究時(shí)，當(dāng)M蛋白聚集時(shí)，在細(xì)胞膜附近觀察到非常濃的圖像。當(dāng)M蛋白不發(fā)生聚集時(shí)，既沒(méi)有可檢測(cè)到的濃縮模式，也沒(méi)有細(xì)胞膜的清晰輪廓。因此，當(dāng)檢測(cè)到很少的或沒(méi)有檢測(cè)到濃縮模式，細(xì)胞膜輪廓不清楚，且通過(guò)細(xì)胞質(zhì)可觀察到淺的染色時(shí)，細(xì)胞表面M蛋白聚集被認(rèn)為降低。
具有顯著降低的細(xì)胞表面聚集活性的突變M蛋白與野生型M蛋白相比，被認(rèn)為具有顯著更低的顆粒形成能力。病毒中顆粒形成能力降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(例如，在顯著水平為5％或更低時(shí))。通過(guò)使用例如Student t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。包含突變M基因的病毒載體在宿主內(nèi)環(huán)境中的顆粒形成能力被降低到優(yōu)選1/5以下的水平，更優(yōu)選1/10以下，更優(yōu)選1/30以下，更優(yōu)選1/50以下，更優(yōu)選1/100以下，更優(yōu)選1/300以下，且更優(yōu)選1/500以下的水平。最優(yōu)選，本發(fā)明的載體在宿主內(nèi)環(huán)境中基本缺乏病毒載體產(chǎn)生能力。術(shù)語(yǔ)“基本缺乏“指在宿主內(nèi)環(huán)境中沒(méi)有檢測(cè)到病毒顆粒的產(chǎn)生。在這種情況下，存在的病毒顆粒濃度為103/ml以下，優(yōu)選102/ml以下，更優(yōu)選101/ml以下。
病毒顆粒的存在可通過(guò)在電子顯微鏡等下觀察直接證實(shí)。可選地，可使用病毒核酸或蛋白作為指示物來(lái)檢測(cè)或定量它們。例如，病毒顆粒中的基因組核酸可以通過(guò)常用的核酸檢測(cè)法例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)檢測(cè)和定量?？蛇x地，包含異源基因的病毒顆?？梢酝ㄟ^(guò)將其感染到細(xì)胞中并檢測(cè)該基因的表達(dá)來(lái)定量。非感染性病毒顆?？梢酝ㄟ^(guò)利用轉(zhuǎn)染劑將所述顆粒導(dǎo)入細(xì)胞以后檢測(cè)基因表達(dá)來(lái)定量。本發(fā)明的病毒顆粒包含沒(méi)有感染性的顆粒，例如VLP。
此外，病毒的效力可通過(guò)例如測(cè)定細(xì)胞感染單位(CIU)或凝血活性(HA)(WO 00/70070；Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996；Yonemitsu，Y.andKaneda，Y.，“Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene deliveryto vascular cells.”，Ed.by Baker，A.H.，Molecular Biology of Vascular Diseases.Methods in Molecular Medicine.，Humana Press.，295-306，1999)來(lái)測(cè)定。對(duì)于用標(biāo)記基因例如GFP基因標(biāo)記的載體，可使用該標(biāo)記作為標(biāo)志物(例如作為GFP-CIU)通過(guò)直接計(jì)數(shù)感染的細(xì)胞來(lái)定量病毒滴度，如實(shí)施例所述。由此測(cè)定的滴度可認(rèn)為與CIU相等(WO 00/70070)。例如，當(dāng)細(xì)胞被包含病毒顆粒的樣品轉(zhuǎn)染時(shí)，病毒顆粒產(chǎn)生力的喪失可以通過(guò)缺乏可檢測(cè)的感染力滴度來(lái)證實(shí)。沒(méi)有感染力的病毒顆粒(VLP)可通過(guò)使用脂轉(zhuǎn)染劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染來(lái)檢測(cè)。具體地，例如可使用DOSPER脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑(Roche，Basel，Switzerland；Cat.No.1811169)。100毫升具有或不具有病毒顆粒的溶液可以和12.5μlDOSPER混合，并在室溫保持10分鐘?；旌衔锩?5分鐘振搖一次，并轉(zhuǎn)染到在6孔板上培養(yǎng)到滿底的細(xì)胞。VLP在轉(zhuǎn)染后第二天可以通過(guò)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存在或缺失來(lái)檢測(cè)。
術(shù)語(yǔ)“宿主內(nèi)環(huán)境”指宿主內(nèi)的環(huán)境，其中野生型副粘病毒(所述載體來(lái)自該病毒)，通常自然增值，或者指允許等同的病毒增殖的環(huán)境。宿主內(nèi)環(huán)境可以是，例如，病毒的最佳生長(zhǎng)條件。當(dāng)副粘病毒的宿主是哺乳動(dòng)物時(shí)，宿主內(nèi)環(huán)境指哺乳動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境，或者其等同環(huán)境。即，溫度大約37℃-38℃(例如，37℃)，對(duì)應(yīng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的溫度。體內(nèi)條件的實(shí)例包括正常細(xì)胞培養(yǎng)條件，更具體為在潮濕環(huán)境中，含有或不含血清的培養(yǎng)基中(pH6.5 to 7.5)，37℃，5％CO2。
由于環(huán)境條件導(dǎo)致的修飾M蛋白的活性中的重要差異包括M蛋白的條件突變，例如溫度敏感的突變。術(shù)語(yǔ)“條件突變”指在宿主內(nèi)環(huán)境中顯示“功能喪失”的突變后基因型，而在另一種環(huán)境中顯示功能活性的突變。例如，可優(yōu)選使用編碼溫度敏感突變M蛋白的基因，其大部分或全部功能在37℃喪失但在較低溫度下恢復(fù)。術(shù)語(yǔ)“溫度敏感的突變”指其活性在高溫(例如37℃)比在低溫(例如32℃)顯著降低的突變。本發(fā)明人使用M蛋白的溫度敏感突變體成功制備了其顆粒形成能力在37℃(該溫度對(duì)應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境)大大降低的病毒顆粒。該M蛋白突變體在低溫條件(例如，32℃)在細(xì)胞表面發(fā)生聚集；然而，在宿主的正常體溫(37℃)，該蛋白喪失聚合力且不能形成病毒顆粒。在基因組中包含編碼這種溫度敏感的M蛋白突變體的核酸的載體優(yōu)選作為本發(fā)明的載體。這種病毒載體的M蛋白編碼條件突變的M蛋白，所述條件突變M蛋白在M蛋白功能的條件，即容許條件下發(fā)揮其功能以形成病毒顆粒。當(dāng)以這種方式產(chǎn)生的病毒顆粒在正常環(huán)境中被感染時(shí)，M蛋白不能起作用，因此沒(méi)有顆粒形成。
溫度敏感的M基因突變沒(méi)有特別的限制，但其包括例如至少一個(gè)選自以下的氨基酸位點(diǎn)仙臺(tái)病毒M蛋白的G69，T116，和A118，優(yōu)選具有兩個(gè)選自其中的位點(diǎn)，并更優(yōu)選具有所述所有三個(gè)位點(diǎn)。包含同源突變的其它(-)鏈RNA病毒M蛋白也可適宜地使用。本文中，G69指M蛋白中的第69個(gè)氨基酸即甘氨酸，T116指M蛋白中的第116個(gè)氨基酸即蘇氨酸，且A183指M蛋白中的第183個(gè)氨基酸即丙氨酸。
編碼M蛋白的基因(即M基因)在(-)鏈RNA病毒中廣泛保守，并已知與病毒核殼及包膜蛋白相互作用(Garoff，H.等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62，117-190，1998)。SeV M蛋白的氨基酸序列104-119(104-KACTDLRITVRRTVRA-119/SEQ ID NO45)推定形成α-螺旋，并鑒定為病毒顆粒形成的重要區(qū)域(Mottet，G.等，J.Gen.Virol.80，2977-2986，1999)。該區(qū)域在(-)鏈RNA病毒中廣泛保守。M蛋白氨基酸序列在(-)鏈RNA病毒中相似。具體地，術(shù)語(yǔ)副粘病毒亞科的病毒中已知的M蛋白通常是具有330-380個(gè)氨基酸殘基的蛋白。它們的結(jié)構(gòu)在整個(gè)區(qū)域是相似的，但C末端的那一半具有特別高的同源性(Gould，A.R.，Virus Res.43，17-31，1996；Harcourt，B.H.等，Virology 271，334-349，2000)。因此，例如與SeV M蛋白的G69，T116和A183同源的氨基酸可輕易鑒定。
對(duì)應(yīng)SeV M蛋白的G69，T116和A183的其它(-)鏈RNA病毒M蛋白的同源位點(diǎn)上的氨基酸殘基可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員利用包括比對(duì)形成功能的氨基酸序列同源性搜索程序例如BLAST或比對(duì)形成程序例如CLUSTAL W，通過(guò)與SeV M蛋白進(jìn)行比對(duì)而鑒定。對(duì)應(yīng)SeV M蛋白中的G69的M蛋白同源位點(diǎn)包括人副流病毒-1(HPIV-1)中的G68；人副流感病毒-3(HPIV-3)；海豹瘟熱病毒(PDV)中和犬瘟熱病毒(CDV)的G70；海豚麻疹病毒(DMV)中的G71；小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)中的G70；亨德拉病毒(Hendra)和立百病毒(Nipah)中的G81；人副流感病毒-2(HPIV-2)中的G70；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)中的E47；和腮腺炎病毒(Mumps)中的E72。(括號(hào)中的描述表示簡(jiǎn)稱(chēng)；字母和數(shù)字表示氨基酸和位置)。對(duì)應(yīng)SeV M蛋白中的T116的M蛋白同源位點(diǎn)包括人副流感病毒-1(HPIV-1)中的T116；人副流感病毒-3(HPIV-3)中的T120；海豹瘟熱病毒(PDV)和犬瘟熱病毒(CDV)中的T104；海豚麻疹病毒(DMV)中的T105；小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)中的T104；亨德拉病毒(Hendra)和立百病毒(Nipah)中的T120；人副流感病毒-2(HPIV-2)和猴副流感病毒5(SV5)中的T117；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)中的T121；腮腺炎病毒(Mumps)中的T119；和新城疫病毒(NDV)中的S120。對(duì)應(yīng)SeV M蛋白中的A183的M蛋白同源位點(diǎn)是人副流感病毒-1(HPIV-1)中的A183；人副流感病毒-3(HPIV-3)中的F187；海豹瘟熱病毒(PDV)和犬瘟熱病毒(CDV)中的Y171；海豚麻疹病毒(DMV)中的Y172；小反芻獸疫病毒(PDPR)，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)中的Y171；亨德拉病毒(Hendra)和立百病毒(Nipah)中的Y187；人副流感病毒-2(HPIV-2)中的Y184；猴副流感病毒5(SV5)中的F184；人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)中的F188；腮腺炎病毒(Mumps)中的F186；和新城疫病毒(NDV)中的Y187。在上述病毒中，適合用于本發(fā)明的病毒包括含有編碼M蛋白突變體的基因組的那些病毒，其中的氨基酸殘基在上述三個(gè)位點(diǎn)之一被取代，優(yōu)選在這三個(gè)位點(diǎn)中任意兩個(gè)被取代，且更優(yōu)選在所有三個(gè)位點(diǎn)被取代。
氨基酸突變包括任何其它理想氨基酸的突變。然而，優(yōu)選用其側(cè)鏈具有不同化學(xué)性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸可分組為堿性氨基酸(例如，賴(lài)氨酸，精氨酸，組氨酸)；酸性氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)；不帶電的極性氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)；非極性氨基酸(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)；分枝氨基酸(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)；和芳香氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。屬于特定氨基酸組的一種氨基酸殘基可用屬于不同組的另一種氨基酸取代。具體例子包括但不限于用堿性氨基酸取代酸性或中性氨基酸；用極性氨基酸取代非極性氨基酸；用分子量大于20中天然存在的氨基酸的平均分子量的氨基酸取代分子量小于上述平均值的氨基酸；以及反過(guò)來(lái)，用分子量小于該平均值的氨基酸取代分子量大于該平均值的氨基酸。例如，可適宜地使用包含選自G69E，T116A，和A183S的突變的仙臺(tái)病毒M蛋白或包含預(yù)期同源位置突變的其它副粘病毒M蛋白。本文中，G69E指其中第68位M蛋白氨基酸甘氨酸被谷氨酸取代的突變，T116A指其中第116位M蛋白氨基酸蘇氨酸被丙氨酸取代的突變，而A183S指其中第183位M蛋白氨基酸丙氨酸被絲氨酸取代的突變。換言之，仙臺(tái)病毒M蛋白中的G69，T116和A183以及其它病毒中的同源M蛋白位點(diǎn)可分別由谷氨酸(E)，丙氨酸(A)，和絲氨酸取代。這些突變優(yōu)選聯(lián)合利用，且尤其優(yōu)選包含所有上述三種突變。M基因誘變可根據(jù)已知的誘變方法進(jìn)行。例如，如實(shí)施例所述，可使用含有理想突變的寡核苷酸導(dǎo)入突變。
例如對(duì)麻疹病毒而言，可以用溫度敏感株P(guān)253-505的M基因序列(其中抗M蛋白單克隆抗體的表位序列已經(jīng)改變)(Morikawa，Y.等，Kitasato Arch.Exp.Med.64，15-30，1991)。此外，麻疹病毒M蛋白的104位殘基蘇氨酸，或者腮腺炎病毒M蛋白的119位殘基蘇氨酸(上述殘基對(duì)應(yīng)SeV M蛋白的116位殘基蘇氨酸)，可以用任何氨基酸(例如丙氨酸)取代。
根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的載體包含M基因缺陷。術(shù)語(yǔ)“M基因缺陷”指缺乏M蛋白功能，包括載體具有包含功能缺陷突變的M基因的情況，以及M基因從載體中缺失的情況。功能缺陷的M基因突變可以通過(guò)例如缺失M基因蛋白編碼序列，或者插入另一序列而產(chǎn)生。例如，可通過(guò)將終止密碼子插入M蛋白編碼序列當(dāng)中(WO 00/09700)。更優(yōu)選，本發(fā)明的載體完全缺乏M蛋白編碼序列。和編碼條件突變M蛋白的載體不同，沒(méi)有M蛋白開(kāi)放閱讀框架(ORF)載體在任何條件下都不能產(chǎn)生病毒顆粒。
為了制備本發(fā)明的載體，在RNP(其包含副粘病毒基因組RNA)重構(gòu)所需的病毒蛋白即N，P和L蛋白存在下，對(duì)編碼副粘病毒基因組RNA的cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。病毒RNP可以通過(guò)形成負(fù)鏈基因組(即與病毒基因組相同的反義鏈)或者正鏈(編碼病毒蛋白的有義鏈)而進(jìn)行重構(gòu)。為提高重構(gòu)效率，優(yōu)選形成正鏈。RNA末端的3’前導(dǎo)序列和5’尾隨序列優(yōu)選盡可能精確地反映天然病毒基因組。為精確控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’末端，可將T7 RNA聚合酶識(shí)別序列用作轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)來(lái)在細(xì)胞中表達(dá)RNA聚合酶。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物地3’末端可以通過(guò)如下方法控制例如將自主切割型核酶編碼到所述3’末端來(lái)保證其被精確地切斷(Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997；Kato，A.等，EMBO J.16，578-587，1997；Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466，1997)。
將異源基因插入cDNA的克隆位點(diǎn)可以被設(shè)計(jì)成使得促進(jìn)異源基因的插入。所述位點(diǎn)可以插入基因組的蛋白非編碼區(qū)的任何優(yōu)選位置。具體地，所述位點(diǎn)可以被插入3’前導(dǎo)區(qū)和最接近3’末端的病毒蛋白ORF之間，插入病毒蛋白ORF之間，和/或插入最接近5’末端和5’尾隨區(qū)的病毒蛋白ORF之間。在M基因缺陷型基因組中，所述克隆位點(diǎn)可被設(shè)計(jì)成位于M基因的缺失位點(diǎn)。所述克隆位點(diǎn)可以是，例如限制性酶的識(shí)別序列。所述克隆位點(diǎn)可以是包含大量限制性酶識(shí)別序列的所謂多克隆位點(diǎn)。該克隆位點(diǎn)可以分別存在與基因組的多個(gè)位點(diǎn)上，從而可將大量異源基因插入基因組的不同位置。
缺乏顆粒形成能力的重組病毒RNP可以根據(jù)例如“Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997”，“Kato，A.等，EMBO J.16，578-587，1997”and“Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466，1997”中的描述構(gòu)建。該方法描述如下為導(dǎo)入異源基因，首先制備包含理想異源基因的cDNA核苷酸序列的DNA樣品。所述DNA樣品優(yōu)選通過(guò)電泳鑒定為濃度為25ng/μl或以上的單質(zhì)粒。以下實(shí)施例描述了NotI位點(diǎn)在將異源基因插入編碼病毒基因組RNA的DNA中的使用如果靶cDNA序列包含NotI識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)將被預(yù)先用例如定點(diǎn)誘變的技術(shù)去除，以改變核苷酸序列，但不改變其編碼的氨基酸序列。擴(kuò)增理想基因片段，并使用PCR從該DNA樣品中回收。通過(guò)NotI位點(diǎn)附加在兩種引物的5’區(qū)，擴(kuò)增片段的兩端都成為NotI位點(diǎn)。E-I-S序列或其部分包含在引物中，使得E-I-S序列位于病毒基因兩側(cè)的ORF之間以及異源基因(將其并入病毒基因組之后)的ORF之間。
例如，為保證NotI進(jìn)行切割，正向側(cè)(forward side)合成DNA序列如下在其5’側(cè)任意選擇兩個(gè)或更多核苷酸(優(yōu)選四個(gè)核苷酸，不包括例如GCG和GCC這樣來(lái)自NotI識(shí)別位點(diǎn)的序列；更優(yōu)選ACTT)，并且將NotI識(shí)別位點(diǎn)“gcggccgc”加入其3’側(cè)。此外，間隔序列(9個(gè)任意核苷酸，或者9＝+6的倍數(shù)個(gè)核苷酸)，和ORF(大約25個(gè)核苷酸并包含理想cDNA的起始密碼子ATG的序列)也被加到3’側(cè)。優(yōu)選從理想cDNA選擇大約25個(gè)核苷酸，使得G或C成為正向側(cè)合成寡DNA的3’末端最后的核苷酸。
反向側(cè)合成DNA序列如下從5’側(cè)選擇兩或多個(gè)任意核苷酸(優(yōu)選四個(gè)核苷酸，不包括例如GCG和GCC這樣來(lái)自NotI識(shí)別位點(diǎn)的序列；更優(yōu)選ACTT)，并且將NotI識(shí)別位點(diǎn)“gcggccgc”加入其3’側(cè)并且進(jìn)一步將寡DNA插入片段加在3’末端以調(diào)節(jié)長(zhǎng)度。該寡DNA的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)成使得最終PCR擴(kuò)增的NotI片段產(chǎn)物(包含E-I-S序列)的核苷酸數(shù)目是6的倍數(shù)(所謂的“6倍規(guī)則”；Kolakofski，D.等，J.Virol.72，891-899，1998；Calain，P.andRoux，L.，J.Virol.67，4822-4830，1993；Calain，P.and Roux，L.，J.Virol.67，4822-4830，1993)。與仙臺(tái)病毒S序列互不的序列，優(yōu)選5’-CTTTCACCCT-3’(SEQ ID NO8)，與I序列互補(bǔ)的序列，優(yōu)選5’-AAG-3’，以及與E序列互補(bǔ)的序列，優(yōu)選5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID NO9)，進(jìn)一步加入插入的寡DNA片段的3’側(cè)。當(dāng)使用加入了E-I-S序列的這些引物時(shí)，反向側(cè)合成DNA的3’末端通過(guò)加入互補(bǔ)序列形成，所述互補(bǔ)序列相當(dāng)于大約25個(gè)核苷酸(從理想cDNA的終止密碼子逆向計(jì)數(shù))，且選擇其長(zhǎng)度使得G或C成為最后的核苷酸。
可根據(jù)常用方法使用Taq聚合酶等進(jìn)行PCR。如此擴(kuò)增的理想片段用NotI消化，并隨后插入質(zhì)粒載體pBluescript中的NotI位點(diǎn)。由此獲得的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列可使用測(cè)序儀證實(shí)，以選擇包含正確序列的質(zhì)粒。插入的片段用NotI從質(zhì)粒中切下，并克隆到攜帶基因組cDNA的質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)中?？蛇x地，重組仙臺(tái)病毒cDNA可以通過(guò)將所述片段直接插入NotI位點(diǎn)獲得，而無(wú)需質(zhì)粒載體的介導(dǎo)。
例如，重組仙臺(tái)病毒基因組cDNA可根據(jù)參考文獻(xiàn)中的描述構(gòu)建(Yu，D.等，Genes Cells 2，457-466，1997；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997)。例如將包含NotI限制位點(diǎn)(5′-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3′)(SEQ ID NO10)18-bp的間隔序列插入克隆的仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV(+))的前導(dǎo)序列和N蛋白的ORF之間，并由此獲得了含有來(lái)自丁型肝炎病毒反基因組鏈的自主切割核酶位點(diǎn)的質(zhì)粒pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，J.General Virology 78，2813-2820，1997)。
此外，例如在M基因缺失的情況下，或者導(dǎo)入溫度敏感性突變的情況下，編碼基因組RNA的cDNA用限制性酶消化，并且包含M基因的片段被收集并克隆到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒中。M基因誘變或M基因缺陷位點(diǎn)的構(gòu)建使用這種質(zhì)粒進(jìn)行。突變的導(dǎo)入可以通過(guò)例如使用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)根據(jù)試劑盒說(shuō)明中的方法進(jìn)行。例如，M基因缺陷或缺失可以通過(guò)使用聯(lián)合的PCR連接方法進(jìn)行，從而可實(shí)現(xiàn)M基因ORF的全部或部分缺失，以及與適當(dāng)間隔序列的連接。獲得M基因突變的或缺陷型序列后，回收包含所述序列的片段，并且原來(lái)全長(zhǎng)cDNA中的M基因區(qū)由該序列取代。因此，可產(chǎn)生包含M基因的病毒基因組cDNA。使用類(lèi)似的方法，可將突變導(dǎo)入例如F和/或HN基因。
本發(fā)明的載體可通過(guò)在病毒蛋白存在下于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼基因組RNA的DNA進(jìn)行重構(gòu)。本發(fā)明提供編碼本發(fā)明載體的病毒基因組RNA的DNA，其可用于制備本發(fā)明的載體。此外，本發(fā)明還涉及編碼該載體基因組RNA的DNA在制備本發(fā)明載體中的用途。從(-)鏈病毒基因組cDNA進(jìn)行病毒重構(gòu)可使用已知的方法進(jìn)行(WO 97/16539；WO 97/16538；Durbin，A.P.等，Virology 235，323-332，1997；Whelan，S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，8388-8392，1995；Schnell.M.J.等，EMBO J.13，4195-4203，1994；Radecke，F(xiàn).等，EMBO J.14，5773-5784，1995；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，4477-4481，1995；Garcin，D.等，EMBO J.14，6087-6094，1995；Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996；Baron，M.D.and Barrett，T.，J.Virol.71，1265-1271，1997；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，15400-15404，1996)。使用這些方法，(-)鏈RNA病毒或作為病毒成分的RNP可從其DNA重構(gòu)，所述病毒包括例如副流感病毒，皰疹性口炎病毒，狂犬病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒，仙臺(tái)病毒等。本發(fā)明的載體可以根據(jù)這些方法重構(gòu)。
具體地，本發(fā)明的載體可以通過(guò)以下步驟產(chǎn)生(a)在表達(dá)N，P和L蛋白的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄cDNA，所述cDNA編碼副粘病毒基因組RNA(負(fù)鏈RNA)或其互補(bǔ)鏈(正鏈)；和(b)從所述細(xì)胞或其培養(yǎng)物上清中收集包含基因組RNA的復(fù)合物。轉(zhuǎn)錄的基因組RNA在N，L，和P蛋白存在下進(jìn)行復(fù)制以形成RNP復(fù)合物。當(dāng)步驟(a)在所述基因組編碼的切割修飾的F蛋白存在下進(jìn)行時(shí)，產(chǎn)生的RNP被轉(zhuǎn)移到與所述細(xì)胞接觸的細(xì)胞，感染擴(kuò)散，并且載體被擴(kuò)增。根據(jù)該方法，即使不存在功能M蛋白，本發(fā)明的載體也可以以RNP的形式產(chǎn)生。
起始從DNA中轉(zhuǎn)錄基因組RNA所需的酶，例如T7 RNA聚合酶，可通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)所述酶的質(zhì)?；虿《据d體而提供?？蛇x地，所述酶可通過(guò)將其基因并入細(xì)胞染色體中提供，以在病毒重構(gòu)中誘導(dǎo)表達(dá)。此外，提供了基因組RNA和載體重構(gòu)所需的病毒蛋白，例如通過(guò)導(dǎo)入表達(dá)這些蛋白的質(zhì)粒。為提供這些病毒蛋白，可用輔助病毒例如野生型副粘病毒或者特定的突變副粘病毒。然而，由于這會(huì)導(dǎo)致這些病毒造成的污染，輔助病毒并不優(yōu)選使用。
將表達(dá)基因組RNA的DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法包括，例如，以下方法1)制備可由目標(biāo)細(xì)胞吸收的DNA沉淀的方法；2)制備具有的細(xì)胞毒活性并可被靶細(xì)胞吸收的含正電荷DNA的復(fù)合物的方法；和3)使用電脈沖瞬間開(kāi)放靶細(xì)胞膜中的孔，使得DNA分子可通過(guò)的方法。
在上述方法2)中，可用多種轉(zhuǎn)染試劑，實(shí)例包括DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)等。方法1)的實(shí)例時(shí)使用磷酸鈣進(jìn)行轉(zhuǎn)染的方法，其中進(jìn)入細(xì)胞的DNA并入吞噬體，但也以足夠的量并入細(xì)胞核中(Graham，F(xiàn).L.and Van Der Eb，J.，Virology 52，456，1973；Wigler，M.and Silverstein，S.，Cell 11，223，1977)。Chen和Okayama已經(jīng)研究如何優(yōu)化該轉(zhuǎn)移技術(shù)，并報(bào)道可在如下條件獲得最佳沉淀1)在含2％-4％CO2的空氣中，在35℃將細(xì)胞和共沉淀物一同溫育15-24小時(shí)；2)使用比線形DNA具有更高活性的環(huán)狀DNA；和3)沉淀混合物中DNA的濃度是20-30μg/ml(Chen，C.and Okayama，H.，Mol.Cell.Biol.7，2745，1987)。方法2)適合瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在過(guò)去的已知方法中以理想的DNA濃度比例制備DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885，M.W.5×105)混合物，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于許多復(fù)合物都在內(nèi)體中分解，加入氯奎以增強(qiáng)結(jié)果(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，3015，1983)。方法3)指電穿孔，并且比方法1)和2)更多變，這是因?yàn)樗簧婕凹?xì)胞敏感性。方法3)據(jù)稱(chēng)在脈沖電流持續(xù)期，脈沖形狀，電場(chǎng)(電極之間的間隙，伏特)強(qiáng)度，緩沖液導(dǎo)電性，DNA濃度以及細(xì)胞密度的最理想條件下有效。
上述三類(lèi)中，方法2)容易操作，并簡(jiǎn)化使用大量細(xì)胞的很多試驗(yàn)樣品的檢驗(yàn)。因此轉(zhuǎn)染劑適合將DNA導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行載體重構(gòu)的情況。優(yōu)選，使用Superfect轉(zhuǎn)染劑(QIAGEN，Cat.No.301305)或DOSPER脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑(Roche，Cat.No.1811169)，但所述轉(zhuǎn)染劑不限于此。
具體地，從cDNA重構(gòu)病毒載體可例如如下進(jìn)行在24孔到6孔塑料培養(yǎng)板或直徑100mm的培養(yǎng)盤(pán)中將猴腎來(lái)源的LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)到100％滿底，使用含有10％胎牛血清(FCS)和抗生物素(100單位/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)。這些細(xì)胞隨后例如以2 PFU/細(xì)胞用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3感染。該病毒已經(jīng)在1μg/ml補(bǔ)骨脂素(psoralen)存在下，用UV照射處理20分鐘而滅活(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986；Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)。加入的補(bǔ)骨脂素的量以及UV照射的時(shí)間可以適當(dāng)調(diào)節(jié)。感染一小時(shí)后，可通過(guò)脂轉(zhuǎn)染法等用2μg-60μg，更優(yōu)選3μg-20μg，上述編碼重組仙臺(tái)病毒基因組RNA的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這種方法使用Superfect(QIAGEN)，并使用表達(dá)產(chǎn)生病毒RNP所需的反式激活病毒蛋白的幾種質(zhì)粒(0.5μg-24μg的pGEM-N，0.25μg-12μg的pGEM-P和0.5μg-24μg的pGEM-L)(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)。編碼N，P，和L的表達(dá)載體的比例優(yōu)選為2∶1∶2。質(zhì)粒的量被適宜調(diào)節(jié)到，例如1μg-4μg的pGEM-N，0.5μg-2μg的pGEM-P，和1μg-4μg的pGEM-L。
轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在無(wú)血清MEM(如需要含100μg/ml的利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)，更優(yōu)選僅含40μg/ml的阿糖胞苷(AraC)(Sigma))中培養(yǎng)。試劑濃度可優(yōu)化成使得痘苗病毒導(dǎo)致的細(xì)胞毒活性最小化，以及病毒回收率最大化(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)。轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)細(xì)胞約48小時(shí)到約72小時(shí)，然后重復(fù)三次冷凍并融化循環(huán)破壞所述細(xì)胞。LLC-MK2用破壞的細(xì)胞再轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行培養(yǎng)。RNP可以作為與例如脂轉(zhuǎn)染胺試劑以及聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體的形成的復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞。具體地，可利用多種脂轉(zhuǎn)染試劑。這些試劑的實(shí)例有DOTMA(Roche)，Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche#1811169)等。可加入氯奎以防止RNP再內(nèi)體中分解(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，3015，1983)。在RNP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，從RNP表達(dá)病毒基因并復(fù)制RNP的步驟后，接著擴(kuò)增該載體。通過(guò)稀釋獲得的細(xì)胞裂解物并重復(fù)擴(kuò)增，痘苗病毒vTF7-3可被完全去除?？芍貜?fù)再擴(kuò)增，例如重復(fù)3次或以上。獲得的RNP保存在-80℃。
用于重構(gòu)的宿主細(xì)胞不受限制，只要病毒載體可被重構(gòu)即可。例如，在重構(gòu)仙臺(tái)病毒載體時(shí)，可使用猴腎來(lái)源的LLC-MK2細(xì)胞和CV-1細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞例如倉(cāng)鼠腎來(lái)源的BHK細(xì)胞，人來(lái)源的細(xì)胞等。通過(guò)在這些細(xì)胞中表達(dá)適宜的包膜蛋白，可獲得包膜中包含該蛋白的感染性病毒粒子。
當(dāng)病毒基因組中的M基因缺陷或缺失時(shí)，這種病毒感染的細(xì)胞不形成病毒顆粒。因此，盡管通過(guò)上述方法本發(fā)明的載體可制備成RNP或包含RNP的細(xì)胞， 在細(xì)胞中增殖的RNP僅轉(zhuǎn)送到接觸細(xì)胞中。因此，轉(zhuǎn)染慢慢擴(kuò)散，導(dǎo)致難以以高低度產(chǎn)生大量病毒載體。本發(fā)明提供將本發(fā)明載體制備成病毒顆粒的方法。溶液中的病毒顆粒比RNP更穩(wěn)定。此外，通過(guò)使病毒顆粒具有感染性，載體可以通過(guò)簡(jiǎn)單接觸而無(wú)需轉(zhuǎn)染劑而導(dǎo)入靶細(xì)胞中。因此，病毒顆粒在工業(yè)應(yīng)用中尤其有用。作為將本發(fā)明的載體制備成病毒顆粒的方法，使用包含具有條件突變的M基因的病毒基因組在容許條件下重構(gòu)所述病毒。具體地，通過(guò)在容許條件下培養(yǎng)由上述步驟(a)或步驟(a)和(b)獲得的復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，使M蛋白發(fā)揮功能形成顆粒。產(chǎn)生包含編碼具有條件突變的突變M蛋白的基因組RNA的病毒顆粒的方法包括以下步驟(i)在細(xì)胞內(nèi)突變M蛋白的容許條件下，擴(kuò)增包含副粘病毒N，P，和L蛋白和基因組RNA的RNP；和(ii)收集釋放到細(xì)胞培養(yǎng)物上清的病毒顆粒。例如溫度敏感突變M蛋白可以在其容許溫度下培養(yǎng)。
另一種將本發(fā)明的載體制備成病毒顆粒的方法使用表達(dá)M蛋白的輔助細(xì)胞。通過(guò)使用M輔助細(xì)胞，本發(fā)明人將一種載體制備成病毒顆粒，所述載體中F蛋白的切割位點(diǎn)被修飾成被另一種蛋白酶切割的序列，且M基因突變或缺失。由于本發(fā)明的方法不需要輔助病毒，例如野生型副粘病毒，不產(chǎn)生具有顆粒形成能力的含M基因的病毒。因此，本發(fā)明的載體可制備成純的形式。本發(fā)明提供了一種病毒顆粒，其包含(i)副粘病毒基因組RNA，其中(a)編碼M蛋白的核酸被突變或缺失，并(b)編碼了修飾的F蛋白，其切割位點(diǎn)序列被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，且所述病毒顆粒還(1)具有在由所述病毒顆粒感染的細(xì)胞中復(fù)制基因組RNA的能力；(2)在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生顯示明顯降低或消除；和(3)在所述蛋白酶存在下，具有將基因組RNA導(dǎo)入與用含有該基因組RNA的病毒顆粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞中的能力。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，這種病毒顆粒將不產(chǎn)生病毒顆粒。
在表達(dá)功能M蛋白的細(xì)胞中制備本發(fā)明病毒顆粒的方法，包括以下步驟(i)在表達(dá)副粘病毒的野生型M蛋白或等同的蛋白的細(xì)胞中擴(kuò)增RNP(其包含副粘病毒N，P和L蛋白和基因組RNA)；(ii)收集釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒。只要野生型M蛋白具有形成病毒顆粒的能力，其可來(lái)自非基因組RNA的來(lái)源的副粘病毒。此外，標(biāo)記肽可加到所述蛋白中，或可選地，當(dāng)其通過(guò)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體表達(dá)時(shí)，來(lái)自載體的接頭肽可加到所述蛋白上。如上述，所用蛋白不一定是野生型M蛋白本身，但可以是與野生型蛋白等同的具有病毒顆粒形成能力的蛋白。從表達(dá)M蛋白的細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒顆粒的包膜中包含這些細(xì)胞中表達(dá)的M蛋白；然而，其不包含編碼該蛋白的基因。因此，野生型M蛋白不繼續(xù)在該病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)。因此，病毒顆粒不能形成。
制備表達(dá)M蛋白的輔助細(xì)胞可如下述進(jìn)行。為制備以可誘導(dǎo)的形式表達(dá)M蛋白的載體，例如可使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或利用重組的表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)(例如Cre/loxP)。Cre/loxP可誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)?？墒褂美缳|(zhì)粒pCALNdlw構(gòu)建，所述質(zhì)?？稍O(shè)計(jì)成利用Cre DNA重組酶可誘導(dǎo)地表達(dá)基因產(chǎn)物(Arai，T.等，J.Virology 72，1115-1121，1998)。作為能夠表達(dá)M蛋白的細(xì)胞，能夠持續(xù)表達(dá)M蛋白的輔助細(xì)胞系優(yōu)選通過(guò)誘導(dǎo)導(dǎo)入其染色體中的M基因建立。例如，猴腎來(lái)源的細(xì)胞系LLC-MK2等可用作這樣的細(xì)胞。LLC-MK2細(xì)胞在含10％熱處理的固定胎牛血清(FBS)，50單位/ml青霉素G鈉和50μg/ml鏈霉素的MEM中，在37℃，含5％的CO2的大氣中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)已知的方案，上述被設(shè)計(jì)成利用Cre DNA重組酶可誘導(dǎo)地表達(dá)M基因產(chǎn)物的質(zhì)粒用磷酸鈣法(哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene))導(dǎo)入LLC-MK2細(xì)胞。
例如，10μg M-表達(dá)質(zhì)?？梢詫?dǎo)入在10cm的板中長(zhǎng)成40％滿底的LLC-MK2細(xì)胞中。這些細(xì)胞隨后在37℃的孵箱中，于含10％FBS的10ml的MEM中以及5％的CO2下孵育。孵育24小時(shí)后，收集細(xì)胞并懸于10ml培養(yǎng)基中。所述懸液隨后加在5個(gè)直徑10cm的皿中將5ml懸液加在一個(gè)皿中，以2ml/皿加入兩個(gè)皿中，及0.2ml/皿加入兩個(gè)皿中。每個(gè)皿中的細(xì)胞在含10％FBS和1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)的10ml MEM中培養(yǎng)14天；每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)基。因此，選擇其中基因被穩(wěn)定導(dǎo)入的細(xì)胞系。使用克隆環(huán)收集培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的G418-抗性細(xì)胞。收集的每種克隆的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)到鋪滿10cm的板。
輔助細(xì)胞中M蛋白高表達(dá)水平對(duì)于回收高滴毒病毒是重要的。為此，例如上述對(duì)M-表達(dá)細(xì)胞的選擇優(yōu)選進(jìn)行兩次或更多。例如，轉(zhuǎn)染包含藥物抗性標(biāo)記基因的M-表達(dá)質(zhì)粒，且使用藥物選擇包含M基因的細(xì)胞。隨后，對(duì)特定藥物抵抗的包含標(biāo)記基因的M-表達(dá)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到相同的細(xì)胞中，并使用該第二藥物抗性基因選擇細(xì)胞。使用第二標(biāo)記的細(xì)胞選擇于第一次轉(zhuǎn)染后選出的細(xì)胞相比，很可能以更高大水平表達(dá)M蛋白。因此，通過(guò)兩次重復(fù)轉(zhuǎn)染構(gòu)建的M輔助細(xì)胞可適宜地使用。由于M輔助細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)F基因，使F和M基因都缺陷的感染性病毒顆粒的制備成為可能(WO03/025570)。因此，也建議對(duì)表達(dá)F基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩次以上，以升高F蛋白表達(dá)誘導(dǎo)的水平。本文所述修飾的F蛋白的基因可用作F基因。
M蛋白誘導(dǎo)表達(dá)可通過(guò)將孵育細(xì)胞到鋪滿6cm的皿而獲得，且隨后，例如使用腺病毒AxCANCre以MOI＝～3感染這些細(xì)胞，這是根據(jù)Saito等(Saito等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)的方法進(jìn)行的。
為使用表達(dá)野生型M蛋白或其等同蛋白(M輔助細(xì)胞)的細(xì)胞制備本發(fā)明的病毒顆粒。本發(fā)明上述RNP可導(dǎo)入這些細(xì)胞并隨后進(jìn)行培養(yǎng)。RNP可通過(guò)如下方法導(dǎo)入M輔助細(xì)胞中例如將含RNP的細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)染到M輔助細(xì)胞中，或通過(guò)產(chǎn)生RNP的細(xì)胞和M輔助細(xì)胞的共培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞融合。也可通過(guò)將基因組RNA轉(zhuǎn)錄到M輔助細(xì)胞中，并在N，P和L蛋白存在下，重新合成RNP來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明上述步驟(i)(使用M輔助細(xì)胞擴(kuò)增RNP的步驟)優(yōu)選在低溫進(jìn)行。在制備使用溫度敏感突變M蛋白的載體中，制備病毒顆粒的方法必須在容許溫度以下的溫度進(jìn)行。然而，令人吃驚地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中，當(dāng)在低溫下進(jìn)行病毒形成過(guò)程時(shí)，有效的顆粒產(chǎn)生是可能的，即使在使用野生型M蛋白的時(shí)候。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“低溫”指35℃或以下，優(yōu)選34℃或以下，更優(yōu)選33℃或以下，且最優(yōu)選32℃或以下。
根據(jù)本發(fā)明，病毒顆?？梢葬尫诺讲《井a(chǎn)生細(xì)胞的細(xì)胞外液中，例如病毒滴毒為1×105CIU/ml以上，優(yōu)選1×106CIU/ml或以上，更優(yōu)選5×106CIU/ml或以上，更優(yōu)選1×107CIU/ml或以上，更優(yōu)選5×107CIU/ml或以上，更優(yōu)選1×108CIU/ml或以上，且更優(yōu)選5×108CIU/ml或以上。所述病毒滴毒可通過(guò)說(shuō)明書(shū)或其它文獻(xiàn)中(Kiyotani，K.等，Virology 177(1)，65-74，1990；WO 00/70070)的方法測(cè)定。
從M缺陷型病毒基因組cDNA重構(gòu)重組病毒載體的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案如下。即，所述方法包含以下步驟(a)在表達(dá)形成感染性病毒顆粒所需的病毒蛋白(即NP，NP，P，L，M，F(xiàn)，和HN蛋白)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄編碼(負(fù)鏈或正鏈)基因組RNA的DNA；(b)將這些細(xì)胞與表達(dá)整合到染色體中的M基因(即M輔助細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)；(c)從該培養(yǎng)物制備細(xì)胞提取物；(d)用所述提取物轉(zhuǎn)染表達(dá)整合到染色體中的M基因(即M輔助細(xì)胞)，并培養(yǎng)這些細(xì)胞；和(e)從培養(yǎng)物上清中回收病毒顆粒。步驟(d)優(yōu)選在上述低溫條件下進(jìn)行。獲得的病毒顆?？赏ㄟ^(guò)輔助細(xì)胞的共感染進(jìn)行擴(kuò)增(優(yōu)選在低溫下)。具體地，所述病毒可根據(jù)實(shí)施例中的描述重構(gòu)?；厥盏牟《绢w?？杀幌♂?zhuān)㈦S后再次轉(zhuǎn)染到待擴(kuò)增的M輔助細(xì)胞。所述擴(kuò)增步驟可重復(fù)兩次或三次或更多次進(jìn)行。獲得的病毒株可保存在-80℃。通過(guò)測(cè)定血凝素活性(HA)可測(cè)定病毒滴度。HA可通過(guò)“終點(diǎn)稀釋法”測(cè)定。
具體地，首先，LLC-MK2細(xì)胞可以5×106細(xì)胞/皿的密度鋪在100mm的板上。當(dāng)使用T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)基因組RNA的轉(zhuǎn)錄時(shí)，細(xì)胞可培養(yǎng)24小時(shí)，并隨后在室溫用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7)以MOI＝大約2，在室溫感染1小時(shí)，所述痘苗病毒已經(jīng)用補(bǔ)骨脂素和長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線(365nm)處理了20分鐘(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)。用無(wú)血清MEM洗滌所述細(xì)胞后，分別使用表達(dá)基因組RNA的質(zhì)粒和表達(dá)副粘病毒N，P，L，F(xiàn)，和HN蛋白的質(zhì)粒，利用合適的脂轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。質(zhì)粒的比例可以是，例如6∶2∶1∶2∶2∶2，但不限于此。培養(yǎng)5小時(shí)后，用無(wú)血清MEM洗滌所述細(xì)胞兩次，并隨后在含有40μg/ml胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(cytosine-β-D-arabinofuranoside)(AraC，Sigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO-BRL，Rockville，MD)的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，所述細(xì)胞用持續(xù)表達(dá)M蛋白的細(xì)胞(M輔助細(xì)胞)以大約8.5×106細(xì)胞/皿的密度進(jìn)行覆蓋，然后在37℃，含0μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶(P0)的MEM中再培養(yǎng)兩天。收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其懸于2ml/皿的ptiMEM中。重復(fù)凍融三次后，直接將裂解物轉(zhuǎn)染到M輔助細(xì)胞，并在32℃，含40μg/mL AraC和切割F蛋白的蛋白酶(P1)的無(wú)血清MEM中培養(yǎng)。3-14天后，收集部分培養(yǎng)物上清，并用其感染剛產(chǎn)生的M輔助細(xì)胞，然后在32℃，含40μg/mL AraC和蛋白酶(P2)的無(wú)血清MEM中培養(yǎng)。3-14天后，再感染剛制備的M輔助細(xì)胞，并在存在(用于制備F-切割的病毒)或不存在(用于制備F-不切割的病毒顆粒)蛋白酶的條件下，使用無(wú)血清MEM(P3)培養(yǎng)3-7天。通過(guò)重復(fù)再擴(kuò)增3次或以上，最初使用的痘苗病毒可被完全消除。將BSA以1％的終濃度加入收集的培養(yǎng)物上清中，并保存在-80℃。
本發(fā)明的病毒顆?？梢允瞧湫揎椀腇蛋白被切割的感染性顆粒，或者可以是潛在的感染性病毒顆粒，即其初始形式不具有感染力，但經(jīng)過(guò)切割所述修飾的F蛋白的蛋白酶處理后就具有感染性。由所述基因組編碼的修飾F蛋白存在于病毒顆粒的包膜上，然而，其在未切割時(shí)缺乏感染力。這種病毒通過(guò)用切割修飾F蛋白的切割片段的蛋白酶處理而獲得感染力，或者通過(guò)在切割該F蛋白的蛋白酶存在下，與細(xì)胞或組織接觸而獲得感染力。為使用病毒生產(chǎn)細(xì)胞通過(guò)上述病毒的產(chǎn)生而獲得其修飾的F蛋白沒(méi)有被切割的病毒顆粒，病毒擴(kuò)增步驟的最后步驟可在缺乏切割修飾的F蛋白的蛋白酶下進(jìn)行。另一方面，在所述蛋白酶存在下制備該病毒使得可以產(chǎn)生具有切割的F蛋白的感染性病毒顆粒。
此外，通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)病毒顆粒產(chǎn)生過(guò)程中病毒基因組中沒(méi)有編碼的包膜蛋白，可產(chǎn)生其包膜包含該蛋白的病毒顆粒。這種包膜蛋白的一個(gè)實(shí)例是野生型F蛋白。以這種方式產(chǎn)生的病毒顆粒的基因組RNA編碼修飾的F蛋白，并且在其包膜上攜帶所述野生型F蛋白和這種修飾的蛋白。通過(guò)在病毒顆粒產(chǎn)生的步驟以反式提供野生型F蛋白并在切割該蛋白的胰蛋白酶存在下進(jìn)行擴(kuò)增，所述病毒顆粒通過(guò)切割病毒顆粒上的野生型F蛋白而成為感染性的。根據(jù)該方法，即使不用切割修飾F蛋白的蛋白酶，也可以高滴度制備感染性病毒顆粒。因此，本發(fā)明的病毒顆粒可以是包含副粘病毒野生型F蛋白的病毒顆粒。野生型F蛋白和病毒基因組不必要來(lái)自同類(lèi)型的副粘病毒，且所述野生型F蛋白可以是來(lái)自另一副粘病毒的包膜蛋白。
此外，可產(chǎn)生其包膜包含除野生型F蛋白以外的任何理想病毒包膜蛋白的病毒顆粒。具體地，在病毒重構(gòu)中，理想的包膜蛋白可以在細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生包含該包膜蛋白的病毒載體。對(duì)這些蛋白沒(méi)有特別的限制。優(yōu)選的實(shí)例包括皰疹性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本發(fā)明的病毒顆粒包括含有包膜蛋白例如VSV-G蛋白的假型病毒載體，所述蛋白來(lái)自除了基因組RNA所來(lái)源的病毒以外的病毒。對(duì)于野生型F蛋白而言，將病毒顆粒感染到細(xì)胞中后，該蛋白不從病毒載體表達(dá)，這是由于該包膜蛋白不在病毒基因組RNA中編碼。
本發(fā)明的病毒顆?？砂逗系鞍祝绨?xì)胞外區(qū)的嵌合蛋白，能在包膜表面與特定細(xì)胞結(jié)合的一或多種蛋白，例如粘附因子，配體，受體，及其抗體和片段，以及來(lái)自細(xì)胞內(nèi)區(qū)中的病毒包膜的多肽。這能產(chǎn)生感染特異性組織靶的載體。這些載體可以在病毒載體重構(gòu)期間通過(guò)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)以反式提供。具體實(shí)例包括含有可溶因子例如細(xì)胞因子的受體結(jié)合區(qū)的片段，或者細(xì)胞表面蛋白的抗體片段(WO 01/20989)。
制備具有缺陷病毒基因的載體時(shí)，可將例如兩或更多種載體類(lèi)型(每種的病毒基因組中都具有缺陷病毒基因)導(dǎo)入相同的細(xì)胞。每種缺陷病毒蛋白都隨后由另一種載體表達(dá)并提供。這種互相補(bǔ)充導(dǎo)致感染性病毒顆粒形成，且可在復(fù)制循環(huán)中擴(kuò)增病毒載體。即，當(dāng)兩或多種類(lèi)型的本發(fā)明載體聯(lián)合接種互補(bǔ)病毒蛋白時(shí)，混合病毒基因缺陷病毒載體可大規(guī)模且低成本制備。由于這些病毒缺乏病毒基因，它們的基因組比完整病毒基因組小，且它們可包含更大的異源基因。此外，由于病毒基因缺陷，這些病毒是無(wú)繁殖力的，并且在細(xì)胞外稀釋?zhuān)虼斯哺腥玖茈y在這些病毒中保持。這些載體因此是無(wú)繁殖力的，這就控制環(huán)境釋放而言是有利的。
大量病毒載體可通過(guò)上述方法將病毒載體感染到含胚雞蛋中以擴(kuò)增載體。例如，可產(chǎn)生M基因轉(zhuǎn)基因雞且載體可接種到雞蛋中進(jìn)行擴(kuò)增。使用雞蛋制備病毒載體的基本方法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)(“Shinkei-kagaku Kenkyu-noSaisentan Protocol III，Bunshi Shinkei Saibou Seirigaku(Leading edgetechniques protocol III in neuroscience research，Molecular，CellularNeurophysiology)”，edited by Nakanishi，等，KOSEISHA，Osaka，pp.153-172，1993)。具體地，例如將受精卵轉(zhuǎn)移到孵箱中，且在37℃-38℃培養(yǎng)9-12天.使胚胎生長(zhǎng)。病毒載體隨后接種到尿囊膜腔，將受精卵保溫幾天以使病毒載體增殖。隨后收集含在病毒中的尿囊液。例如培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間的培養(yǎng)條件根據(jù)擴(kuò)增的重組病毒而變化。從尿囊液中分離并純化病毒載體根據(jù)傳統(tǒng)方法進(jìn)行(“Protocols of Virology”by Masato Tashiro，edited by Nagai andIshihama，Medical View，pp.68-73，1995)。
回收的病毒載體可經(jīng)純化到基本純?？赏ㄟ^(guò)已知的純化和分離方法進(jìn)行純化，所述方法包括過(guò)濾，離心，柱層析純化等，或者其組合。本文術(shù)語(yǔ)“基本純”指作為組分的病毒載體是其所在樣品中的主要部分。通常，基本純的病毒載體可通過(guò)證實(shí)病毒來(lái)源的蛋白和樣品中總蛋白(不包括加入的作為載體或穩(wěn)定劑的蛋白)的比例是10％或以上，優(yōu)選20％或以上，更優(yōu)選50％或以上，更優(yōu)選70％或以上，更優(yōu)選80％或以上，甚至更優(yōu)選90％或以上。具體地，可純化副粘病毒，例如通過(guò)使用纖維素硫酸酯或交聯(lián)的多糖硫酸酯的方法(JP-B No.Sho 62-30752；JP-B Sho 62-33879；JP-B Sho62-30753)，，使用含硫酸海藻糖的多糖和/或其分解產(chǎn)物的方法(WO97/32010)等。
切割位點(diǎn)被修飾的M基因缺陷載體在特定蛋白酶存在下，只通過(guò)細(xì)胞融合型感染，就可將載體轉(zhuǎn)送到細(xì)胞內(nèi)。因此，本發(fā)明的載體可用于靶向表達(dá)特定蛋白酶的組織的基因治療。正常載體使得基因轉(zhuǎn)移到靶組織的表層；但它們不能穿透到組織內(nèi)部。另一方面，本發(fā)明的載體具有滲透到具有增強(qiáng)的蛋白酶活性的靶組織深處的能力。例如，本發(fā)明的載體可以通過(guò)感染到表層的載體可感染癌細(xì)胞，而被轉(zhuǎn)送到浸潤(rùn)到正常組織深處的癌細(xì)胞內(nèi)部。
本發(fā)明的載體可用于癌癥，動(dòng)脈硬化，關(guān)節(jié)疾病例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。例如，在如RA的關(guān)節(jié)疾病中，細(xì)胞外基質(zhì)降解對(duì)軟骨的較高級(jí)的結(jié)構(gòu)(higher order structure)的破壞如上述發(fā)生下去，并且關(guān)節(jié)被破壞。通過(guò)去除由于本發(fā)明的載體而導(dǎo)致其ECM降解酶活性增強(qiáng)的細(xì)胞，期待關(guān)節(jié)破壞減輕。此外，在動(dòng)脈硬化中，巨噬細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞繼續(xù)聚集。這些泡沫細(xì)胞分泌大量金屬蛋白酶，并且破壞纖維增生導(dǎo)致斑塊崩解。通過(guò)使用本發(fā)明的載體殺死表達(dá)MMP的巨噬細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這種動(dòng)脈硬化的治療。此外，如下所述，在癌癥中各種蛋白酶均激活。本發(fā)明的載體可用作特異性感染并浸潤(rùn)癌癥的治療性載體。
為制備包含本發(fā)明載體的組合物，必要時(shí)將載體與理想的可藥用載體或溶劑聯(lián)用?！翱伤幱玫妮d體或溶劑”指可和載體一同給藥而不明顯抑制該載體的基因轉(zhuǎn)移的物質(zhì)。例如，載體可以通過(guò)用生理鹽水，磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)適當(dāng)稀釋配制成組合物。當(dāng)載體在雞蛋中增殖時(shí)，所述組合物可以含有尿囊液。此外，包含所述載體的組合物可以含有載體或溶劑，例如去離子水和5％的葡聚糖溶液。此外，所述組合物還可含有植物油，懸浮劑，清潔劑，殺生物劑等。此外，還可將防腐劑和其它添加劑加入所述組合物。含有本發(fā)明載體的組合物可用作清潔劑和藥物。
載體劑量依賴(lài)于疾病類(lèi)型，病人體重，年齡，性別和癥狀，給藥目的，待給藥組合物的劑型，給藥方法，待導(dǎo)入基因的類(lèi)型等。然而，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可常規(guī)確定正確劑量。載體給藥劑量?jī)?yōu)選約105-1011CIU/ml，更優(yōu)選在約107-109CIU/ml，更優(yōu)選約1×108-5×108CIU/ml.。優(yōu)選將所述載體和可藥用的載體混合。為給藥癌組織，載體可在多時(shí)間點(diǎn)給藥多個(gè)靶位點(diǎn)，使得所述載體均勻分布。每次給藥人個(gè)體的優(yōu)選劑量是2×109-2×1010CIU。在臨床可接受的副作用限制以?xún)?nèi)，可給藥一次或更多次數(shù)。日給藥頻率可以類(lèi)似確定。當(dāng)將病毒載體給藥除人以外的動(dòng)物時(shí)，例如給藥的劑量可以將上述劑量根據(jù)靶動(dòng)物和人之間的給藥靶位點(diǎn)的體重比或體積比(例如，平均值)進(jìn)行轉(zhuǎn)化來(lái)確定。包含本發(fā)明載體的組合物可以給藥所有哺乳動(dòng)物種類(lèi)，包括人，猴，小鼠，大鼠，兔，綿羊，牛，狗等。
本發(fā)明的載體尤其可用于治療癌癥。用本發(fā)明載體感染的細(xì)胞在蛋白酶存在下通過(guò)細(xì)胞融合形成合胞體。利用這一性質(zhì)，本發(fā)明的載體可用于來(lái)治療特定蛋白酶活性增強(qiáng)的癌癥。本發(fā)明提供用于癌癥的治療組合物，其包含可藥用的載體和本發(fā)明的載體(其編碼由在癌癥中顯示增強(qiáng)的活性的蛋白酶切割的F蛋白)。此外，本發(fā)明涉及載體在制備癌癥治療組合物的用途。本發(fā)明還涉及治療癌癥的方法，包括將這種載體給藥癌組織的步驟。由于ECM降解酶的活性在浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性惡性癌癥中增強(qiáng)，包含由ECM降解酶切割大F蛋白的基因的載體可用來(lái)特異性感染惡性癌癥，從而導(dǎo)致癌組織的死亡。
本發(fā)明的載體還包含異源基因。所述異源基因可以是監(jiān)控載體或治療性基因?qū)Π┌Y的感染的標(biāo)記基因。治療基因的實(shí)例包括凋亡的細(xì)胞誘導(dǎo)的基因；編碼細(xì)胞毒活性蛋白的基因；細(xì)胞因子；和激素。將本發(fā)明載體給藥癌癥可直接(體內(nèi))給藥癌癥或者間接(離體)給藥，其中所述載體可導(dǎo)入病人來(lái)源的細(xì)胞或其它細(xì)胞，且所述細(xì)胞可注入癌癥。
靶向的癌癥可以是其中特異性蛋白酶的活性增強(qiáng)的任何癌癥。實(shí)例包括最具侵入性和轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤(肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，食道癌，乳腺癌等)。然而，例如MMP，uPA，和tPA的蛋白酶在一些惡性癌癥中表達(dá)水平較低。因此，能否靶向癌癥可根據(jù)增強(qiáng)的蛋白酶活性的存在或缺失判斷。本發(fā)明的載體尤其可用于浸潤(rùn)到食道癌的粘膜下層的癌癥，在內(nèi)括約肌中進(jìn)展到III和IV期癌的結(jié)腸癌，以及浸潤(rùn)很深導(dǎo)致不能完全由手術(shù)去除的浸潤(rùn)性黑素瘤。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是F缺陷的SeV基因組cDNA的構(gòu)建，其中溫度敏感性突變已被導(dǎo)入M基因。
圖2描述了構(gòu)建的病毒基因結(jié)構(gòu)，其用來(lái)根據(jù)導(dǎo)入M基因的溫度敏感性突變來(lái)抑制二次顆粒釋放，還描述了為了檢測(cè)并比較這些導(dǎo)入突變的效果而構(gòu)建或使用的病毒基因。
圖3提供了代表持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/A)中GFP表達(dá)的顯微圖像，所述細(xì)胞在用SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后分別在32℃和37℃培養(yǎng)6天。
圖4代表了使用Western印跡對(duì)持續(xù)表達(dá)SeV-F蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/A)中的F蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量測(cè)定隨時(shí)間變化的結(jié)果，所述細(xì)胞在不含胰蛋白酶，不含血清的MEM中，在32℃或37℃培養(yǎng)。
圖5提供了代表LLC-MK2細(xì)胞中GFP表達(dá)的顯微圖像，所述細(xì)胞用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)3天。
圖6描述了隨時(shí)間采樣(同時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基)的LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的血凝(HA)活性，所述細(xì)胞用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)。
圖7代表細(xì)胞中M蛋白水平與病毒樣顆粒(VLP)中M蛋白水平的比例。該比例通過(guò)使用抗M抗體用Western印跡測(cè)定。LLC-MK2細(xì)胞從用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后，在37℃保溫兩天，從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收培養(yǎng)上清。每個(gè)泳道含有的培養(yǎng)物相當(dāng)于來(lái)自6孔板各孔中培養(yǎng)物的1/10。
圖8顯示LLC-MK2細(xì)胞用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后，培養(yǎng)12，18，24，50，或120小時(shí)的培養(yǎng)上清中的SEAP活性。
圖9顯示用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后培養(yǎng)24，50，或120小時(shí)的LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HA活性。
圖10表示通過(guò)Western印跡使用抗M抗體測(cè)定的VLP量。LLC-MK2細(xì)胞用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染后培養(yǎng)5天。離心培養(yǎng)上清以回收病毒。每個(gè)泳道含有的培養(yǎng)物相當(dāng)于6孔板各孔中的內(nèi)含物的1/10。
圖11顯示根據(jù)釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH的量估計(jì)的細(xì)胞毒活性。LLC-MK2，BEAS-2B或CV-1細(xì)胞用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，或10感染。細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清或含10％FBS的培養(yǎng)基中，并且分別在感染后3或6天進(jìn)行細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)。圖中示出細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞毒活性值，其以相等數(shù)目的細(xì)胞(其100％都被細(xì)胞變性劑(Triton)裂解)的細(xì)胞毒活性作為100％。
圖12表示M蛋白在LLC-MK2細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，這是通過(guò)使用抗M抗體進(jìn)行免疫染色觀察的，其中所述細(xì)胞是用SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔ-F-GFP以MOI＝1感染后在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)2天的細(xì)胞。
圖13提供了在共聚焦激光顯微鏡下觀察到的M和HN蛋白的亞細(xì)胞定位立體三維圖像。A-10細(xì)胞使用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并隨后在含由10％血清的培養(yǎng)基中在32℃或37℃培養(yǎng)一天。這些圖像是用抗M抗體和抗HN抗體通過(guò)免疫染色獲得的。
圖14提供了在共聚焦激光顯微鏡下觀察到的M和HN蛋白的亞細(xì)胞定位立體三維圖像。A-10細(xì)胞使用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并隨后在含由10％血清的培養(yǎng)基中在32℃或37℃培養(yǎng)兩天。這些圖像是用抗M抗體和抗HN抗體通過(guò)免疫染色獲得的。
圖15表示微管解聚劑對(duì)M和HN蛋白的亞細(xì)胞定位的影響。A-10細(xì)胞使用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并且立即將微管解聚劑，秋水仙堿或秋水仙胺，加入這些細(xì)胞中使得終濃度為1μM。這些細(xì)胞在含有10％血清的培養(yǎng)基中32℃培養(yǎng)。兩天后，使用抗M抗體和抗HN抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，并隨后在共聚焦激光顯微鏡下觀察。這些圖像顯示了M和HN蛋白的亞細(xì)胞定位的立體三維圖像。
圖16表示微管解聚劑對(duì)M和HN蛋白的亞細(xì)胞定位的影響。A-10細(xì)胞使用SeV18+/F-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并且立即將微管解聚劑秋水仙堿加入這些細(xì)胞中，使得終濃度為1μM。這些細(xì)胞在含有10％血清的培養(yǎng)基中32℃或37℃培養(yǎng)。兩天后，使用抗M抗體和抗HN抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，并隨后在共聚焦激光顯微鏡下觀察。這些圖像顯示了M和HN蛋白的亞細(xì)胞定位的立體三維圖像。
圖17表示包含EGFP基因的M缺陷型SeV基因組cDNA的構(gòu)建。
圖18圖示了F缺陷型和M缺陷型SeV基因組cDNA的構(gòu)建。
圖19圖示了所構(gòu)建的F缺陷型和/或M缺陷型SeV基因的結(jié)構(gòu)。
圖20表示包含潮霉素抗性基因的M基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖21表示，誘導(dǎo)性表達(dá)克隆化M蛋白(和F蛋白)的克隆細(xì)胞用表達(dá)Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AcCANCre)感染，然后通過(guò)Western印跡對(duì)細(xì)胞中M和F蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量比較。
圖22表示用輔助細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M)克隆#18和#62對(duì)M缺陷SeV(SeV1 8+/ΔM-GFP)進(jìn)行的病毒重構(gòu)。
圖23顯示SeV18+/ΔM-GFP的病毒生產(chǎn)力(CIU和HAU時(shí)間過(guò)程)圖24提供了用來(lái)證實(shí)SeV18+/ΔM-GFP病毒粒子中的基因結(jié)構(gòu)的RT-PCR結(jié)果的圖片和說(shuō)明。
圖25表示比較SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+GFP以及SeV18+/ΔF-GFP的結(jié)果，其中對(duì)LLC-MK2細(xì)胞進(jìn)行感染后，對(duì)來(lái)自這些細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)的病毒蛋白進(jìn)行Western印跡來(lái)從蛋白的角度證實(shí)SeV18+/ΔM-GFP的病毒結(jié)構(gòu)。
圖26表示SeV18+/ΔM-GFP和SeV18+/ΔF-GFP(制備了連續(xù)稀釋液并使用Western印跡檢測(cè))感染的LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)物上清中病毒來(lái)源的蛋白的定量比較，使用抗SeV抗體。
圖27顯示用SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP以MOI＝3感染的LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)物上清(隨時(shí)間收集)中的HA活性。
圖28提供了用SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP以MOI＝3感染的LLC-MK2細(xì)胞，5天后獲得的熒光顯微圖像。
圖29提供了如下制備的LLC-MK2細(xì)胞的熒光顯微圖像LLC-MK2細(xì)胞用SeV18+/ΔM-GFP或SeV18+/ΔF-GFP以MOI＝3感染，感染5天后收集培養(yǎng)物上清，并使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Dosper)轉(zhuǎn)染到LLC-MK2細(xì)胞。兩天后，進(jìn)行顯微觀察。
圖30顯示F1/F2切割位點(diǎn)(F蛋白活化位點(diǎn))的氨基酸序列的設(shè)計(jì)。在癌細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白酶(MMP或uPA)的識(shí)別序列是根據(jù)合成底物的識(shí)別序列設(shè)計(jì)的。從上開(kāi)始，顯示了SEQ ID NO40-44的序列。
圖31圖示了M缺陷型SeV載體cDNA的構(gòu)建，所述載體中F活化位點(diǎn)被修飾。
圖32圖示了F修飾的，M缺陷型仙臺(tái)病毒載體的蛋白酶依賴(lài)性細(xì)胞融合型感染。通過(guò)使用LLC-MK2，可證實(shí)F的修飾導(dǎo)致蛋白酶依賴(lài)性細(xì)胞融合型感染。用每種M缺陷型SeV(SeV/ΔM-GFP(A，B，C，J，K，和L)，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP(D，E，F(xiàn)，M，N，和O)，以及SeV/F(uPA)ΔM-GFP(G，H，I，P，O，和R))感染細(xì)胞，同時(shí)加入0.1μg/ml膠原酶(梭菌(Clostridium))(B，E，和H)，MMP-2(C，F(xiàn)，和I)，MMP-9(J，M，和P)，uPA(K，N，和Q)，以及7.5μg/ml胰蛋白酶(L，Q，和R)。四天后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。只有加入胰蛋白酶的LLC-MK2中，包含未修飾F的SeV/ΔM-GFP導(dǎo)致感染細(xì)胞與周?chē)?xì)胞的融合，導(dǎo)致細(xì)胞融合型感染以形成多核細(xì)胞，即合胞體(L)。在加入膠原酶，MMP-2，和MMP-9的LLC-MK2中，包含導(dǎo)入F的MMP降解序列的SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP造成細(xì)胞融合型感染以形成合胞體(E，F(xiàn)，和M)。另一方面，據(jù)觀察包含導(dǎo)入F的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和組織型PA(tPA)降解序列的SeV/(uPA)ΔM-GFP在胰蛋白酶存在下，導(dǎo)致細(xì)胞融合型感染，且進(jìn)一步修飾后，在有uPA(Q和R)時(shí)形成合胞體。
圖33表示了F修飾的，M缺陷型仙臺(tái)病毒載體對(duì)癌細(xì)胞的蛋白酶依賴(lài)性細(xì)胞融合型感染。用試驗(yàn)檢驗(yàn)是否能觀察到內(nèi)源蛋白酶選擇性細(xì)胞融合型感染。使用以下細(xì)胞HT1080，表達(dá)MMP的癌細(xì)胞株(A，D，和G)；MKN28，表達(dá)tPA的癌細(xì)胞株(B，E，和H)；和SW620，不表達(dá)這些蛋白酶中任何一種的的細(xì)胞株(C，F(xiàn)，和I)。在HT1080中，只有SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染擴(kuò)散十倍或以上(D)。在表達(dá)tPA的細(xì)胞株MKN28中，只觀察到SeV/F(uPA)ΔM-GFP的細(xì)胞融合型感染。在不表達(dá)上述兩種酶中任何一種的SW620中，沒(méi)有觀察到感染擴(kuò)散。
圖34表示通過(guò)佛波醇酯對(duì)MMP的誘導(dǎo)以及F修飾的，M缺陷型仙臺(tái)病毒載體對(duì)細(xì)胞融合型感染的誘導(dǎo)。MMP-2和MMP-9的表達(dá)通過(guò)明膠酶譜法(gelatinzymography)證實(shí)，其中存在凝膠水解(gelatinolytic)活性的部分變透明(A)。泳道C表示對(duì)照。泳道T是用20nM PMA誘導(dǎo)后所得的上清的結(jié)果。對(duì)應(yīng)MMP-9的帶在HT1080和Panc I中觀察到，證明了對(duì)MMP-9的誘導(dǎo)。對(duì)于MMP-2，幾乎沒(méi)有任何活性的潛在型MMP-2在誘導(dǎo)前的PancI中檢測(cè)到。如圖34B所示，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP由于誘導(dǎo)了MMP-9而顯示細(xì)胞融合型感染。
圖35表示F修飾的，M缺陷型仙臺(tái)病毒載體在體內(nèi)的細(xì)胞融合型感染。制備了HT1080患癌裸鼠。其中，使用皮下注射后7-9天，癌直徑大于3mm的動(dòng)物。50μL的SeV被一次注入動(dòng)物中。兩天后，在熒光顯微鏡下觀察癌。圖A，D，G，和J是亮視野圖像；B，E，H，和K對(duì)應(yīng)GFP的熒光圖像；以及C，F(xiàn)，I，和L是放大圖像。僅在分別注入SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP的位點(diǎn)周?chē)膮^(qū)域觀察到熒光(圖E和H)。反之，觀察到SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP注射將熒光擴(kuò)散到整個(gè)癌(圖K)。在放大圖中，各細(xì)胞中的熒光可證實(shí)為SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP；然而，注射了SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的細(xì)胞形狀不清楚，提示出現(xiàn)細(xì)胞融合。
圖36顯示F修飾的，M缺陷型仙臺(tái)病毒載體的體內(nèi)細(xì)胞融合型感染。圖35中GFP與整個(gè)癌的比例使用NIH Image根據(jù)其面積測(cè)定。結(jié)果SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP分別顯示10％和20％的感染；而SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP顯示90％的感染，提示感染明顯擴(kuò)散。
圖37顯示患癌裸鼠中F修飾的，M缺陷型SeV載體的抗腫瘤效果。對(duì)圖35中的小鼠癌體積進(jìn)行測(cè)定。將四組SeV注入直徑3mm或以上的癌中。兩天后再次注射，并測(cè)定癌體積。注入了PBS，SeV-GFP，和SeV/ΔM-GFP的癌的體積顯示快速增長(zhǎng)。反之注入了SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的癌體積(圖36的實(shí)驗(yàn)中顯示擴(kuò)散到整個(gè)癌)顯然不增殖并保持小體積。與其它3組相比，觀察到明顯的抗腫瘤效果，根據(jù)t檢驗(yàn)P＜0.05。
圖38表示F未切割的，F(xiàn)修飾的，M缺陷型SeV載體對(duì)癌細(xì)胞的蛋白酶表達(dá)-選擇性感染。蛋白酶表達(dá)引起選擇性感染的可能性在以下細(xì)胞株中檢驗(yàn)表達(dá)MMP的HT1080細(xì)胞株，表達(dá)tPA的MKN28細(xì)胞株，和幾乎不表達(dá)蛋白酶的SW620。SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP造成的感染在表達(dá)MMP的HT1080細(xì)胞株中觀察到但在表達(dá)tPA的MKN28細(xì)胞株中未觀察到。SeV/F(uPA)ΔM-GFP造成的感染在表達(dá)tPA的MKN28細(xì)胞株中觀察到，但在表達(dá)MMP的HT1080細(xì)胞株中沒(méi)有觀察到。
圖39顯示F-未切割，F(xiàn)修飾的，M缺陷型SeV載體獲得感染能力，這是由于纖維母細(xì)胞誘導(dǎo)MMP-3和MMP-7。由纖維母細(xì)胞誘導(dǎo)MMP造成F修飾的，M缺陷型SeV載體的感染力變化是用SW480和WiDr在體外檢驗(yàn)。將人纖維母細(xì)胞(hFB)與SW480和WiDr共培養(yǎng)導(dǎo)致SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染(B和D)。這種現(xiàn)象在不發(fā)生誘導(dǎo)的SW620中觀察不到(F)。
圖40顯示F修飾的，M缺陷型SeV載體對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的MMP選擇性感染。SeV/ΔM-GFP的感染只能通過(guò)加入胰蛋白酶繼續(xù)進(jìn)行。反之SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染在加入膠原酶，MMP-2，MMP-3，和MMP-9后繼續(xù)。
圖41表示F修飾的M缺陷型SeV載體中蛋白酶依賴(lài)性F蛋白的切割。通過(guò)Western印跡證實(shí)仙臺(tái)病毒的F0經(jīng)蛋白酶依賴(lài)性切割成為F1。包含未修飾的F的M缺陷型SeV載體(顯示于泳道1，4，7，和10)，在F中插入了MMP#2序列的M缺陷型SeV載體(顯示于泳道2，5，8，和11)，以及在F中插入了uPA序列的M缺陷型SeV載體(顯示于泳道3，6，9，和12)用上述蛋白酶在37℃處理30分鐘(未處理(泳道1，2，和3)；0.1ng/mL MMP-9(泳道4，5，和6)；0.1ng/mL uPA(泳道7，8，和9)；和7.5μg/mL胰蛋白酶(泳道10，11，和12))。結(jié)果，根據(jù)插入的蛋白酶底物而出現(xiàn)F1切割。即，胰蛋白酶切割F未修飾M缺陷型SeV載體的F蛋白，MMP-9切割在F蛋白中插入了MMP#2序列的那些M缺陷型SeV載體的F蛋白，uPA切割在F蛋白中插入了uPA序列的那些M缺陷型SeV載體的F蛋白。
圖42顯示F包質(zhì)區(qū)缺失突變體的產(chǎn)生，并通過(guò)與HN同時(shí)表達(dá)比較了其致融合力。圖42A是仙臺(tái)病毒F蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變體的構(gòu)建。從上起為SEQ ID NO76-79。圖42B顯示F蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變體的產(chǎn)生以及和HN同時(shí)表達(dá)所獲得的致融合力的比較。仙臺(tái)病毒F蛋白的胞質(zhì)區(qū)缺失突變體和HN在加入7.5μg/mL胰蛋白酶的LLC-MK2細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)。四天后，用蘇木精進(jìn)行核染色，并計(jì)數(shù)形成合胞體的核的數(shù)目。
圖43顯示了F/HN嵌合蛋白產(chǎn)生的致融合力劇增。圖43A顯示F/HN嵌合蛋白的結(jié)構(gòu)。接頭序列在SEQ ID NO80中描述。圖43B顯示通過(guò)插入接頭增加F/HN嵌合蛋白的致融合力。每種仙臺(tái)病毒F/HN嵌合蛋白和HN在加入7.5μg/mL胰蛋白酶的LLC-MK2細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)。
圖44的圖和照片概述了將MMP底物序列插入F/HN嵌合蛋白的F切割位點(diǎn)中。圖44A圖示插入了MMP底物序列的F修飾型F/HN嵌合蛋白的結(jié)構(gòu)。從上起，SEQ ID NO81-89。圖44B圖示了由于表達(dá)MMP的HT1080細(xì)胞中F修飾型F/HN的表達(dá)造成的合胞體形成。
圖45顯示了F肽(融合肽)的修飾以及其對(duì)合胞體形成的濃度依賴(lài)性效應(yīng)。圖45A是融合肽修飾構(gòu)建圖。從上起，SEQ ID NO90-93。
圖45B顯示與加入的膠原酶(梭菌)濃度相關(guān)的MMP#2，MMP#6，和MMP#6G12A的致融合力。
圖46顯示了改良的F修飾M缺陷型仙臺(tái)病毒的基因組結(jié)構(gòu)。
圖47圖示了改良的F修飾M缺陷型仙臺(tái)病毒在低水平表達(dá)MMP的癌中的擴(kuò)散。圖中顯示，改良的F修飾M缺陷型仙臺(tái)病毒感染兩天后，細(xì)胞融合的擴(kuò)散。
圖48圖示了癌細(xì)胞系中MMP-2和MMP-9的表達(dá)。顯示了癌細(xì)胞系上清的凝膠信號(hào)識(shí)別蛋白的受體。
圖49顯示了改良的F修飾的M缺陷型仙臺(tái)病毒的在低水平表達(dá)MMP的腫瘤中的擴(kuò)散。圖中標(biāo)出了感染兩天后每0.3cm2的合胞體數(shù)目。“ΔM”的表示SeV18+/ΔM-GFP“#2”表示SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP，“#6”表示SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP，“#6ct14”表示SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP，“F/HN嵌合體”表示SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP。
最佳實(shí)施方式本發(fā)明的下文具體描述了實(shí)施例；但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。所有引用的對(duì)比文件包含在此作為說(shuō)明書(shū)的一部分。
1.構(gòu)建具有降低或缺陷的顆粒形成能力的SeV載體[實(shí)施例1]構(gòu)建溫度敏感性突變SeV基因組cDNA構(gòu)建了SeV基因組cDNA，其中將溫度敏感性突變導(dǎo)入M基因。圖1圖示了所述cDNA的構(gòu)建，其描述如下。含有位于F缺失位點(diǎn)的EGFP基因的F缺陷型全長(zhǎng)仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV18+/ΔF-GFPLi，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)用NaeI消化。含M基因的片段(4922 bp)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。切下目的帶后，通過(guò)QIAEXII凝膠提取系統(tǒng)(QIAGEN，Bothell，WA)回收DNA，并亞克隆到pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRV位點(diǎn)(pBlueNaeIfrg-ΔFGFP構(gòu)建)。將溫度敏感性突變導(dǎo)入pBlueNaeIfrg-ΔFGFP的M基因通過(guò)使用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)根據(jù)試劑盒說(shuō)明中的方法進(jìn)行。根據(jù)Kondo等報(bào)道的Cl.151株的序列(Kondo，T.等，J.Biol.Chem.268，21924-21930，1993)，導(dǎo)入M基因的三種類(lèi)型的突變是G69E，T116A和A183S。用于導(dǎo)入突變的合成寡核苷酸序列如下G69E(5′-gaaacaaacaaccaatctagagagcgtatctgacttgac-3′/SEQ ID NO11，5′-gtcaagtcagatacgctctctagattggttgtttgtttc-3′/SEQ ID NO12)，T116A(5′-attacggtgaggagggctgttcgagcaggag-3′/SEQ ID NO13，5′-ctcctgctcgaacagccctcctcaccgtaat-3′/SEQ ID NO14)和A183S(5′-ggggcaatcaccatatccaagatcccaaagacc-3′/SEQ ID NO15，5′-ggtctttgggatcttggatatggtgattgcccc-3′/SEQ ID NO16).
質(zhì)粒pBlueNaeIfrg-ΔFGFP的M基因含有上述三種突變，其由SalI消化并隨后用ApaLI進(jìn)行部分消化。含全部M基因的片段隨后被回收(2644bp)。pSeV18+/ΔF-GFP用ApaLI/NheI消化，并回收含HN基因的片段(6287bp)。這兩個(gè)片段被亞克隆到Litmus38(New England Biolabs，Beverly，MA)SalI/NheI位點(diǎn)(LitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFP構(gòu)建)。通過(guò)使用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖懈鶕?jù)試劑盒說(shuō)明中的方法，將溫度敏感性突變以將突變導(dǎo)入M基因相同的方式導(dǎo)入LitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFP HN基因。根據(jù)Thompson等報(bào)道的ts271株的序列(Thompson，S.D.等，Virology160，1-8，1987)，導(dǎo)入HN基因的三個(gè)突變是A262T，G264R和K461G。用于導(dǎo)入突變的合成寡核苷酸序列如下A262T/G264R(5′-catgctctgtggtgacaacccggactaggggttatca-3′/SEQ ID NO17，5′-tgataacccctagtccgggttgtcaccacagagcatg-3′/SEQ ID NO18)，和K461G(5′-cttgtctagaccaggaaatgaagagtgcaattggtacaata-3′/SEQ ID NO19，5′-tattgtaccaattgcactcttcatttcctggtctagacaag-3′/SEQ ID NO20).
雖然可將突變導(dǎo)入不同載體的M和HN基因，通過(guò)質(zhì)粒(LitmusSalI/NheIfrg-ΔFGFP)也可將所有突變導(dǎo)入M和HN基因兩者中，其中所述質(zhì)粒是通過(guò)在Litmus38的SalI/NheI位點(diǎn)亞克隆含M和HN基因的片段(8931 bp)獲得的，所述片段用SalI/Nhe I消化pSev18+/ΔF-GFP得到的。連續(xù)導(dǎo)入突變導(dǎo)致總共導(dǎo)入六個(gè)溫度敏感性突變；三個(gè)突變位于M基因中，且三個(gè)突變位于HN基因中(LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFP構(gòu)建)。
LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFP用SalI/NheI消化并獲得8931 bp的片段。缺乏M和HN基因的另一片段(8294 bp)通過(guò)用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP獲得。這兩個(gè)片段連接在一起來(lái)構(gòu)建F缺陷型全長(zhǎng)仙臺(tái)病毒基因組cDNA(pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP)，所述cDNA包含位于M和HN基因中的6個(gè)溫度敏感性突變，且EGFP基因位于F缺失位點(diǎn)(圖2)。
此外，為定量質(zhì)粒中基因的表達(dá)水平，構(gòu)建了含分泌型堿性磷酸酶(SEAP)基因的cDNA。具體地，用NotI切出含有位于SEAP基因下游的終止信號(hào)干擾序列起始信號(hào)的SEAP片段(1638 bp)(WO 00/70070)。在進(jìn)行電泳后回收該片段并純化。隨后將該片段插入pSeV18+/ΔF-GFP和pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP各自的NotI位點(diǎn)。產(chǎn)生的質(zhì)粒分別為pSeV18+SEAP/ΔF-GFP和pSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP(圖2)。
導(dǎo)入溫度敏感性突變的病毒的重構(gòu)和擴(kuò)增病毒重構(gòu)根據(jù)Li等報(bào)道的方法進(jìn)行(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)。使用誘導(dǎo)型Cre/loxP表達(dá)系統(tǒng)制備的F蛋白輔助細(xì)胞用來(lái)重構(gòu)F缺陷型病毒。該系統(tǒng)利用pCALNdLw質(zhì)粒，所述質(zhì)粒被設(shè)計(jì)成用于表達(dá)Cre DNA重組酶介導(dǎo)的誘導(dǎo)型基因產(chǎn)物表達(dá)(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)。在該系統(tǒng)中，使用Saito等的用表達(dá)CreDNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染轉(zhuǎn)化體的方法(Saito，I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)在攜帶該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體中表達(dá)插入的基因。對(duì)于SeV-F蛋白而言，含有F基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在本文稱(chēng)LLC-MK2/F7，且經(jīng)AxCANCre誘導(dǎo)后持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞在本文稱(chēng)LLC-MK2/F7/A。
包含溫度敏感性突變的病毒重構(gòu)如下進(jìn)行將LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿鋪在100-mm的皿上，并隨后培養(yǎng)24小時(shí)。用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒(已經(jīng)由補(bǔ)骨脂素和長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光(365nm)處理20分鐘)(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)在室溫感染(MOI＝2)這些細(xì)胞一小時(shí)。用無(wú)血清MEM洗滌細(xì)胞。質(zhì)粒，pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L和pGEM/F-HN(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)，分別以12μg，4μg，2μg，4μg和4μg/皿的量重懸于Opti-MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。加入相當(dāng)于1μg DNA/5μL的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，Bothell，WA)并混合。產(chǎn)生的混合物在室溫放置15分鐘，并隨后加入3ml含3％FBS的Opti-MEM。將混合物加入細(xì)胞。培養(yǎng)5小時(shí)后，用無(wú)血清MEM洗滌細(xì)胞兩次，并在含40μg/ml胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/ALi，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)以8.5×106細(xì)胞/皿的量進(jìn)行上層覆蓋。這些細(xì)胞隨后在含40μg/mL AraC和7.5μg/mL胰蛋白酶的MEM中，在37℃再培養(yǎng)兩天(P0)。收集細(xì)胞并將沉淀用2ml Opti-MEM/皿重懸。凍融處理三次，并將裂解物直接轉(zhuǎn)染到LLC-MK2/F7/A中。細(xì)胞在含40μg/mL AraC和7.5μg/mL胰蛋白酶的無(wú)血清MEM中在32℃培養(yǎng)(P1)。5-7天后，用部分培養(yǎng)物上清感染剛制備的LLC-MK2/F7/A，并在相同的含40μg/mLAraC和7.5μg/mL胰蛋白酶的無(wú)血清MEM中32℃培養(yǎng)(P2)。3-5天后，再次感染剛制備的LLC-MK2/F7/A，并將細(xì)胞在僅含7.5μg/mL胰蛋白酶的無(wú)血清MEM中32℃培養(yǎng)3-5天(P3)。將BSA以終濃度1％加入回收的培養(yǎng)物上清中，并將混合物儲(chǔ)存在-80℃。將儲(chǔ)存的病毒溶液解凍，并用于以后的實(shí)驗(yàn)中。
通過(guò)這種方法制備的病毒溶液的滴度如下SeV18+/ΔF-GFP，3×108；SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP，7×107；SeV18+SEAP/ΔF-GFP，1.8×108；SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP，8.9×107GFP-CIU/mL(GFP-CIU在 WO00/70070中定義)。另一方面，對(duì)于包含GFP的載體，通過(guò)直接檢測(cè)GFP所測(cè)定的CIU被定義為GFP-CIU。證實(shí)GFP-CIU值與相應(yīng)的CIU值基本相等(WO 00/70070)。在SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP滴度的測(cè)定中，在32℃和37℃觀察到持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/A)的空斑的感染后擴(kuò)散。圖3顯示感染后6天觀察到的圖形。
SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP空斑在32℃有一定程度的擴(kuò)散，但在37℃擴(kuò)散程度大大降低。這提示病毒粒子形成在37℃降低。
培養(yǎng)溫度(32℃)對(duì)病毒重構(gòu)的影響
在導(dǎo)入溫度敏感性突變的病毒的試驗(yàn)性重構(gòu)中(實(shí)施例2)，P1和所有隨后的培養(yǎng)都在32℃進(jìn)行。使用該溫度是由于用于評(píng)估溫度敏感性突變的導(dǎo)入的對(duì)比病毒在32℃生長(zhǎng)良好(Kondo，T.等，J.Biol.Chem.268，21924-21930，1993；Thompson，S.D.等，Virology 160，1-8，1987)。對(duì)試驗(yàn)條件的仔細(xì)研究揭示，對(duì)于SeV的重構(gòu)(以及對(duì)于除了其中已導(dǎo)入了溫度敏感性突變的病毒以外的其它病毒)，通過(guò)在32℃進(jìn)行P1和隨后的培養(yǎng)可提高重構(gòu)效率，從而很有可能回收以前難以獲得的病毒。
考慮在32℃重構(gòu)效率提高有兩個(gè)原因。第一點(diǎn)，當(dāng)在32℃培養(yǎng)時(shí)與在37℃培養(yǎng)不同，認(rèn)為由AraC(補(bǔ)充它的目的是抑制痘苗病毒擴(kuò)增)造成的細(xì)胞毒活性受到抑制。在病毒重構(gòu)條件下，在37℃，含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的無(wú)血清MEM中培養(yǎng)LLC-MK2/F7/A細(xì)胞3-4天后，導(dǎo)致細(xì)胞破壞，包括剝離的細(xì)胞增加。但在32℃培養(yǎng)可有效持續(xù)7-10天而細(xì)胞仍未受到損害。在重構(gòu)轉(zhuǎn)錄和/或復(fù)制效率不良，或者感染性病毒粒子的形成不良的SeV時(shí)，成功被認(rèn)為是培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間的直接反映。第二點(diǎn)是，在32℃培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，LLC-MK2/F7/A中可維持F蛋白表達(dá)。將持續(xù)表達(dá)F蛋白的LLC-MK2/F7/A細(xì)胞在含10％FBS的MEM中37℃培養(yǎng)，直到鋪滿6孔板，然后用含7.5μg/ml胰蛋白酶的無(wú)血清MEM置換培養(yǎng)基，且進(jìn)一步在32℃或37℃培養(yǎng)細(xì)胞。使用細(xì)胞刮器隨時(shí)間回收細(xì)胞，并用抗F蛋白抗體(小鼠單克隆抗體)進(jìn)行Western印跡以半定量分析細(xì)胞內(nèi)F蛋白。F蛋白表達(dá)在37℃持續(xù)兩天，隨后降低。然而，在32℃表達(dá)持續(xù)至少8天(圖4)。這些結(jié)果證實(shí)了病毒重構(gòu)在32℃的有效性(P1階段之后)。
上述Western印跡使用以下方法進(jìn)行從6孔板中的一個(gè)孔回收的細(xì)胞保存在-80℃，然后在100μL 1x稀釋SDS-PAGE的樣品緩沖液(Red LoadingBuffer Pack；New England Biolabs，Beverly，MA)中解凍。隨后在98℃加熱樣品10分鐘，離心，并將10-μl等分上清液加在SDS-PAGE凝膠上(multigel10/20；Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)。在15mA電泳2.5小時(shí)后，使用半干法在100mA進(jìn)行一小時(shí)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(ImmobilonPVDF transfer membrane；Millipore，Bedford，MA)。轉(zhuǎn)移膜浸在封閉液(BlockAce；Snow Brand Milk Products Co.，Ltd.，Sapporo，Japan)中在4℃保持一小時(shí)或以上，在含10％Block Ace(補(bǔ)充1/1000體積的抗F蛋白抗體)的第一抗體溶液中浸泡，并隨后在4℃過(guò)夜所述膜。用含0.05％Tween 20的TBS(TBST)洗滌3次再用TBS洗滌3次后，浸在含10％Block Ace并補(bǔ)充1/1000體積的HPR偶聯(lián)型抗小鼠IgG+IgM抗體(山羊F(ab’)2抗小鼠IgG+IgM，HRP；BioSource Int.，Camarillo，CA)的第二抗體溶液中。隨后在室溫?cái)噭?dòng)樣品1小時(shí)。所述膜用TBST洗滌3次，并用TBS洗滌3次。隨后用化學(xué)發(fā)光法(ECL western印跡檢測(cè)試劑；Amersham Pharmacia biotech，Uppsala，Sweden)檢測(cè)膜上的蛋白。
定量導(dǎo)入了本發(fā)明溫度敏感性突變的病毒的二次釋放顆粒(HA測(cè)定，Western印跡)利用包含所有病毒蛋白和GFP片段(780 bp)的自主復(fù)制型SeV，與SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP一起比較了二次釋放顆粒的水平，其中所述GFP片段在NotI位點(diǎn)包含位于GFP基因下游的終止信號(hào)-干擾序列-起始信號(hào)(SeV18+GFP圖2)。
LLC-MK2細(xì)胞在6孔板上生長(zhǎng)到滿底。將3×107CIU/ml的每種病毒溶液以100μL每孔(MOI＝3)加入這些細(xì)胞中，且轉(zhuǎn)染細(xì)胞一小時(shí)。用MEM洗滌細(xì)胞后，將無(wú)血清MEM(1ml)加入各孔，并分別將細(xì)胞在32℃，37℃和38℃培養(yǎng)。每天取樣，并在取樣后立刻將1ml新鮮無(wú)血清MEM加入余下的細(xì)胞中。隨時(shí)間培養(yǎng)和取樣。感染后3天，在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)顯示，三種類(lèi)型的病毒在三種溫度條件下(32℃，37℃和38℃)的感染水平幾乎相等，且GFP表達(dá)相似(圖5)。
二次釋放顆粒使用血凝活性(HA活性)實(shí)驗(yàn)根據(jù)Kato等(Kato，A.，等，Genes Cell 1，569-579，1996)的方法進(jìn)行定量。具體地，用圓底96孔板，使用PBS連續(xù)稀釋病毒溶液。連續(xù)兩倍50μL稀釋在各孔中進(jìn)行。50μL保藏的雞血(Cosmo Bio，Tokyo，Japan)，用PBS稀釋到1％，加入50μL病毒溶液中，且混合物在4℃放置一小時(shí)。檢查紅細(xì)胞凝集。凝集的樣品中最高的病毒稀釋度確定為HA活性。此外，一個(gè)凝血單位(HAU)計(jì)算為1×106病毒，并表達(dá)為病毒數(shù)量(圖6)。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP的二次釋放顆粒明顯降低，且在37℃，確定為SeV18+/ΔF-GFP的二次釋放顆粒的水平的大約1/10。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP病毒顆粒形成在32℃降低，且雖然只有一些病毒顆粒產(chǎn)生，仍可在一定程度上進(jìn)行制備。
Western印跡用于定量二次釋放顆粒。與上述類(lèi)似的方式用所述病毒以MOI＝3感染LLC-MK2細(xì)胞，并在感染后兩天回收培養(yǎng)物上清和細(xì)胞。培養(yǎng)物上清在48,000 xg離心45分鐘來(lái)回收病毒顆粒。SDS-PAGE后，進(jìn)行Western印跡以使用抗M蛋白抗體檢測(cè)這些蛋白。該抗-M蛋白抗體是新制備的多克隆抗體，其從用以下三種合成肽的混合物免疫的兔血清中制備對(duì)應(yīng)SeV M蛋白的氨基酸1-13(MADIYRFPKFSYE+Cys/SEQ ID NO21)，23-35(LRTGPDKKAIPH+Cys/SEQ ID NO22)，和336-348(Cys+NVVAKNIGRIRKL/SEQ ID NO23)。根據(jù)實(shí)施例3中所述的方法進(jìn)行Western印跡，其中第一抗體即抗M蛋白抗體，以1/4000的稀釋度使用，其二級(jí)抗體即與HRP結(jié)合的抗兔IgG抗體(抗兔IgG(山羊)H+L conj.；ICN P.，Aurola，OH)，以1/5000的稀釋度使用。在SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染的細(xì)胞的情況下，M蛋白以相似的程度廣泛表達(dá)，但病毒蛋白的表達(dá)降低(圖7)。Western印跡還證實(shí)二次釋放的病毒顆粒減少。
導(dǎo)入溫度敏感性突變的病毒所含基因的表達(dá)水平(SEAP實(shí)驗(yàn))SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP二次顆粒的釋放減少。如果所含基因的表達(dá)同時(shí)降低，這種修飾在基因表達(dá)載體中沒(méi)有意義。因此，評(píng)估基因表達(dá)水平。用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝3感染LLC-MK2細(xì)胞，并隨時(shí)間(感染后12，18，24，50和120小時(shí))收集培養(yǎng)物上清。上清中的SEAP活性用Reporter Assay Kit-SEAP(TOYOBO，Osaka，Japan)根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定。兩種類(lèi)型的SEAP活性相當(dāng)(圖8)。也測(cè)定了相同樣品血凝活性(HA活性)。SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP的HA活性降低到十分之一(圖9)。通過(guò)在48,000 xg離心45分鐘從樣品病毒中收獲病毒蛋白，并隨后通過(guò)Western印跡使用抗M抗體進(jìn)行半定量測(cè)定。上清中病毒蛋白的水平也降低(圖10)。這些發(fā)現(xiàn)表明誘導(dǎo)溫度敏感性突變將二次顆粒釋放的水平降低到約1/10，而所含基因的表達(dá)水平基本不降低。
導(dǎo)入溫度敏感性突變的病毒的細(xì)胞毒活性(LDH實(shí)驗(yàn))SeV感染通常是具有細(xì)胞毒活性的。由此從這方面檢驗(yàn)導(dǎo)入的突變的影響。LLC-MK2，BEAS-2B和CV-1細(xì)胞各以2.5×104細(xì)胞/孔鋪于96孔板上(100μL/孔)，然后進(jìn)行培養(yǎng)。LLC-MK2和CV-1培養(yǎng)在含有10％FBS的MEM中，并將BEAS-2B培養(yǎng)在含10％FBS的1∶1的D-MEM和RPMI(Gibco-BRL，Rockville，MD)的混合培養(yǎng)基中。培養(yǎng)24小時(shí)后，通過(guò)加入5μL/孔的SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP溶液(用含1％的BSA的MEM稀釋)進(jìn)行病毒感染。6小時(shí)后，含有病毒溶液的培養(yǎng)基被去除，并用相應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基(含或不含10％FBS)置換。如果使用無(wú)FBS培養(yǎng)基，感染后3天對(duì)培養(yǎng)物上清取樣，或者如果使用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基，感染后6天取樣。通過(guò)使用細(xì)胞毒活性檢測(cè)試劑盒(Roche，Basel，Switzerland)根據(jù)試劑盒說(shuō)明分析細(xì)胞毒活性。病毒載體在LLC-MK2中都不具有細(xì)胞毒活性。此外，CV-1和BEAS-2B中測(cè)定的SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP細(xì)胞毒活性相當(dāng)于或小于SeV18+/ΔF-GFP的細(xì)胞毒活性(圖11)。因此，由于導(dǎo)入溫度敏感突變導(dǎo)致的二次顆粒釋放的抑制不誘導(dǎo)細(xì)胞毒活性。
研究二次顆粒釋放抑制的機(jī)制為說(shuō)明與導(dǎo)入溫度敏感性突變相關(guān)的二次顆粒釋放抑制的部分機(jī)制，檢測(cè)了M蛋白的亞細(xì)胞定位。LLC-MK2細(xì)胞用各類(lèi)型SeV(SeV18+GFP，SeV18+/ΔF-GFP，SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP)感染，并在32℃，37℃或38℃培養(yǎng)兩天。所述細(xì)胞用抗M抗體進(jìn)行免疫染色。如下進(jìn)行免疫染色用PBS洗滌培養(yǎng)細(xì)胞一次，加入冷凍到-20℃的甲醇，并在4℃固定細(xì)胞15分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞3次后，在室溫用含2％山羊血清和0.1％Triton的PBS溶液封閉一小時(shí)。用PBS再洗滌三次后，將細(xì)胞與含2％山羊血清的第一抗體溶液(10μg/mL抗M抗體)在37℃保溫30分。用PBS洗滌3次后，用含2％山羊血清的二級(jí)抗體溶液(10μg/mL Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(H+L)偶聯(lián)物Molecular Probes，Eugene，OR)在37℃與細(xì)胞反應(yīng)15分鐘。最后，再用PBS洗滌三次后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。對(duì)于含有F和HN蛋白的自主復(fù)制型SeV18+GFP，在所有檢測(cè)溫度下可在細(xì)胞表面檢測(cè)到濃縮的M蛋白(圖12)。這種M蛋白濃縮以前有報(bào)道(Yoshida，T.等，Virology 71，143-161，1976)，并推定其反映病毒粒子形成的位點(diǎn)。具體地，對(duì)于SeV18+GFP，細(xì)胞表面的M蛋白定位顯示在所有溫度下正常，表明形成了足量的病毒粒子。另一方面，對(duì)于SeV18+/ΔF-GFP，M蛋白濃縮在38℃劇烈降低。據(jù)信M蛋白定位于細(xì)胞表面，與F蛋白和HN蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)合(Sanderson，C.M.等，J.Virology 68，69-76，1994；Ali，A.等，Virology 276，289-303，2000)。由于這兩種蛋白之一即F蛋白在SeV18+/ΔF-GFP中缺失，F(xiàn)蛋白缺陷被推定對(duì)M蛋白定位有影響。所述影響預(yù)期對(duì)SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP更強(qiáng)，且還預(yù)期即使在37℃，M蛋白定位將被干擾且二次釋放的顆粒數(shù)目將減少。
研究二次顆粒釋放的抑制機(jī)制(2)為更詳細(xì)研究SeV蛋白的亞細(xì)胞定位，使用共聚焦激光顯微鏡(MRC1024；Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)進(jìn)行分析。A-10細(xì)胞(大鼠成肌細(xì)胞)用SeV18+SEAP/ΔF-GFP和SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP(MOI＝1)分別感染，并隨后在含有10％血清的MEM中在32℃或37℃進(jìn)行培養(yǎng)。一或兩天后，使用抗M抗體和抗HN抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。如下進(jìn)行免疫染色感染細(xì)胞培養(yǎng)物用PBS洗滌一次。將冷卻到-20℃的甲醇加入細(xì)胞中，并在4℃固定細(xì)胞15分鐘。所述細(xì)胞用PBS洗滌3次，并隨后在室溫使用含2％山羊血清，1％BSA和0.1％Triton的PBS溶液封閉一小時(shí)。所述細(xì)胞與含2％山羊血清的抗M第一抗體溶液(10μg/mL抗M抗體)在37℃反應(yīng)30分鐘。隨后將細(xì)胞與抗HN第一抗體溶液(1μg/mL抗HN抗體(IL4-1))在37℃反應(yīng)30分鐘。用PBS洗滌三次后，所述細(xì)胞與含2％山羊血清的二級(jí)抗體溶液(10μg/mL Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG(H+L)偶聯(lián)物以及10μg/mL Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)偶聯(lián)物MolecularProbes，Eugene，OR)在37℃反應(yīng)15分鐘。細(xì)胞用PBS洗滌三次，并用稀釋4000倍的TO PRO3(Molecular Probes，Eugene，OR)對(duì)核進(jìn)行染色。所述細(xì)胞在室溫放置15分鐘。最后，為防止猝滅(quenching)，使用Slow FadeAntifade Kit溶液(Molecular Probes，Eugene，OR)替換液體，其在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。圖13顯示感染后一天的結(jié)果。紅色代表M蛋白定位；綠色代表HN蛋白定位；且黃色為兩者的共同定位。深紅色部分(Far red)經(jīng)過(guò)顏色轉(zhuǎn)換，因此藍(lán)色代表細(xì)胞核。對(duì)于SeV18+SEAP/ΔF-GFP，每種蛋白的定位模式在32℃和37℃之間差異不大，且觀察到M蛋白在細(xì)胞表面的定位。另一方面，對(duì)于SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP，每種蛋白在上述兩個(gè)溫度下的定位與SeV18+SEAP/ΔF-GFP中的定位不同。具體地，幾乎沒(méi)有任何M蛋白定位與細(xì)胞表面。具體地，在37℃，M和HN蛋白幾乎完全分離，使得M蛋白定位于推定接近微管中間體的位點(diǎn)(例如接近高爾基體)。從感染后培養(yǎng)兩天的的細(xì)胞獲得了類(lèi)似的結(jié)果。特別在SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP-感染的細(xì)胞中，亞細(xì)胞M蛋白定位在感染后一天和兩天之間沒(méi)有改變(圖14)，且蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)顯示停止。該結(jié)果還顯示由于導(dǎo)入溫度敏感性突變的病毒造成的二次顆粒釋放減少是由于M蛋白定位缺陷造成的，其對(duì)顆粒形成有重要作用。
當(dāng)細(xì)胞感染SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以后在32℃培養(yǎng)時(shí)，染色的M蛋白的形態(tài)與微管的形態(tài)相似(圖13)。為顯示微管的參與，加入增強(qiáng)微管解聚的試劑，然后研究了M蛋白(和HN蛋白)定位的改變。A-10細(xì)胞用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1感染，并立即以1mM的終濃度加入解聚試劑秋水仙堿(Nakarai Tesque，Kyoto，Japan)或秋水仙胺(Nakarai Tesque，Kyoto，Japan)。隨后在32℃培養(yǎng)細(xì)胞。感染后兩天，M和HN蛋白的亞細(xì)胞定位通過(guò)上述同樣的方法觀察。缺乏解聚劑時(shí)，M蛋白分布在形態(tài)上與微管相似(圖13)。然而，加入解聚劑導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)的破壞，且所述蛋白檢測(cè)為大的纖維結(jié)構(gòu)(圖15)。該結(jié)構(gòu)可以是M蛋白本身的聚合物，或者與解聚微管的殘基結(jié)合的M蛋白。在任一情況下，如圖13所示，似乎可信地?cái)喽∕蛋白位于用SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染后在32℃培養(yǎng)的細(xì)胞的微管上。
為證明上述M蛋白在微管中的定位是溫度敏感性病毒的特征，評(píng)估了病毒SeV18+/ΔF-GFP和SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染后關(guān)于微管解聚劑(秋水仙堿)對(duì)的M蛋白(和HN蛋白)定位改變的影響。A-10細(xì)胞由SeV18+/ΔF-GFP或SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP以MOI＝1進(jìn)行感染，且立即以1μM的終濃度加入所述解聚劑秋水仙堿。所述細(xì)胞培養(yǎng)在32℃或37℃。感染后兩天，M蛋白(和HN蛋白)的亞細(xì)胞定位通過(guò)上述相同方法觀察。結(jié)果顯示在圖16中。兩種病毒感染的細(xì)胞顯示類(lèi)似的特征。具體地，當(dāng)細(xì)胞感染后在32℃培養(yǎng)時(shí)，觀察到的M蛋白為大的纖維狀結(jié)構(gòu)，與圖15中的類(lèi)似。M蛋白與微管的共存只見(jiàn)于SeV18+/ΔF-GFP感染的情況。具體地，在用SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染并在37℃培養(yǎng)的細(xì)胞中，觀察到的M蛋白定位在推定接近高爾基體的區(qū)域。
根據(jù)以上結(jié)果，可推出以下結(jié)論M蛋白在高爾基體附近合成；其沿微管(例如與動(dòng)力蛋白例如肌動(dòng)蛋白結(jié)合)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周?chē)饕cF和HN蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)合(Sanderson，C.M.等，J.Virology 68，69-76，1994；Ali，A.等，Virology 276，289-303，2000)；且M蛋白定位于細(xì)胞表面，然后形成顆粒。在包含溫度敏感性突變的病毒中，直到沿微管進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的所有事件在32℃都正常。然而，從微管易位到細(xì)胞表面可被阻礙，導(dǎo)致沿微管的定位。在37℃，推定即使是沿微管的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)也受阻，由此觀察到定位于高爾基體附近。M蛋白合成推定在高爾基體附近發(fā)生。然而，可能在這些位點(diǎn)觀察到M蛋白聚集，并且可能自身合成的區(qū)域在其它地方。然而，據(jù)報(bào)道，微管蛋白，即微管的成分，活化并參與SeV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制(Moyer，S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，5405-5409，1986；Ogino，T.等，J.Biol.Chem.274，35999-36008，1999)。然而，由于高爾基體位于中心體附近，其中預(yù)計(jì)微管蛋白大量存在，所述高爾基體可以在接近微管中心體處合成(即，接近高爾基體)。此外，盡管SeV突變株F1-R的M基因含有突變，其在感染細(xì)胞后修飾微管，且所述修飾可使得顆粒形成不依賴(lài)F1-R株的細(xì)胞極性(Tashiro，M.等，J.Virol.67，5902-5910，1993)。換言之，本實(shí)施例所得結(jié)果可通過(guò)推定M蛋白沿微管蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)而解釋。在推定的機(jī)制中，將溫度敏感性突變導(dǎo)入M和HN基因可導(dǎo)致缺陷型亞細(xì)胞M蛋白定位，導(dǎo)致二次顆粒釋放的減少。
構(gòu)建包含EGFP基因的M基因缺陷型SeV的基因組cDNAcDNA的構(gòu)建使用M缺陷型SeV(其是M基因缺陷型(pSeV18+/ΔMWO 00/09700))的全長(zhǎng)基因組cDNA。構(gòu)建方案如圖17所示。包含pSeV18+/ΔM的M缺陷位點(diǎn)的BstEII片段(2098 bp)亞克隆到pSE280(pSE-BstEIIfrg結(jié)構(gòu))的BstEII位點(diǎn)。pSE280位點(diǎn)的EcoRV識(shí)別位點(diǎn)通過(guò)用SalI/XhoI消化隨后進(jìn)行連接而缺失(Invitrogen，Groningen，Netherlands)。包含GFP基因的pEGFP(TOYOBO，Osaka，Japan)用Acc65I和EcoRI消化，且消化物的5’-末端通過(guò)使用DNA截短試劑盒(Takara，Kyoto，Japan)形成平末端。平末端片段隨后亞克隆到pSE-BstEIIfrg中，其已經(jīng)由EcoRV消化并由BAP(TOYOBO，Osaka，Japan)處理。所述包含EGFP基因的BstEII片段，返回最初的pSeV18+/ΔM以構(gòu)建包含位于M缺陷位點(diǎn)的EGFP基因的M基因缺陷型SeV基因組cDNA(pSeV18+/ΔM-GFP)。
構(gòu)建基因組M基因缺陷和復(fù)制能力缺陷的SeV的cDNA
構(gòu)建M基因缺陷型和F基因缺陷型SeV的基因組cDNA。下述構(gòu)建方案如圖18所示。M基因用pBlueNaeIfrg-ΔFGFP缺失，其可通過(guò)將F缺陷型仙臺(tái)病毒全長(zhǎng)基因組cDNA(其包含位于F基因缺陷位點(diǎn)的EGFP基因)的NaeI片段(4922 bp)(pSeV18+/ΔF-GFPLi，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)亞克隆到pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRV位點(diǎn)而構(gòu)建。缺失的設(shè)計(jì)使得可利用緊接在M基因之后的ApaLI位點(diǎn)直接切割M基因。即，ApaLI識(shí)別位點(diǎn)插入P基因后，使得待切除的片段變成6n，誘變使用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，LaJolla，CA)根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。用于誘變的合成寡核苷酸序列如下5’-agagtcactgaccaactagatcgtgcacgaggcatcctaccatcctca-3’/SEQ ID NO24和5’-tgaggatggtaggatgcctcgtgcacgatctagttggtcagtgactct-3’/SEQ ID NO25.
誘變后，產(chǎn)生的突變cDNA用ApaLI(在37℃，5分鐘)部分消化，使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，Bothell，WA)回收，然后進(jìn)行連接。再次用QIAquick PCR純化試劑盒回收，用BsmI和StuI消化，并用于轉(zhuǎn)化H5以制備M基因缺陷的(和F基因缺陷的)DNA(pBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFP)。
M基因缺陷的pBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFP(和F基因)用SalI和ApaLI消化以回收包含M基因缺陷位點(diǎn)的1480 bp片段。pSeV18+/ΔF-GFP用ApaLI/NheI消化以回收含HN基因的片段(6287 bp)，且這兩個(gè)片段被克隆到Litmus 38 (New Engl和Biolabs，Beverly，MA)的 SalI/NheI位點(diǎn)(LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFP結(jié)構(gòu))。通過(guò)用SalI/NheI消化LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFP回收的7767 bp片段與另一用SalI/NheI消化pSeV18+/ΔF-GFP所得的片段(8294 bp)連接，后一片段不包含基因例如M和HN基因。由此，構(gòu)建了在缺陷位點(diǎn)(pSeV18+/ΔMΔF-GFP)包含EGFP基因的M缺陷型和F缺陷型仙臺(tái)病毒全長(zhǎng)基因組cDNA。如此構(gòu)建的M缺陷型(和M缺陷型及F缺陷型)病毒的結(jié)構(gòu)如圖19所示。該基因組cDNA可用于構(gòu)建包含所需修飾后F蛋白的M缺陷型和F缺陷型SeV。
制備表達(dá)SeV-M蛋白的輔助細(xì)胞為制備表達(dá)M蛋白的輔助細(xì)胞，使用Cre/loxP表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)。為構(gòu)建該系統(tǒng)，使用質(zhì)粒pCALNdLw，其被設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)使用Cre DNA重組酶表達(dá)基因產(chǎn)物(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)。該系統(tǒng)也用于制備F蛋白的輔助細(xì)胞(LLC-MK2/F7細(xì)胞)(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)。
<1>表達(dá)M基因的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)為制備誘導(dǎo)F和M蛋白表達(dá)的輔助細(xì)胞，使用上述LLC-MK2/F7細(xì)胞利用上述系統(tǒng)將M基因轉(zhuǎn)移到這些細(xì)胞。由于pCALNdLw/F用于轉(zhuǎn)移含F(xiàn)基因的新霉素抗性基因，其對(duì)于插入不同的藥物抗性基因以使得能夠使用相同的細(xì)胞是必要的。因此，根據(jù)圖20所述的方案，包含M基因的質(zhì)粒(pCALNdLw/MM基因插入pCALNdLw的SwaI位點(diǎn))的新霉素抗性基因用潮霉素抗性基因取代。即，用HincII和EcoT22I消化pCALNdLw/M后，含M基因的片段(4737 bp)通過(guò)在瓊脂糖上進(jìn)行電泳分離，并用QIAEXII Gel提取系統(tǒng)切除并回收相應(yīng)的帶。同時(shí)，用XhoI消化pCALNdLw/M以回收不包含新霉素抗性基因的片段(5941 bp)，然后用HincII進(jìn)一步消化以回收1779 bp的片段。通過(guò)使用pcDNA3.1hygro(+)(Invitrogen，Groningen，Netherlands)作為模板以及以下引物對(duì)進(jìn)行PCR制備潮霉素抗性基因hygro-5’(5’-tctcgagtcgctcggtacgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgag-3’/SEQ ID NO26)和hygro-3’(5’-aatgcatgatcagtaaattacaatgaacatcgaaccccagagtcccgcctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtc-3’)/SEQ ID NO27).
PCR產(chǎn)物使用QIAquick PCR純化試劑盒回收，并使用XhoI和EcoT22I消化。通過(guò)連接這三個(gè)片段構(gòu)建pCALNdLw-hygroM。
<2>克隆誘導(dǎo)SeV-M和SeV-F蛋白表達(dá)的輔助細(xì)胞使用Superfect轉(zhuǎn)染試劑通過(guò)產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體地，進(jìn)行以下步驟LLC-MK2/F7細(xì)胞以5×105細(xì)胞/皿鋪在直徑60mm的Petri皿中，并隨后在含10％FBS的D-MEM中培養(yǎng)24小時(shí)。pCALNdLw-hygroM(5μg)在不含F(xiàn)BS也不含抗體的D-MEM(共150μL)中稀釋。攪拌混合物，并加入30μL的Superfect轉(zhuǎn)染試劑，并再次攪拌混合物。在室溫放置10分鐘后，加入含10％FBS的D-MEM(1ml)。攪拌由此制備的轉(zhuǎn)染混合物，并加入已經(jīng)用PBS洗滌一次的LLC-MK2/F7細(xì)胞。在孵箱中在37℃和5％CO2大氣中培養(yǎng)3小時(shí)后，去除轉(zhuǎn)染混合物，并且用PBS洗滌細(xì)胞三次。含10％FBS的D-MEM加入已經(jīng)培養(yǎng)了24小時(shí)細(xì)胞中。培養(yǎng)后，細(xì)胞用胰蛋白酶解離，以大約5個(gè)細(xì)胞/孔的稀釋度鋪于96孔板上，并在含10％FBS的D-MEM(補(bǔ)充150μg/ml潮霉素)(Gibco-BRL，Rockville，MD)中培養(yǎng)約兩周。培養(yǎng)從單細(xì)胞增殖的克隆使其在6孔板上擴(kuò)增。共制備130個(gè)克隆，并如下具體分析。
<3>分析誘導(dǎo)一或多種SeV-M(和SeV-F)蛋白表達(dá)的輔助細(xì)胞克隆用Western印跡半定量分析如上述獲得的130個(gè)克隆中的M蛋白的表達(dá)。每個(gè)克隆鋪于6孔板上，并在接近滿底態(tài)時(shí)，根據(jù)Saito等(Saito，I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)的方法，用表達(dá)Cre DNA重組酶(AxCANCre)的重組腺病毒(稀釋于含5％FBS的MEM中)以MOI＝5進(jìn)行感染。在32℃培養(yǎng)兩天后，去除培養(yǎng)物上清。使用PBS洗滌細(xì)胞一次，并通過(guò)使用細(xì)胞刮器進(jìn)行分離。通過(guò)將如此回收細(xì)胞的1/10加樣于各個(gè)泳道進(jìn)行SDS-PAGE，然后使用抗M蛋白抗體根據(jù)實(shí)施例3和4所述的方法進(jìn)行Western印跡。在130個(gè)克隆中，相對(duì)高M(jìn)蛋白表達(dá)水平的那些克隆通過(guò)WesteRN印跡用抗F蛋白抗體(f236Segawa，H.等，J.Biochem.123，1064-1072，1998)分析。兩個(gè)結(jié)果都顯示在圖21中。
評(píng)估誘導(dǎo)SeV-M蛋白的表達(dá)的輔助細(xì)胞使用在實(shí)施例11中克隆的誘導(dǎo)SeV-M蛋白的表達(dá)的輔助細(xì)胞，進(jìn)行M缺陷型SeV(SeV18+/ΔM-GFP)的病毒重構(gòu)來(lái)評(píng)價(jià)這些細(xì)胞克隆的病毒產(chǎn)生能力。將SeV18+/ΔM-GFP的P0裂解物加入各克隆中，并檢驗(yàn)了是否觀察到GFP蛋白擴(kuò)散(無(wú)論M蛋白的反式提供(trans-supply)是否實(shí)現(xiàn))。如下制備P0裂解物。將LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿鋪于直徑100mm的Petri皿上5×106細(xì)胞/皿，培養(yǎng)24小時(shí)，和并隨后以MOI＝2用PLWUV-VacT7在室溫感染1小時(shí)。質(zhì)粒pSeV18+/ΔM-GFP，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L，pGEM/F-HN和pGEM/M分別以12μg，4μg，2μg，4μg，4μg和4μg/皿的重量比懸于Opti-MEM中。將相當(dāng)于1μg DNA/5μL的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑加入這些懸液并混合。所述混合物在室溫放置15分鐘，并最后加入3ml含3％FBS的Opti-MEM中。將混合物加入細(xì)胞，并隨后培養(yǎng)所述細(xì)胞。培養(yǎng)5個(gè)小時(shí)后，所述細(xì)胞用無(wú)血清MEM洗滌兩次，并在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，將LLC-MK2/F7/A細(xì)胞以8.5×106細(xì)胞/皿鋪于皿中，并進(jìn)一步在含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中在37℃培養(yǎng)兩天(P0)?；厥者@些細(xì)胞，并將沉淀重懸于2ml/皿Opti-MEM，和P0裂解物通過(guò)重復(fù)三次冷凍和解凍循環(huán)而制備。同時(shí)，將10個(gè)不同的克隆鋪于24孔板上。當(dāng)接近滿底時(shí)，它們用AxCANCre以MOI＝5感染，并在32℃培養(yǎng)兩天。這些細(xì)胞用SeV18+/ΔM-GFP的P0裂解物以200μL/孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并使用含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶的無(wú)血清MEM在32℃培養(yǎng)。由SeV18+/ΔM-GFP造成的GFP蛋白的擴(kuò)散在克隆#18和#62(圖36)中觀察到。所述擴(kuò)散在克隆#62中特別快，所述克隆用于隨后的實(shí)驗(yàn)中。此后，這些細(xì)胞在用AxCANCre誘導(dǎo)前稱(chēng)為L(zhǎng)LC-MK2/F7/M62。保溫后，持續(xù)表達(dá)F和M蛋白稱(chēng)為L(zhǎng)LC-MK2/F7/M62/A。繼續(xù)用LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞制備SeV18+/ΔM-GFP細(xì)胞。P2感染后6天，制備9.5×107GFP-CIU的病毒。P4感染后5天，制備3.7×107GFP-CIU的病毒。
如實(shí)施例3所示，推定在P1階段后于32℃培養(yǎng)對(duì)于回收SeV18+/ΔM-GFP病毒特別重要。在SeV18+/ΔM-GFP中，M蛋白從表達(dá)細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M62/A)的反式供給被認(rèn)為是一個(gè)原因；然而，感染的擴(kuò)散極慢，且最后在P1感染后7天觀察到(圖22)。因此，在病毒重構(gòu)實(shí)驗(yàn)中，“P1階段后在32℃培養(yǎng)”由其在重構(gòu)低效轉(zhuǎn)錄-復(fù)制或低形成感染性病毒顆粒能力的SeV中非常有效而得到支持。
使用誘導(dǎo)SeV-M蛋白表達(dá)的輔助細(xì)胞研究病毒制備條件研究了上述病毒的繁殖力。將LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞鋪于6孔板上并在37℃培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞接近滿底時(shí)，將溫度變?yōu)?2℃。一天后，這些細(xì)胞以MOI＝0.5用SeV18+/ΔM-GFP感染。培養(yǎng)物上清隨時(shí)間回收，并用新鮮培養(yǎng)基置換。由此回收的上清用于測(cè)定CIU和HAU。大多數(shù)病毒在感染后4-6天回收(圖23)。HAU在感染后保持6天以上，但在該時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞毒活性仍強(qiáng)烈顯示，表明原因不是來(lái)自病毒顆粒的HA蛋白，而是游離或與細(xì)胞碎片結(jié)合的HA蛋白的活性。因此為采集病毒，培養(yǎng)物上清優(yōu)選在感染后第5天回收。
M基因缺陷SeV的結(jié)構(gòu)確認(rèn)SeV18+/ΔM-GFP’的病毒基因通過(guò)PCR確認(rèn)，而病毒蛋白通過(guò)Western印跡確認(rèn)。在RT-PCR中，使用感染后6天的P2階段病毒。QIAamp病毒RNA袖珍試劑盒(QIAGEN，Bothell，WA)用于從病毒溶液中回收RNA。Thermoscript RT-PCR系統(tǒng)(Gibco-BRL，Rockville，MD)用于制備所述cDNA。這兩種系統(tǒng)都按試劑盒說(shuō)明中的方法使用。該試劑盒提供的隨機(jī)六聚物用作cDNA制備的引物。為證實(shí)所述產(chǎn)物從RNA開(kāi)始形成，在反轉(zhuǎn)錄酶存在或缺失下進(jìn)行RT-PCR。使用上述制備的cDNA作為模板進(jìn)行PCR，使用兩對(duì)引物P基因上的F3593(5’-ccaatctaccatcagcatcagc-3’/SEQ ID NO28)和F基因上的R4993(5’-ttcccttcatcgactatgacc-3’/SEQ ID NO29)的一種組合物，以及P基因上的F3208(5’-agagaacaagactaaggctacc-3’/SEQ ID NO30)和R4993的另一組合物。如從SeV18+/ΔM-GFP的基因結(jié)構(gòu)預(yù)期，1073 bp和1458 bp DNA的擴(kuò)增分別從前一組合物和后一組合物觀察到(圖24)。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶被缺省(RT-)時(shí)，基因擴(kuò)增不出現(xiàn)。當(dāng)插入M基因而不是GFP基因(pSeV18+GFP)時(shí)，分別擴(kuò)增1400 bp和1785 bp的DNA。這些DNA與上述那些的大小明顯不同，支持了該病毒在結(jié)構(gòu)上時(shí)M基因缺陷的這一事實(shí)。
蛋白確認(rèn)使用Western印跡進(jìn)行。LLC-MK2細(xì)胞分別用SeV18+/ΔM-GFP(圖中顯示為ΔM)，SeV18+/ΔF-GFP(圖中顯示為F)，和SeV18+GFP(圖中顯示為18+)以MOI＝3進(jìn)行感染，并在感染后3天回收培養(yǎng)物上清和細(xì)胞。培養(yǎng)物上清在48,000 xg離心45分鐘以回收病毒蛋白。SDS-PAGE后，進(jìn)行Western印跡以用抗M蛋白抗體，抗F蛋白抗體，和DN-1抗體(兔多克隆)(其主要檢測(cè)NP蛋白)，根據(jù)實(shí)施例3和4中的方法檢測(cè)蛋白。在用SeV18+/ΔM-GFP感染的細(xì)胞中，沒(méi)有檢測(cè)到M蛋白而觀察到F和/或NP蛋白。因此，該病毒也證實(shí)從蛋白角度上具有SeV18+/ΔM-GFP結(jié)構(gòu)(圖25)。在用SeV18+/ΔF-GFP感染的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到F蛋白，但所有檢測(cè)的病毒蛋白都在用SeV18+GFP感染的細(xì)胞中檢測(cè)到。此外，非常少的NP蛋白在用SeV18+/ΔM-GFP感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清中檢測(cè)到，表明沒(méi)有或由極少的二次釋放顆粒。
存在或缺失M基因缺陷型SeV的二次釋放顆粒的定量分析如實(shí)施例14所述，LLK-MK2細(xì)胞用SeV18+/ΔM-GFP以MOI＝3感染，并在感染后三天回收培養(yǎng)物上清，通過(guò)孔徑0.45μM的濾器過(guò)濾，并隨后在48,000 xg離心45分鐘以回收病毒蛋白。隨后使用Western印跡半定量地檢測(cè)培養(yǎng)物上清中的病毒蛋白。從SeV18+/ΔF-GFP感染的細(xì)胞中類(lèi)似地制備的樣品用作對(duì)照。制備各樣品的連續(xù)稀釋物并對(duì)其進(jìn)行Western印跡以使用DN-1抗體(主要識(shí)別NP蛋白)檢測(cè)蛋白。SeV18+/ΔM-GFP感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清中的病毒蛋白水平估計(jì)為SeV18+/ΔF-GFP感染的細(xì)胞的約1/100(圖26)。SeV18+/ΔF-GFP的樣品HA活性為64 HAU，比SeV18+/ΔM-GFP的樣品HA活性低2 HAU。
檢驗(yàn)了相同實(shí)驗(yàn)的時(shí)間過(guò)程。即，LLC-MK2細(xì)胞用SeV18+/ΔM-GFP以MOI＝3進(jìn)行感染，且隨時(shí)間(每天)回收培養(yǎng)物上清以測(cè)定HA活性(圖27)。感染后四天以上，檢測(cè)到少量HA活性。然而，感染后4天或4天以上的SeV18+/ΔM-GFP-感染的細(xì)胞中，LDH活性(細(xì)胞毒活性指示物)的測(cè)定顯示明顯的細(xì)胞毒活性(圖28)。這表明，很有可能升高的HA活性不是由于VLP，而是由于與細(xì)胞碎片結(jié)合或游離的HA蛋白的活性。此外，感染后5天獲得培養(yǎng)物上清使用Dosper脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(陽(yáng)離子脂質(zhì)體)(Roche，Basel，Switzerland)進(jìn)行檢驗(yàn)。培養(yǎng)物上清(100μL)與Dosper(12.5μL)混合，在室溫放置十分鐘，然后轉(zhuǎn)染到在6孔板上培養(yǎng)到滿底的LLC-MK2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后兩天在熒光顯微鏡下的觀察顯示在用SeV18+/ΔF-GFP感染的細(xì)胞上清(其含有二次釋放顆粒)中觀察到許多GFP陽(yáng)性細(xì)胞，而在SeV18+/ΔM-GFP感染的細(xì)胞上清中觀察到非常少的或幾乎沒(méi)有GFP-陽(yáng)性細(xì)胞(圖29)。從上述結(jié)果可見(jiàn)，顆粒的二次釋放推論被M蛋白缺陷幾乎完全抑制。
2.構(gòu)建由于修飾的蛋白酶依賴(lài)向性而具有降低或缺陷顆粒形成能力的SeV載體利用上述構(gòu)建的M缺陷型SeV的重構(gòu)系統(tǒng)，如下述構(gòu)建其中F蛋白切割位點(diǎn)被修飾的SeV。
構(gòu)建具有修飾的F蛋白活化位點(diǎn)的M缺陷型SeV基因組cDNA
構(gòu)建插入F蛋白F1/F2切割位點(diǎn)(活化位點(diǎn))的M缺陷型SeV基因組cDNA，其具有在癌細(xì)胞中高度表達(dá)的蛋白酶的識(shí)別序列。構(gòu)建基于用作MMP-2和MMP-9的合成底物的序列的各種序列，以及基于uPA底物的序列。圖30顯示4種序列兩種基于用作MMP-2和MMP-9的合成底物的序列而設(shè)計(jì)的序列(Netzel-Arnett，S.等，Anal.Biochem.195，86-92，1991)，其具有或不具有修飾[PLG↓MTS(SEQ ID NO3)和PLG↓LGL(SEQ ID NO31)；下文中，包含這些序列的F蛋白分別稱(chēng)為F(MMP#2)和F(MMP#3)]；另一序列通過(guò)僅插入3個(gè)氨基酸的序列PLG(其與MMP合成底物共通(common))而設(shè)計(jì)(下文中，具有該序列的F蛋白稱(chēng)為F(MMP#4))；以及基于uPA底物，VGR(SEQ ID NO6)設(shè)計(jì)的序列，(下文中，包含該序列的F蛋白稱(chēng)為F(uPA))。
對(duì)于目前設(shè)計(jì)為實(shí)現(xiàn)對(duì)目的MMPs(MMP-2和MMP-9)的選擇性作用的序列，可購(gòu)得的合成底物的序列，以及對(duì)底物特異性的進(jìn)行詳細(xì)研究的報(bào)告(Turk，B.E.等，Nature Biotech.19(7)，661-667，2001；Chen，E.I.等，J.Biol.Chem.277(6)，4485-4491，2002)可作為參考。尤其對(duì)于MMP-9，推薦從P3-P2’的共有序列，Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)(X＝任何殘基；Hy＝疏水殘基)(Kridel，S.J.等，J.Biol.Chem.276(23)，20572-20578，2001)。因此，F(xiàn)(MMP#2)被新設(shè)計(jì)為目前的設(shè)計(jì)，PLG↓MTS，來(lái)自初始合成底物的序列，PLG↓MWS，使得其與共有序列相匹配。
基因構(gòu)建方案顯示于圖31。M缺陷型仙臺(tái)病毒的M缺陷位點(diǎn)的全長(zhǎng)基因組cDNA(pSeV18+/ΔM-GFP)(其中EGFP基因被插入M缺陷位點(diǎn))，用SalI和NheI消化。包含F(xiàn)基因的片段(9634 bp)通過(guò)瓊脂糖凝膠和電泳分離，并隨后用QIAEXII凝膠提取系統(tǒng)(QIAGEN，Bothell，WA)切出相應(yīng)帶并進(jìn)行收獲。獲得的片段亞克隆到LITMUS38(New Engl和Biolabs，Beverly，MA)(LitmusSalI/NheIfrgΔM-GFP的結(jié)構(gòu))的SalI/NheI位點(diǎn)中。對(duì)F基因的誘變?cè)谠揕itmusSalI/NheIfrgΔM-GFP上，使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)根據(jù)試劑盒說(shuō)明的方法進(jìn)行。用于誘變的合成寡核苷酸的序列如下5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’(SEQ ID NO32)和
5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’(SEQ ID NO33)用于轉(zhuǎn)化成F(MMP#2)；5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3’(SEQ ID NO34)和5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’(SEQ ID NO35)用于轉(zhuǎn)化成F(MMP#3)；5’-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3’(SEQ ID NO36)和5’-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3’(SEQ ID NO37)用于轉(zhuǎn)化成F(MMP#4)；和5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCCCgtGggGAGATTCTTCGGTGCTGTGATTG-3’(SEQ ID NO38)和5’-CAATCACAGCACCGAAGAATCTCccCacGGGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3’(SEQ ID NO39)用于轉(zhuǎn)化成F(uPA)。
小寫(xiě)字母表示突變的核苷酸。
包含位于F基因上的目標(biāo)突變的LitmusSalI/NheIfrgΔM-GFP用SalI/NheI消化，來(lái)收集包含F(xiàn)基因的片段(9634 bp)。包含位于F缺陷位點(diǎn)的EGFP基因的F缺陷型仙臺(tái)病毒(pSeV18+/ΔF-GFPLi，H.-O.等，J.Virol.74，6564-6569，2000；WO 00/70070)用SalI和NheI消化以收集包含NP基因的片段(8294 bp)，并使用合成寡DNA將多克隆位點(diǎn)導(dǎo)入所述片段以獲得質(zhì)粒(pSeV/SalINheIfrg-MCSPCT/JP00/06051)。所得質(zhì)粒用SalI和NheI消化以收集片段(8294 bp)。收集的片段互相連接以構(gòu)建M缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP，pSeV18+/F(MMP#3)ΔM-GFP，或pSeV18+/F(MMP#4)ΔM-GFP，其包含F(xiàn)(MMP#2)，F(xiàn)(MMP#3)或F(MMP#4)基因(設(shè)計(jì)為通過(guò)MMP活化的F基因)，和M缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/F(uPA)ΔM-GFP)，其包含F(xiàn)(uPA)基因(設(shè)計(jì)為通過(guò)uPA活化的F基因)。
具有修飾的F活化位點(diǎn)的M缺陷型SeV載體的重構(gòu)和擴(kuò)增病毒的重構(gòu)根據(jù)Li等(Li，H.-O.等，J.Virol.74，6564-6569，2000；WO00/70070)報(bào)告的方法進(jìn)行。由于病毒是M缺陷的形式，使用反式提供M蛋白的上述輔助細(xì)胞(如實(shí)施例11中)。Cre/loxP表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)用于輔助細(xì)胞的制備。所述利用pCALNdLw質(zhì)粒的系統(tǒng)利用設(shè)計(jì)為利用Cre DNA重組酶誘導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)。因此，使用Saito等(Saito，I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)的方法，用表達(dá)Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，以表達(dá)插入的基因(見(jiàn)實(shí)施例11和12)。
其中F的活化位點(diǎn)被修飾的M缺陷SeV的重構(gòu)如下進(jìn)行。LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿鋪于100-mm的皿中，并保溫24小時(shí)。表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)用補(bǔ)骨酯素在紫外A照射下(365 nm)處理20分鐘，并在室溫感染(MOI＝2)細(xì)胞一小時(shí)。所述細(xì)胞用無(wú)血清MEM洗滌。pSeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP(可選為，pSeV18+/F(MMP#3)ΔM-GFP，pSeV18+/F(MMP#4)ΔM-GFP，或pSeV18+/F(uPA)ΔM-GFP)，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)，和pGEM/F-HN(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)質(zhì)粒以12μg，4μg，2μg，4μg，和4μg/皿的密度分別懸于Opti-MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。對(duì)應(yīng)5μL/1μg DNA的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，Bothell，WA)加入各溶液中，混合，隨后在室溫放置15分鐘。最后，所述混合物以3％的終濃度加入3mL的含PBS的Opti-MEM中，并隨后加入細(xì)胞中用于培養(yǎng)。培養(yǎng)5小時(shí)后，所述細(xì)胞用無(wú)血清MEM洗滌兩次，并在含和40μg/mL胞苷酸β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/mL胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，持續(xù)表達(dá)M蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M62/A)以8.5×106細(xì)胞/皿的密度生長(zhǎng)成層，并在含40μg/mL AraC和7.5μg/mL胰蛋白酶的MEM中在37℃再培養(yǎng)兩天(P0)。收集這些細(xì)胞，并將沉淀懸于2mL/皿的Opti-MEM中。重復(fù)三次凍融后，所述裂解物直接轉(zhuǎn)染到LLC-MK2/F7/M62/A中，并在32℃含40μg/mL AraC，7.5μg/mL胰蛋白酶，和50U/mL IV型膠原酶的無(wú)血清MEM(ICN，Aurola，OH)(P1)中培養(yǎng)。3-14天后，取出部分培養(yǎng)物上清并轉(zhuǎn)染到剛制備的LLC-MK2/F7/A中，并在32℃含40μg/mLAraC，7.5μg/mL胰蛋白酶，和50U/mL IV型膠原酶(P2)的無(wú)血清MEM中培養(yǎng)。3-14天后，將培養(yǎng)物再次轉(zhuǎn)染到剛制備的LLC-MK2/F7/M62/A，并在32℃含7.5μg/mL胰蛋白酶和50U/mL IV型膠原酶(P3)的無(wú)血清MEM中培養(yǎng)2-7天。將BSA加入收集的培養(yǎng)物上清中使得終濃度為1％，并將培養(yǎng)物保存在-80℃。解凍病毒株溶液用于隨后的制備和體外實(shí)驗(yàn)。
此外，能以高滴度產(chǎn)生M缺陷型SeV載體的輔助細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M62-#33)通過(guò)將同一系統(tǒng)的SeV-M基因(和SeV-F基因)(pCALNdLwArai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)導(dǎo)入LLC-MK2/F7/M62作為輔助細(xì)胞(其反式提供M蛋白，并繼續(xù)細(xì)胞的克隆)成功獲得。使用這些細(xì)胞，其中F基因沒(méi)有突變的M缺陷型SeV載體(SeV18+/ΔM-GFP)可以以1×108GFP-CIU/mL(GFP-CIU定義在WO 00/70070中)或更高滴度產(chǎn)生。此外，使用這些細(xì)胞還實(shí)現(xiàn)了SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP和SeV18+/F(uPA)ΔM-GFP以1×108GFP-CIU/mL或更高滴度的制備。
當(dāng)對(duì)SeV18+/F(MMP#3)ΔM-GFP和SeV18+/F(MMP#4)ΔM-GFP類(lèi)似地進(jìn)行重構(gòu)時(shí)，不能收集病毒顆粒。為收集這些病毒顆粒，重構(gòu)條件必須進(jìn)一步檢驗(yàn)?？紤]到它們不可在相同條件下收集的事實(shí)，F(xiàn)(MMP#3)和F(MMP#4)中的F1/F2切割位點(diǎn)(F蛋白的活化位點(diǎn))可能有問(wèn)題，其導(dǎo)致例如低切割效率或切割后的F蛋白的活性較弱。
制備具有修飾的F活化位點(diǎn)的M缺陷型SeV載體的體內(nèi)樣品各種用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的M缺陷型SeV載體通過(guò)簡(jiǎn)單的純化制備，其中病毒顆粒通過(guò)離心而沉淀。LLC-MK2/F7/M62-#33在6孔板上長(zhǎng)到幾乎滿底，用AxCANCre(MOI＝5)感染，并隨后在32℃培養(yǎng)兩天。這些細(xì)胞用SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP或SeV18+/ΔM-GFP以MOI＝0.5感染。隨后，在32℃，將用SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP感染的細(xì)胞在含7.5μg/mL胰蛋白酶和50 U/mL IV型膠原酶的無(wú)血清MEM(1mL/孔)中培養(yǎng)3天；并將SeV18+/ΔM-GFP感染的細(xì)胞在僅含7.5μg/mL胰蛋白酶的無(wú)血清MEM(1mL/孔)中培養(yǎng)3天。從六個(gè)孔內(nèi)收集上清，并混合，然后在2,190 xg離心15分鐘。收集的上清通過(guò)濾器(其孔內(nèi)徑為0.45μM)，并隨后進(jìn)一步在40,000 xg離心30分鐘。產(chǎn)生的沉淀懸于500μL的PBS中制備純化的病毒溶液。如上述制備的M缺陷型SeV載體的滴度為1.3×109和4.5×109GFP-CIU/mL(分別對(duì)應(yīng)SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP和SeV18+/ΔM-GFP)。切割實(shí)施例17和18中制備的病毒中的F蛋白，且所述病毒具有感染力。這種SeV稱(chēng)為F-切割的SeV或感染性SeV。下文中，SeV18+/ΔM-GFP，SeV18+/F(MMP#2)ΔM-GFP，和SeV18+/F(uPA)ΔM-GFP也分別簡(jiǎn)化為SeV/ΔM-GFP，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，和SeV/F(uPA)ΔM-GFP。
評(píng)估蛋白酶依賴(lài)的感染和F修飾M缺陷型SeV載體的細(xì)胞融合型感染<1>外源性實(shí)驗(yàn)其中將細(xì)胞外蛋白酶加入細(xì)胞系的感染方法稱(chēng)為外源性實(shí)驗(yàn)。以下實(shí)施例中進(jìn)行的外源性實(shí)驗(yàn)的基本步驟如下所述。不同條件的使用在各實(shí)施例中描述。LLC-MK2培養(yǎng)到鋪滿96孔板(5×105細(xì)胞/孔)。用MEM洗滌兩次后，將含SeV(F-切割的形式1×105CIU/mL，或F-未切割的形式1×107顆粒/mL(表示為HA單位；見(jiàn)實(shí)施例25)]的50μL MEM加入并感染細(xì)胞。同時(shí)，也加入含MEM的50μL蛋白酶，并在37℃培養(yǎng)細(xì)胞。四天后，在熒光顯微鏡下觀察到感染的擴(kuò)散。計(jì)數(shù)1mm2內(nèi)的細(xì)胞中表達(dá)GPF的細(xì)胞數(shù)。將使用的蛋白酶購(gòu)自ICN Biomedicals Inc.for膠原酶(IV型膠原酶)，和MMP-2(活性MMP-2)，MMP-3，MMP-7，MMP-9(活性MMP-9)，和纖維蛋白溶酶購(gòu)自COSMO BIO Co.ltd。
<2>內(nèi)源性實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白酶而不加入細(xì)胞外蛋白酶的感染方法稱(chēng)為內(nèi)源性實(shí)驗(yàn)。以下實(shí)施例中進(jìn)行的內(nèi)源性實(shí)驗(yàn)的基本步驟描述如下。不同條件的使用在各實(shí)施例中描述。各種癌細(xì)胞培養(yǎng)到鋪滿96孔板(5×105細(xì)胞/孔)。用MEM洗滌兩次后，將含SeV(F-切割的形式1×105CIU/mL，或F-未切割的形式1×107顆粒/mL(表示為HA單位；見(jiàn)實(shí)施例25))的50μL MEM加入并感染細(xì)胞。同時(shí)，也加入含MEM的50μL蛋白酶，并在37℃培養(yǎng)細(xì)胞。四天后，在熒光顯微鏡下觀察到感染的擴(kuò)散。計(jì)數(shù)1mm2內(nèi)的細(xì)胞中表達(dá)GPF的細(xì)胞數(shù)。
通過(guò)F修飾的M缺陷型仙臺(tái)病毒載體的蛋白酶依賴(lài)的細(xì)胞融合型感染(外源性實(shí)驗(yàn))使用幾乎不表達(dá)蛋白酶的LLC-MK2細(xì)胞，證實(shí)F的修飾，并通過(guò)上述外源性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，從而確定它是否造成蛋白酶依賴(lài)的細(xì)胞融合型感染(圖32)。用三種類(lèi)M缺陷型SeV(如實(shí)施例17所述)，SeV/ΔM-GFP，SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，和SeV/F(uPA)ΔM-GFP，感染細(xì)胞。同時(shí)，將0.1μg/mL的各種IV型膠原酶(溶組織梭菌(Clostridium histolyticum))，活性MMP-2，活性MMP-9，或uPA，或7.5μg/mL胰蛋白酶加入其中。四天后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。僅在加入胰蛋白酶的LLC-MK2中，具有未修飾F的SeV/ΔM-GFP導(dǎo)致感染細(xì)胞與其周?chē)?xì)胞的融合，導(dǎo)致細(xì)胞融合型感染和多核細(xì)胞(合胞體)形成(圖32L)。其F蛋白中插入MMP降解序列的SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP顯示LLC-MK2的細(xì)胞融合型感染(其中加入了膠原酶，活性MMP-2，和活性MMP-9)，導(dǎo)致合胞體形成(圖32E，32F，和32M)。另一方面，其F蛋白中插入了尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和組織型PA(tPA)降解序列的SeV/F(uPA)ΔM-GFP自胰蛋白酶存在下顯示了細(xì)胞融合型感染，并且對(duì)F蛋白進(jìn)一步修飾時(shí)，在存在uPA時(shí)顯示合胞體，多核細(xì)胞的形成(圖32Q和32R)。這些結(jié)果表明，由于各種蛋白酶降解底物序列摻入F蛋白，M缺陷型SeV導(dǎo)致降解底物依賴(lài)的細(xì)胞融合型感染，并擴(kuò)散到接觸的細(xì)胞。
癌細(xì)胞系的MMP表達(dá)特異性細(xì)胞融合型感染(內(nèi)源性實(shí)驗(yàn))使用實(shí)施例17中制備的SeV，進(jìn)行內(nèi)源性實(shí)驗(yàn)以測(cè)定是否存在內(nèi)源蛋白酶選擇性細(xì)胞融合型感染。使用表達(dá)MMP的癌細(xì)胞系，HT1080(人纖維母細(xì)胞肉瘤)(Morodomi，T.等，Biochem.J.285(Pt 2)，603-611，1992)，表達(dá)tPA的細(xì)胞系，MKN28(人胃癌細(xì)胞系)(Koshikawa，N.等，Cancer Res.52，5046-5053，1992)，和不表達(dá)任一蛋白酶的細(xì)胞系，SW620(人結(jié)腸癌細(xì)胞系)。MKN28得自Riken Institute of Physical and Chemical Research(Cell No.RCB1000)，而用于以下實(shí)施例的HT1080(ATCC No.CCL-121)和SW620(ATCC No.CCL-227)，以及SW480(ATCC No.CCL-228)，WiDr(ATCC No.CCL-218)，和Panc-1(ATCC No.CRL-1469)得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。提供細(xì)胞的不同研究所所用培養(yǎng)基用于實(shí)驗(yàn)中。此外，將FBS以1％的終濃度加入所有培養(yǎng)基中。如圖33所示，在表達(dá)MMP的細(xì)胞系，HT1080中，只有用SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染擴(kuò)散10倍或更多。此外，在表達(dá)tPA的細(xì)胞系，MKN28中，只有用SeV/F(uPA)ΔM-GFP的細(xì)胞融合型感染擴(kuò)散。在不表達(dá)任一蛋白酶的SW620中，根本沒(méi)有觀察到感染的擴(kuò)散。
由佛波醇酯誘導(dǎo)的MMP造成的細(xì)胞融合型感染據(jù)報(bào)道，癌細(xì)胞周?chē)纳L(zhǎng)因子，可在體內(nèi)在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)MMP。該現(xiàn)象可使用佛波醇酯，即佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸(PMA)在體外復(fù)制。為研究出現(xiàn)在復(fù)制條件(其中MMP表達(dá)被誘導(dǎo))下的感染，PancI，已知通過(guò)PMA活化MMP-2并誘導(dǎo)MMP-9的胰腺癌細(xì)胞系，用來(lái)通過(guò)F修飾的M缺陷型SeV載體檢驗(yàn)細(xì)胞融合型感染的存在或缺失(Zervos，E.E.等，J.Surg.Res.84，162-167，1999)。PancI和其它癌細(xì)胞系培養(yǎng)在96孔中直到滿底(5×105細(xì)胞/孔)。所述內(nèi)源性實(shí)驗(yàn)用實(shí)施例7中制備的SeV進(jìn)行。用MEM洗滌兩次后，將50μL含有1×105CIU/mL SeV的MEM加入用來(lái)感染(MOI＝0.01)。加入相同量的(50μL)MEM(含40nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸(Sigma)。同時(shí)，將FBS加入培養(yǎng)基使其終濃度為1％。
MMP-2和MMP-9的誘導(dǎo)的表達(dá)通過(guò)凝膠酶譜法(其中存在凝膠水解活性的部分變清)而證實(shí)(Johansson，S.，和Smedsrod，B.，J.Biol.Chem.261，4363-4366，1986)。具體地，收集每種培養(yǎng)物的上清并溶于樣品緩沖液中。所述混合物與丙稀酰胺混合，使凝膠終濃度為1mg/mL以制備8％的丙稀酰胺凝膠。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，所述凝膠用10mM Tris(pH 8.0)和2.5％Triton X-100在37℃洗滌凝膠，在明膠酶活化緩沖液(50mM Tris，0.5mM CaCl2，10-6M ZnCl2)中保溫一天并用1％考馬斯藍(lán)R-250，5％醋酸，和10％甲醇染色(圖34的上半部)?！癈”代表對(duì)照，且“T”代表由20nM PMA誘導(dǎo)的樣品上清。所述圖上部顯示MMP-9在HT1080和Panc I中誘導(dǎo)。在Panc I中進(jìn)行誘導(dǎo)前檢測(cè)潛在的MMP-2。然而，該潛在形式已知幾乎不具有任何凝膠水解活性。如圖34(下半部)用SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP感染的Panc I通過(guò)MMP誘導(dǎo)指示細(xì)胞融合型感染。
SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染在體內(nèi)HT1080細(xì)胞系中的擴(kuò)散制備患癌HT1080裸鼠。將人纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HT1080的5×106個(gè)細(xì)胞(50μL，1×108細(xì)胞/mL)，經(jīng)皮下注入BALB/c裸鼠(Charles River)的右背皮膚。7-9天后，使用具有直徑大于3mm的腫瘤的動(dòng)物。癌體積(其形狀推定為橢圓形)為30-100 mm3。將50μL的以下F-切割型SeV一次性注入癌MEM(對(duì)照)(N＝5)；含SeV-GFP的MEM(1×108CIU/mL)(N＝5)；含SeV/ΔM-GFP的MEM(1×108CIU/mL)(N＝7)；和含SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的MEM(1×108CIU/mL)(N＝7)。兩天后，在熒光顯微鏡下觀察上述癌(圖35)。僅在SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP注射位點(diǎn)附近的區(qū)域觀察到熒光(圖35E和35H)。反之，對(duì)于SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，觀察到熒光擴(kuò)散到整個(gè)癌(圖35K)。放大圖像顯示，來(lái)自對(duì)應(yīng)SeV-GFP和SeV/ΔM-GFP的單個(gè)細(xì)胞的熒光，而對(duì)于SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP，細(xì)胞形狀不清楚，提示細(xì)胞融合。此外，整個(gè)癌區(qū)和GFP表達(dá)區(qū)在上述圖像中通過(guò)NIH image測(cè)定。GFP表達(dá)區(qū)在整個(gè)癌中的比例為10％(對(duì)應(yīng)SeV-GFP)和20％(對(duì)應(yīng)SeV/ΔM-GFP)，且反之，對(duì)應(yīng)SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的所述比例為90％，明顯表明感染擴(kuò)散(圖36)。在除癌組織以外的組織中，細(xì)胞融合型感染在與癌細(xì)胞鄰接的筋膜和皮下連接組織中幾乎不能觀察到。因此，在這些條件下，確定感染不擴(kuò)散到癌組織以外的正常組織。
F修飾的M缺陷型SeV載體對(duì)患癌裸鼠的抗腫瘤效果HT1080患瘤小鼠如圖35中所述以相同的方式制備。8或9天后，患直徑大于3mm的腫瘤的動(dòng)物被選出，并將50μL以下四種F-切割的SeV注入癌位點(diǎn)MEM(N＝5)；含SeV-GFP(1×108CIU/mL)的MEM(N＝5)；含MSeV/ΔM-GFP(1×108CIU/mL)的MEM(N＝7)；和含SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP(1×108CIU/mL)的MEM(N＝7)。兩天后，將等量的SeV再次注入癌位點(diǎn)。每隔一天測(cè)定癌位點(diǎn)的長(zhǎng)軸(a)，短軸(b)和厚度(c)的長(zhǎng)度。推定癌是橢圓體形，癌體積按V＝π/6 x abc計(jì)算。分別給藥PBS，SeV-GFP，和SeV/ΔM-GFP的癌迅速長(zhǎng)大。反之，給藥SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的癌(其中載體擴(kuò)散到整個(gè)癌，如圖37所示)，明確顯示沒(méi)有擴(kuò)增并保持小的體積。通過(guò)t檢驗(yàn)分析顯著性差異顯示，與其它三組相比，其體積明顯更小，P＜0.05。這表明即使沒(méi)有治療基因所述載體仍具有抗癌效果。
制備和選擇性感染F-未切割/F修飾的M缺陷型SeV載體在上述使用的SeV載體的制備步驟中，在含有高濃度胰蛋白酶和50U/mL膠原酶的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以誘導(dǎo)F的切割，并收集F切割的載體(見(jiàn)實(shí)施例17和18)。在本實(shí)施例中，F(xiàn)未切割的SeV通過(guò)收集在制備過(guò)程中不加入蛋白酶的SeV而產(chǎn)生。
具體地，LLC-MK2/F7/M62/A細(xì)胞在10cm的皿中培養(yǎng)直到滿底。用實(shí)施例17中制備的每種F修飾的M缺陷型SeV感染細(xì)胞(MOI＝5)。一小時(shí)后，去除上清并用MEM培養(yǎng)基洗滌兩次。將4mL MEM加入細(xì)胞并在32℃培養(yǎng)。5天后，收集上清，并將牛血清白蛋白(BSA)加入(終濃度為1％)。測(cè)定HAU滴度后，將上清保存在-70℃?zhèn)溆?。收集每種F修飾的M缺陷型SeV，使其濃度范圍在27-210HAU/mL(1 HAU＝1×106病毒顆粒/mL，并因此對(duì)應(yīng)1×108-1×109顆粒/mL)，并通過(guò)稀釋調(diào)節(jié)到1×108。
該外源性試驗(yàn)的結(jié)果分別證實(shí)了由SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP和SeV/F(uPA)ΔM-GFP以MMP依賴(lài)的以及以u(píng)PA-或tPA依賴(lài)的方式感染LLC-MK2的載體的產(chǎn)生(外源性蛋白酶的數(shù)據(jù)未顯示)。此外，蛋白酶表達(dá)造成的選擇性感染在表達(dá)MMP的HT1080菌株，表達(dá)tPA的MKN28菌株以及幾乎不表達(dá)所述蛋白酶的SW620中是否可能，通過(guò)內(nèi)源性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)(圖38)。SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP感染表達(dá)MMP的HT1080菌株，但不感染表達(dá)tPA的MKN28菌株。SeV/F(uPA)ΔM-GFP感染表達(dá)tPA的MKN28菌株但不感染表達(dá)MMP的HT1080菌株。如上述，每種SeV顯示蛋白酶依賴(lài)的選擇性感染。
由于由于人纖維母細(xì)胞對(duì)MMP-3和MMP-7的誘導(dǎo)導(dǎo)致的F修飾的M缺陷型SeV載體感染
通過(guò)與纖維母細(xì)胞共培養(yǎng)或者體內(nèi)培養(yǎng)，SW480和WiDr分別誘導(dǎo)MMP-3和MMP-7(Kataoka，H.等，Oncol.Res.9，101-109，1997；Mc Donnell，S.等，Clin.Exp.Metastasis.17，341-349，1999)。使用這些細(xì)胞研究F修飾的M缺陷型SeV載體的感染在體內(nèi)是否改變。每種癌細(xì)胞系培養(yǎng)在96孔板直到滿底(5×104細(xì)胞/孔)。用MEM洗滌兩次后，加入含1HAU/mL的F-未切割的SeV(1HAU＝1×106病毒顆粒/mL，并因此相當(dāng)于1×106顆粒/mL)的50μL MEM用于感染。正常人肺纖維母細(xì)胞(TAKARA)以5×104細(xì)胞/孔的濃度加入細(xì)胞中并在37℃培養(yǎng)四天(圖39)。SW480和WiDr用SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP通過(guò)與人纖維母細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行感染。這種現(xiàn)象在SW620中沒(méi)有觀察到，其是不可誘導(dǎo)的。
F修飾的M缺陷型SeV載體對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的MMP選擇性感染MMP的錯(cuò)誤表達(dá)(aberrant expression)除在癌癥中有報(bào)道外，還在動(dòng)脈硬化，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，傷口愈合有所報(bào)道(Galis，Z.S.，和Khatri，J.J.，Circ.Res.90，251-262，2002；Martel-Pelletier，J.等，Best Pract.Res.Clin.Rheumatol.15，805-829，2001)。
為證明F修飾的M-缺失型SeV載體對(duì)這些疾病的可應(yīng)用性，進(jìn)行了載體對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的MMP選擇性感染。人平滑肌細(xì)胞(TAKARA)培養(yǎng)于96孔板直到滿底(5×105細(xì)胞/孔)。用MEM洗滌兩次后，將50μL含SeV(F-未切割的形式1 HAU/mL(1×106顆粒/mL))的MEM加入細(xì)胞進(jìn)行感染。將等量(50μL)的含蛋白酶MEM加入其中，并在37℃培養(yǎng)四天。計(jì)算每1mm2的細(xì)胞中表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)目(圖40)。SeV/ΔM-GFP的感染通過(guò)僅加入胰蛋白酶增強(qiáng)，然而SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP的感染通過(guò)加入膠原酶，MMP-2，MMP-3和MMP-9增強(qiáng)。
F修飾的M缺陷型SeV載體中F蛋白的蛋白酶依賴(lài)的切割如實(shí)施例20所示，通過(guò)將各蛋白酶降解序列摻入F蛋白，F(xiàn)修飾的M缺陷型SeV載體顯示依賴(lài)于這些降解序列的細(xì)胞融合型感染。此外，修飾后F0的切割是否以蛋白酶依賴(lài)的方式出現(xiàn)通過(guò)Western印跡證實(shí)。通過(guò)以下方法對(duì)病毒取樣。三種類(lèi)型的病毒顆粒，SeV/ΔM，SeV/F(MMP#2)ΔM，和SeV/F(uPA)ΔM，以MOI＝3感染M蛋白誘導(dǎo)的輔助細(xì)胞。感染后兩天，收集上清并在18,500xg離心三小時(shí)，并將沉淀重懸于PBS中。對(duì)各病毒懸液而言，加入蛋白酶使胰蛋白酶的終濃度為7.5μg/mL，MMP-9的終濃度為0.1ng/mL，且uPA的終濃度為和0.1ng/mL，并在在37℃保溫30分鐘。將樣品緩沖液加入各混合物以制備SDS-PAGE樣品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡(Kido，H.等“Isolation and characterization of anovel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells.Apossible activator of the virus fusion glycoprotein.”J Biol Chem 267，13573-13579，1992)。通過(guò)用三種合成肽(FFGAVIGT+Cys117-124，EAREAKRDIALIK143-155，和CGTGRRPISQDRS401-413；分別為SEQID NO46，47，和48)的混合物進(jìn)行免疫，獲得作為抗血清的兔抗F1抗體。HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體(ICN，Aurola，OH)用作二級(jí)抗體，且化學(xué)熒光法(ECL Western印跡檢測(cè)試劑；Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)用于檢測(cè)出現(xiàn)的顏色。圖41顯示用上述蛋白酶在37℃處理以下物質(zhì)30分鐘的結(jié)果包含未修飾的F的M缺陷型SeV載體(1，4，7，和10)，具有插入F的MMP#2序列的M缺陷型SeV載體(2，5，8，和11)，以及具有插入F的uPA序列的M缺陷型SeV載體(3，6，9，和12)。
如圖41所示，F(xiàn)1的切割根據(jù)各插入的蛋白酶底物，分別在以下情況下出現(xiàn)，即對(duì)于具有未修飾的F的M缺陷型SeV載體為在胰蛋白酶存在的條件下，對(duì)于具有插入F的MMP#2序列的M缺陷型SeV載體為在MMP存在的條件下，對(duì)于具有插入F的uPA序列的M缺陷型SeV載體為在uPA存在的條件下。盡管未顯示，對(duì)于插入了uPA序列的M缺陷型SeV載體，當(dāng)降解時(shí)間延長(zhǎng)到四小時(shí)的情況下，F(xiàn)1的切割在胰蛋白酶存在的條件下觀察到。這與實(shí)施例20的結(jié)果很好地相符，并表明合胞體形成以F切割依賴(lài)的方式出現(xiàn)。
通過(guò)F蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失增加融合力副粘病毒對(duì)宿主的浸潤(rùn)通過(guò)將病毒膜和宿主細(xì)胞膜融合實(shí)現(xiàn)。在這一浸潤(rùn)機(jī)制中，仙臺(tái)病毒的HN蛋白與宿主的唾液酸結(jié)合，且F蛋白導(dǎo)致細(xì)胞膜融合。在該步驟中，由于HN的結(jié)合導(dǎo)致的F蛋白的構(gòu)象變化據(jù)提示是重要的(Russell，C.J.，Jardetzky，T.S.和Lamb，R.A.，“Membrane fusionmachines of paramyxoviruscapture of intermediates of fusion.”EMBO J.20，4024-34，2001)。因此，副粘病毒的大部分F蛋白在細(xì)胞上單獨(dú)表達(dá)時(shí)不顯示細(xì)胞致融合力。只有同時(shí)表達(dá)HN蛋白的細(xì)胞具有致融合力。副粘病毒中F和HN蛋白胞質(zhì)區(qū)的缺失已知增強(qiáng)其致融合力(Cathomen，T.，Naim，H.Y.和Cattaneo，R.，“Measles virus with altered envelope protein cytoplasmic tailsgain cell fusion competence.”J.Virol.72，1224-34，1998)。為測(cè)定仙臺(tái)病毒中的F蛋白的胞質(zhì)區(qū)的哪個(gè)缺失突變體導(dǎo)致致融合力增加最多，制備缺失突變體，并將其插入pCAGGS表達(dá)載體(Niwa，H.等，Gene 108，193-199，1991)。對(duì)攜帶HN的pCAGGS進(jìn)行共轉(zhuǎn)染并且根據(jù)形成的合胞體的數(shù)目證實(shí)產(chǎn)生的致融合力。
對(duì)各突變基因(其中F的胞質(zhì)區(qū)已經(jīng)缺失)進(jìn)行PCR，使用以下引物，產(chǎn)生的片段用XhoI和NotI處理，并隨后連接于pCAGGS載體。用于PCR的引物如下Fct27引物(5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/SEQ ID NO49，和5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3’/SEQ IDNO50)；Fct14引物(5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/SEQ ID NO51，和5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’/SEQ IDNO52)；和Fct4引物(5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/SEQID NO53，和5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’/SEQ IDNO54)(Kobayashi M.等，J.Viol.，77，2607，2003)。
為測(cè)定細(xì)胞致融合力，將LLC-MK2或HT1080細(xì)胞鋪于24孔板直到滿底。將3μL Fugene 6與50μL Opti-MEM混合。2μg的各種pCAGGS表達(dá)質(zhì)粒與等量的pCAGGS/EGFP混合，并隨后加入Opti-MEM和Fugene 6的混合物中。在室溫放置15分鐘后，將混合物加入24孔板中(其中的培養(yǎng)基用500μL MEM培養(yǎng)基置換)。在37℃，5％CO2培養(yǎng)3小時(shí)后，所述培養(yǎng)基用含1％FBS的MEM置換(用于HT1080)，并用含7.5μg/mL胰蛋白酶的MEM或預(yù)定濃度的IV型膠原酶(Clostridium)置換(用于LLC-MK2)。培養(yǎng)48小時(shí)后，計(jì)數(shù)融合的合胞體的數(shù)目/每×100視野(0.3cm2)(倒置顯微鏡)?？蛇x地，培養(yǎng)的細(xì)胞在4％多聚甲醛中固定2小時(shí)，轉(zhuǎn)移到70％的乙醇中，并隨后轉(zhuǎn)移到蒸餾水中，用蘇木精染色5分鐘，并用水洗滌以計(jì)數(shù)每0.3cm2中形成合胞體的核的數(shù)目。
其胞質(zhì)區(qū)缺失的F蛋白的三種氨基酸顯示于圖42(A)，且其融合活性顯示于圖42(B)。如圖42(B)所示，僅表達(dá)F蛋白的細(xì)胞不融合，但與HN的共轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)致融合。此外，具有缺失了28個(gè)氨基酸的序列的F蛋白(Fct14)被缺失，使得胞質(zhì)區(qū)變成14個(gè)氨基酸，其顯示最高的致融合力。
F/HN嵌合蛋白導(dǎo)致致融合力大大降低副粘病毒包膜蛋白，即F和HN蛋白分別在細(xì)胞膜上形成三聚體和四聚體，并已知通過(guò)其胞外域以及M蛋白相互作用(Plemper，R.K.，Hammond，A.L.和Cattaneo，R.，“Measles envelope glycoproteins hetero-oligomerize in theendoplasmic reticulum.”J.Biol.Chem.276，44239-22346，2001)。如圖42所示，單獨(dú)的F蛋白不顯示致融合力，且HN蛋白對(duì)其致融合力是必要的。因此，產(chǎn)生包含F(xiàn)和HN蛋白的嵌合蛋白以通過(guò)在細(xì)胞膜上同時(shí)表達(dá)F和HN蛋白(作為融合蛋白)而制備具有增強(qiáng)的致融合力的載體。F蛋白是II型膜蛋白且HN是I型膜蛋白。因此如圖43(A)所示，制備嵌合蛋白(Fct14/HN)以在細(xì)胞膜上形成U形，且其包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。顯示高度致融合力的Fct14用作F蛋白。由50個(gè)氨基酸組成的接頭序列被插入兩個(gè)蛋白之間(Fct 14/接頭/HN)。根據(jù)目前搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)，該接頭序列顯示與任何蛋白的同源性。(使用無(wú)義序列，其是通過(guò)反轉(zhuǎn)猴免疫缺陷病毒(SIVagm)的env的胞質(zhì)區(qū)的氨基酸序列的N末端到C末端而合成的)。
制備F/HN嵌合蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒的方法具體在下文描述。所述F/HN嵌合蛋白基因被插入pCAGGS載體。分別對(duì)F基因和HN基因進(jìn)行PCR，且獲得的兩個(gè)片段連接于pCAGGS。在該步驟中，將150-bp接頭基因(50amino acids)插入F/HN基因或不向其中插入基因。所用引物的序列如下F基因引物(F-F5’-ATCCGAATTCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG-3’/SEQ ID NO55和Fct14-R5’-ATCCGCGGCCGCCGGTCATCTGGATTACCCATTAGC-3’/SEQ ID NO56)；接頭/HN基因引物(接頭-HN-F5’-ATCCGCGGCCGCAATCGAGGGAAGGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGAGGACGCCAACGACCCACGGGGAAAGGGGTGAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGAGGGTTAGG-3’/SEQ ID NO57)和HN-R5’-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCATAA-3’/SEQID NO58)；和HN基因引物(5’-ATCCGCGGCCGCAATGGATGGTGATAGGGGCA-3’/SEQ ID NO59和5’-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCA-3’/SEQ ID NO60).
如圖43(B)所示，盡管不具有接頭序列的嵌合蛋顯示低致融合力，插入接頭將融合活性活性顯著增加到通過(guò)F和HN蛋白的共轉(zhuǎn)染獲得的序列的大約5倍。
保持致融合力的功能和底物特異性為獲得致融合力，不僅需要將F蛋白與HN蛋白同時(shí)表達(dá)，還需要通過(guò)蛋白酶將F蛋白切成兩個(gè)亞單位(F1和F2)。在圖42和43中，在胰蛋白酶存在下測(cè)定致融合力，且不存在胰蛋白酶時(shí)所示致融合力完全缺失。F蛋白的切割序列在圖43所示的Fct14/接頭/HN嵌合蛋白中修飾，使得其以MMP依賴(lài)的方式獲得致融合力。報(bào)道了許多MMP的降解底物序列。其中，8種序列被修飾。切割位點(diǎn)的氨基酸序列如圖44(A)所示進(jìn)行修飾，使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)。蛋白酶切割猴的融合肽的序列也考慮在修飾中。副粘病毒F蛋白F1區(qū)的N末端，其稱(chēng)為融合肽，據(jù)報(bào)道對(duì)其融合活性很重要，且F蛋白的致融合力有時(shí)通過(guò)該區(qū)內(nèi)氨基酸的突變而丟失(Bagai，S.和Lamb，R.A.，“A glycine to alaninesubstitution in the aramyxoviral SV5 fusion peptide increases the initial rate offusion.”Virology 238，283-90，1997)。因此，已指明其重要性的F1的N末端區(qū)序列沒(méi)有改變。在上述情況下，當(dāng)插入已知為MMP的降解底物的常見(jiàn)六殘基序列時(shí)，由MMP降解后F1的設(shè)計(jì)涉及將三個(gè)殘基加入N末端。這表明，所述添加可使得通過(guò)MMP進(jìn)行降解，但可能影響F蛋白的致融合力。因此，在設(shè)計(jì)通過(guò)MMP依賴(lài)的切割而活化的F蛋白時(shí)，必須考慮以下兩點(diǎn)(1)MMP的底物特異性；以及(2)切割后F蛋白致融合力的保持。
MMP#1是作為MMP合成底物的最著名的序列。該序列還用于靶向其它MMP。MMP#3和MMP#8也是可購(gòu)得的合成底物序列。MMP-2和MMP-9的降解底物序列PLGMWS，分別跟據(jù)由噬菌體展示揭示的共有序列(MMP-9的Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr))而修飾成PLGMTS和PQGMTS(分別為SEQ ID NO61和62)作為MMP#2和MMP#6。根據(jù)Shneider等(AmericanSociety of Gene therapy，Annual meeting No.1163，2002，Boston)的報(bào)道，MMP#5被構(gòu)建為PQGLYA(SEQ ID NO63)。在MMP#4中，降解后融合肽的序列沒(méi)有修飾。MMP7#的序列通過(guò)對(duì)MMP-2的噬菌體展示法而發(fā)現(xiàn)。
制備具有位于F/HN基因中的修飾的F活化位點(diǎn)的表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)節(jié)顯示在下文中。構(gòu)建F/HN融合基因后，F(xiàn)蛋白活化位點(diǎn)的誘變?cè)趐Bluescript F/HN上進(jìn)行。為導(dǎo)入突變，根據(jù)試劑盒說(shuō)明使用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)。用于進(jìn)行誘變的合成寡核苷酸的序列如下F(MMP#1)(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3’/SEQ ID NO64，和5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ IDNO65)；F(MMP#2)(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO32，和5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO33)；F(MMP#3)(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3’/SEQ ID NO34，和5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO35)；F(MMP#4)(5’-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-33’/SEQ ID NO36，和5’-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3’/SEQ IDNO37)；F(MMP#5)(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcagggCttGtatgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO66，和5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcataCaaGccctgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO67)；F(MMP#6)(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcaaggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-33’/SEQ ID NO68，和5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccttgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQID NO69)；F(MMP#7)(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCctTgcTtaCtataCGgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO70，和5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcCGtataGtaAgcAagGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO71)；和F(MMP#8)(5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCttGgCGAGaTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3’/SEQ ID NO72，以及5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAtCTCGcCaaGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3’/SEQ ID NO73)。
小寫(xiě)字母表示突變的核苷酸。修飾后，所述序列用EcoRI切割并與pCAGGS連接。
包含各序列的各載體，以及包含EGFP基因(pCAGGS/EGFP)的載體以等量混合，并將混合物轉(zhuǎn)染到高表達(dá)MMP的HT1080。結(jié)果，只有MMP#2和MMP#6的序列的基因被導(dǎo)入，出現(xiàn)細(xì)胞融合并形成合胞體(圖44(B))。這些序列的共同之處是用蛋白酶進(jìn)行切割后，將Hy-S/T-S/T序列(MTS)添加到F1蛋白的N末端。因此，認(rèn)為Hy-S/T-S/T序列(尤其是MTS序列)的添加很可能滿足了以下需要(1)由HT1080-來(lái)源的MMP切割F蛋白，和(2)切割后F蛋白保持致融合力。另一方面，對(duì)MMP#1，MMP#3，MMP#4，MMP#5，MMP#7，和MMP#8完全沒(méi)有觀察到細(xì)胞融合。由于除MMP#4的序列以外的所有序列都來(lái)自MMP的合成底物并預(yù)期被蛋白酶切割，提示將該三氨基酸肽加入F1可限制切割的F蛋白的活性。對(duì)于MMP#4，在這種情況下，很可能切割本身不發(fā)生。雖然數(shù)據(jù)未顯示，從由于佛波醇酯在HT1080中誘導(dǎo)MMP，導(dǎo)致對(duì)MMP#4觀察到合胞體形成這一事實(shí)顯而易見(jiàn)。
此外，除了MMP#2和MMP#6的序列的致融合力的比較，還測(cè)定了從#6的融合肽序列的序列的N末端起第7和第12個(gè)殘基由G修飾成A的序列的MMP濃度依賴(lài)的細(xì)胞致融合力(圖45)。用于該F/HN融合基因的誘變的寡核苷酸序列如下5’-CTTCGGTGCTGTGATTGcTACTATCGCACTTGcAGTGGCGACATCAGCAC-3’(SEQ ID NO74)和5’-GTGCTGATGTCGCCACTgCAAGTGCGATAGTAgCAATCACAGCACCGAAG-3’(SEQ ID NO75)。小寫(xiě)字母表示突變的核苷酸。制備表達(dá)質(zhì)粒與上述類(lèi)似，通過(guò)在誘變后，用EcoRI切出序列并將其連接于pCAGGS。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MMP#6具有的致融合力比MMP#2高3倍。重要的是，即使是在低蛋白酶濃度條件下，MMP#6仍誘導(dǎo)細(xì)胞融合。即，在低濃度下實(shí)現(xiàn)F蛋白活化。然而，當(dāng)進(jìn)一步導(dǎo)入G到A的突變(據(jù)報(bào)道該突變?cè)黾覨蛋白的致融合力)(Peisajovich，S.G.，Epand，R.F.，Epand，R.M.和Shai，Y.，“Sendaiviral N-terminal fusion peptide consists of two similar repeats，both of whichcontribute to membrane fusion.”Eur.J.Biochem.269，4342-50，2002))(#6G12A)時(shí)，所述致融合力降低到1/10或更低。這些結(jié)果解釋?zhuān)ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單插入蛋白酶切割序列來(lái)通過(guò)蛋白酶修飾向性，F(xiàn)蛋白的活性不能保持，且導(dǎo)致多種情況下丟失致融合力。當(dāng)通過(guò)將目的降解序列導(dǎo)入而構(gòu)建病毒時(shí)，所述致融合力通過(guò)使用該系統(tǒng)而證實(shí)。此外，由于pCAGGS攜帶的Fct14/接頭/HN顯示明顯的融合活性，預(yù)期該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染具有抗腫瘤效應(yīng)。此外，通過(guò)將該嵌合蛋白導(dǎo)入M缺陷型仙臺(tái)病毒，預(yù)期可進(jìn)一步增加抗腫瘤效應(yīng)。
構(gòu)建具有增加的致融合力的改良F修飾的M缺陷型SeV基因組cDNA實(shí)施例29和30顯示通過(guò)修飾pCAGGS載體攜帶的F蛋白增加致融合力。通過(guò)對(duì)M缺陷型仙臺(tái)病毒載體進(jìn)行類(lèi)似修飾，預(yù)期可制備致融合力增加的改良的F修飾的ΔM SeV。改良的F修飾的M缺陷型SeV基因組cDNA的基因構(gòu)建是通過(guò)以下方法進(jìn)行的。SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP根據(jù)與實(shí)施例16中同樣的方法構(gòu)建。F基因的突變?cè)贚ITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFP上用SEQ ID NO69的寡核苷酸，和QuikChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP的cDNA的構(gòu)建是通過(guò)將突變LITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFP的SalI和NheI-消化的片段以及包含NP基因的片段偶聯(lián)(通過(guò)SalI和NheI消化攜帶位于F缺失位點(diǎn)上的EGFP基因的F缺陷型仙臺(tái)病毒全長(zhǎng)基因組cDNA獲得(pSeV+18/F-GFP；Li，H等，J.Viol.74，6564-6569，2000；WO00/70070))(圖46)。多克隆位點(diǎn)仙病毒cDNA(稱(chēng)為pSeV(TDK))(JP-A 2002-272465)用來(lái)構(gòu)建M缺陷型仙臺(tái)病毒(其中F蛋白胞質(zhì)區(qū)的28個(gè)氨基酸是缺失的(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP))和攜帶F/HN嵌合蛋白(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP)的M缺陷型仙臺(tái)病毒的基本框架。M缺陷型仙臺(tái)病毒SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP，其中F蛋白胞質(zhì)區(qū)被截短，如下構(gòu)建。由于TDK用作框架，首先構(gòu)建pSeV(TDK)/ΔM-GFP。GFP/EIS(加入編碼轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)的EIS序列的GFP)通過(guò)PCR使用合成引物(Nhe-GFP-FATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG(SEQ ID NO94)，和GFP-EIS-BssHIIATCCGCGCGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC(SEQ ID NO95))，以LITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFP為模板進(jìn)行擴(kuò)增。NheI和BssHII處理對(duì)仙臺(tái)病毒cDNA的多克隆位點(diǎn)和擴(kuò)增的GFP/EIS進(jìn)行，且產(chǎn)生的片段被偶聯(lián)以用GFP取代M蛋白來(lái)制備pSeV(TDK)/ΔM-GFP。
Fct14(MMP#6)通過(guò)PCR用實(shí)施例13中制備的pCAGGS/Fct14(MMP#6)/接頭/HN作為模板，使用合成引物，Mlv-FATCCACGCGTCATGACAGCATATATCCAGAG(SEQ ID NO96)和Fct14-EIS-SalIATCCGTCGACACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTAACGGTCATCTGGATTACC(SEQ ID NO97)進(jìn)行擴(kuò)增。Fct14(MMP#6)插入F的位置以取代F基因，從而構(gòu)建pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP(圖46)。隨后，構(gòu)建攜帶F/HN嵌合蛋白的M缺陷型仙臺(tái)病毒(pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP)。GFP/EIS通過(guò)PCR以GFP為模板，使用合成引物(Nhe-GFP-FATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG(SEQ ID NO98)和GFP-EIS-SalIATCCGCTAGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC(SEQ ID NO99))進(jìn)行擴(kuò)增。GFP/EIS和多克隆位點(diǎn)仙臺(tái)病毒cDNA用NheI和SalI處理。產(chǎn)生的片段被偶聯(lián)以缺失M和F基因，并用 GFP取代以產(chǎn)生pSeV(TDK)/ΔMΔF-GFP。Fct14(MMP#6)/接頭/HN通過(guò)PCR用實(shí)施例31中制備的Fct14(MMP#6)/接頭/HN作為模板，使用合成引物(F/HN5’Nhe-FATCCGCTAGCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG(SEQ ID NO100)，和F/HN3’Nhe-EIS-RATCCGCTAGCACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTTAAGACTCGGCCTTGCATAA(SEQ ID NO101))進(jìn)行擴(kuò)增。
pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP通過(guò)將Fct14(MMP#6)/接頭/HN偶聯(lián)于上述pSeV(TDK)/ΔMΔF-GFP的NheI位點(diǎn)而構(gòu)建。
改良的F修飾的M缺陷型仙臺(tái)病毒的重構(gòu)和擴(kuò)增從實(shí)施例32中構(gòu)建的cDNA重構(gòu)病毒根據(jù)Li等的方法(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)進(jìn)行。然而，由于cDNA是實(shí)施例17中的M缺陷形式，使用反式提供M蛋白的輔助細(xì)胞(實(shí)施例11)。Cre/loxP表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)用于制備輔助細(xì)胞。該系統(tǒng)使用質(zhì)粒pCALNdLw，所述質(zhì)粒設(shè)計(jì)成可誘導(dǎo)地通過(guò)Cre DNA重組酶表達(dá)基因產(chǎn)物(Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1988)。插入的基因通過(guò)將重組腺病毒(AxCANCre)(其表達(dá)Cre DNA重組酶)感染到該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體而表達(dá)，所述過(guò)程通采用Saito等的方法(Saito，I.等，Nucleic Acids Res.23，3816-3821，1995)；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)。F蛋白活化位點(diǎn)被替代的M缺陷型SeV如下述進(jìn)行重構(gòu)。LLC-MK2細(xì)胞以5×106細(xì)胞/皿鋪于100-mm皿上，培養(yǎng)24小時(shí)，然后在室溫用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)(以MOI＝2)感染一小時(shí)(PLWUV-VacT7Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126，1986)，所述痘苗病毒已經(jīng)用補(bǔ)骨酯素在紫外A(365nm)下處理了20分鐘。用無(wú)血清MEM洗滌細(xì)胞。pSeV/F(MMP#6)ΔM-GFP(可選地為，pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP或pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP)，pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L(Kato，A.等，Genes Cells 1，569-579，1996)，pGEM/M，和pGEM/F-HN(Li，H.-O.等，J.Virology 74，6564-6569，2000；WO 00/70070)質(zhì)粒分別以12μg，4μg，2μg，4μg，4μg，和4μg/皿的密度懸于Opti-MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)中。相當(dāng)于5μL/1μg DNA的SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，Bothell，WA)加入混合物中并進(jìn)行混合。在室溫放置15分鐘后，將混合物最后和3mL含3％FBS的Opti-MEM混合，加入細(xì)胞中，并進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)5小時(shí)后，細(xì)胞用無(wú)血清MEM洗滌兩次，并隨后在含40μg/mL胞苷酸β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraCSigma，St.Louis，MO)和7.5μg/mL胰蛋白酶(Gibco-BRL，Rockville，MD)的MEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，持續(xù)表達(dá)F蛋白的細(xì)胞(LLC-MK2/F7/M62/A實(shí)施例12)以8.5×106細(xì)胞/皿形成層，并在在37℃含40μg/mL AraC和7.5μg/mL胰蛋白酶(P0)的MEM中再培養(yǎng)兩天。收集這些細(xì)胞，并將沉淀以2 mL/皿懸于Opti-MEM中。重復(fù)冷凍解凍循環(huán)3次后，將裂解物直接轉(zhuǎn)染到LLC-MK2/F7/M62/A，且細(xì)胞培養(yǎng)在32℃含40μg/mL AraC，7.5μg/mL胰蛋白酶，和50U/mL IV型膠原酶的無(wú)血清MEM中(ICN，Aurola，OH)(對(duì)于pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP僅含胰蛋白酶)(P1)。3-14天后，收集部分培養(yǎng)物上清，轉(zhuǎn)染到剛制備的LLC-MK2/F7/M62/A中，并將細(xì)胞培養(yǎng)在32℃含40μg/mL AraC，7.5μg/mL胰蛋白酶，和50U/mL IV型膠原酶的無(wú)血清MEM中(對(duì)于pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP僅含胰蛋白酶)(P2).3-14天后，用部分培養(yǎng)物感染剛制備的LLC-MK2/F7/M62/A，并將細(xì)胞在32℃含7.5μg/mL胰蛋白酶和50U/mLIV型膠原酶的無(wú)血清MEM(對(duì)于pSeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP僅含胰蛋白酶)(P3)培養(yǎng)307天。收集培養(yǎng)物上清，并加入BSA(終濃度為1％)，并保存于-80℃。解凍保存的病毒溶液，并用于以后的制備和體外試驗(yàn)中。
如上述，成功制備了F蛋白裂解位點(diǎn)從PLGMTS(SEQ ID NO61)成PQGMTS(SEQ ID NO62)的SeV/F(MMP#6)ΔM-GFP，其胞質(zhì)區(qū)缺失28個(gè)氨基酸的SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)ΔM-GFP，和攜帶F/HN嵌合蛋白的SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP。
改良的F修飾的M缺陷型仙臺(tái)病毒載體的致融合活性的增加為研究實(shí)施例33中制備的病毒的效力，具有MMP-2和MMP-9的不同表達(dá)水平的各種癌細(xì)胞系，以及未檢測(cè)到其中MMP表達(dá)的LLC-MK2如下進(jìn)行感染，并測(cè)定載體的細(xì)胞致融合力(圖47)。各癌細(xì)胞(HT1080，U87MG，A172，U251，SW480，和LLC-MK2)鋪于24-孔板上(含有供應(yīng)商指定的介質(zhì))直到滿底。U87MG(ATCC No.HTB-14)和A172(ATCC No.CRL-1620)購(gòu)自ATCC。U251(IFO50288)購(gòu)自JCRB細(xì)胞庫(kù)。用MEM培養(yǎng)基洗滌兩次后，以MOI＝0.1感染各M缺陷型仙臺(tái)病毒載體(SeV/AM-GFP)。細(xì)胞在室溫放置1小時(shí)，并用MEM培養(yǎng)基洗滌，然后將含1％FBS的0.5mL MEM加入24孔板。培養(yǎng)48小時(shí)后，計(jì)數(shù)融合的合胞體的數(shù)目每X100視野(O.3cm2)(倒置顯微鏡)。可選地，培養(yǎng)的細(xì)胞在4％多聚甲醛中固定兩小時(shí)，轉(zhuǎn)移到70％C醇然后轉(zhuǎn)移到蒸餾水中，用蘇木精染色5分鐘，并用水洗滌以計(jì)數(shù)每0.3cm2中形成合胞體的核數(shù)。結(jié)果顯示于圖49。
MMP-2和MMP-9的表達(dá)通過(guò)實(shí)施例22中進(jìn)行的凝膠信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體證實(shí)(圖48)。結(jié)果，HT1080，U87MG，和A172中MMP2的表達(dá)被證實(shí)。此外，低水平的MMP-9表達(dá)在U251和SW480中證實(shí)。MMP-2在LLC-MK2中的明顯表達(dá)是由于培養(yǎng)基中所含的1％的血清中的MMP-2活性。各癌細(xì)胞系感染兩天后，觀察到GFP擴(kuò)散。結(jié)果，在U251和SW480中觀察到致融合活性，其不顯示傳統(tǒng)SeV/F(MMP#2)ΔM-GFP(用改良的F修飾的M缺陷型仙臺(tái)病毒載體感染)的感染的擴(kuò)散。具體地，用攜帶F/HN嵌合蛋白的M缺陷型仙臺(tái)病毒載體(SeV(TDK)/Fct14(MMP#6)/接頭/HNΔM-GFP)感染的那些細(xì)胞顯示致融合活性。盡管數(shù)據(jù)未顯示，小鼠Lewis肺癌和小鼠結(jié)腸-26癌由于被改良的M缺陷型仙臺(tái)病毒載體感染也顯示致融合活性。載體的改良預(yù)期進(jìn)一步增強(qiáng)所述效果，并對(duì)具有低濃度MMP的癌癥顯示影響。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了在目的蛋白酶存在下特異性擴(kuò)散感染的載體。本發(fā)明的載體不顯示病毒樣顆粒的明顯生成，并僅通過(guò)細(xì)胞融合轉(zhuǎn)移到周?chē)?xì)胞中。因此，本發(fā)明的載體可用來(lái)感染位于目的組織限制區(qū)域中的載體。具體地，本發(fā)明提供將其感染特異性擴(kuò)散到癌癥的載體。這些載體對(duì)腫瘤增殖有強(qiáng)抑制效果。使用本發(fā)明的載體對(duì)癌癥進(jìn)行基因治療很可能成為有很小副作用的新癌癥療法。
序列表<110>株式會(huì)社載體研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>具有修飾的蛋白酶依賴(lài)的向性的載體<130>D3-A0202P<150>JP 2002-129351<151>2002-04-30<160>101<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于蛋白水解切割的人工合成序列<400>1Met Thr Ser1<210>2<211>3<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于蛋白水解切割的人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置2的’Xaa’代表Leu或Gln.
<400>2Pro Xaa Gly1
<210>3<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于蛋白水解切割的人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置2的’Xaa’代表Leu或Gln.
<400>3Pro Xaa Gly Met Thr Ser1 5<210>4<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于蛋白水解切割的人工合成序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>位置2的’Xaa’代表Leu或Gln.
<400>4Pro Xaa Gly Met Thr1 5<210>5<211>4<212>PRT<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒的人工合成序列<400>5Pro Gln Ser Arg1<210>6<211>3<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于蛋白水解切割的人工合成序列<400>6Val Gly Arg1<210>7<211>3<212>PRT<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒的人工合成序列<400>7Gln Ser Arg1<210>8<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒的人工合成序列<400>8ctttcaccct 10
<210>9<211>15<212>DNA<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒的人工合成序列<400>9tttttcttac tacgg 15<210>10<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>含有Not I位點(diǎn)的人工合成序列<400>10cggccgcaga tcttcacg 18<210>11<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>11gaaacaaaca accaatctag agagcgtatc tgacttgac 39<210>12<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列
<400>12gtcaagtcag atacgctctc tagattggtt gtttgtttc 39<210>13<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>13attacggtga ggagggctgt tcgagcagga g 31<210>14<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>14ctcctgctcg aacagccctc ctcaccgtaa t 31<210>15<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>15ggggcaatca ccatatccaa gatcccaaag acc33<210>16<211>33<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>16ggtctttggg atcttggata tggtgattgc ccc 33<210>17<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>17catgctctgt ggtgacaacc cggactaggg gttatca 37<210>18<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>18tgataacccc tagtccgggt tgtcaccaca gagcatg 37<210>19<211>41<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列
<400>19cttgtctaga ccaggaaatg aagagtgcaa ttggtacaat a41<210>20<211>41<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>20tattgtacca attgcactct tcatttcctg gtctagacaa g41<210>21<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于免疫的人工合成序列<400>21Met Ala Asp Ile Tyr Arg Phe Pro Lys Phe Ser Tyr Glu Cys1 5 10<210>22<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于免疫的人工合成序列<400>22Leu Arg Thr Gly Pro Asp Lys Lys Ala Ile Pro His Cys1 5 10<210>23<211>14
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于免疫的人工合成序列<400>23Cys Asn Val Val Ala Lys Asn Ile Gly Arg Ile Arg Lys Leu1 5 10<210>24<211>48<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>24agagtcactg accaactaga tcgtgcacga ggcatcctac catcctca 48<210>25<211>48<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>25tgaggatggt aggatgcctc gtgcacgatc tagttggtca gtgactct 48<210>26<211>55<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于擴(kuò)增潮霉素抗性基因的人工合成序列<400>26
tctcgagtcg ctcggtacga tgaaaaagcc tgaactcacc gcgacgtctg tcgag 55<210>27<211>83<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于擴(kuò)增潮霉素抗性基因的人工合成序列<400>27aatgcatgat cagtaaatta caatgaacat cgaaccccag agtcccgcct attcctttgc 60cctcggacga gtgctggggc gtc 83<210>28<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒的人工合成序列<400>28ccaatctacc atcagcatca gc 22<210>29<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒的人工合成序列<400>29ttcccttcat cgactatgac c 21<210>30<211>22<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒的人工合成序列<400>30agagaacaag actaaggcta cc 22<210>31<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>用于蛋白水解切割的人工合成序列<400>31Pro Leu Gly Leu Gly Leu1 5<210>32<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>32ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggcat gacgagtttc ttcggtgctg 60tgattggtac tatc 74<210>33<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>33gatagtacca atcacagcac cgaagaaact cgtcatgcca agaggggcat tttgtgtcgt 60
atcattggtg acag 74<210>34<211>75<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>34ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggcct ggggttattc ttcggtgctg 60tgattggtac tatcg 75<210>35<211>75<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>35cgatagtacc aatcacagca ccgaagaata accccaggcc aagaggggca ttttgtgtcg 60tatcattggt gacag 75<210>36<211>45<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>36caaaatgccg gtgctccccc gttgggattc ttcggtgctg tgatt 45<210>37
<211>45<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>37aatcacagca ccgaagaatc ccaacggggg agcaccggca ttttg 45<210>38<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>38gacacaaaat gccggtgctc ccgtggggag attcttcggt gctgtgattg50<210>39<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于仙臺(tái)病毒定點(diǎn)誘變的人工合成序列<400>39caatcacagc accgaagaat ctccccacgg gagcaccggc attttgtgtc50<210>40<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒F蛋白的人工合成序列
<400>40Gly Val Pro Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>41<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒誘變的F蛋白的人工合成序列<400>41Gly Val Pro Leu Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>42<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒誘變的F蛋白的人工合成序列<400>42Gly Val Pro Leu Gly Leu Gly Leu Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>43<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒誘變的F蛋白的人工合成序列<400>43Gly Val Pro Leu Gly Phe Phe Gly Ala Val1 5 10
<210>44<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>來(lái)自仙臺(tái)病毒誘變的F蛋白的人工合成序列<400>44Gly Val Pro Val Gly Arg Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>45<211>16<212>PRT<213>人工的<220>
<223>仙臺(tái)病毒的兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)域<400>45Lys Ala Cys Thr Asp Leu Arg Ile Thr Val Arg Arg Thr Val Arg Ala1 5 10 15<210>46<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成多肽<400>46Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr1 5<210>47<211>13<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>合成多肽<400>47Glu Ala Arg Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ala Leu Ile Lys1 5 10<210>48<211>13<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成多肽<400>48Cys Gly Thr Gly Arg Arg Pro Ile Ser Gln Asp Arg Ser1 5 10<210>49<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物<400>49ccgctcgagc atgacagcat atatccagag a31<210>50<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物
<400>50atagtttagc ggccgctcat ctgatcttcg gctctaatgt 40<210>51<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物<400>51ccgctcgagc atgacagcat atatccagag a31<210>52<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物<400>52atagtttagc ggccgctcac cttctgagtc tataaagcac 40<210>53<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物<400>53ccgctcgagc atgacagcat atatccagag a31<210>54<211>40<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>合成引物<400>54atagtttagc ggccgctcac cttctgagtc tataaagcac 40<210>55<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物，F(xiàn)-F<400>55atccgaattc agttcaatga cagcatatat ccagag 36<210>56<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>Fct14-合成引物，F(xiàn)ct14-R<400>56atccgcggcc gccggtcatc tggattaccc attagc 36<210>57<211>152<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物，接頭-HN-F<400>57atccgcggcc gcaatcgagg gaaggtggtc tgagttaaaa atcaggagca acgacggagg 60
tgaaggacca gaggacgcca acgacccacg gggaaagggg tgaacacatc catatccagc 120catctctacc tgtttatgga cagagggtta gg 152<210>58<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物，HN-R<400>58atccgcggcc gcttaagact cggccttgca taa 33<210>59<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物<400>59atccgcggcc gcaatggatg gtgatagggg ca 32<210>60<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成引物<400>60atccgcggcc gcttaagact cggccttgca 30<210>61<211>6<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>MMP切割序列<400>61Pro Leu Gly Met Thr Ser1 5<210>62<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>MMP切割序列<400>62Pro Gln Gly Met Thr Ser1 5<210>63<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>MMP切割序列<400>63Pro Gln Gly Leu Tyr Ala1 5<210>64<211>75<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>64ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggcct ggggttattc ttcggtgctg 60tgattggtac tatcg 75<210>65<211>75<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>65cgatagtacc aatcacagca ccgaagaata accccaggcc aagaggggca ttttgtgtcg 60tatcattggt gacag 75<210>66<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>66ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcagggctt gtatgctttc ttcggtgctg 60tgattggtac tatc 74<210>67<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸
<400>67gatagtacca atcacagcac cgaagaaagc atacaagccc tgaggggcat tttgtgtcgt 60atcattggtg acag 74<210>68<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>68ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcaaggcat gacgagtttc ttcggtgctg 60tgattggtac tatc 74<210>69<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>69gatagtacca atcacagcac cgaagaaact cgtcatgcct tgaggggcat tttgtgtcgt60atcattggtg acag 74<210>70<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸
<400>70ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ttgcttacta tacggctttc ttcggtgctg 60tgattggtac tatc 74<210>71<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>71gatagtacca atcacagcac cgaagaaagc cgtatagtaa gcaagggcat tttgtgtcgt 60atcattggtg acag 74<210>72<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>72ctgtcaccaa tgatacgaca caaaatgccc ctcttggctt ggcgagattc ttcggtgctg 60tgattggtac tatc 74<210>73<211>74<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>73gatagtacca atcacagcac cgaagaatct cgccaagcca agaggggcat tttgtgtcgt 60
atcattggtg acag 74<210>74<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>74cttcggtgct gtgattgcta ctatcgcact tgcagtggcg acatcagcac50<210>75<211>50<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于誘變的合成寡核苷酸<400>75gtgctgatgt cgccactgca agtgcgatag tagcaatcac agcaccgaag 50<210>76<211>49<212>PRT<213>人工的<220>
<223>仙臺(tái)病毒F蛋白的部分序列<400>76Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly1 5 10 15Asn Pro Asp Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu Pro Lys20 25 30
Ile Arg His Met Tyr Thr Lys Gly Gly Phe Asp Ala Met Ala Glu Lys35 40 45Arg<210>77<211>34<212>PRT<213>人工的<220>
<223>仙臺(tái)病毒F蛋白的部分序列<400>77Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly1 5 10 15Asn Pro Asp Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu Pro Lys20 25 30Ile Arg<210>78<211>21<212>PRT<213>人工的<220>
<223>仙臺(tái)病毒F蛋白的部分序列<400>78Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly1 5 10 15Asn Pro Asp Asp Arg20
<210>79<211>11<212>PRT<213>人工的<220>
<223>仙臺(tái)病毒F蛋白的部分序列<400>79Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Lys Arg1 5 10<210>80<211>50<212>PRT<213>人工的<220>
<223>接頭序列<400>80Ala Ala Ala Ile Glu Gly Arg Trp Ser Glu Leu Lys Ile Arg Ser Asn1 5 10 15Asp Gly Gly Glu Gly Pro Glu Asp Ala Asn Asp Pro Arg Gly Lys Gly20 25 30Val Gln His Ile His Ile Gln Pro Ser Leu Pro Val Tyr Gly Gln Arg35 40 45Val Arg50<210>81<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)
<400>81Ala Gly Val Pro Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>82<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>82Ala Pro Leu Gly Leu Trp Ala Phe Phe Gly Ala Val1 510<210>83<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>83Ala Pro Leu Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>84<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>84
Ala Pro Leu Gly Leu Gly Leu Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>85<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>85Ala Gly Val Pro Pro Leu Gly Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>86<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>86Ala Pro Gln Gly Leu Tyr Ala Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>87<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>87
Ala Pro Gln Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>88<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>88Ala Leu Ala Tyr Tyr Thr Arg Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>89<211>12<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>89Ala Pro Leu Gly Leu Ala Arg Phe Phe Gly Ala Val1 5 10<210>90<211>23<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>90Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val
1 5 10 15Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr20<210>91<211>26<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>91Pro Leu Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala1 5 10 15Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr20 25<210>92<211>26<212>PRT<213>人工的<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>92Pro Gln Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala1 5 10 15Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr20 25<210>93<211>26<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>F蛋白切割位點(diǎn)<400>93Pro Gln Gly Met Thr Ser Phe Phe Gly Ala Val Ile Ala Thr Ile Ala1 5 10 15Leu Ala Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr20 25<210>94<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>94atccgctagc ccgtacggcc atggtgagca ag 32<210>95<211>72<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>95atccgcgcgc ccgtacgatg aactttcacc ctaagttttt cttactacgg agctttactt60gtacagctcg tc72<210>96<211>31<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>96atccacgcgt catgacagca tatatccaga g31<210>97<211>66<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>97atccgtcgac acgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctactttaac ggtcatctgg 60attacc66<210>98<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>98atccgctagc ccgtacggcc atggtgagca ag 32<210>99<211>72<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>99atccgctagc ccgtacgatg aactttcacc ctaagttttt cttactacgg agctttactt 60
gtacagctcg tc 72<210>100<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>100atccgctagc agttcaatga cagcatatat ccagag 36<210>101<211>67<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸<400>101atccgctagc acgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacttttaa gactcggcct 60tgcataa 6權(quán)利要求
1.包含副粘病毒基因組RNA的復(fù)合物，其中(a)編碼M蛋白的核酸被突變或缺失，且(b)編碼了一種修飾過(guò)的F蛋白，其切割位點(diǎn)序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述復(fù)合物還包括以下特性(1)在已導(dǎo)入所述復(fù)合物的細(xì)胞中復(fù)制所述基因組RNA的能力；(2)在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少或缺乏；和(3)在所述蛋白酶存在的條件下，具有將所述RNA導(dǎo)入細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞是與由所述復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物是病毒顆粒。
3.權(quán)利要求2的復(fù)合物，還包含野生型F蛋白。
4.權(quán)利要求1-3之一的復(fù)合物，其中所述副粘病毒是仙臺(tái)病毒。
5.權(quán)利要求1-4之一的復(fù)合物，其中所述蛋白酶是其活性在癌癥中增強(qiáng)的蛋白酶。
6.權(quán)利要求1-5之一的復(fù)合物，其中所述蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶或纖溶酶原激活物。
7.權(quán)利要求1-6之一的復(fù)合物，其中由所述蛋白酶切割的序列包含Pro-Leu-Gly，Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg。
8.權(quán)利要求1-7之一的復(fù)合物，其中野生型F蛋白的胞質(zhì)區(qū)在修飾后的F蛋白中部分缺失。
9.權(quán)利要求1-8之一的復(fù)合物，其中修飾后的F蛋白與HN蛋白融合。
10.制備包含副粘病毒基因組RNA的病毒顆粒的方法，在該病毒顆粒中(a)編碼M蛋白的核酸被突變或缺失，且(b)編碼了一種修飾過(guò)的F蛋白，其切割位點(diǎn)序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代，所述病毒顆粒(1)具有在已導(dǎo)入所述病毒顆粒的細(xì)胞中復(fù)制所述基因組RNA的能力；(2)顯示在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少或缺乏；和(3)在所述蛋白酶存在的條件下，具有將所述基因組RNA導(dǎo)入細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞是與由包含所述基因組RNA的病毒顆粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞；所述方法包括以下步驟(i)在表達(dá)副粘病毒野生型M蛋白的細(xì)胞中，擴(kuò)增包含副粘病毒N，P，和L蛋白以及基因組RNA的RNP；和(ii)收集釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒。
11.制備包含副粘病毒基因組RNA的病毒顆粒的方法，在該病毒顆粒中(a)編碼了條件突變性M蛋白，和(b)編碼種修飾過(guò)的F蛋白，其切割位點(diǎn)序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶切割的序列所取代；其中所述病毒顆粒(1)具有在已導(dǎo)入所述病毒顆粒的細(xì)胞中復(fù)制所述基因組RNA的能力；(2)顯示在宿主內(nèi)環(huán)境中病毒顆粒的產(chǎn)生明顯減少或缺乏；和(3)在所述蛋白酶存在的條件下，具有將所述基因組RNA導(dǎo)入細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞是與由包含所述基因組RNA的病毒顆粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸的細(xì)胞；所述方法包括以下步驟i)在突變型M蛋白的容許條件下，在細(xì)胞中擴(kuò)增包含副粘病毒N，P，和L蛋白以及基因組RNA的RNP；和(ii)收集釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中步驟(i)在等于或小于35℃的溫度進(jìn)行。
13.權(quán)利要求10或11的方法，還包括在至少步驟(i)或(ii)之一中提供切割修飾后F蛋白的蛋白酶的步驟；或者使用所述蛋白酶處理步驟(ii)中收集的病毒顆粒的步驟。
14.權(quán)利要求10或11的方法，還包括在步驟(i)中在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)副粘病毒野生型F蛋白；和在至少步驟(i)或(ii)之一中提供切割野生型F蛋白的蛋白酶的步驟；或者包含用所述蛋白酶處理步驟(ii)中收集的病毒顆粒的步驟。
15.用于癌癥的治療性組合物，其包含權(quán)利要求5的復(fù)合物和可藥用的載體。
16.重組的修飾后副粘病毒F蛋白，其切割位點(diǎn)包含Pro-Leu-Gly，Pro-Gln-Gly或Val-Gly-Arg，并在存在基質(zhì)金屬蛋白酶或纖溶酶原激活物的條件下顯示致細(xì)胞融合力。
17.編碼權(quán)利要求16的蛋白的核酸。
18.一種病毒顆粒，其包含權(quán)利要求16的蛋白或編碼該蛋白的核酸。
19.一種具有致細(xì)胞融合活性的融合蛋白，其包含副粘病毒F和HN蛋白的跨膜區(qū)，其中所述F和HN蛋白在胞質(zhì)側(cè)互相結(jié)合。
20.權(quán)利要求19的融合蛋白，其中該蛋白切割位點(diǎn)的序列由可被不切割野生型F蛋白的蛋白酶所切割的序列取代。
21.編碼權(quán)利要求19的蛋白的核酸。
22.包含權(quán)利要求21的核酸的載體。
23.一種病毒顆粒，其包含權(quán)利要求19的蛋白或者編碼該蛋白的核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供具有復(fù)制能力的細(xì)胞致融合型載體，其蛋白酶依賴(lài)向性經(jīng)過(guò)修飾。制備了編碼經(jīng)修飾的F蛋白的M基因缺陷型病毒載體，其中副粘病毒的F蛋白的切割位點(diǎn)被修飾成由另一種蛋白酶切割的序列。在用這些載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，載體中的基因組RNA被復(fù)制，并因此依賴(lài)于上述后一種蛋白酶將細(xì)胞融合型感染擴(kuò)散到鄰近的細(xì)胞；然而，沒(méi)有病毒顆粒被釋放。編碼由蛋白酶(其活性在癌癥中增強(qiáng))切割的F蛋白的本發(fā)明的載體，在體內(nèi)顯示癌癥生長(zhǎng)抑制作用。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1665932SQ0381557
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月30日
發(fā)明者喜納宏昭, 井上誠(chéng), 上田泰次, 飯?zhí)镎虏? 長(zhǎng)谷川護(hù), 小林雅典 申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所