專利名稱：神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請涉及能夠邊對細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行顯微鏡觀察，邊以1細(xì)胞單位培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞并且同時計測電位變化的新型神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室。
背景技術(shù)：
神經(jīng)科學(xué)的進(jìn)步顯著，為了弄清腦功能，開發(fā)了利用光、磁場、化學(xué)物質(zhì)等的各種各樣的手法，用于研究。特別是對于高度的信息處理能力，一般用體內(nèi)(invivo)使其功能明確，但由于神經(jīng)回路網(wǎng)的復(fù)雜性，要完全實現(xiàn)穩(wěn)定的樣品狀態(tài)的維持、樣品條件的再現(xiàn)性等近乎不可能。因此，人工構(gòu)筑由少數(shù)的神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成的比較單純的神經(jīng)回路網(wǎng)，要在完全控制的環(huán)境下弄清細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的信息處理功能的研究也在蓬勃地進(jìn)行。例如，Dichter，M.A.Brain Res.，149，279-293(1978)、Mains R.E.，Patterson P.H.J. Cell.Biol.，59，329-345(1973)、或Potter S.M.，DeMarse T.B.，J.Neurosci.Methods，110，17-24(2001)、以及Jimbo Y.，Tateno T.，RobinsonH.P.C.，Biophys.J.76，670-678(1999)等的研究。
為了進(jìn)行以1個1個神經(jīng)細(xì)胞為最小構(gòu)成單位的信息處理模型的計測，重要的是多點同時計測技術(shù)和細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)圖案的控制技術(shù)，但神經(jīng)細(xì)胞的活動電位計測技術(shù)也處于初期階段，膜片鉗法(パツチクランプ)法等給予細(xì)胞損傷的手法為主，因此存在不能同時在3點以上的多點進(jìn)行計測，在開始計測后數(shù)小時內(nèi)測定的細(xì)胞死亡的問題，近年來開發(fā)了在電極排列(MEAS)基板上的神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)計測法，克服了上述問題，可以進(jìn)行達(dá)到數(shù)周時間的長期培養(yǎng)。
另一方面，對于使用化學(xué)或物理的方法對神經(jīng)細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)圖案進(jìn)行控制的技術(shù)，從古至今進(jìn)行了大量研究。例如，在化學(xué)方法方面，Letourneau等在用層粘連蛋白(ラミニン)等細(xì)胞粘接性的基質(zhì)在培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的基板表面描繪圖案，沿著圖案使神經(jīng)突起伸展方面獲得成功。對此，例如在Letourneau P.C.Dev.Biol.，66，183-196(1975)進(jìn)行了報告。在物理學(xué)方法方面，報告了通過在構(gòu)筑了對于基板表面上神經(jīng)細(xì)胞的伸展成為障壁的臺階高差的基板上進(jìn)行培養(yǎng)，如果障壁的高度為10μm左右以上，可以限制神經(jīng)細(xì)胞的伸展和移動(StopakD.et al.Dev.Biol.，90，383-398(1982)或HironoT.，TorimitsuK.，Kawana A.，F(xiàn)ukuda J.，Brain Res.，446，189-194(1988)等)。
但是，對于上述以往技術(shù)中發(fā)明的電極排列基板技術(shù)，由于基板上不具有立體障礙，因此難于完全控制細(xì)胞的空間配置。此外，當(dāng)使用上述以往技術(shù)的立體結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的空間配置進(jìn)行控制時，不易防止從循環(huán)的培養(yǎng)液等外界侵入細(xì)菌等。
本申請發(fā)明消除了上述以往技術(shù)的問題，其課題在于提供為了弄清細(xì)胞的學(xué)習(xí)過程，能夠完全控制網(wǎng)絡(luò)形狀，而且在無細(xì)菌等侵入的情況下長時間對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的刺激應(yīng)答的變化進(jìn)行計測的新型技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
作為解決上述課題的技術(shù)，本發(fā)明申請第1提供神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，其特征在于在基板上具有用于計測神經(jīng)細(xì)胞的電位變化的多個電極圖案，在其上面具有用于將神經(jīng)細(xì)胞封入特定的空間配置中的多個分割壁，在分割壁上配置光學(xué)上透明的半透膜。即，更具體地說，例如，本發(fā)明申請的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室由在透明玻璃基板上具有細(xì)胞水平大小的電極排列，在其上面具有的厚度10μm以上厚壁的細(xì)胞配列用微室排列，以及在上述微室上面的半透膜構(gòu)成，上述半透膜是對于被覆微室上面的細(xì)胞不能通過程度的以使細(xì)胞不從微室中逃逸而對粗的上述集束光在光學(xué)上透明的網(wǎng)眼粗細(xì)的半透膜。
此外，本發(fā)明申請?zhí)峁┥窠?jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，對于上述第1發(fā)明，其第2特征在于電極圖案為光學(xué)上透明的電極，其第3特征在于電極圖案能夠獨立計測的電極數(shù)為3個以上，其第4特征在于用多個分割壁隔開的細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)域為3個以上，其第5特征在于上述各電極和各區(qū)域是一一對應(yīng)的。
在本發(fā)明申請的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室中，上述半透膜的上面還具有能夠使培養(yǎng)液循環(huán)的溶液交換部液體交換的裝置。此外，具有在光學(xué)上連續(xù)觀察上述微室排列內(nèi)的細(xì)胞的狀態(tài)變化的裝置和與連續(xù)計測各神經(jīng)細(xì)胞的電位變化的裝置組合的裝置。


圖1為例示本申請的多電極排列長期培養(yǎng)顯微觀察系的基本構(gòu)成的模式圖。
圖2為多電極排列和微室的顯微鏡照片。
圖3為半透膜的基板粘接順序的概念圖。
圖4為多電極排列芯片的外觀的顯微鏡照片。
圖5為多電極計測單元的概要和裝置外觀的照片。
圖6為計測、觀察用長期培養(yǎng)顯微鏡系統(tǒng)的外觀的照片。
圖7為表示多電極排列芯片上的大鼠小腦顆粒細(xì)胞的顯微鏡照片。
具體實施例方式
本發(fā)明申請具有如上所述的特征，以下對其實施方式進(jìn)行說明。
例如，附圖1表示使用本發(fā)明申請的神經(jīng)細(xì)胞微室的多電極長期培養(yǎng)顯微觀察系的一例。如圖1(a)所示，為該系統(tǒng)心臟部分的多電極排列芯片(1)固定在顯微鏡觀察系統(tǒng)中，可以進(jìn)行從光學(xué)系統(tǒng)通過CCD照相機(jī)向控制用計算機(jī)的一趟時間(lap time)計測和來自電極排列的電信號的記錄和從各電極排列端子向細(xì)胞的電刺激，可以進(jìn)行電信號和光學(xué)數(shù)據(jù)的同時計測、記錄。
圖1(b)表示作為該系統(tǒng)心臟部分的多電極排列芯片(1)的一例的一部分截面。在可以用100倍的物鏡觀察的0.18mm壁薄的滑動玻璃(11)上，首先配置電極(12)排列的層。然后，用對粘度進(jìn)行了調(diào)整的光固化性樹脂SU-8(為環(huán)氧系高分子，通過光照射使光照到的部分聚合的壁厚光致抗蝕劑材料Micro Chem Inc.制，USP 4882245)被覆電極面以使層的厚度達(dá)到25μm，同時進(jìn)行蝕刻局部地將該樹脂層除去，形成分割壁(13)，構(gòu)成封入細(xì)胞(2)的穴(微室排列)。當(dāng)然，除了上述SU-8以外，如果是光固化性且壁比較厚的抗蝕劑材料，可以使用各種樹脂。
此外，在這里，在封入細(xì)胞(2)的金電極(12)表面上涂布層粘連蛋白或膠原等。在封入了細(xì)胞(2)的微室排列的上面用半透膜(14)封蓋，以防止來自外部的污染并防止細(xì)胞(2)的逃逸。芯片上的培養(yǎng)液緩沖液經(jīng)常循環(huán)保持新鮮的狀態(tài)。在該例中使用金電極，但也可以使用ITO等光學(xué)上透明的電極。
以下，對多電極排列芯片進(jìn)行詳細(xì)介紹。圖2表示加工的各階段中基板的狀態(tài)的顯微鏡照片。圖2的各照片右下方的比例尺為長100μm。圖2(a)為在滑動玻璃基板上以Cr100、Au1000的順序蒸鍍后，經(jīng)過光致抗蝕劑涂布、曝光、顯影、蝕刻工序而作成的電極圖案。電極的大小與同其組合的微室的尺寸相匹配，為一邊30μm。圖2(b)為將上述光固化性樹脂SU-8涂布到滑動玻璃基板并干燥后，進(jìn)行所希望的圖案曝光、蝕刻處理而作成的微室排列。在該例中，與圖2(a)的電極的位置相適合，配置8個1邊30μm的壁。SU-8的壁的高度為25μm(用臺階高差計測定)，如從圖中看到的那樣，微室排列的壁的寬度為1-5μm左右。如上所述通過使用SU-8，可以簡單地作成(高度/寬度)的比高的構(gòu)造物。圖2(c)實際上將圖2(a)的電極和圖2(b)的微結(jié)構(gòu)組合，在作為實施例的神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)中使用該形狀的多電極排列芯片。
以下，對覆蓋多電極排列芯片上面的半透膜的蓋的固定方法的手法之一進(jìn)行簡單介紹。圖3簡單表示在基板(11)表面生物素改性方法和在半透膜上抗生物素蛋白改性方法的順序。首先，在基板(11)表面上加成氨基，使其與末端導(dǎo)入環(huán)氧基的生物素反應(yīng)。另一方面，半透膜(14)例如由纖維素構(gòu)成，因此使該糖的五元環(huán)的一部分開裂，使其與加成在抗生物素蛋白末端的氨基反應(yīng)，制作抗生物素蛋白改性半透膜。半透膜(14)和基板(11)通過抗生物素蛋白-生物素鍵接合固定。
當(dāng)使用上述光固化性樹脂SU-8時，由于SU-8具有反應(yīng)性的環(huán)氧基，因此可以在光照射前使預(yù)烘烤的基板(11)表面和蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，然后進(jìn)行光照射，或者在用SU-8作成圖案后，通過濺射將SiO2涂布到其表面上，用硅烷偶聯(lián)劑在其上面使環(huán)氧基加成，使其與蛋白質(zhì)的氨基共價鍵結(jié)合。
圖4(a)為表示這樣作成的多電極排列芯片的整體像的顯微鏡照片。比例尺的長度為150μm。此外，圖4(b)為將該多電極排列芯片的滑動玻璃基板固定到支座上的照片。該滑動玻璃的大小為3cm×3cm。當(dāng)實際培養(yǎng)、觀察時，與該圖4(b)所示的支座一起載置到安裝在顯微鏡平臺上的多電極1次放大器上，進(jìn)行觀察。
以下，對載置多電極排列芯片，實際進(jìn)行計測、培養(yǎng)的系統(tǒng)進(jìn)行簡單說明。圖5表示實際給予神經(jīng)細(xì)胞刺激，或電計測細(xì)胞沖動的系統(tǒng)的概略情況。本裝置的特征在于可以使用配置在多電極排列內(nèi)的同一電極給予細(xì)胞刺激進(jìn)行計測，可以在光學(xué)上連續(xù)觀察細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形態(tài)，而且由于細(xì)胞與信息記錄裝置光學(xué)地連接，在1次放大器內(nèi)以接地水平進(jìn)行絕緣。因此，即使當(dāng)長期培養(yǎng)時，通過接地不使脈沖信號波及細(xì)胞。圖5(a)為該系統(tǒng)的概略圖，該裝置的1次放大器部的照片為圖5(b)。圖5(b)所示的1次放大器基板的中心部為了進(jìn)行顯微鏡觀察而空著，直接固定到顯微鏡的平臺上。安裝基板使用4層多層基板，最上層和最下層為接地面，此外，如前所述，這些接地面的內(nèi)側(cè)和外側(cè)彼此獨立，細(xì)胞為電池驅(qū)動，控制用計算機(jī)為電源裝置驅(qū)動。本試制機(jī)為用于試制的12通道型，通過提高安裝密度，可以成為更多通道型。
圖6表示載置多電極排列芯片進(jìn)行培養(yǎng)的顯微鏡系統(tǒng)。圖6(a)為表示固定在顯微鏡系統(tǒng)平臺上的1次放大器基板和固定在該基板上的芯片的照片。飽和蒸汽壓的含有5％CO2的空氣加熱到37℃，直接吹到基板上的芯片上。在該照片中，沒有安裝培養(yǎng)液的回流系，培養(yǎng)時采用2根SUS細(xì)管邊置換培養(yǎng)液邊連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。此外，如圖6(b)所示，用恒溫槽將顯微鏡系統(tǒng)整體包起，努力使包括顯微鏡的系統(tǒng)整體的溫度維持一定。
圖7為用40倍物鏡拍攝的用本系統(tǒng)實際培養(yǎng)大鼠小腦顆粒細(xì)胞的結(jié)果的1例的圖像。觀察到封入微室排列的細(xì)胞沒有從微室逃逸而形成了網(wǎng)絡(luò)。此外，也沒有觀察到大腸菌等來自環(huán)境的雜質(zhì)的混入。由此可知，微室的結(jié)構(gòu)發(fā)揮了所期待的性能。
當(dāng)然，本發(fā)明申請并不限于以上的例示。其細(xì)節(jié)部分的實施方式可以各種各樣。
如上所述，通過使用本發(fā)明申請，可以以1細(xì)胞單位對神經(jīng)細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)空間配置進(jìn)行控制，同時邊長期培養(yǎng)邊連續(xù)地計測其形態(tài)變化、電特性的變化。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，其特征在于在基板上具有用于計測神經(jīng)細(xì)胞的電位變化的多個電極圖案和，在其上面具有用于將神經(jīng)細(xì)胞封入特定的空間配置中的多個分割壁，在分割壁上配置光學(xué)上透明的半透膜。
2.權(quán)利要求1所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，其特征在于電極圖案為光學(xué)上透明的電極。
3.權(quán)利要求1或2所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，其特征在于電極圖案的能夠獨立計測的電極數(shù)為3個以上。
4.權(quán)利要求1所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，其特征在于用多個分割壁隔開的細(xì)胞的區(qū)域為3個區(qū)域以上。
5.權(quán)利要求1-4的任一項所述的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，其特征在于對于電極圖案和用多個分割隔開的區(qū)域，各電極和各區(qū)域一一對應(yīng)。
全文摘要
神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)微室，其由在透明玻璃基板上具有細(xì)胞水平大小的電極排列，在其上面具有厚度10μm以上厚壁的細(xì)胞配列用微室排列，以及在上述微室上面的半透膜構(gòu)成，上述半透膜是，對于被覆微室上面的細(xì)胞不能通過程度的以使細(xì)胞不從微室中逃逸對粗的上述集束光在光學(xué)上是透明的網(wǎng)眼粗細(xì)的半透膜，此外，上述半透膜的上面具有能夠使培養(yǎng)液循環(huán)的溶液交換部液體交換的裝置，此外，具有在光學(xué)上連續(xù)觀察上述微室排列內(nèi)的細(xì)胞的狀態(tài)變化的裝置和與連續(xù)計測各神經(jīng)細(xì)胞的電位變化的裝置組合的裝置，其為能夠?qū)W(wǎng)絡(luò)形狀進(jìn)行完全控制，而且在無細(xì)菌等侵入的情況下長時間對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的刺激應(yīng)答的變化進(jìn)行計測的裝置。
文檔編號C12M1/12GK1678733SQ0382030
公開日2005年10月5日 申請日期2003年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月26日
發(fā)明者安田賢二 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)