亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基及其專用培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是一類具有自我更新能力且在適合微環(huán)境下具有多系分化潛能的原始細(xì)胞。根據(jù)個(gè)體發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞、新生兒干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，按照干細(xì)胞分化潛能的不同，可以分為全能干細(xì)胞、亞全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。目前，已有利用干細(xì)胞治療心肌梗塞、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)損傷和肌肉萎縮等。
[0003]亞全能干細(xì)胞是指具有三胚層分化潛能的一類干細(xì)胞亞群，在特定環(huán)境下，理論上可以誘導(dǎo)分化為人體任何一種組織細(xì)胞，主要來(lái)源于人體中廣泛存在的間充質(zhì)組織，特別是骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等間充質(zhì)組織，由于臍帶和胎盤來(lái)源的亞全能干細(xì)胞具有更為原始和更為強(qiáng)大的增值能力，較強(qiáng)的分化能力，低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越受人們關(guān)注。
[0004]作為要應(yīng)用于臨床細(xì)胞治療的細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)具有如下特點(diǎn):組織取材方便，來(lái)源廣泛，不受倫理限制；分離過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)外源污染引入；外來(lái)添加物少，過(guò)程可控性強(qiáng)，重復(fù)性好；可獲得足夠細(xì)胞，細(xì)胞活力好；培養(yǎng)周期短，成本低。目前亞全能干細(xì)胞的制備過(guò)程中，獲得的亞全能干細(xì)胞不穩(wěn)定，且需要多次傳代才可獲得足夠的干細(xì)胞，因此生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。
[0005]現(xiàn)有培養(yǎng)基中含有血清等成分。
[0006]細(xì)胞凍存代數(shù)越早，細(xì)胞的增殖，活力，分化能力就越好，而現(xiàn)有技術(shù)(CN200810240040.8和CN103275926A)都需要至少擴(kuò)增到兩代以上才能后得足夠的干細(xì)胞。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的提供一種亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基及其專用培養(yǎng)方法，使細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次傳代就可以獲得足夠的干細(xì)胞用于儲(chǔ)存。并且不含血清方便使用。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，供一種亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，包含95 %的DMEM/F12, 5 %血清替代物,5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子，2xl0-8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長(zhǎng)因子，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，50umol/L β -巰基乙醇,2mmol/L L-谷氨酰胺。
[0009]該培養(yǎng)基不含血清，培養(yǎng)效果好，只需培養(yǎng)一代即可達(dá)到所需要冷凍的數(shù)量。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟:
[0011 ] 取亞全能干細(xì)胞混勻后，加入到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞濃度。亞全能干細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加所述亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)；
[0012]將培養(yǎng)瓶放于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后首次換液；
[0013]待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%?90%的匯合度，加入胰蛋白酶消化，加入亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基終止消化將脫落的細(xì)胞和亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200?1800rpm,離心6?8min,將細(xì)胞沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以1?5X104/cm接種，進(jìn)行一代培養(yǎng)得。該方法發(fā)培養(yǎng)效果好只需一代培養(yǎng)即可達(dá)到可觀數(shù)量。
[0014]在一些實(shí)施方式中，入胰蛋白酶消化步驟為:加入0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37°C消化1?3min。消化效果好。
[0015]在一些實(shí)施方式中，一代培養(yǎng)的亞全能干細(xì)胞可冷凍處理，所述冷凍處理的方法如下:血清替代物和二甲基亞砜按體積比9:1的比例緩慢混勻后配成凍存液，放于4°C預(yù)冷10?30min，同時(shí)將凍存管和不銹鋼凍存管架放于_20°C預(yù)冷；收集一代培養(yǎng)的亞全能干細(xì)胞，將預(yù)冷的凍存液加入大離心管內(nèi)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞放入凍存管，加樣時(shí)凍存管放于預(yù)冷的凍存管架上，將凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開(kāi)始凍存程序，降至_90°C，取出凍存管，放入液氮儲(chǔ)存箱長(zhǎng)期保存。該方法保存效果好活力高。
[0016]在一些實(shí)施方式中，冷凍處理的亞全能干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，方法如下:將冷凍的干細(xì)胞37°水浴快速化凍，孵育時(shí)間為2-5min，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含5%人血白蛋白的復(fù)合氨基酸生理鹽水中。該復(fù)蘇方法復(fù)蘇效果好恢復(fù)好。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為24h后首次換液亞全能干細(xì)胞生長(zhǎng)情況顯微照片；
[0018]圖2為細(xì)胞生長(zhǎng)至80%?90%的匯合度時(shí)顯微照片；
[0019]圖3為第二天細(xì)胞生長(zhǎng)情況顯微照片；
[0020]圖4為第三天細(xì)胞生長(zhǎng)情況顯微照片；
[0021]圖5為冷凍復(fù)蘇后細(xì)胞生長(zhǎng)情況顯微照片；
[0022]圖6為冷凍復(fù)蘇后貼壁，開(kāi)始鋪展細(xì)胞生長(zhǎng)情況顯微照片；
[0023]圖7為冷凍復(fù)蘇后第二天細(xì)胞生長(zhǎng)情況顯微照片；
【具體實(shí)施方式】
[0024]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0025]實(shí)驗(yàn)所需器具儀器等均可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)得。
[0026]1.亞全能干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0027]1.1將亞全能干細(xì)胞混勻后，取10ul加入到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5?IX 104/cm，接種于T75瓶?jī)?nèi)，每瓶加亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基至15ml，亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基成分為:包含95%的DMEM/F12，5%血清替代物(市售本例用 KnockOut? Serum Replacement), 5mg/ml 人血白蛋白，5.5ug/ml 亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子，2x10 8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長(zhǎng)因子，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子,50umol/LP -巰基乙醇,2mmol/LL-谷氨酰胺。亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，劑型為培養(yǎng)液形態(tài)，。
[0028]1.2將培養(yǎng)瓶放于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后首次換液(圖1)可見(jiàn)生長(zhǎng)狀況良好。
[0029]1.3每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%?90%的匯合度(圖2)，加入10ml濃度為0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37 °C消化1?3min，加入適量亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基終止消化，將脫落的細(xì)胞和亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200?1800rpm，離心6?8min，將細(xì)胞沉淀用本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以1?5X104/cm接種，第二天細(xì)胞可達(dá)到50%左右匯合度(圖3)，第三天基本可以達(dá)到80%以上匯合度(圖4)。可見(jiàn)融合速度快效率高且形態(tài)良好。
[0030]2 凍存
[0031 ] 將血清替代物和二甲基亞砜(DMS0)按體積比9:1的比例緩慢混勻后配成凍存液，放于4°C預(yù)冷10?30min，同時(shí)將凍存管和不銹鋼凍存管架放于_20度預(yù)冷；收集P1代干細(xì)胞，將預(yù)冷的凍存液(4?7X106個(gè)干細(xì)胞/ml)加入大離心管內(nèi)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞放入凍存管，加樣時(shí)凍存管放于預(yù)冷的凍存管架上，將凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開(kāi)始凍存程序第一步4°C等待，第二步1.0°C /min降至_4°C，第三步25.0°C /min降至_40°C，第四步
10.0°C /min 降至 _12°C,第五步 1.0°C /min 降至-40°C,第六步 10.0°C /min 降至 _90°C,取出凍存管，放入液氮儲(chǔ)存箱長(zhǎng)期保存。
[0032]3 復(fù)蘇
[0033]將干細(xì)胞37°C水浴快速化凍，孵育時(shí)間為2_5min，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含5%人血白蛋白的復(fù)合氨基酸生理鹽水中，1200-1500rpm,離心6_8min，棄上清后，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，計(jì)細(xì)胞活力，細(xì)胞存活率高于80%，如圖5，接種培養(yǎng)，30min貼壁，開(kāi)始鋪展(圖6)，2天后細(xì)胞可達(dá)到85%的匯合度(圖7)?？梢?jiàn)本方法保存后復(fù)蘇效果好。
[0034]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干相似的變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，其特征在于，包含95%的DMEM/F12，5 %血清替代物，5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子，2xl0_8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長(zhǎng)因子，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子,50umol/L β -巰基乙醇,2mmol/LL-谷氨酰胺ο2.亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 取亞全能干細(xì)胞混勻后，加入到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞濃度，亞全能干細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加所述亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)； 將培養(yǎng)瓶放于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后首次換液； 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%?90%的匯合度，加入胰蛋白酶消化，加入所述亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基終止消化，將脫落的細(xì)胞和亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200?1800rpm,離心6?8min,將細(xì)胞沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以1?5X104/cm接種，進(jìn)行一代培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述加入胰蛋白酶消化步驟為:加入0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37°C消化1?3min。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述一代培養(yǎng)的亞全能干細(xì)胞可冷凍處理，所述冷凍處理的方法如下:血清替代物和二甲基亞砜按體積比9:1的比例緩慢混勻后配成凍存液，放于4°C預(yù)冷10?30min，同時(shí)將凍存管和不銹鋼凍存管架放于-20°C預(yù)冷；收集一代培養(yǎng)的亞全能干細(xì)胞，將預(yù)冷的凍存液加入大離心管內(nèi)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞放入凍存管，加樣時(shí)凍存管放于預(yù)冷的凍存管架上，將凍存管放入程控降溫儀進(jìn)行預(yù)冷，開(kāi)始凍存程序，降至_90°C，取出凍存管，放入液氮儲(chǔ)存箱長(zhǎng)期保存。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述冷凍處理的亞全能干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，方法如下:將冷凍的干細(xì)胞37°水浴快速化凍，孵育時(shí)間為2-5min，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含5 %人血白蛋白的復(fù)合氨基酸生理鹽水中。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基及其專用培養(yǎng)方法，使細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次傳代就可以獲得足夠的干細(xì)胞用于儲(chǔ)存。并且不含血清方便使用。亞全能干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，包含95％的DMEM/F12，5％血清替代物，5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子，2x10-8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長(zhǎng)因子，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，50umol/Lβ-巰基乙醇，2mmol/L？L-谷氨酰胺。該培養(yǎng)基不含血清，培養(yǎng)效果好，只需培養(yǎng)一代即可達(dá)到所需要冷凍的數(shù)量。
【IPC分類】C12N5/0775, A01N1/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105441387
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410446098
【發(fā)明人】王軍霞, 黃福來(lái)
【申請(qǐng)人】黃福來(lái)
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2014年9月3日