專利名稱：茶氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造茶氨酸的新方法背景技術(shù)茶氨酸是已知的綠茶味道的主要成分，是以茶為代表的食品的重要的香料物質(zhì)。另外，有文獻(xiàn)指出，包括茶氨酸在內(nèi)的γ-谷氨酰胺衍生物，在動(dòng)、植物體內(nèi)作為生理活性物質(zhì)發(fā)揮作用。例如，在Chem.Parm.Bull.，19(7)，1301-1307(1971)；同一刊物中的19(6)，1257-1261(1971)；同一刊物中的34(7)，3053-3057(1986)；藥學(xué)雜志，95(7)，892-895(1975)等文獻(xiàn)中，揭示了茶氨酸、谷氨酰胺等可抑制由咖啡因引發(fā)的抽搐的內(nèi)容。由此說(shuō)明這些化合物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，有望作為有效的生理活性物質(zhì)發(fā)揮作用。
一直以來(lái)，茶氨酸的常見制造方法是從生產(chǎn)含茶氨酸的玉露茶的茶園中得到的干茶葉中提取的方法。但由于茶氨酸在干茶葉中存量?jī)H有1.5％左右，且由于一般煎茶用茶園的茶葉因活躍的光合作用會(huì)使茶氨酸迅速分解，所以，很難保證充足的產(chǎn)量。因此，從干茶葉提取茶氨酸的方法被指工業(yè)上不實(shí)用。
因此，人們對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)方法的開發(fā)有所期待，其一就是化學(xué)有機(jī)合成茶氨酸的方法(Chem.Parm.Bull.，19(7)，1301-1308(1971))。但這類技術(shù)存在著有機(jī)合成反應(yīng)時(shí)收率低、合成產(chǎn)物分離、精制等時(shí)需要復(fù)雜操作的問(wèn)題。
另外，還有利用谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，由谷氨酰胺、乙胺合成茶氨酸的酶法(日本特公平07-55154號(hào)公報(bào))。但該方法存在著因谷氨酰胺酶的水解反應(yīng)而在生成茶氨酸的同時(shí)，還生成副產(chǎn)物谷氨酸，而使茶氨酸的精制變得麻煩的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是考慮到上述情況而作出的發(fā)明，目的在于提供有效的茶氨酸制造方法，能使茶氨酸的生產(chǎn)變得簡(jiǎn)單，并有利于工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明人等為解決上述問(wèn)題，反復(fù)從自然界的土壤中分離、選定新型茶氨酸生產(chǎn)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特定微生物所具有的谷氨酰胺酶與日本特公平07-55154中所揭示的硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)IFO 12694的谷氨酰胺酶相比，具有高茶氨酸合成活性和低谷氨酸合成活性，從而基本上完成了本發(fā)明。上述茶氨酸生產(chǎn)菌是本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)鑒定的新型菌株，名為香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA(保藏機(jī)關(guān)名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心地址日本茨城縣筑波市東一丁目1番地中央第6，保藏日2002年7月31日，保藏編號(hào)FERM BP-8353)。
根據(jù)本發(fā)明，能提供高效的制造茶氨酸的新方法，能使茶氨酸的生產(chǎn)變得簡(jiǎn)單，并有利于工業(yè)生產(chǎn)。


圖1為茶氨酸的IR光譜示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受限于下述實(shí)施方式，在不改變其要點(diǎn)的前提下，可做各種改變進(jìn)行實(shí)施。另外，本發(fā)明的技術(shù)范圍延及均等的范圍。
本發(fā)明的茶氨酸是指γ-谷氨?；野贰-谷氨酸-γ-乙胺等。茶氨酸是茶的味道成分，是用于調(diào)味用途的食品添加劑。
本發(fā)明所用的香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA，保藏編號(hào)FERM BP-8353)，是由本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的新菌株，屬于假單胞菌屬、香茅(citronellosis)種，是具有γ-谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的茶氨酸生產(chǎn)菌。另外，本發(fā)明所用的香茅醇假單孢菌GEA的鑒定，是通過(guò)根據(jù)一定法則的菌類學(xué)性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)的分析和相當(dāng)于16s rRNA的DNA堿基序列與已知微生物的比較來(lái)進(jìn)行的。
本發(fā)明的谷氨酰胺酶是來(lái)自香茅醇假單孢菌GEA的酶。該反應(yīng)的酶活性源可直接使用活菌體或各種處理標(biāo)準(zhǔn)品，例如菌體磨碎物、超聲波處理菌體、溶劑處理菌體、低溫干燥菌體、硫酸銨鹽析物、精制酶標(biāo)準(zhǔn)品等，或上述制品的定形品。為高效進(jìn)行本發(fā)明的酶反應(yīng)，pH值范圍優(yōu)選為9～12、更優(yōu)選為10～11。而反應(yīng)溫度優(yōu)選為10～55℃、更優(yōu)選為25～35℃。
從如上所述而得的反應(yīng)液中分離精制茶氨酸采用公知方法。例如，可很容易地通過(guò)組合各種色譜(例如，溶劑分配色譜、HPLC等)進(jìn)行。
下面，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1茶氨酸營(yíng)養(yǎng)性菌(utilizing bacteria)的分離采用日本滋賀縣、京都府的土壤，配制成土壤懸濁液后，利用以茶氨酸為碳源的選擇培養(yǎng)基，其中，茶氨酸0.5％、酵母提取物0.03％、KH2PO40.05％、K2HPO40.05％、MgSO4·7H2O 0.03％、pH為7，進(jìn)行3次傳代培養(yǎng)，分離100株茶氨酸營(yíng)養(yǎng)性菌。
實(shí)施例2無(wú)細(xì)胞提取液的配制在1升實(shí)施例1的選擇培養(yǎng)基中，分別將100株茶氨酸營(yíng)養(yǎng)性菌在30℃下培養(yǎng)20小時(shí)。然后收集菌體并洗凈，懸濁在50毫升30mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，在5℃～20℃下超聲波破碎，得到無(wú)細(xì)胞提取液。
實(shí)施例3酶反應(yīng)使用實(shí)施例2的無(wú)細(xì)胞提取液，在含谷氨酰胺0.3M、乙胺0.6M的100mM硼酸緩沖液(Na2B4O7-NaOH、pH11)中，在30℃下進(jìn)行24小時(shí)的酶反應(yīng)，合成了茶氨酸。
實(shí)施例4茶氨酸合成活性、谷氨酸合成活性的測(cè)定將實(shí)施例3中進(jìn)行了茶氨酸合成的酶反應(yīng)液適當(dāng)稀釋，通過(guò)進(jìn)行逆相HPLC，分別對(duì)茶氨酸、谷氨酸的合成量進(jìn)行定量。分析條件如下。分析柱使用Develosil ODS HG-5(野村化學(xué)(株))，檢測(cè)儀使用Waters 2487DualλUV/VIS(Waters社制)檢測(cè)儀。而內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用煙酰胺(Nacalai Tesque，Inc.)。移動(dòng)相使用以純水∶甲醇∶三氟乙酸＝980∶20∶1的比例混合的混合物。
比較例1將硝基還原假單胞菌的無(wú)細(xì)胞提取液用作100株茶氨酸營(yíng)養(yǎng)性菌的對(duì)照菌株，進(jìn)行茶氨酸合成活性與谷氨酸合成活性的測(cè)定。
試驗(yàn)例1以茶氨酸合成活性為標(biāo)準(zhǔn)，從茶氨酸營(yíng)養(yǎng)性菌群中選擇高茶氨酸生產(chǎn)菌用實(shí)施例2的方法分別調(diào)制實(shí)施例1中分離的100株茶氨酸營(yíng)養(yǎng)性菌各菌株的無(wú)細(xì)胞提取液，用實(shí)施例3的方法進(jìn)行酶反應(yīng)，用實(shí)施例4的方法測(cè)定茶氨酸的合成量。結(jié)果與成功得到1種與以往報(bào)告的硝基還原假單胞菌茶氨酸合成活性相比，具有4倍以上高活性的新型茶氨酸生產(chǎn)菌的菌株。
表1

單位mM(h·mg)實(shí)施例5新型茶氨酸生產(chǎn)菌的鑒定按照一定法則，將試驗(yàn)例1所得新型茶氨酸生產(chǎn)菌的菌類學(xué)性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)，對(duì)下述項(xiàng)目，即革蘭氏染色、細(xì)胞形態(tài)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))、硝酸鹽還原活性、吡嗪酰胺酶、吡咯烷酮酰芳基酰胺酶(pyrrolidonyarylamidase)、堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、尿素酶、明膠液化能力、七葉苷利用能力、葡萄糖利用能力、核糖利用能力、木糖利用能力、甘露醇利用能力、麥芽糖利用能力、乳糖利用能力、蔗糖利用能力、糖原利用能力進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)這些試驗(yàn)的結(jié)果，參照Bergey′s manual(第8版)的結(jié)果，得出菌屬是假單孢菌屬(Pseudomonas)的結(jié)論。
另外，決定相當(dāng)于16s rRNA的DNA堿基序列，與已知微生物的同序列比較。結(jié)果，本菌株鑒定為假單孢菌屬(Pseudomonas)，香茅(citronellosis)種，是一種新菌種，據(jù)此命名為香茅醇假單孢菌GEA。
實(shí)施例6香茅醇假單孢菌GEA培養(yǎng)條件的最優(yōu)化本發(fā)明人等研究了使用實(shí)施例1中的菌選擇培養(yǎng)基(碳源茶氨酸)之外的碳源的培養(yǎng)基的香茅醇假單孢菌GEA的培養(yǎng)。在研究了谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、甘油等碳源后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甘油時(shí)能達(dá)到最佳結(jié)果。而在研究了培養(yǎng)基中的甘油濃度后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3％甘油濃度下，可得到具有最佳茶氨酸合成活性的無(wú)細(xì)胞提取液。同時(shí)，在研究了酵母提取物濃度后發(fā)現(xiàn)，0.3％時(shí)可得到具有最佳茶氨酸合成活性的無(wú)細(xì)胞提取液。
表2

單位mM/(h·mg)實(shí)施例7使用來(lái)自香茅醇假單孢菌GEA的無(wú)細(xì)胞提取液的酶反應(yīng)條件的最優(yōu)化按照實(shí)施例1中的酶反應(yīng)條件，研究使用來(lái)自香茅醇假單孢菌GEA的無(wú)細(xì)胞提取液時(shí)的谷氨酰胺、乙胺的各種濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用0.3M谷氨酰胺與0.9M乙胺反應(yīng)48小時(shí)可得到最大的茶氨酸合成量。
表3

The茶氨酸，Glu谷氨酸，()內(nèi)是反應(yīng)時(shí)間(單位小時(shí))，單位mM實(shí)施例8使用香茅醇假單孢菌GEA制造茶氨酸使用20升含有3.0％甘油、0.3％酵母提取物、0.05％KH2PO4、0.05％K2HPO4、0.03％MgSO4·7H2O的培養(yǎng)液，在容積30升的發(fā)酵罐(30℃、轉(zhuǎn)速2000rpm)中將香茅醇假單孢菌GEA培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)后，利用離心分離收集菌體并洗凈，得到180g菌體。
使用10g配制的菌體，以0.3M谷氨酰胺、0.9M乙胺、pH10、30℃的條件進(jìn)行酶反應(yīng)，24小時(shí)后得到每升40g的茶氨酸。從反應(yīng)液中分離精制茶氨酸是通過(guò)從反應(yīng)液中除去菌體后，通過(guò)Dowex 50×8、Dowe×1×2譜柱，用乙醇處理而施行的。
用氨基酸分析儀與紙色譜分析法分析該分離物，結(jié)果顯示出與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同樣的特性。而當(dāng)用鹽酸或谷氨酰胺酶進(jìn)行水解處理后，會(huì)按照1∶1的比例產(chǎn)生谷氨酸與乙胺。由于利用谷氨酰胺酶可使該分離物水解，所以表明乙胺結(jié)合在谷氨酸的γ位。另外，還利用谷氨酸脫氫酶(GluDH)確認(rèn)水解生成的谷氨酸為L(zhǎng)型。圖1表示茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的IR光譜。分離物得到與圖1的IR光譜同樣的光譜。根據(jù)上述結(jié)果可以確認(rèn)分離物為茶氨酸。
實(shí)施例9使用來(lái)自香茅醇假單孢菌GEA的谷氨酰胺酶的固定化酶制造茶氨酸(1)無(wú)細(xì)胞提取液的采取洗凈160g實(shí)施例8得到的菌體后，懸濁于2升30mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，以5℃～20℃下超聲波破碎，得到無(wú)細(xì)胞提取液。
(2)硫酸銨分級(jí)分離(fractionation)在2升上述(1)所得無(wú)細(xì)胞提取液中，用7％氨水將pH值調(diào)至7，同時(shí)加入硫酸銨。在得到35％飽和溶液的階段，利用離心分離除去沉淀，再添加硫酸銨。在得到90％飽和溶液的階段放置一夜，由離心分離回收沉淀，將其溶于0.01M磷酸鉀緩沖液，對(duì)該緩沖液進(jìn)行透析，得到透析酶液。
(3)使用DEAE-纖維素色譜柱的精制以0.01M磷酸鉀緩沖液緩沖上述(2)所得的透析酶液。然后使之吸附于DEAE-纖維素柱(15×60cm)，用含有0.1M食鹽的緩沖液洗提谷氨酰胺酶。結(jié)果得到800mg谷氨酰胺酶部分精制(partially purified)品。
(4)固定化谷氨酰胺酶的制備預(yù)先對(duì)以水膨潤(rùn)的市售固定化載體Chitopearl 3510(富士紡織(株))充分水洗，然后用0.1M磷酸鈉(pH6.8)平衡。將該濕潤(rùn)載體2g懸濁于5ml含35mg上述(3)制備的谷氨酰胺部分精制品的20mM磷酸鈉(pH6.8)中，在4℃下攪拌一夜。然后添加戊二醛使最終濃度為2.5％(V/V)，在4℃下放置3小時(shí)使之交聯(lián)。用0.1M磷酸鈉(pH6.8)充分洗凈根據(jù)上述操作而得的固定化酶，在4℃下保存。
(5)由固定化谷氨酰胺酶引起的酶反應(yīng)在上述(4)所制備的固定化谷氨酰胺酶中，以30℃、SV＝0.2的流速使基質(zhì)溶液(4％谷氨酰胺、25％乙胺、pH10.0)通過(guò)后，能得到收率65％的茶氨酸。從反應(yīng)液中分離精制茶氨酸是通過(guò)使反應(yīng)液通過(guò)Dowex 50×8、Dowex 1×2譜柱，用乙醇處理而進(jìn)行。
用氨基酸分析儀與紙色譜分析法分析該分離物，結(jié)果顯示出與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同樣的特性。而當(dāng)用鹽酸或谷氨酰胺酶進(jìn)行水解處理后，會(huì)按照1∶1的比例產(chǎn)生谷氨酸與乙胺。由于利用谷氨酰胺酶可使該分離物水解，所以表明乙胺結(jié)合在谷氨酸的γ位。另外，還利用谷氨酸脫氫酶(GluDH)確認(rèn)水解生成的谷氨酸為L(zhǎng)型。經(jīng)過(guò)茶氨酸的IR光譜分析后，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和分離物都得到與實(shí)施例8同樣的光譜。因此可確認(rèn)分離物為茶氨酸。
權(quán)利要求
1.茶氨酸的制造方法，其特征在于，使用香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)。
2.如權(quán)利要求1所述的茶氨酸制造方法，其特征在于，使用來(lái)自香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)的谷氨酰胺酶。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供高效的茶氨酸制造方法，能使茶氨酸的生產(chǎn)變得簡(jiǎn)單，并有利于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明人等從自然界的土壤中分離、選定的香茅醇假單孢菌GEA是屬于假單胞菌屬香茅(citronellosis)種，具有γ－谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的茶氨酸生產(chǎn)菌。通過(guò)在9～12的pH值的條件下將來(lái)自上述生產(chǎn)菌的谷氨酰胺酶用于谷氨酰胺和乙胺混合物，能以與現(xiàn)有方法相比非常高的效率制造茶氨酸。
文檔編號(hào)C12P13/02GK1688705SQ03821300
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2003年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者立木隆, 岡田幸隆, 小關(guān)誠(chéng), 大久保勉, L·R·朱內(nèi)賈, 山崎長(zhǎng)宏 申請(qǐng)人:太陽(yáng)化學(xué)株式會(huì)社