專利名稱：肌生長抑制素的金屬蛋白酶活化以及調(diào)節(jié)肌生長抑制素活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及肌生長抑制素(myostatin)活性的金屬蛋白酶調(diào)控，更具體地，是涉及應(yīng)用金屬蛋白酶BMP-1/TLD家族的激動劑或者拮抗劑來調(diào)節(jié)肌生長抑制素活性的方法，包括例如，調(diào)控生物體中的肌肉發(fā)育的方法，本發(fā)明還涉及鑒定這樣的金屬蛋白酶的激動劑和拮抗劑的方法，以及由此鑒定的激動劑和拮抗劑。
背景技術(shù)：
肌生長抑制素是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)家族的成員，其對于骨骼肌生長的正常調(diào)控是必需的。肌生長抑制素是一種分泌蛋白，其特異地在胚胎發(fā)育期間以及在成熟動物中由骨骼肌系的細胞表達，低水平的肌生長抑制素mRNA也存在于成熟動物的脂肪細胞中。在早期胚胎發(fā)生中，肌生長抑制素mRNA可以在發(fā)育中的體節(jié)的肌節(jié)區(qū)域檢測到。在晚期胚胎階段以及在動物出生后，已經(jīng)檢測到肌生長抑制素在所有骨骼肌中的廣泛表達。
肌生長抑制素的功能通過在小鼠中的基因打靶(gene targeting)研究得以闡明。缺乏肌生長抑制素的鼠表現(xiàn)出顯著的以及廣泛的骨骼肌重量增加，這是由于肌肉纖維的過度增生和過度肥大，這說明了肌生長抑制素是肌肉生長的負調(diào)控劑。肌生長抑制素基因在進化過程中是高度保守的，預(yù)測的成熟肌生長抑制素蛋白序列在小鼠、大鼠、人、雞、火雞和豬中是完全一樣的，并且與水生生物體也高度同源。肌生長抑制素的功能也是保守的，在牛中肌生長抑制素基因帶有與雙肌型表型相關(guān)的突變。
肌生長抑制素在調(diào)控肌肉生長和發(fā)育中的作用表明調(diào)控肌生長抑制素活性的方法和組合物可以具有廣泛的各種應(yīng)用，包括，例如，用于治療人類疾病和用于改善家畜的產(chǎn)量。至于人類治療方面的應(yīng)用，肌生長抑制素的表達或功能的抑制劑可以在治療肌肉萎縮病癥如肌營養(yǎng)不良、惡病質(zhì)(cachexia)和肌肉減少(sarcopenia)方面提供臨床上的幫助。此外，肌生長抑制素缺陷動物具有顯著的脂肪積累下降，在鼠的遺傳模型中，肌生長抑制素的缺失能夠抵抗肥胖癥和II型糖尿病的發(fā)展。正是如此，對肌生長抑制素活性的調(diào)節(jié)也可能對代謝紊亂如肥胖癥和II型糖尿病的治療有用處。而且在此方面，肌生長抑制素的表達或功能的抑制劑不僅可以用于提高家畜產(chǎn)率，也可以導(dǎo)致獲得具有更低脂肪含量的肉。
用于操縱肌生長抑制素的生物活性的各種策略已有描述。將肌生長抑制素以前體蛋白的形式合成，其經(jīng)過蛋白水解過程產(chǎn)生一個稱為“前肽(pro peptide)”的N-末端片段和一個C-末端片段，后者的通過二硫鍵連接的二聚體是具有生物活性的物質(zhì)。目前描述的用于抑制肌生長抑制素活性的策略是利用可以結(jié)合肌生長抑制素C-末端的二聚體并抑制其活性的分子。例如，肌生長抑制素在體外結(jié)合兩種II型活化素受體，Act RIIA和Act RIIB，在轉(zhuǎn)基因鼠中表達Act RIIB的截短的顯負性形式，得到了具有與轉(zhuǎn)基因肌生長抑制素基因敲除小鼠相當(dāng)?shù)募∪庵亓吭黾拥氖蟆?br> 肌生長抑制素前肽也已經(jīng)用于抑制肌生長抑制素的活性。在蛋白水解處理后，肌生長抑制素前肽與C-末端二聚體仍保持非共價的聯(lián)系，并維持二聚體為潛在的非活性形式。在各種體外分析中已經(jīng)表明前肽可以阻斷純化的肌生長抑制素C-末端二聚體的活性，在轉(zhuǎn)基因小鼠中過量表達前肽可導(dǎo)致肌生長抑制素?zé)o效突變的表型特征。濾泡素抑制素是另一種用作肌生長抑制素的抑制物的蛋白。濾泡素抑制素可以結(jié)合并抑制各種TGF-β家族成員的活性，包括肌生長抑制素，在肌肉中過量表達濾泡素抑制素的轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉生長具有顯著的增加，這與肌生長抑制素的活性抑制是相一致的。
以上所述的肌生長抑制素的抑制物的每一種都與成熟的肌生長抑制素特異地相互作用來抑制其活性。應(yīng)用可直接與某種蛋白如肌生長抑制素相互作用的藥劑來抑制這種蛋白的活性，可以具有很強的特異性，而同時這樣的方法可能要求大多數(shù)蛋白或者所有蛋白都被該藥劑結(jié)合，從而才能達到明顯的抑制效應(yīng)。抑制蛋白——特別是其本身必須由另一個第二蛋白例如一種酶來激活以使該第一蛋白具有功能的蛋白——的活性的另一個可選擇的方法是以所述第二蛋白作為靶標(biāo)。這樣的方法具有優(yōu)勢，因為激活蛋白如酶通常是以比其底物低得多的濃度水平存在。正是如此，所有的或者大多數(shù)的激活蛋白如酶都被抑制的可能性更大。
至于肌生長抑制素，已知至少兩種蛋白酶涉及到初始的基因產(chǎn)物，前肌生長抑制素(promyostatin)加工變成信號肽，一種前肽和C-末端片段的過程，C-末端片段形成同型二聚體，其具有肌生長抑制素的生物活性。遺憾的是，這些蛋白也可以作用于其它的各種蛋白，因此，靶向并抑制這些蛋白酶例如信號肽酶的藥劑如果被施用于活的生物體的話，很可能具有不同的和有害的效應(yīng)。因此，有必要鑒定出涉及調(diào)控肌生長抑制素的活化及其活性的更加特異的生物分子。本發(fā)明就滿足了這一要求，并提供了額外的優(yōu)勢。
發(fā)明概述 本發(fā)明是基于可以切割肌生長抑制素前肽的蛋白酶的鑒定，包括在所述肌生長抑制素前肽與肌生長抑制素C-末端二聚體以復(fù)合物的形式存在時。這樣，所述蛋白酶可以將潛在的無活性的肌生長抑制素復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為活性的肌生長抑制素，前者包括與C-末端肌生長抑制素多肽相結(jié)合的肌生長抑制素前肽，而后者是肌肉生長和發(fā)育的負調(diào)控因子。這樣的蛋白酶的實例是金屬蛋白酶骨形態(tài)發(fā)生蛋白1/tolloid(BMP-1/TLD)家族中的蛋白，它們?yōu)樗幬锾峁┝税袠?biāo)，所述藥物可以增加或者降低所述蛋白酶的活性，并因此增加或者降低肌生長抑制素的活性。因此，本發(fā)明提供了可調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割以及肌生長抑制素的活化的藥劑，還提供了應(yīng)用這些藥劑來例如在生物體中調(diào)控肌生長抑制素活性的方法。也提供了這些藥劑的鑒定方法。
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)肌生長抑制素的活化的方法。可以這樣來實施這一方法，例如，通過將可以切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶與潛在的肌生長抑制素復(fù)合物進行接觸，其中所述的肌生長抑制素復(fù)合物包括肌生長抑制素前肽和肌生長抑制素C-末端片段，特別是C-末端片段二聚體，并與可以增加或者降低所述金屬蛋白酶對所述前肽的蛋白水解切割的藥劑接觸，由此調(diào)節(jié)肌生長抑制素的活化。金屬蛋白酶可以是任何能夠切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶，特別地，當(dāng)所述前肽包含于潛在的肌生長抑制素復(fù)合物時，所述金屬蛋白酶包括例如，BMP-1/TLD家族成員如，BMP-1、TLD、tolloid樣蛋白1(TLL-1)或者tolloid樣蛋白2(TLL-2)，特別地，哺乳動物BMP-1/TLD家族成員，如哺乳動物(m)TLD(mTLD)、mTLL-1和mTLL-2。
本發(fā)明的方法可以用于增加肌生長抑制素的活化水平(即，高于不存在該藥劑時肌生長抑制素活化的基底水平)，例如，通過將潛在的肌生長抑制素復(fù)合物和金屬蛋白酶與可以增加金屬蛋白酶對前肽的蛋白切割的藥劑接觸；或者，本發(fā)明的方法可以用于減少肌生長抑制素的活化水平(低于基底水平)，例如，通過將潛在的肌生長抑制素復(fù)合物和金屬蛋白酶與可以降低金屬蛋白酶對前肽的蛋白切割的藥劑接觸。該方法可以在體外進行，其中可以應(yīng)用例如培養(yǎng)的組織或者細胞、細胞提取物，或者基本上純化的試劑，包括基本上純化的金屬蛋白酶和/或者潛在的肌生長抑制素復(fù)合物；或者，該方法可以在體內(nèi)進行，例如，在細胞或者組織中，它們中任何一個都可以是在生物體中的原位或者分離自生物體(如，培養(yǎng)中的離體細胞)。這樣，該方法可以通過將含有潛在的肌生長抑制素復(fù)合物和金屬蛋白酶的樣品(如組織樣品和/或者生物流體)與藥劑在體外接觸來實施，或者這樣的接觸也可以在體內(nèi)進行，例如，通過對受者施用藥劑。
游離的肌生長抑制素前肽、潛在的肌生長抑制素復(fù)合物，以及可以切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶可以在細胞內(nèi)或者細胞外存在。然而，前肽或者潛在的肌生長抑制素復(fù)合物通常并不與金屬蛋白酶共存于相同的細胞或者細胞類型中，因此，金屬蛋白酶對肌生長抑制素前肽的切割一般是于細胞外在金屬蛋白酶與前肽接觸后發(fā)生。這樣，藥劑與前肽、復(fù)合物和/或者金屬蛋白酶的接觸將部分依賴于藥劑是如何作用以調(diào)節(jié)切割的。例如，在藥劑能夠結(jié)合金屬蛋白酶并改變其構(gòu)象從而抑制其對肌生長抑制素前肽的切割活性時，可以將產(chǎn)生金屬蛋白酶的細胞與藥劑接觸，這樣，分泌出的金屬蛋白酶便缺乏這樣的活性，或者可以將藥劑施于某介質(zhì)中，而金屬蛋白酶也分泌到該介質(zhì)中(如活的生物體的血流中)，這樣，在與介質(zhì)中的藥劑接觸后，金屬蛋白酶對前肽的切割就降低或者被抑制了。與之比較的是，在藥劑所起的作用是例如使金屬蛋白酶和前肽的相互作用去穩(wěn)定化時，或者對于前肽而言，藥劑所起的作用是金屬蛋白酶的競爭性或者非競爭性抑制劑時，藥劑通常是與介質(zhì)接觸，而在所述介質(zhì)中金屬蛋白酶和前肽很可能相互作用(如血液)。
在一個實施方式中，藥劑降低了從潛在的肌生長抑制素復(fù)合物中切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶的蛋白水解活性，因此降低或者抑制了肌生長抑制素的活化，使其低于在不存在該藥劑時肌生長抑制素的活化水平。當(dāng)這樣的藥劑被施用于個體時，該藥劑可以引起個體內(nèi)肌肉重量的增加或者脂肪含量的降低或者兩者都有。個體可以是肌生長抑制素在其中被表達的任何個體，特別地，可以是脊椎動物生物體，例如，作為食物來源而被飼養(yǎng)的動物，如哺乳動物物種(如，綿羊、豬，或者牛)，家禽(如，雞或者火雞)，或者魚類(如，鮭魚、鱒魚，或者鱈魚)。個體也可以是人類個體，例如，患有肌肉病癥的個體(如，張力障礙或者營養(yǎng)障礙)，患有肌肉萎縮病癥的個體(如，惡病質(zhì))，或者患有臨床肥胖癥的個體或者其它的代謝紊亂如II型糖尿病的個體。在另一個實施方式中，該藥劑增強從潛在的肌生長抑制素復(fù)合物中切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶的蛋白水解活性，從而增強了肌生長抑制素的活化，使之高于在不存在該藥劑時肌生長抑制素發(fā)生的活化水平。當(dāng)這樣的藥劑被施用于個體時，該藥劑會導(dǎo)致個體內(nèi)肌肉重量的減少或者脂肪含量的增加，或者兩者均有。
本發(fā)明也涉及增加在個體中的肌肉重量的方法?？梢赃M行這樣的方法，例如通過對個體施用能夠降低或者抑制可切割肌生長抑制素前肽的蛋白酶對肌生長抑制素前肽進行的切割的藥劑，從而阻止在細胞中潛在的肌生長抑制素的活化，增加個體的肌肉重量。金屬蛋白酶可以是任何金屬蛋白酶，特別是BMP-1/TLD家族成員如，BMP-1、TLD、TLL-1或者TLL-2，包括mTLD、mTLL-1和mTLL-2。肌肉重量待增加的個體通常是脊椎動物，例如家養(yǎng)的或者農(nóng)場動物，包括哺乳動物如羊類、豬類，或者牛類；家禽如雞或者火雞類；或者魚類；或者可以是人類個體。
本發(fā)明進一步涉及改善個體的代謝紊亂的方法?？梢詫嵤┻@樣的方法，例如，通過給個體施用能夠降低或者抑制可切割肌生長抑制素前肽的蛋白酶對肌生長抑制素前肽進行的蛋白水解切割的藥劑，從而阻止?jié)撛诘募∩L抑制素在細胞中的活化，并改善代謝紊亂。代謝紊亂可以是與增加的或者不需要的肌生長抑制素活化或者活性相關(guān)的任何紊亂，包括，例如，肌肉萎縮病癥，如與肌營養(yǎng)不良、惡病質(zhì)(如，與癌癥或者獲得性免疫缺陷疾病相關(guān))或者肌肉減少相關(guān)的病癥；或者是例如臨床肥胖癥或II型糖尿病的代謝紊亂。代謝紊亂需被改善的個體可以是任何個體，一般是脊椎動物個體，例如家養(yǎng)的動物，如貓和狗，或者是用作食物來源的飼養(yǎng)動物(如牛、羊、豬，或者魚)，或者可以是人類個體。紊亂的改善可以使用通常用來監(jiān)控特定的代謝紊亂的任何分析來進行鑒定，例如，針對糖尿病的葡萄糖耐受測試，針對體內(nèi)脂肪分析的血清瘦素測試。
本發(fā)明也涉及鑒定可以調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割和潛在的肌生長抑制素的活化的藥劑的方法。可以進行這樣的篩選方法，例如，通過將肌生長抑制素前肽、可以切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶和受測藥劑在足以使得金屬蛋白酶對前肽進行切割的條件下接觸；檢測在不存在受測藥劑的情況下前肽的切割量與在存在受測藥劑的情況下的變化，由此鑒定可以調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素活化的藥劑。肌生長抑制素前肽可以是已經(jīng)分離的形式，或者是潛在的肌生長抑制素復(fù)合物的一個組成部分，該復(fù)合物進一步含有肌生長抑制素C-末端片段或者肌生長抑制素C-末端二聚體。
當(dāng)確定受測藥劑具有金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素調(diào)節(jié)活性時，本發(fā)明的篩選分析可以進一步包括定量的步驟，即定量分析該藥劑對肌生長抑制素前肽的切割或者肌生長抑制素的活化的增加或降低。例如，當(dāng)確定在細胞中藥劑增加了金屬蛋白酶的蛋白水解活性而使其高于基底水平時，本發(fā)明的方法可以進一步包括確定用什么量的藥劑可以增加肌生長抑制素的活化使其高于基底水平。這樣，本發(fā)明的方法提供了一種手段來獲得可以多樣地調(diào)節(jié)肌生長抑制素經(jīng)金屬蛋白酶的活化的藥劑或者一系列藥劑。這樣的方法進一步提供了一種手段來確定用于達到所需水平的肌生長抑制素活性所需的藥劑的量。
由于與受測藥劑的接觸而導(dǎo)致的前肽切割量的差異可以被檢測，例如，通過應(yīng)用例如電泳、色譜或質(zhì)譜的方法來檢測前肽或者前肽的切割產(chǎn)物，這些方法對肌生長抑制素前肽或者其切割產(chǎn)物的檢測是基于其大小、電荷或者兩者均有；還可以應(yīng)用以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的分析如免疫印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或者類似的分析，它們利用了針對完整前肽或者切割的前肽的特異抗體，但非既結(jié)合完整的前肽也結(jié)合切割的前肽的抗體；還可以應(yīng)用以熒光為基礎(chǔ)的分析，包括，例如，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析，其中完整前肽的熒光是猝滅的，而猝滅可以通過前肽的切割而解除。根據(jù)被檢測的完整肌生長抑制素前肽、前肽切割產(chǎn)物或者它們的組合的相對量，可以鑒定受測藥劑是增強或者降低金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割和潛在的肌生長抑制素的活化的藥劑。
前肽的切割量的差異也可以通過以下的方法檢測出來，即通過檢測肌生長抑制素對在體外的或者表達在細胞表面的肌生長抑制素受體的結(jié)合的變化，或者通過檢測在表達肌生長抑制素受體的細胞中肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化。當(dāng)分析是基于細胞的分析時，細胞可以是表達內(nèi)源性肌生長抑制素受體的細胞，例如L6肌細胞，或者可以是表達編碼肌生長抑制素受體的轉(zhuǎn)基因的細胞，例如，用編碼活化素受體如II型活化素受體的多聚核苷酸轉(zhuǎn)染的細胞。肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的任何水平被檢測，包括從肌生長抑制素結(jié)合于細胞表面受體到由于肌生長抑制素結(jié)合于肌生長抑制素受體而被調(diào)控的基因表達，其中，在本發(fā)明的篩選分析中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割和潛在的肌生長抑制素復(fù)合物的活化。這樣，肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過應(yīng)用受體結(jié)合分析檢測結(jié)合于肌生長抑制素受體的肌生長抑制素來檢測，或者通過檢測肌生長抑制素調(diào)控的基因的表達來檢測，所述的肌生長抑制素調(diào)控的基因包括例如，報告基因，其可以包括，例如，有效連接于編碼可以檢測到的多肽的多聚核苷酸的TGF-β調(diào)控元件。因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽切割和肌生長抑制素活化的藥劑，其中所述藥劑通過應(yīng)用本發(fā)明的篩選分析而被鑒定。本方法也用于證實調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽切割和肌生長抑制素活化的藥劑，包括證實，如果需要的話，藥劑的比活性。
本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化的藥劑。藥劑可以是金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化的激動劑或者拮抗劑，并且可以降低或者抑制金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化，或者可以增強金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化。調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化的藥劑可以是任何類型的分子，包括，例如，肽藥劑、多聚核苷酸藥劑、抗體藥劑或者有機小分子藥劑。
調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化的藥劑在此以肽藥劑為例進行說明。肽藥劑可以包括，例如，肌生長抑制素多肽的肽部分，或者肌生長抑制素的這樣的肽部分的衍生物。在一個實施方式中，肌生長抑制素的肽部分的衍生物是與肌生長抑制素前肽相對應(yīng)的肽。在該實施方式的一方面，衍生物是具有金屬蛋白酶切割位點的突變的前肽，例如，在與切割位點足夠近的地方取代、刪除或者插入氨基酸，這樣，使得金屬蛋白酶對于肽藥劑的切割活性增加或者降低。在該實施方式的另一個方面，肌生長抑制素多肽的肽部分的衍生物是降低或者抑制金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化的肽藥劑。調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化的藥劑可有效連接于(operatively linked to)第二分子上，該第二分子有利于該藥劑的作用或者活性，或者在特定的環(huán)境下增加或降低該藥劑的穩(wěn)定性。例如，肽藥劑可通過有效連接于例如抗體分子的Fc結(jié)構(gòu)域的多肽而被穩(wěn)定化，由此增加了該肽藥劑在體內(nèi)的半衰期。


圖1說明的是，肌生長抑制素復(fù)合物(MSTN；C-末端肌生長抑制素二聚體和前肽)和mTLL-1的溫育導(dǎo)致熒光素酶報告基因的表達顯著增加(點畫條柱；參見實施例2)，在轉(zhuǎn)染的橫紋肌肉瘤細胞中熒光素酶報告基因的表達在細胞與活性的肌生長抑制素接觸后受到調(diào)控。觀察到只與肌生長抑制素復(fù)合物接觸(實心條柱)或者只與mTLL-1接觸(陰影線條柱)的細胞的表達是背景水平的表達。
圖2顯示的是應(yīng)用熒光素酶報告子分析產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中轉(zhuǎn)基因細胞(參見以上的圖1)與特定量的具有活性的純化的C-末端肌生長抑制素二聚體接觸(菱形)。對照的熒光素酶活性(無肌生長抑制素)用圓點表示。
圖3A到3E顯示了BMP-1/TLD家族的蛋白酶對肌生長抑制素前肽的切割的測定。
圖3A和3B顯示了在CHO細胞條件培養(yǎng)基中前肽降解產(chǎn)物的檢測。由表達前肽(圖3A)或者前肽/Fc融合蛋白的野生型和突變體形式(圖3B)的CHO細胞制備的條件培養(yǎng)基用SDS-PAGE分析，隨后用抗肌生長抑制素前肽(圖3A)或者IgG(圖3B)的抗體進行western印跡分析。注意，D76到A的突變引起了降解產(chǎn)物的損失。
圖3C顯示了野生型和突變型前肽/C-末端二聚體復(fù)合物的純化。蛋白復(fù)合物在存在或者不存在β巰基乙醇的條件下用SDS-PAGE分析，隨后進行western印跡分析，正如所說明的。注意在與C-末端二聚體形成的復(fù)合物中純化出的D76突變體前肽，如同野生型前肽的情況。前肽的降解產(chǎn)物并沒有共純化，因此它不是復(fù)合物的一部分。用星號標(biāo)記的條帶顯示的是錯誤折疊的肌生長抑制素種類，其在非還原條件下是明顯的。
圖3D和圖3E顯示的是BMP-1/TLD蛋白酶對前肽進行的切割。野生型和突變型復(fù)合物與純化的蛋白酶一起溫育，用SDS-PAGE分析，隨后用抗前肽的抗體進行western印跡。溫育進行的條件是1μg潛在的復(fù)合物和250ng蛋白酶在37℃溫育16小時，作為例外，在圖3D中，樣品與另外的250ng的BMP-1溫育超過4小時。在圖3E中，標(biāo)記為“無酶”的條帶顯示的是樣品在不存在酶的情況下37℃溫育16個小時。注意，所有的酶都能夠產(chǎn)生切割產(chǎn)物，而D76A突變蛋白對于切割具有完全的抗性。
圖4A到4D顯示的是BMP-1/TLD蛋白酶對潛在的肌生長抑制素活性的激活。在圖4B到4D，黑色條柱代表野生型，灰色的條柱代表D76A突變體復(fù)合物。注意，盡管熱處理可以活化野生型和突變體復(fù)合物(圖4B)，但各種蛋白酶都僅僅能夠活化野生型復(fù)合物(圖4C和4D)*p＜0.05，**p＜0.01。
圖4A顯示的是純化的肌生長抑制素C-末端二聚體對pGL3-(CAGA)12-熒光素酶報告基因活性的活化。
圖4B顯示的是肌生長抑制素前肽/C-末端二聚體潛在的復(fù)合物通過加熱處理的活化。也標(biāo)示出了對照(無肌生長抑制素(MSTN))的結(jié)果。
圖4C和4D顯示了肌生長抑制素前肽/C-末端二聚體潛在復(fù)合物通過BMP-1/TLD蛋白酶的活化。在圖4C和4D中用于報告子分析的樣品分別與在圖3D和3E中說明的一樣。
圖5顯示了在體外，野生型和突變型前肽/Fc融合蛋白對報告基因活性的抑制。用報告基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的A204細胞與10ng/ml的純化的肌生長抑制素C-末端二聚體以及不同濃度的野生型(深色)或者D76A突變型(淺色)前肽/Fc融合蛋白一起溫育。注意，野生型和突變型蛋白在阻斷肌生長抑制素的活性方面是同樣有效的。
發(fā)明詳述 本發(fā)明是基于可切割肌生長抑制素前肽的蛋白酶的鑒定，包括所述前肽與肌生長抑制素C-末端二聚體存在于復(fù)合物中的情況，從而將潛在的無活性的肌生長抑制素復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘募∩L抑制素。具有這樣的肌生長抑制素前肽切割活性的蛋白酶的實例是金屬蛋白酶骨形態(tài)發(fā)生蛋白1/tolloid(BMP-1/TLD)家族的蛋白。這樣，所述蛋白酶為鑒定藥物提供了靶標(biāo)和試劑，所述藥物可以增加或降低蛋白酶活性，或者可以增加或減少由所述蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割并因此增加或者降低肌生長抑制素的活性。
肌生長抑制素(生長分化因子8；GDF-8)表達為原前體蛋白(pre-proprotein)，前肌生長抑制素(promyostatin)，其包括一段信號肽(氨基酸殘基大約1到20)、肌生長抑制素前肽結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基大約20到262或者263)以及肌生長抑制素C-末端結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基大約267或者268到375)。前肌生長抑制素多肽和編碼多聚核苷酸在進化中高度保守。(參見McPherron和Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 9412457，1997；GenBank Acc.Nos.AF019619、AF019620、AF019621、AF019622、AF019623、AF019624、AF019625、AF019626和AF019627；U.S.Pat.No.5,994,618，其中的每一個在此并入作為參考)。前肌生長抑制素多聚核苷酸以及編碼的多肽在此以人前肌生長抑制素(SEQ ID NOS1和2；前肽的氨基酸殘基是20到263)、牛前肌生長抑制素(SEQ ID NOS3和4；前肽的氨基酸殘基是20到262)、雞前肌生長抑制素(SEQ ID NOS5和6；前肽的氨基酸殘基是20到262)以及斑馬魚前肌生長抑制素(SEQ ID NOS7和8；前肽的氨基酸殘基為20到262)為例。
肌生長抑制素是通過兩個蛋白水解切割事件來活化的——首先去除信號序列(前肌生長抑制素的大約前20個N-端氨基酸殘基；參見，如，SEQ ID NO2)，第二步是在四元加工位點(tetrabasic processing site)(在前肌生長抑制素的大約氨基酸殘基263到266)處切割——結(jié)果產(chǎn)生26kDa的N-末端前肽(大約為氨基酸殘基20到262或者263)和12.5kDa的C-末端肽(大約為氨基酸殘基266或者267到C-末端)；C-末端肽的二聚體具有生物活性。在從細胞中分泌出后，由于其仍然結(jié)合于肌生長抑制素前肽，肌生長抑制素C-末端二聚體保持為潛在的無活性狀態(tài)(Lee和McPherron，Proc.Natl.Acad.Sci，，USA 989306-9311，2001，其在此列于參考文獻中)。在成年小鼠的血液中循環(huán)的潛在的肌生長抑制素復(fù)合物可以在體外通過酸處理而激活(Zimmers et al..Science 2961486-1488，2002，其在此列于參考文獻中)。
肌生長抑制素基因被敲除的小鼠顯示出肌肉重量的增加，并且進一步表現(xiàn)出隨著年齡的增長脂肪積累與野生型同窩出生仔畜相比顯著的下降(McPherron和Lee，J.din.Invest.109595-601，2002，其在此列于參考文獻中)。與之相反，在體內(nèi)過度表達肌生長抑制素產(chǎn)生了肌肉萎縮綜合癥的表征和癥狀特征，惡病質(zhì)(Zimmers et al.，supra，2002)。具有增加水平的循環(huán)的肌生長抑制素的小鼠中觀察到的肌肉萎縮可以部分地通過向鼠中引入肌生長抑制素結(jié)合藥劑如肌生長抑制素前肽和濾泡素抑制素來逆轉(zhuǎn)(Zimmers et al.，supra，2002)。這些結(jié)果確證了所觀察到的肌肉萎縮是由于增加的肌生長抑制素，并且表明降低活性肌生長抑制素的水平或者降低或抑制肌生長抑制素活性的方法可以用于改善肌肉萎縮?？紤]到在甚至多樣至魚類和人類的物種中肌生長抑制素高度保守的性質(zhì)，這些結(jié)果表明肌生長抑制素也可能涉及人類中與與各種紊亂相關(guān)的惡病質(zhì)，包括，例如癌癥，獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)和敗血癥，以及神經(jīng)肌肉紊亂，如肌肉營養(yǎng)不良(參見Gonzalez-Kadavid等，Proc.Natl.Acad Med.，USA 9514938-14943，1998，在此列于參考文獻中)。
恰當(dāng)?shù)墓趋兰」δ芤采婕熬S持正常的葡萄糖代謝，骨骼肌對胰島素刺激的葡萄糖吸收的抗性是非胰島素依賴型(II型)糖尿病的早期表現(xiàn)(參見McPherron和Lee，supra，2002)。在肥胖癥和糖尿病的兩個小鼠模型中，肌生長抑制素的損失阻止了脂肪組織重量隨年齡的增加并且減輕了在小鼠模型中的肥胖和糖尿病表型(McPherron和Lee，supra，2002)。這樣，調(diào)節(jié)肌生長抑制素活性的方法也可以用于在個體中降低體內(nèi)的脂肪，以及治療與異常的肌肉功能或者肥胖癥相關(guān)的病癥例如II型糖尿病。
正如在此所公開的，肌生長抑制素前肽既可以以游離的形式存在，也可以作為與肌生長抑制素C-末端二聚體形成的復(fù)合物的一部分，它可以通過金屬蛋白酶的BMP-1/TLD家族成員進行切割，這樣的切割可以釋放出肌生長抑制素C-末端二聚體，解除前肽的抑制效應(yīng)，這樣就產(chǎn)生了具有活性的肌生長抑制素。這樣，BMP-1/TLD蛋白酶為藥物提供了靶標(biāo)，所述藥物可以調(diào)節(jié)肌生長抑制素活性，并因此在生物體內(nèi)增加或者減少肌肉重量或者減緩或預(yù)防肥胖癥。同樣地，本發(fā)明提供了用于鑒定調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽切割的藥劑的方法，提供了鑒定調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素活化的藥劑的方法。
可以進行本發(fā)明的篩選方法，例如，通過將肌生長抑制素前肽、可以切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶和受測藥劑在金屬蛋白酶足以切割前肽的條件下相互接觸；檢測切割的前肽量的變化，以不存在受測藥劑和存在受測藥劑這兩種情況進行對比，由此來鑒定受測藥劑是調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽切割的藥劑。肌生長抑制素前肽可以是已經(jīng)分離的形式，也可以是潛在的肌生長抑制素復(fù)合物的組成部分，該復(fù)合物進一步包括肌生長抑制素C-末端片段或者肌生長抑制素C-末端二聚體。
按照本發(fā)明的篩選分析方法檢查的金屬蛋白酶可以是可切割肌生長抑制素前肽的任何蛋白酶，特別地，可以是在前肽與C-末端肌生長抑制素片段或者其二聚體形成潛在的肌生長抑制素復(fù)合物時能夠切割所述前肽的金屬蛋白酶，這樣就從潛在的肌生長抑制素復(fù)合物中產(chǎn)生了具有活性的肌生長抑制素。這樣的金屬蛋白酶的實例是金屬蛋白酶BMP-1/TLD家族，其中包括四種哺乳動物蛋白，BMP-1(Wbzney etaL，Science 2421528-1534，1988)、哺乳動物Tolloid(mTLD；Takahara etal.，J.Biol.Chem.26932572-32578，1994)；哺乳動物Tolloid樣1(mTLL-1；Takahara et al.，Genomics 34157-165，1996)以及哺乳動物Tolloid樣-2(mTLL-2；Scott et al.，Devel.Biol.213283-300，1999)。BMP-1/TLD家族的金屬蛋白酶又是更大的蛋白家族——蝦紅素家族——的成員，蝦紅素家族包括在各種脊椎動物和無脊椎動物生物體中表達的蛋白酶，包括，例如，爪蟾屬(Xenopus)(Xolloid；UVS.2)、魚類(choriolysin H和L；斑馬魚Tolloid)、海膽(BP-10和SpAN)，以及水螅屬(HMP-1；參見，例如，Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA935127-5130，1996，在此列于參考文獻中)。這樣，可以應(yīng)用任何不同的金屬蛋白酶來實踐本發(fā)明的篩選分析，而且，通過這樣的篩選方法可以鑒定出可能有用的藥劑，例如，用于在各種不同的生物體中調(diào)節(jié)肌生長抑制素的活化的藥劑。
BMP-1和mTLD是由來自單個基因的不同地剪接的mRNA編碼的(Takahara et al.，supra，1994)，而mTLL-1和mTLL-2是通過完全不同的基因編碼的。已知BMP-1/TLD家族的蛋白酶在對至少三類底物的活性的調(diào)控中發(fā)揮作用。首先，BMP-1、mTLD和mTLL-1可以將前膠原的前體加工成為用于裝配多聚纖維所需的成熟單體，所述多聚纖維一般存在于細胞外基質(zhì)(Kessler et al.，Science 271360-362，1996；Li etal.，supra，1996)。其次，BMP-1、mTLD、mTLL-1和mTLL-2中的每一種均可以將前賴氨酰氧化酶加工成為成熟的具有生物活性的酶(Uzel et al.，J.Biol.Chem.27622537-22543，2001)。第三，BMP-1和mTLL-1可以切割脊索蛋白(chordin)(Scott et al.，supra，1999)，其通常結(jié)合于TGF-β超家族的BMP亞組的不同成員并使它們維持在潛在狀態(tài)(Blader et al.，Science 2781937-1940，1997；Marques et al..Cell91417-26，1997；Piccolo et al..Cell 91407-416，1997)。這些金屬蛋白酶對脊索蛋白的切割將BMP從脊索蛋白的抑制效應(yīng)中釋放出來。這樣，據(jù)信BMP-1和TLL-1在各種形態(tài)發(fā)生過程中能夠起到調(diào)節(jié)BMP的效應(yīng)的作用。正如在此所揭示的，BMP-1/TLD家族成員，包括BMP-1、mTLD、mTLL-1和mTLL-2也能夠切割肌生長抑制素前肽，無論它是以游離的形式存在，還是以結(jié)合于肌生長抑制素C-末端二聚體的形式(潛在的肌生長抑制素復(fù)合物)存在，其中所述前肽的切割導(dǎo)致肌生長抑制素C-末端二聚體的活化(參見實施例1和2)。
可以按照本發(fā)明的方法來檢查的受測藥劑可以是任何類型的分子，包括例如，肽、肽衍生物如肽的異羥肟酸鹽(hydroxamate)，或者膦肽(phosphinic peptide)、peptoid(類胨，一種肽衍生物，即“甘氨酸胺基取代的陽離子寡聚合物”)，多聚核苷酸，或者有機小分子(參見實施例3)。因此，術(shù)語“受測藥劑”在此廣泛應(yīng)用來表示針對金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割或者肌生長抑制素的活化檢查其激動劑或者拮抗劑活性的任何化合物。盡管該方法通常用作篩選分析來鑒定能夠用作激動劑或者拮抗劑的以前未知的分子(受測藥劑)，該方法也可以用來確證已知具有特定活性的藥劑事實上具有該活性，例如，標(biāo)定該藥劑的活性；并且可以用來篩查這樣的已知藥劑的衍生物，或者其它的經(jīng)過修飾的形式或者模擬物(mimics)。
本發(fā)明的篩選方法可以很方便地應(yīng)用于高通量的分析，因此，可以用于篩查受測藥劑的組合文庫，其可以是隨機的受測藥劑的文庫，有一定偏向性的受測藥劑的文庫，或者富于變化的受測藥劑的文庫(參見，例如，U.S.Pat.No.5,571,698，其在此列于參考文獻中)，這樣可以鑒定那些可以調(diào)控金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽切割并因此調(diào)控肌生長抑制素活性的藥劑。制備可以被測試其所需活性的分子組合文庫的方法在本領(lǐng)域是已知的，包括，例如，制備肽的噬菌體展示肽文庫的方法，其可以是限定性的肽(參見，例如，U.S.Pat.No.5,622,699；U.S.Pat.No.5,206,347；Scott和Smith，Science 249386-390，1992；Markland et al.，Gene 10913-19，1991；它們每一個在此均列于參考文獻中)；肽庫(美國專利5,264,563，其在此列于參考文獻中)；肽衍生物化合物的文庫，如異羥肟酸鹽化合物文庫、反式異羥肟酸鹽化合物文庫、羧化化合物文庫、硫醇化合物文庫、瞵肽文庫，或者膦酸鹽化合物文庫(參見，例如，Dive et al.，Biochem.Soc.Trans.28455-460，2000；Ye和Marshall，PeptidesThe Wave of the Future(Lebland Houghten，ed.；American Peptide Society，2001)，它們每一個在此均列于參考文獻中)；肽模擬物文庫(Blondelle et al..Trends Anal.Chem.1483-92，1995，在此列于參考文獻中)；核酸文庫(O′Connell et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 935883-5887，1996；Tuerk和Gold，Science249505-510，1990；Gold et al，Ann.Rev.Biochem.64763-797，1995；它們每一個在此均列于參考文獻中)；寡聚糖文庫(York et al.，Corb.Res.28599-128，1996；Liang et al.，Science 2741520-1522，1996；Ding et al.，Adv.Expt.Med.Biol.376261-269，1995；它們每一個在此均列于參考文獻中)；脂蛋白文庫(de Kruif et al.，F(xiàn)EBS Lett.399232-236，1996，其在此列于參考文獻中)；糖蛋白和糖脂文庫(Karaoglu et al.，J.Cell Biol.130567-577，1995，其在此列于參考文獻中)；或者含有例如藥物或者其它藥學(xué)試劑的化學(xué)品文庫(Gordon et al.，J.Med.Chem.371385-1401，1994；Ecker and Crooke，BioTechnology 13351-360，1995；它們每一個在此均列于參考文獻中)。
多聚核苷酸可以作為一種特定的藥劑用于調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割或者肌生長抑制素的活化，這是因為對于細胞內(nèi)的靶標(biāo)——包括細胞內(nèi)多肽——具有結(jié)合特異性的核酸分子是天然存在的，而且因為具有這樣的特異性的合成的分子可以容易地進行制備和鑒定(參見，例如，美國專利5,750,342，其在此列于參考文獻中)。在此廣泛應(yīng)用的術(shù)語“多聚核苷酸”是指兩個或者更多個脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的序列，它們都是通過磷酯鍵連接在一起。因此，術(shù)語“多聚核苷酸”包括RNA和DNA，其可以是基因或者基因的一部分、cDNA、合成的多聚脫氧核糖核酸序列，或者類似物，并且可以是單鏈的或者雙鏈，以及DNA/RNA雜交鏈。多聚核苷酸可以是自然發(fā)生的核酸分子，其可以分離自細胞，或者是合成的分子，它的制備可以，例如，通過化學(xué)合成的方法或者通過酶學(xué)方法如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
多聚核苷酸藥劑(或者受測藥劑)可以含有核苷或者核苷酸類似物，或者骨架上的鍵不是磷酸二酯鍵。一般而言，構(gòu)成多聚核苷酸的核苷酸是自然發(fā)生的脫氧核糖核苷酸，如連接到2′-脫氧核糖上的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或者胸腺嘧啶，或者是核糖核苷酸，如連接到核糖上的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或者尿嘧啶。然而，多聚核苷酸也可以含有核苷酸類似物，包括非自然發(fā)生的合成的核苷酸或者經(jīng)修飾的自然發(fā)生的核苷酸。這樣的核苷酸類似物以及含有這樣的核苷酸類似物的多聚核苷酸是本領(lǐng)域已知的，并且可以通過商業(yè)渠道獲得，(Lin et al.，Nucl.Acids Res.225220-5234，1994；Jellinek et al..Biochemistry 3411363-11372，1995；Pagratis et al..Nature Biotechnol.1568-73，1997，它們每一個在此均列于參考文獻中)。
連接多聚核苷酸中的核苷酸的共價鍵一般是磷酸二酯鍵。然而，共價鍵也可以是任何其它的鍵，包括硫代二酯鍵、硫代磷酸鍵、肽類似鍵或者其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于連接核苷酸來得到合成的多聚核苷酸的任何鍵(參見，例如，Tam et al.，Nucl.Acids Res.22977-986，1994；Ecker and Crooke，Biotechnology 13351360，1995，它們每一個在此均列于參考文獻中)。非自然發(fā)生的核苷酸類似物或者連接核苷酸或類似物的鍵的摻入可能是有用的，特別是當(dāng)該多聚核苷酸暴露于可能含有核酸切割活性的環(huán)境中時，包括，例如，組織培養(yǎng)基或者對于存活個體的施用，這是由于經(jīng)修飾的寡聚核苷酸對于降解具有較小的敏感性。
包括天然發(fā)生的核苷酸和磷酸二酯鍵的多聚核苷酸可以是化學(xué)合成的，也可以應(yīng)用適當(dāng)?shù)亩嗑酆塑账釣槟０謇弥亟MDNA方法產(chǎn)生。相比而言，含有核苷酸類似物或者非磷酸二酯鍵的共價鍵的多聚核苷酸一般是化學(xué)合成的，盡管例如T7聚合酶的酶可以將某些類型的核苷酸類似物整合到多聚核苷酸中，并因此可以用于由適當(dāng)?shù)哪０褰?jīng)重組產(chǎn)生這樣的多聚核苷酸(Jellinek et al，supra，1995)。
類似地，肽，正如在此所舉例說明的(參見實施例3和4)，可以用作藥劑來調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素的活化，或者作為受測藥劑來篩選這樣的活性。肽藥劑(或者受測肽)可以含有一個或者更多個的D-氨基酸和/或L-氨基酸；和/或一個或者多個氨基酸類似物，例如，在其反應(yīng)性側(cè)鏈上經(jīng)過衍生處理或者修飾的氨基酸。此外，可以修飾肽中的一個或者多個肽鍵、在氨基端或者羧基端或者兩端的反應(yīng)性基團。含有D-氨基酸或L-氨基酸類似物或者類似物的肽，可以對該肽可能在生物環(huán)境中遇到的蛋白酶、氧化劑或者其它活性物質(zhì)具有更高的穩(wěn)定性，因此在實施于此公開的調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化的方法時是特別有用的。正如在此所公開的，肽藥劑(或者受測藥劑)的穩(wěn)定性也可以通過形成(或連接)包括該肽和第二多肽(如，抗體的Fc結(jié)構(gòu)域)的融合蛋白來進行改進，這樣可以增加肽藥劑在體內(nèi)的半衰期(參見實施例4，也參見美國專利申請US2003/0104406 A1，其在此列入?yún)⒖贾?。也可以對肽進行修飾使其具有在生物環(huán)境下降低的穩(wěn)定性，如果需要的話，這樣，經(jīng)過一段時間，肽在環(huán)境中的活性將降低。
受測藥劑也可以是抗體，其是針對能夠切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶的一個或者多個表位而制備出來的，可與其特異結(jié)合；或者是針對前肽的表位而制備出來的，該前肽可以是分離的前肽或者是潛在的肌生長抑制素復(fù)合物中的前肽組分，或者是金屬蛋白酶和前肽的復(fù)合物。正如在此所應(yīng)用的，在此廣泛應(yīng)用的術(shù)語“抗體”包括多克隆的或者單克隆的抗體，以及如抗體的抗原結(jié)合片段。術(shù)語“特異性結(jié)合”或者“特異的結(jié)合活性”或者類似的術(shù)語，當(dāng)用于抗體時，是指抗體與特定的抗原表位相互作用，其具有的解離常數(shù)是至少大約1×10-6M，一般至少大約1×10-7M，通常至少大約1×10-8M，特別地，至少大約1×1O-9M或者1×10-10M或者更小。這樣，保持特異結(jié)合活性的Fab、F(ab′)2、Fd和Fv抗體片段包括在抗體的定義中。除了特異結(jié)合于特定的表位，抗體藥劑調(diào)節(jié)金屬蛋白酶對于肌生長抑制素前肽的蛋白酶切割活性，包括增加或者降低這樣的活性。
正如在此所應(yīng)用的術(shù)語“抗體”包括天然發(fā)生的抗體以及非天然發(fā)生的抗體，包括，例如，單鏈抗體、嵌合、雙功能和人源化的抗體，以及其抗原結(jié)合片段。這樣的非天然發(fā)生的抗體可以利用固相肽合成來構(gòu)建，可以通過重組產(chǎn)生，或者，例如，通過篩選由不同的可變區(qū)重鏈和可變區(qū)輕鏈組成的組合文庫來得到(參見，Huse et al..Science 2461275-1281，1989，其在此列入?yún)⒖贾?。這些和其它的制備例如嵌合的、人源化的、CDR-移植的、單鏈的和雙功能的抗體的方法是已知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14243-246，1993；Ward et al..Nature 341544-546，1989；Harlow and Lane，AntibodiesA laboratorymanual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；Hilyard et al.，Protein EngineeringA practical approach(IRL Press 1992)；Borrabeck，Antibody Engineering，2d ed.(Oxford University Press 1995)；它們中的每一個在此列入?yún)⒖嘉墨I中)。
通過應(yīng)用肌生長抑制素前肽的肽部分或者金屬蛋白酶的肽部分特別是BMP-1/TLD家族成員的肽部分來免疫動物，可以方便地得到一系列受測藥劑抗體。當(dāng)前肽或者金屬蛋白酶的這樣的肽部分是非免疫源性時，可以通過偶聯(lián)該半抗原到載體分子如牛血清白蛋白(BSA)或者鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)上來使其具有抗原性，或者以融合蛋白的形式表達該肽部分。用于偶聯(lián)半抗原至載體分子的各種其它的載體分子以及方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，Harlow和Lane，supra，1999)。例如在兔中、山羊中、小鼠中以及其它動物中產(chǎn)生多克隆抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的(參見，如，Green et al.，″Production ofPolyclonal Antisera，″in Immunochemical Protocols(Manson，ed.，HumanaPress 1992)，pages 1-5；Coligan et al.，″Production of Polyclonal Antiserain Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，″in Curr.Protocols Immunol.(1992)，section 2.4.1；每一個在此列于參考文獻中)。此外，可以應(yīng)用本領(lǐng)域所熟知的傳統(tǒng)方法和技術(shù)路線來制備單克隆抗體(參見，例如，Kohler和Milstein，Nature 256495，1975，其在此列于參考文獻中，也參見，Harlow和Lane，supra，1999)。例如，來自用肌生長抑制素受體或者其表位片段免疫的鼠的脾細胞，與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾毎等鏢P/02骨髓瘤細胞融合來得到雜交瘤細胞。克隆的雜交瘤細胞系可以用標(biāo)記的抗原來篩選，以鑒定分泌具有適當(dāng)?shù)奶禺愋缘膯慰寺】贵w的克隆，表達具有所需的特異性和親和性的單克隆抗體的雜交瘤可以被分離出來并用作抗體的持續(xù)來源。表達例如調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割的單鏈抗體的重組噬菌體也提供了可以用于制備標(biāo)準(zhǔn)化藥劑盒的抗體。
通過各種已經(jīng)建立起來的技術(shù)可以從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體，包括，例如，用Protein-A SEPHAROSE凝膠的親和層析、分子大小排阻層析和離子交換層析(Coligan et al.，supra，1992，參見章節(jié)2.7.1-2.7.12以及章節(jié)2.9.1-2.9.3；也參見，Barnes et al.，“Purification of Immuno globulin G(IgG)，”在Meth.Molec.Biol.1079-104(Humana Press 1992)，其在此列于參考文獻中)。在體外和體內(nèi)擴增單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。在體外，放大擴增可以在適合的培養(yǎng)基中，如Dulbecco′s Modified Eagle Medium或者RPMI1640培養(yǎng)基中進行，可選擇性地用哺乳動物血清如胎牛血清或者痕量元素以及生長維持補充物如正常的鼠腹膜滲出物細胞、脾細胞、骨髓巨噬細胞進行補充。在體外的制備可以得到相對純的抗體制備物，并且可以進行放大化以產(chǎn)生大量所需的抗體。大規(guī)模的雜交瘤的培養(yǎng)可以通過在空使反應(yīng)器(airlift reactor)中、在連續(xù)攪拌反應(yīng)器中通過勻質(zhì)懸浮培養(yǎng)來進行，或者以固定化的或者捕獲的細胞培養(yǎng)進行。在體內(nèi)的擴增可以通過注射細胞克隆至與母細胞具有組織相容性的哺乳動物例如同源鼠中來進行，從而導(dǎo)致產(chǎn)生抗體的腫瘤的生長?？蛇x擇的，在進行注射前，動物首先要注入烴類化合物，特別是油，如，姥鮫烷(四甲基十五烷)。在一到三周后，從該動物的體液中回收所需的單克隆抗體。
也提供了按照本發(fā)明的篩選分析鑒定的抗體藥劑的治療應(yīng)用。當(dāng)該治療程序是用于治療人類個體時，抗體可以是源于近似人類的靈長類動物的抗體(參見，如，Goldenberg et al.，國際公布號WO 91/11465，1991；和Losman et al.，Intl.J.Cancer 46310，1990，它們中的每一個在此列于參考文獻中)。對于人類治療有治療用途的抗體也可以是來源于“人源化”的單克隆抗體。人源化的單克隆抗體的產(chǎn)生是通過轉(zhuǎn)移鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)域至人的可變結(jié)構(gòu)域，然后在鼠的對應(yīng)物的框架區(qū)取代人的殘基。源于人源化的單克隆抗體的抗體組分的應(yīng)用避免了潛在的與鼠恒定區(qū)的免疫源性相關(guān)的問題。已經(jīng)知道了用于克隆鼠免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的一般技術(shù)(參見，如，Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 863833，1989，其在此一并列入?yún)⒖嘉墨I中)。也知道產(chǎn)生人源化單克隆抗體的技術(shù)(參見，例如，Jones et al..Nature 321522，1986；Riechmann et al..Nature 332323，1988；Verhoeyen et al.，Science 2391534，1988；Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 894285，1992；Sandhu，Crit.Rev.Biotechnol.12437，1992；andSinger et al.，J.Immunol.1502844，1993；它們中的每一個在此作為參考文獻)?？蛇x擇地，抗體可以是源于分離自組合免疫球蛋白文庫的人抗體片段(參見，如，Barbas et al.，METHODSA Companion to Methods inImmunology 2119，1991；Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.12433，1994；它們中的每一個在此作為參考文獻)。
抗體也可以是源自人單克隆抗體，它例如可以從轉(zhuǎn)基因小鼠中得到，該小鼠已經(jīng)經(jīng)過遺傳學(xué)修飾，能夠在對抗原刺激的應(yīng)答中產(chǎn)生特異的人抗體。在這一技術(shù)中，人重鏈和輕鏈基因座的元件被導(dǎo)入到源于胚胎干細胞系的小鼠細胞株中，所述胚胎干細胞系中含有被靶向的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的斷裂。轉(zhuǎn)基因鼠可以合成對于人抗原特異的人抗體，小鼠可以用來產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠中得到人抗體的方法是熟知的(參見，例如，Green et al.，Nature Genet.713，1994；Lonberg et al.，Nature 368856，1994；and Taylor et al.，Intl.Immunol.6579，1994；它們中的每一個在此作為參考文獻)，并且，可以從商業(yè)渠道得到人抗體(Abgenix，Inc.；Fremont CA)。
抗體的抗原結(jié)合片段可以通過抗體的蛋白水解來制備或者通過在大腸桿菌中表達編碼該片段的DNA來制備?？贵w片段可以通過利用傳統(tǒng)的方法用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶對完整抗體進行消化而得到。例如，抗體片段可以通過用胃蛋白酶切割抗體從而產(chǎn)生5S片段，F(xiàn)(ab′)2來進行制備。該片段可以用硫醇還原試劑進一步切割，并且，可選擇地，可以使用針對由二硫鍵的切割得到的硫氫基的封閉基團，從而產(chǎn)生3.5S Fab′單價片段。可選擇地，應(yīng)用胃蛋白酶的酶切割直接產(chǎn)生兩個單價Fab′片段和一個Fc片段(參見，例如，Goldenberg，U.S.Pat.Nos.4,036,945和4,331,647，它們均在此列于參考文獻中，并且參考文獻在此還包括Nisonhoffetal.，Arch Biochem.Biophys.89230，1960；Porter，Biochem.J.73119，1959；Edelman et al.，Meth.Enzymol.1422(Academic Press 1967)，它們均在此列于參考文獻中，也參見，Coliganet al.，supra，1992，參見章節(jié)2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4)。
切割抗體的其它的方法，如分離重鏈來形成單價重鏈/輕鏈片段，進一步切割片段，或者，也可以應(yīng)用其它的酶學(xué)方法、化學(xué)劑或者遺傳技術(shù)，只要所述片段能夠特異結(jié)合于被完整抗體識別的抗原。例如，F(xiàn)v片段包括VH和VL鏈的聯(lián)合；這一聯(lián)合可以是非共價的(Inbaret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 692659，1972)。作為選擇，可變鏈可以通過分子內(nèi)的二硫鍵來連接或者通過如戊二醛的化學(xué)試劑來交聯(lián)(Sandhu，supra，1992)。優(yōu)選地，F(xiàn)v片段包括通過肽連接子(linker)來連接的VH和VL。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)通過構(gòu)建含有通過寡聚核苷酸連接的編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列的結(jié)構(gòu)基因來制備。該結(jié)構(gòu)基因被插入到表達載體中，隨后將其引入到宿主細胞如大腸桿菌中。重組的宿主細胞合成具有連接肽(linker peptide)的單個多肽鏈，所述連接肽連接兩個V結(jié)構(gòu)域。制備sFvs的方法例如在Whitlowet al.，METHODSA Companion to Methods in Enzymology 297，1991；Bird et al..Science 242423-426，1988；Ladner et al.，U.S.Pat.No.4,946,778；Pack et al.Biotechnology 111271-1277，1993中被描述；它們的每一個在此均列為參考文獻，也參見，如，Sandbu，supra，1992。另一種形式的抗體片段是編碼單個互補決定區(qū)域(CDR)的肽。CDR肽(“最小的識別單位”)可以通過構(gòu)建編碼感興趣的抗體的CDR的基因來得到。制備這樣的基因可以例如通過應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而由產(chǎn)生抗體的細胞的RNA合成可變區(qū)(參見，例如，Lan-ick et al.，METHODSA Companion to Methods in Enzymology 2106，1991，其在此列于參考文獻中)。
由于與受測藥劑接觸而引起的對前肽切割量的差異可以被檢測，例如，通過應(yīng)用如電泳、色譜或者質(zhì)譜的方法來檢測前肽和/或前肽的切割產(chǎn)物(參見，例如，Thies et al.，Growth Factors 18251-259，2001，其在此列于參考文獻)，這些方法可以依據(jù)大小、電荷或兩者來檢測肌生長抑制素前肽或者其切割產(chǎn)物；可以應(yīng)用以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的分析如免疫印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，或者類似的分析，其利用了對于完整前肽或者切割的前肽具有特異性的抗體，但不是既結(jié)合完整的也可以結(jié)合切割的前肽的抗體；或者可以應(yīng)用基于熒光的分析，包括，例如，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET分析)，其中完整前肽的熒光是猝滅的，猝滅可以通過前肽的切割而解除。當(dāng)存在受測藥劑(或者與受測藥劑接觸之后)檢測到的前肽的切割產(chǎn)物的量相比于在不存在該受測藥劑時切割產(chǎn)物的量有所增加時，就確定該受測藥劑可以增加金屬硫蛋白介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化。類似地，當(dāng)存在受測藥劑(或者與受測藥物接觸之后)檢測到的前肽的量相比于在不存在該受測藥劑時前肽的量有所降低時，就確定該受測藥劑可以增加金屬硫蛋白介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化。與之相反，當(dāng)存在受測藥劑(或者與受測藥物接觸之后)檢測到的前肽的切割產(chǎn)物的量相比于在不存在該受測藥劑時切割產(chǎn)物的量有所減少時，就確定該受測藥劑可以降低金屬硫蛋白介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化。當(dāng)存在受測藥劑(或者與受測藥物接觸之后)檢測到的前肽的量相比于在不存在該受測藥劑時前肽的量有所增加時，就確定該受測藥劑可以降低金屬硫蛋白介導(dǎo)的潛在的肌生長抑制素的活化。這樣的活性可以應(yīng)用基于細胞的分析或者動物分析，通過檢測例如由該藥劑導(dǎo)致的肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的變化來證實。
也可以通過檢測結(jié)合肌生長抑制素受體的肌生長抑制素的變化來檢測前肽切割量的變化，或者通過檢測在表達肌生長抑制素受體的細胞中肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化來進行檢測。用于實施本發(fā)明的篩選分析的細胞包括，例如，來自哺乳動物、鳥類、魚類、酵母或者果蠅的細胞。這樣的功能分析可以直接表明，受測藥劑調(diào)節(jié)了金屬硫蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素的活化。用于這樣的方法的細胞可以是表達內(nèi)源性肌生長抑制素受體的細胞，例如，L6肌細胞，或者是經(jīng)過遺傳學(xué)修飾的暫時或者穩(wěn)定表達編碼肌生長抑制素受體的轉(zhuǎn)基因的細胞，所述的肌生長抑制素受體例如活化素受體，如II型活化素受體(Thies et al.，supra，2001)。肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的檢測可以在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的任何水平進行，包括從肌生長抑制素結(jié)合細胞表面受體到由肌生長抑制素調(diào)控的基因的表達，其在本發(fā)明的篩選分析中，是依賴于金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割和肌生長抑制素的活化。
金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素的活化以及隨后的肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過應(yīng)用受體結(jié)合分析來測定結(jié)合于肌生長抑制素受體的肌生長抑制素來進行檢測，這可以是體外的分析或者是以細胞為基礎(chǔ)的分析。金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素的活化以及隨后的肌生長抑制素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也可以通過測定肌生長抑制素調(diào)控的基因的表達來進行檢測，肌生長抑制素調(diào)控的基因可以是報告基因，例如，包含有效連接于編碼可以檢測到的標(biāo)記的多聚核苷酸的TGF-β調(diào)控元件的基因?？梢詸z測該報告基因的表達，例如，通過檢測報告基因序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，或者通過檢測由該報告基因編碼的多肽，或者檢測被編碼的多肽的活性。多肽報告子可以是，例如，β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、腺苷脫氨酶、氨基葡糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸腺嘧啶激酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶，或者黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，它們可以被檢測，例如，通過檢測由報告多肽導(dǎo)致的放射性、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、熒光、酶活性或特異性結(jié)合，或者檢測在選擇性培養(yǎng)基中表達報告多肽的細胞的存活。在此公開或者本領(lǐng)域已知，在由轉(zhuǎn)基因編碼的多肽可以表達的條件下導(dǎo)入例如編碼肌生長抑制素受體的多聚核苷酸或者報告基因的轉(zhuǎn)基因的方法。
一般來說，報告基因包括編碼序列，其編碼報告子多聚核苷酸或者多肽，其可有效連接于一個或者多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，適當(dāng)?shù)脑挘梢赃B接于翻譯調(diào)控元件，它們可以包含于載體中，特定地，可以包含于表達載體中。如果需要，該編碼序列可以進一步編碼有效連接的肽標(biāo)記，如His-6標(biāo)記，其可以應(yīng)用二價陽離子如鎳離子、鈷離子以及類似的離子來檢測；FLAG表位，其可以應(yīng)用抗FLAG抗體來檢測(參見，例如，Hopp et al.，BioTechnology 61204，1988；U.S.Pat.No.5,011,912，它們中的每一個在此列于參考文獻中)；c-myc表位，其可以用對該表位特異的抗體來檢測；生物素，其可以用鏈抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白來檢測；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，其可以應(yīng)用谷胱甘肽來檢測；或者抗體的Fc結(jié)構(gòu)域，其可以應(yīng)用Protein A或者抗-Fc抗體來檢測，它們中的每一個都可以但并不是必須進行可檢測的標(biāo)記或者附著于固相支持物，或者再用二抗來檢測。這樣，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，也可以應(yīng)用檢測特定標(biāo)記的分子的各種方法來分離被標(biāo)記的分子。
正如在此所應(yīng)用的，術(shù)語“有效連接(operatively linked)”是指兩個或者更多個分子針對彼此被定位，以便它們可以以單個的單位起作用，并且實現(xiàn)一個或者兩個分子或者其組合所具有的功能。例如，編碼報告多肽的多聚核苷酸序列可以有效連接于調(diào)控元件，在這種情況下，調(diào)控元件以該調(diào)控元件作用于在細胞中與之正常聯(lián)系的多聚核苷酸的方式作用于該多聚核苷酸。第一多聚核苷酸編碼序列也可以有效連接于第二(或者更多的)編碼序列，這樣，嵌合多肽可以由有效連接的編碼序列表達出來。嵌合多肽可以是融合蛋白，其中兩個(或者更多個)被編碼的多肽翻譯成為單個多肽(參見，如實施例4)，即，它們通過肽鍵共價結(jié)合；或者可以翻譯為兩個分離的肽，其在翻譯出之后，可以相互聯(lián)合從而形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
例如報告基因的多聚核苷酸可以包含于載體中，這可利于多聚核苷酸的操作，包括引入多聚核苷酸到靶細胞中。載體可以是克隆載體，其可以用于保存多聚核苷酸，或者可以是表達載體，其中除了該多聚核苷酸，還含有用于表達多聚核苷酸的調(diào)控元件，當(dāng)多聚核苷酸編碼多肽時，這可用于在特定細胞中表達被編碼的多肽。表達載體可以含有對于實現(xiàn)編碼多聚核苷酸的持續(xù)轉(zhuǎn)錄來說必要的表達元件，或者在克隆進載體之前，調(diào)控元件可以被有效連接于該多聚核苷酸。
表達載體(或者多聚核苷酸)一般含有或者編碼啟動子序列，它們可以提供編碼多聚核苷酸的組成型表達，或者如果需要的話，可以是可誘導(dǎo)的、組織特異的或者發(fā)育階段特異的表達，還可以含有poly-A識別序列，以及核糖體識別位點或者內(nèi)部核糖體進入位點，或者其它的調(diào)控元件，如增強子，其可以是組織特異性的。載體也可以含有在原核或真核宿主系統(tǒng)或者兩者中進行復(fù)制所需的元件，如果需要的話。這樣的載體包括質(zhì)粒載體和病毒載體如噬菌體、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(lentivirus)、腺病毒、痘苗病毒、塞姆利基森林病毒和腺相關(guān)病毒載體，它們在本領(lǐng)域都是已知的，并且可以從商業(yè)渠道獲得(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，Gaithersburg MD)或者它們可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建(參見，例如，Meth.Enzymol.Vol.185，Goeddel，ed.(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Cane.Gene Ther.151-64，1994；Flotte，J.Bioenerg.Biomemb.2537-42，1993；Kirshenbaum et al.，J.din.Invest.92381-387，1993；每一個在此列于參考文獻)。
編碼報告多肽的多聚核苷酸可以有效連接于例如組織特異性的調(diào)控元件，例如，肌肉細胞特異的調(diào)控元件，其中，報告多肽的表達限制于個體的肌肉細胞，或者在培養(yǎng)物如器官培養(yǎng)物中的混合細胞群體中的肌肉細胞。肌肉細胞特異的調(diào)控元件包括，例如，肌肉肌酸激酶啟動子(Stemberg et al.，Mol.Cell.Biol.82896-2909，1988，在此列于參考文獻)和肌球蛋白輕鏈增強子/啟動子(Donoghue et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 885847-5851，1991，在此列于參考文獻)。
病毒表達載體可以對于將多聚核苷酸導(dǎo)入到細胞中，包括，如果需要的話，引入到個體的細胞中，是特別有用的。病毒載體具有優(yōu)勢，即是，它們可以以相對高的效率感染宿主細胞，并且可以感染特定的細胞類型。病毒載體已經(jīng)被開發(fā)用于特定的宿主系統(tǒng)，特別地，用于哺乳動物系統(tǒng)，它們包括，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其它的慢病毒載體，如，那些基于人類免疫缺陷病毒(HIV)的載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體以及類似的載體(參見Miller和Rosman，BioTechniques 7980-990，1992；Anderson et al..Nature 39225-30 Suppl.，1998；Verma and Somia，Nature 389239-242，1997；Wilson，New Engl.J.Med.3341185-1187，1996，其中的每一個均列入?yún)⒖嘉墨I中)。
例如報告基因的多聚核苷酸或者多聚核苷酸藥劑可以包含于載體中，可以用各種不同的方法導(dǎo)入到宿主細胞中(Sambrook et al..Molecular CloningA laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress 1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley and Sons，Baltimore，MD 1987，and supplements through 1995)，其中的每一個均列入?yún)⒖嘉墨I中)。這些方法包括，例如，轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染(lipofection)、微注射、生物彈射方法、電穿孔和使用病毒載體、感染；還可以包括應(yīng)用脂質(zhì)體、微乳液或者類似的方法，其可以幫助多聚核苷酸導(dǎo)入到細胞中，并且可以保護多聚核苷酸以免在其導(dǎo)入到細胞前被降解。特定方法的選擇將依賴于例如，多聚核苷酸待導(dǎo)入的細胞，以及，該細胞是分離自培養(yǎng)物，或者是培養(yǎng)中的組織或器官，或者是在原位。
當(dāng)鑒定某受測藥劑具有肌生長抑制素調(diào)節(jié)活性時，篩選分析可以進一步包括定量該藥劑對肌生長抑制素活化的增加或者降低的步驟。例如，在特定的系統(tǒng)中，當(dāng)藥劑被確定具有增加金屬蛋白酶對于肌生長抑制素前肽的蛋白水解活性而使其高于基底水平時，例如，用純化的試劑在體外分析或者在個體內(nèi)的體內(nèi)分析，該方法可以進一步包括對藥劑增加肌生長抑制素活化使其高于基底水平的作用進行定量的步驟。這樣，可以獲得不同的藥劑或者一系列的藥劑，它們以相對確定的量增加或者降低金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化。這樣的方法進一步提供了一種途徑來確定為達到所需水平的肌生長抑制素活化而需應(yīng)用的特定藥劑的量。正是如此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化的藥劑和一系列藥劑，這樣的藥劑可以用作藥物來調(diào)節(jié)個體內(nèi)的肌生長抑制素活化，所述個體例如具有代謝紊亂如肌營養(yǎng)不良、肌肉萎縮、肥胖癥或者II型糖尿病的個體。
因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化的方法。正如在此所應(yīng)用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”，當(dāng)用于對由金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割或者金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化產(chǎn)生的效應(yīng)時，是指前肽切割的量或者肌生長抑制素的活化中任一個被增加或者降低或者抑制。在此應(yīng)用的術(shù)語“增加”和“降低或者抑制”是指藥劑相對于基底水平的金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割或者肌生長抑制素的活化的影響?；姿降幕钚钥梢允沁@樣一種水平的切割或者活化，即是當(dāng)發(fā)生于體外分析或者個體的體內(nèi)分析時所確定的切割或活化水平，其中所述體外分析是在確定的條件下應(yīng)用純化的前肽和金屬蛋白酶，或者應(yīng)用生物樣品，如，來自個體的細胞或者組織提取物，所述個體可以是但非必須是正常的健康個體。在此一起應(yīng)用術(shù)語“降低”或者“抑制”，這是因為認(rèn)識到，在一些情況下，金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割或者肌生長抑制素的活化可能降低到低于可被特定的分析檢測的水平。這樣的話，應(yīng)用這樣的分析就有可能不能確定，例如，肌生長抑制素前肽的切割是維持在一個低的水平，還是這樣的切割完全被抑制了。
可以實施調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割或者肌生長抑制素活化的方法，例如，通過將包括肌生長抑制素前肽和肌生長抑制素C末端片段，尤其是C末端片段二聚體的潛在的肌生長抑制素復(fù)合物、可以切割肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶，以及增加或者降低由金屬蛋白酶介導(dǎo)的對前肽的蛋白水解切割的藥劑相互接觸。金屬蛋白酶可以是能夠切割肌生長抑制素前肽的任何金屬蛋白酶，特別地，所述前肽包含在潛在的肌生長抑制素復(fù)合物中，所述金屬蛋白酶包括，例如，BMP-1/TLD家族成員，如，BMP-1、mTLD、mTLL-1或者mTLL-2。藥劑可以以任何方式起作用來調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割，包括，例如，通過增加或者降低金屬蛋白酶的蛋白水解活性，通過與前肽競爭金屬蛋白酶，通過促進金屬蛋白酶與含有前肽的潛在的肌生長抑制素復(fù)合物的接觸，或者通過誘導(dǎo)潛在的肌生長抑制素復(fù)合物的構(gòu)象變化使其變得相對更加不適于(或者更加適于)作為金屬蛋白酶的底物。
調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化的方法可以在任何表達肌生長抑制素的個體上應(yīng)用，包括脊椎動物和無脊椎動物。例如，個體可以是人、鼠、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、雞、火雞、斑馬魚、鮭魚、長須鯨，其它的水生生物和其它的物種。水生生物的例子包括那些屬于魚(Piscina)類的生物，如，鱒魚、紅點鮭、香魚、鯉魚、鯽魚、金魚、翻車魚、銀魚、鰻魚、海鰻、沙丁魚、飛魚、海洋鱸魚、海洋鯛、鸚鵡鱸、紅鰭笛鯛、鯖魚、金槍魚、鮪魚、鰹魚、黃尾魚、黑巖魚、比目魚、鰈魚、鲆魚、河豚、豚魚；那些屬于頭足類(Cephalopoda)的生物，如，魷魚、烏賊、章魚；那些屬于斧足(Pelecypoda)類的生物，如，蛤(例如，硬殼類、馬尼拉蛤、圓蛤類、蛤蜊、軟殼類)；海扇、蚌類、濱螺；扇貝(如，海扇貝、港灣扇貝、澳洲淡水巖鱸)；海螺、蝸牛、海參；赤貝；牡蠣(如，美國牡蠣(C.virginica)、海灣、新西蘭、太平洋)；那些屬于腹足(Gastropoda)類的生物，如蠑螺、鮑魚(如，綠色、粉紅、紅色)；和那些屬于甲殼(Crustacea)類的生物，如龍蝦，包括但不限于刺龍蝦、巖龍蝦和美洲龍蝦；對蝦；蝦，包括，但不限于羅氏沼蝦(M.rosenbergii)、P.styllrolls、印度對蝦(P.indicus)、P.jeponious、斑節(jié)對蝦(P.monodon)、P.vannemel、砂蝦(M.ensis)、大管鞭蝦(S.melantho)、挪威蝦(N.norvegious)、冷水蝦；蟹，包括，但不限于藍蟹、rook蟹、隆背哲蟹、鉅蟹、蛛雪蟹、雪蟹、褐蟹、鄧杰內(nèi)斯蟹、北方黃道蟹、鋸緣青蟹、軟殼蟹；蝦蛄、磷蝦、海螯蝦；螯蝦/小龍蝦包括但不限于藍色小龍蝦、栗色小龍蝦、紅爪小龍蝦、赤沼小龍蝦、軟殼小龍蝦、白色小龍蝦；環(huán)節(jié)動物；脊索動物，包括，但不限于爬行動物，如短吻鱷和龜；兩棲動物，包括，蛙；和棘皮動物，包括但不限于海膽。
調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活性的方法可以在體外或者離體進行，其中應(yīng)用培養(yǎng)中的細胞或者組織、細胞或者組織提取物、生物流體如血清或者血漿樣品，或者基本上純化的試劑包括基本上純化的金屬蛋白酶和/或潛在的肌生長抑制素復(fù)合物(參見，例如，Thieset al.，supra，2001)。當(dāng)該方法是在體外進行時，藥劑可以通過將藥劑加入到樣品中來與包括金屬蛋白酶和潛在的肌生長抑制素復(fù)合物的樣品接觸，所述樣品一般是在培養(yǎng)基中或者其它的緩沖溶液中。例如，當(dāng)應(yīng)用培養(yǎng)的細胞來實施該方法時，可以將藥劑加入到培養(yǎng)基中使其與金屬蛋白酶和/或者前肽接觸，它們中的一個或者兩者可以存在于培養(yǎng)物的細胞中或者被分泌到培養(yǎng)基中。可以選擇藥劑，以便其在樣品培養(yǎng)基中是可溶的，或者，如果需要的話，可以制成配方來增加其溶解性。
調(diào)節(jié)肌生長抑制素活化的方法也可以在體內(nèi)進行，包括在活的生物體中進行，包括在個體的原位細胞或者組織進行。一般而言，這樣的方法是通過將藥劑施用于個體來實施，因此，藥劑一般配制成適于施用給個體的組合物。因此，提供了含有可以調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化的藥劑的組合物，這樣的組合物包括在藥學(xué)上可接受的載劑中的藥劑。這樣的組合物可以用作治療患有在此公開的肌肉病癥和/或代謝紊亂的個體的藥物，它們也可以施用給動物，例如用于勞作或者食物來源的農(nóng)場動物。
施用于存活個體的組合物一般包括在藥學(xué)上可接受的載劑中的藥劑。藥學(xué)上可接受的載劑在本領(lǐng)域是已知的，包括，例如，水溶液如水或者生理緩沖鹽水或者其它溶劑或介質(zhì)如乙二醇、甘油、例如橄欖油的油或者可注射的有機酯。藥學(xué)上可接受的載劑可以含有生理學(xué)上可接受的化合物，其作用是例如穩(wěn)定或者增加藥劑的吸收。這樣的生理學(xué)上可接受的化合物包括，例如，糖類，如葡萄糖、蔗糖或者葡聚糖，抗氧化劑，如，維生素C或者谷胱甘肽、螯合劑、低分子量蛋白或者其它穩(wěn)定劑或者賦形劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣選擇包括生理學(xué)上可接受的化合物在內(nèi)的藥學(xué)上可接受的載劑，這依賴于例如，待施用的藥劑的生理化學(xué)特性，以及組合物的施用方式，其可以是，例如口服或者不經(jīng)腸胃如靜脈內(nèi)施用，或者注射、插管或者其它的本領(lǐng)域已知的方法。組合物也可以含有一種或者更多種額外的試劑，包括，例如，營養(yǎng)物質(zhì)或者維生素，或者，當(dāng)組合物的施用是出于治療目的時，可以加入與待治療的病癥相關(guān)的診斷劑或者治療劑。
藥劑可以整入到膠囊材料中，例如整入到水包油乳劑、微乳劑、微膠粒、混和的微膠粒、脂質(zhì)體、微球體或者其它的聚合物基質(zhì)中(參見，例如，Gregoriadis，Liposome Technology Vol.1(CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)L 1984)；Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.677(1981)，每一個在此均列入?yún)⒖嘉墨I中)。脂質(zhì)體，例如，由磷脂或者其它脂類組成，它們是非毒性的、生理上可接受的或者可代謝的載劑，它們的制備和施用相對簡單?！半[形(Stealth)”脂質(zhì)體(參見，例如，美國專利5,882,679；5,395,619和5,225,212，每一個在此均列入?yún)⒖嘉墨I中)是這樣的膠囊材料的例子，對于制備可用于實踐本發(fā)明的方法的組合物來說，它是特別有用的，其它的“掩蓋式(masked)”脂質(zhì)體也可以類似地被應(yīng)用，這樣的脂質(zhì)體延長了治療藥劑在循環(huán)系統(tǒng)滯留的時間。陽離子型脂質(zhì)體，例如，也可以用特定的受體或者配基進行修飾(Morishita et al.，J.Clin.Invest.912580-2585(1993)，其在此也列入?yún)⒖嘉墨I)。
含有調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化的藥物的藥學(xué)組合物的施用途徑部分依賴于分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，當(dāng)口服施用時，多肽和多聚核苷酸并不是特別有用，因為它們會在消化道中被降解。然而，已經(jīng)知道用于化學(xué)修飾多肽的方法，這些方法例如，可以使得它們對內(nèi)源性蛋白酶的降解的敏感性降低或者更加易于被消化道吸收(參見，例如，Blondelle et al.，supra，1995；Ecker and Crook，supra，1995)。此外，肽試劑可以用D-氨基酸來進行制備，或者可以含有一個或者多個基于肽模擬物的結(jié)構(gòu)域，所述的肽模擬物是模擬肽結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的有機分子；或者含有基于類胨例如聯(lián)乙烯式類胨(vinylogous peptoid)的一個或者多個結(jié)構(gòu)域。
在此所公開的組合物可以通過不同的方式施用給個體，包括，例如，口服或者不經(jīng)腸胃，如，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、囊內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、腦池內(nèi)，或者通過皮膚的被動吸收或易化吸收，例如，分別應(yīng)用皮膚貼片或透皮離子電滲。而且，組合物可以通過注射、插管術(shù)施用，可以口服或者局部施用，其中后者可以是被動的，例如，通過直接應(yīng)用軟膏，或者可以是主動的，例如應(yīng)用鼻腔噴霧或者吸入劑，在這種情況下，該組合物中的一種成分是恰當(dāng)?shù)拇龠M劑。
藥物學(xué)組合物可以配制成口服配方，如片劑，或者溶液或者懸液的形式；或者可以與適于腸內(nèi)或者腸胃外應(yīng)用的有機或者無機載劑或者賦形劑構(gòu)成混合物，并且可以與例如常用的非毒性的、藥學(xué)上可接受的載劑化合，形成片劑、丸劑、膠囊、栓劑、溶液、乳劑、懸浮劑或者其它適合應(yīng)用的形式。載劑，除了在以上所公開的，還可以包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯膠、明膠、甘露醇、淀粉糊精、三硅酸鎂、滑石、玉米淀粉、角蛋白、膠體硅、馬鈴薯淀粉、尿素、中等鏈長的甘油三酸酯、葡聚糖，以及其它適于操作制備的載劑，它們可以是固體形式、半固體形式或者液體形式。除了輔助劑，還可以應(yīng)用穩(wěn)定劑、增稠劑，或者染色劑以及香料，例如，穩(wěn)定性干燥劑，如triulose(參見，例如，U.S.Pat.No.5,314,695)。
在實踐本發(fā)明的方法時，待施用的藥劑的總量可以按單劑量施用于個體，可以彈丸注射，或者在相對短的時間內(nèi)輸注，或者可以采用分步驟治療的方案來施用，其中，在一段延長的時間內(nèi)施用多次劑量。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，藥學(xué)組合物的量，例如，用于治療個體的肥胖癥的組合物的用量，依賴于很多的因素，包括個體的年齡和總體上的健康狀況以及施用途徑和施用的治療的次數(shù)?？紤]到這些因素，技術(shù)人員可以調(diào)整特定的劑量，這是必要的。一般來說，組合物的配方以及施用途徑和頻率最初要通過I期和II期臨床實驗來確定。
本發(fā)明的方法可以用來增加肌生長抑制素活化的水平(即，高于在沒有藥劑的條件下肌生長抑制素活化的基底水平)，例如，通過將潛在的肌生長抑制素復(fù)合物和/或金屬蛋白酶與可增加金屬蛋白酶的蛋白水解活性的藥劑接觸；或者，本發(fā)明的方法可以用于降低肌生長抑制素活化的水平(低于基底水平)，例如，通過將潛在的肌生長抑制素復(fù)合物和/或金屬蛋白酶與可降低金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的蛋白水解活性的藥劑接觸。所述藥劑可以是這樣的藥劑，即是，其可以降低切割潛在的肌生長抑制素復(fù)合物中的肌生長抑制素前肽的金屬蛋白酶的蛋白水解活性，從而降低或者抑制肌生長抑制素的活化使其低于在不存在該藥劑的情況下的肌生長抑制素的活化水平。當(dāng)這樣的藥劑被施用于個體時，該藥劑可以導(dǎo)致個體內(nèi)肌肉重量的增加或者脂肪含量的減少或者兩者均有。例如，所述個體可以是患有肌肉萎縮病癥的人類個體，其中增加的肌肉重量可以改善該疾病的體征和癥狀?？蛇x擇地，所述藥劑可以是這樣的藥劑，即是，其可以增加金屬蛋白酶介導(dǎo)的對來自潛在的肌生長抑制素復(fù)合物的肌生長抑制素前肽的蛋白水解切割，從而增加肌生長抑制素的活化水平使其高于在不存在藥劑的情況下的肌生長抑制素的活化水平。當(dāng)這樣的藥劑被施用于個體時，該藥劑可以導(dǎo)致個體內(nèi)肌肉重量的降低或者脂肪含量的增加或者兩者均有。這樣的個體可以是，例如，不良的生物體，如具侵害性的魚類或者嚙齒類動物，其中降低的肌肉重量和/或者增加的脂肪含量使這些具侵害性的物種在環(huán)境中處于競爭的劣勢。
因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)由金屬蛋白酶如金屬蛋白酶BMP-1/TLD家族介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的蛋白水解切割來增加個體中的肌肉重量或者降低脂肪含量或者兩者均有的方法。可以進行這樣的方法，例如，通過對個體施用降低或者抑制可切割肌生長抑制素前肽的蛋白酶的蛋白水解活性，從而阻止?jié)撛诘募∩L抑制素的活化，并增加個體中的肌肉重量。待增加其肌肉重量的個體可以是表達肌生長抑制素的任何個體，特別是脊椎動物，包括，家養(yǎng)的動物(如，貓和犬類)、農(nóng)場動物或者飼養(yǎng)用來作為食物來源的動物，包括哺乳動物(如，羊、豬或者牛)、鳥類(如，雞或者火雞)，以及魚類(如，鮭魚、鱒魚或者鱈魚)。例如，當(dāng)這樣的方法實施于用作食品來源的生物時，食物中的蛋白含量可以增加，膽固醇的含量可以降低，食品的質(zhì)量被改善。因此，本發(fā)明的方法可以實施于表達肌生長抑制素并依賴于金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素前肽的切割來活化肌生長抑制素的任何真核生物，包括脊椎動物生物，例如，哺乳動物、鳥類或者魚類生物，或者無脊椎動物生物，例如，軟體動物、棘皮動物、腹足動物或者頭足動物。在一個實施方式中，個體是人類個體，例如，患有代謝紊亂的個體，所述的代謝紊亂如肌肉病癥(如，張力障礙或者肌營養(yǎng)不良)、萎縮病癥(如，惡病質(zhì))、臨床肥胖癥，或者II型糖尿病。
這樣，本發(fā)明也提供了通過對個體施用調(diào)節(jié)金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素活化的藥劑來改善個體的代謝紊亂的方法。正如在此所應(yīng)用的，當(dāng)用于代謝紊亂時，術(shù)語“改善”是指與該紊亂相關(guān)的病癥或者體征減輕了。紊亂的改善可以通過應(yīng)用熟練的臨床醫(yī)師通常用來臨控特定的代謝紊亂的任何分析來進行鑒定，例如，對于糖尿病的監(jiān)控應(yīng)用葡萄糖耐量分析，對于身體脂肪分析應(yīng)用血清瘦素分析(McPherron and Lee，supra，2002)。例如肥胖癥或者惡病質(zhì)的代謝紊亂的改善可以簡單地通過測定患者的體重來監(jiān)控。
屬于雜合子的肌生長抑制素基因敲除小鼠的骨骼肌的重量有增加，盡管增加的程度小于在純合的突變體小鼠中所觀察的情況，這表明肌生長抑制素在體內(nèi)以劑量依賴的方式起作用。而且，在動物中過量表達肌生長抑制素對于肌肉的生長有相反的效應(yīng)。例如，攜帶有表達肌生長抑制素的腫瘤的裸鼠發(fā)育出萎縮癥狀，其特征是肌肉和脂肪重量顯著地下降，類似于在具有如癌癥或者艾滋病的慢性病的病人中發(fā)生的惡病質(zhì)。此外，就肌肉萎縮而言，血清中肌生長抑制素免疫活性物質(zhì)的水平與病人的狀況相關(guān)(Gonzalez-Kadavid et al.，supra，1998)。因此，帶有艾滋病的病人，通過對總體重下降的測定，也表現(xiàn)出惡病質(zhì)的，其血清中肌生長抑制素免疫活性物質(zhì)的水平與無艾滋病的正常雄性或者體重沒有下降的艾滋病病人相比有輕微的增加。肌生長抑制素不僅僅影響肌肉重量，也影響生物體的整個代謝。例如，肌生長抑制素在脂肪組織中表達，肌生長抑制素缺陷小鼠的脂肪積累隨著該動物年齡的增長具有顯著的下降。在對降低的肌生長抑制素活性的應(yīng)答中產(chǎn)生的對肌肉組織的整個組成代謝效應(yīng)可以改變生物體的整個代謝，并影響脂肪形式的能量儲存，這通過導(dǎo)入肌生長抑制素突變到肥胖小鼠株(agouti致死性黃色(Ay)小鼠)中來證明，所述小鼠抑制其脂肪的積累達5倍。在含有肌生長抑制素突變的agouti小鼠中異常的葡萄糖代謝也部分地受到了抑制。
這樣，本發(fā)明的試劑和方法降低或者抑制了金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素的活化，其可以用于治療或者預(yù)防代謝疾病，如過度肥胖和II型糖尿病。本發(fā)明的方法可以用于，例如，改善不同的代謝紊亂，包括，例如，與慢性病相關(guān)的惡病質(zhì)，所述慢性病例如癌癥(參見Norton et al.，Crit.Rev.Oncol.Hematol.7289-327，1987，其在此列入?yún)⒖嘉墨I)，以及如II型糖尿病、肥胖癥和其它代謝紊亂的狀況。正如在此所應(yīng)用的，術(shù)語“代謝紊亂”是指至少部分地以肌肉和/或脂肪組織的異常量、異常發(fā)育或異常代謝活性為特征的狀況。這樣的代謝紊亂包括，例如，肥胖癥；肌肉萎縮紊亂，如肌營養(yǎng)不良、神經(jīng)肌肉疾病、惡病質(zhì)和食欲缺乏；如II型糖尿病的紊亂，其在一般情況下與肥胖癥相關(guān)，但這不是必然的。術(shù)語“異?！保?dāng)應(yīng)用于肌肉和/或脂肪組織的量、發(fā)育或代謝活性時，是指與臨床醫(yī)師或者其他相關(guān)的技術(shù)人員所認(rèn)為的正常或者理想的肌肉和/或脂肪組織的量、發(fā)育或代謝活性相比較時得出的相對概念。這樣的正常值或者理想值對臨床醫(yī)師來說是了解的，它們是基于在相應(yīng)群體的健康個體中一般所觀察到的或者期望達到的平均值。例如，臨床醫(yī)師知道，對于具有特定高度和體型的人來說，肥胖癥是指體重高于“理想”的體重范圍大約20％。然而，臨床醫(yī)師會認(rèn)識到，在不同的對應(yīng)人群中，不能憑借其體重高于具有同樣身高和體型的人的體重期望值的20％或者更多，來簡單地認(rèn)為健身者必然肥胖。類似地，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，表現(xiàn)出似乎是異常降低的肌肉活性的病人可能會被鑒定為具有異常的肌肉發(fā)育，例如，通過讓病人進行各種力量測試，并將這些結(jié)果與在相應(yīng)的人群中一般的健康個體的期望值進行比較。
可以實施改善個體的代謝紊亂的方法，例如，通過向個體施用降低或抑制可切割肌生長抑制素前肽的蛋白酶的蛋白水解活性的藥劑，從而阻止細胞中潛在的肌生長抑制素的活化并改善所述的代謝紊亂。正如以上所說明的，代謝紊亂可以是與增加的或者不良的高的肌生長抑制素活化或者活性相關(guān)的任何紊亂，包括，例如，肌肉萎縮紊亂，如與肌營養(yǎng)不良、惡病質(zhì)相關(guān)的病癥(如，與癌癥或者免疫缺陷疾病相關(guān)的病癥)，或者肌肉減少；或者如臨床性肥胖或者II型糖尿病的代謝紊亂。作為例子，肌肉減少是一種代謝紊亂，其特征是骨骼肌重量、質(zhì)量和力量下降，并會在年齡大時導(dǎo)致脆弱。對整體質(zhì)量具有貢獻的骨骼肌性質(zhì)的例子包括收縮性、纖維大小和類型，以及葡萄糖的吸收和代謝。肌肉減少具有非常嚴(yán)重的后果，因為瘦質(zhì)體重的損失使其功能降低，還因為失去大約40％的瘦質(zhì)體重在通常情況下是致命的(參見，例如，Roubenoff and Castaneda，J.Amer.Med.Assn.286，2001)。本發(fā)明的方法提供了通過降低或者抑制金屬蛋白酶介導(dǎo)的肌生長抑制素的活化來改善肌肉減少并因此使得個體的肌肉生長和發(fā)育增加的手段。
以下的實施例是用于說明而不是限制本發(fā)明。
實施例1BMP-1/TLD金屬蛋白酶家族切割肌生長抑制素前肽 本實施例說明了金屬蛋白酶的骨形態(tài)發(fā)生蛋白1/Tolloid(BMP-1/TLD)家族的成員切割肌生長抑制素前肽。
將500ng的純化的肌生長抑制素前肽或純化的含有前肽和C-末端二聚體的潛在的肌生長抑制素復(fù)合物(Lee和McPherron，supra，2001)與100ng的純化的BMP-1、mTLD、mTLL-1或mTLL-2(Scott etal.，Devel.Biol.213283-300，1999，其在此列于參考文獻中)在37℃溫育過夜。反應(yīng)產(chǎn)物用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，接著用抗肌生長抑制素前肽的抗血清進行western印跡分析(Lee和McPherron，supra，2001)。
在含有所述四種蛋白酶中的一種的每一個反應(yīng)中，檢測到分離的前肽蛋白水解切割產(chǎn)物，但是在不含有蛋白酶的對照反應(yīng)中沒有檢測到。而且，不管前肽是純化的形式或者是與肌生長抑制素C-末端二聚體形成復(fù)合物的形式，每一種蛋白酶都切割前肽。這些結(jié)果說明BMP-1/TLD金屬蛋白酶切割肌生長抑制素前肽。
實施例2金屬蛋白酶對肌生長抑制素前肽的切割活化了潛在的肌生長抑制素 該實施例說明了由BMP-1/TLD金屬蛋白酶對肌生長抑制素前肽的切割活化了潛在的肌生長抑制素。
將純化的肌生長抑制素前肽和C-末端二聚體復(fù)合物與mTLL-1一起溫育，然后用特異地檢測肌生長抑制素活性的報告基因分析來檢查。用pGL3-(CAGA)12熒光素酶報告基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染A204橫紋肌肉瘤細胞，所述構(gòu)建物包括熒光素酶編碼序列，其連接于來自可TGF-β誘導(dǎo)的PAI-1基因的啟動子的TGF-β應(yīng)答性CAGA序列(Thies et al.，supra，2001)。將轉(zhuǎn)染的細胞與未處理的前肽/C-末端二聚體復(fù)合物或與已經(jīng)用mTLL-1進行過預(yù)溫育的復(fù)合物進行接觸。在報告子細胞分析中檢測到，復(fù)合物與mTLL-1進行的溫育顯著地增加了熒光素酶活性的量，而在只用mTLL-1處理的細胞中或者只用肌生長抑制素復(fù)合物處理的細胞中沒有觀察到變化(圖1)。
為了確定肌生長抑制素被mTLL-1活化的程度，用純化的肌生長抑制素C-末端二聚體在報告基因分析中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，然后將用mTLL-1處理的復(fù)合物處理的細胞中的熒光素酶活性的定量與該標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較。mTLL-1處理的樣品中出現(xiàn)的肌生長抑制素活性的量與在該樣品中mTLL-1對前肽的蛋白水解加工的程度的比較，表明被蛋白水解切割的肌生長抑制素復(fù)合物中有至少大約50％在報告子分析中表現(xiàn)出活性。這些結(jié)果說明了，BMP-1/TLD金屬蛋白酶，mTLL-1，對在前肽與肌生長抑制素C-末端二聚體形成的復(fù)合物中的肌生長抑制素前肽的切割活化了肌生長抑制素。
實施例3Tolloid家族成員的肽底物 依據(jù)肌生長抑制素前肽的序列合成一系列肽，它們分別為10、20、30、40或者50個氨基酸殘基，其中每個系列包括三個肽，它們都含有對應(yīng)于BMP-1/TLD金屬蛋白酶的切割位點的位點(在野生型肽SEQ ID NOS9、12、15、18和21中，氨基酸殘基“RD”以粗體顯示，如下)。其中緊位于切割位點的上游的P1位置的精氨酸殘基變成了谷氨酰胺殘基的肽被合成(SEQ ID NOS10、13、16、19和22；參見粗體)，其中緊位于切割位點的下游的P1’位置的天冬氨酸變成了丙氨酸的肽被合成(SEQ ID NOS11、14、17、20和23；參見粗體)。肽的序列列在下面 50聚體(50-mer) KDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPT(SEQ ID NO9)
KDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQQDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPT(SEQ ID NO10) KDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPT(SEQ ID NO11) 40-mer QLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETI(SEQ ID NO12) QLLPKAPPLRELIDQYDVQQDDSSDGSLEDDDYHATTETI(SEQ ID NO13) QLLPKAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETI(SEQ ID NO14) 30-mer APPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHA(SEQ ID NO15) APPLRELIDQYDVQQDDSSDGSLEDDDYHA(SEQ ID NO16) APPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHA(SEQ ID NO17) 20-mer ELIDQYDVQRDDSSDGSLED(SEQ ID NO18) ELIDQYDVQQDDSSDGSLED(SEQ ID NO19) ELIDQYDVQRADSSDGSLED(SEQ ID NO20) 10-mer YDVQRDDSSD(SEQ ID NO21) YDVQQDDSSD(SEQ ID NO22) YDVQRADSSD(SEQ ID NO23) 肽以凍干的粉末形式提供，1.0mM的貯存液用60％乙腈-0.1％三氟乙酸(TFA)和40％的水制備。酶對肽底物的活性被評估，通過將70μl的水、20μl的模擬條件培養(yǎng)基(mock conditioned medium)或含有感興趣的蛋白的條件培養(yǎng)基和10μl合成的肽組合起來。在室溫條件或者37℃溫育樣品過夜，然后通過加入1.0μl的0.1％TFA降低pH來中止反應(yīng)。將各小等份加到2cm的C18保護柱的上樣筒(Supelco)，用在0.1％的TFA中的乙腈梯度(0％到40％，超過20分鐘)進行洗脫。用質(zhì)譜鑒定并確證對應(yīng)于切割的肽片段的峰。40mer、30-mer和20-mer的野生型肽和R->Q突變體肽被含有TLL-2的條件培養(yǎng)基切割，而在P1’位置含有D->A突變的肽沒有被切割；在所應(yīng)用的條件下，50-mer是不可溶的，而10-mer的切割產(chǎn)物很難檢測到，因為它們太小(即，5-mers)。
實施例4BMP-1/TOLLOID家族的金屬蛋白酶活化潛在的肌生長抑制素 該實施例說明了BMP-1/TLL家族成員可以切割并激活潛在的肌生長抑制素。
肌生長抑制素的純化和分析。以前5，6(數(shù)字是指列于實施例4后的參考文獻的編號)已經(jīng)描述過如何獲得過量表達肌生長抑制素的CHO細胞系。應(yīng)用類似的策略來獲得表達全長人肌生長抑制素和前肽/Fc融合蛋白的突變體形式的CHO細胞系(參見美國
發(fā)明者S-J·李, A·C·麥克弗洛, D·S·格林斯潘, W·N·帕帕諾, N·沃爾夫曼, K·湯姆金森 申請人:約翰霍普金斯大學(xué), 威斯康星校友研究基金會, 惠氏公司