專利名稱：一種弧菌及用它生產(chǎn)古羅糖醛酸裂合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種弧菌以及用它生產(chǎn)α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶的方法。
背景技術(shù)：
褐藻膠是褐藻細(xì)胞壁的主要成分，是由甘露糖醛酸與古羅糖醛酸組成的線性分子。褐藻膠的許多生物學(xué)功能與其分子中含有古羅糖醛酸有關(guān)。古羅糖醛酸寡糖具有結(jié)構(gòu)明確，性能穩(wěn)定，容易吸收等特點，以褐藻膠為原料，采用酸法、氧化法和酶法等均能得到古羅糖醛酸寡糖，但不同方法得到的寡糖結(jié)構(gòu)不同。酶法制備寡糖具有條件溫和、容易控制的特點，是研究開發(fā)的重點?；【捎糜谥苽浜衷迥z裂合酶，如在CN1445365A中公開了一種用弧菌(Vibro SP QY101)制備褐藻膠裂合酶的方法，在CN1333336A中公開了一種用河弧菌(Vibro fluvialis)制備褐藻膠裂合酶的方法，但由這兩種弧菌產(chǎn)生的褐藻膠裂合酶缺乏單一性，這是由于這些弧菌能同時降解褐藻膠中古羅糖醛酸和甘露糖醛酸，不能單一地降解褐藻膠中古羅糖醛酸所致。
本發(fā)明的目的是提供一種弧菌Vibro sp.WYB，該弧菌能單一產(chǎn)生古羅糖醛酸裂合酶，并專一降解褐藻膠中α-1，4-L-古羅糖醛酸，能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。

發(fā)明內(nèi)容
一種弧菌，其特征是該弧菌為Vibro sp.WYB；保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為M203075。
弧菌Vibro SP WYB用于生產(chǎn)α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶。
一種用弧菌Vibro sp.WYB生產(chǎn)古羅糖醛酸裂合酶的方法，包括將弧菌接種于含有褐藻膠的液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)，離心去除菌體，上清液用硫酸銨沉淀得到粗古羅糖醛酸裂合酶，該粗酶液進(jìn)一步用離子交換色譜分離。
本發(fā)明的弧菌Vibro sp.WYB性能穩(wěn)定，用它生產(chǎn)的古羅糖醛酸裂合酶種類單一，專一性強，活力高，因為它專一水解褐藻膠中的α-1，4-L-古羅糖醛酸糖苷鍵，并在非還原端產(chǎn)生一個不飽和雙鍵。該弧菌可以連續(xù)發(fā)酵，粗古羅糖醛酸裂合酶液只需經(jīng)過一次色譜分離純化就可以得到純的古羅糖醛酸裂合酶，且該酶的活力不受影響。


及
具體實施例方式
附圖1為本發(fā)明的弧菌株形態(tài)圖。
附圖2為本發(fā)明的弧菌16s rRNA基因序列分析圖。
從圖1可知，本發(fā)明的弧菌Vibro sp.WYB端生單鞭毛，鞭毛的長度與菌體長幾乎相等。根據(jù)16srRNA基因序列分析及其生化指標(biāo)分析，確認(rèn)該菌為弧菌屬的新種。該弧菌的種子培養(yǎng)基組成是褐藻膠0.2％(重量百分?jǐn)?shù)，下同)-0.5％；氯化鈉1-3％；酵母提取物0.1-0.3％；蛋白胨0.5-1％，pH7-7.5，發(fā)酵溫度25-30℃，得到Vibro sp.WYB弧菌，其保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號為M203075。制備古羅糖醛酸裂合酶時，將弧菌于液體培養(yǎng)基(含有褐藻膠0.5-1.0％，2-3％NaCl，0.5-1.0％酵母提取物)中培養(yǎng)，在25℃，150rpm下發(fā)酵培養(yǎng)12-48小時，將發(fā)酵液高速離心收集上清液，向上清液中加入硫酸銨，使其飽和度50-55％，離心去除沉淀，收集上清液，繼續(xù)向清液添加硫酸銨，使飽和度達(dá)到65-85％，離心收集沉淀，透析后得到古羅糖醛酸裂合酶粗酶液。將所得的粗酶液用DEAE-A25(XK26/20)柱分離，用含有磷酸鈉(10mmol/L，pH7)的氯化鈉溶液(0-1mol/L)梯度洗脫，收集活性組分，經(jīng)透洗后采用壓濾濃縮，冷凍干燥得到純酶，該酶最佳溫度35℃，最佳pH7.0，分子量41.3KD。本實施例中的DEAE-A25可以改用DEAE-Sephacel或Q-Sepharose F.F。
分別將褐藻膠、古羅糖醛酸和甘露糖醛酸用10mmol/L磷酸鹽(PH7)配成0.02％水溶液，在35℃恒溫比色池中加入20μL古羅糖醛酸裂合酶(68u/mg)，在UV-2 102PCS紫外分析儀上運用酶動力學(xué)專用分析軟件動態(tài)測定紫外(235nm)吸收值，隨著時間延長，古羅糖醛酸溶液和褐藻膠溶液中吸收值顯著增高，而甘露糖醛酸溶液吸收值基本不變，表明該酶具有專一降解古羅糖醛酸功能。
權(quán)利要求
1 一種弧菌，其特征是該弧菌為Vibro sp.WYB，保藏單位是CCTCC，保藏號為M203075。
2 弧菌Vibro sp.WYB用于生產(chǎn)α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶。
3一種用弧菌Vibro sp.WYB生產(chǎn)古羅糖醛酸裂合酶的方法，包括將弧菌接種于含有褐藻膠的液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)，離心去除菌體，上清液用硫酸銨沉淀得到粗古羅糖醛酸裂合酶，該粗酶液進(jìn)一步用離子交換色譜分離。
4 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的恒溫溫度為20-30℃，搖瓶速度為100-300rpm，培養(yǎng)時間為12-48小時，所述的硫酸銨的飽和度為65-85％，所述的色譜分離用的填料為DEAE-A25、DEAE-Sephacel或者Q-Sepharose F.F。
5 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的液體培養(yǎng)基含有0.5-1.0％褐藻膠，2-3％NaCI，以及0.5-1.0％酵母提取物。
全文摘要
一種弧菌，其特征是該弧菌為弧菌Vibrosp.WYB，保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為M203075。用該菌制備α－1，4－L－古羅糖醛酸裂合酶時，將該菌接種于含有褐藻膠的液體培養(yǎng)基中，20－30℃恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)，離心去除菌體，上清液用飽和度為65－85％硫酸銨沉淀，沉淀物經(jīng)過離子交換色譜分離得到純古羅糖醛酸裂合酶，該酶在20－45℃穩(wěn)定，最佳作用溫度為35℃，最適pH7。本發(fā)明的菌種性能穩(wěn)定，發(fā)酵時間短，古羅糖醛酸裂合酶得率高，該酶容易分離且穩(wěn)定性好。所述的酶為α－1，4－L－古羅糖醛酸裂合酶，該酶專一性強，活力高，可以作為褐藻膠糖鏈分析的工具酶。
文檔編號C12N1/20GK1544615SQ20031010572
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者于廣利, 王遠(yuǎn)紅, 趙峽, 呂志華 申請人:中國海洋大學(xué)