專利名稱：一種用古羅糖醛酸裂合酶制備古羅糖醛酸寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶制備古羅糖醛酸寡糖的方法。
背景技術(shù)：
褐藻膠是褐藻細(xì)胞壁主要組成成分，是由甘露糖醛酸與古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物，因此，古羅糖醛酸是褐藻膠的主要組成單位之一，以褐藻膠為原料采用稀酸降解，并進(jìn)行分級可以得到多聚古羅糖醛酸。作為一種性能優(yōu)良帶負(fù)電荷的線型分子，古羅糖醛酸寡糖在抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和降血脂、治療心腦血管疾病和老年癡呆等方面都顯示出良好的應(yīng)用前景。目前，古羅糖醛酸寡糖制備大多采用酸法、氧化法和酶法。各種方法得到的寡糖結(jié)構(gòu)不同，酸法和氧化法得率較低且需要高溫或者加壓，酶法條件溫和，無污染，是研究開發(fā)的重點(diǎn)。在中國專利(CN1333336A以及CN1445365A)中披露了兩種弧菌，其發(fā)酵液中含有褐藻膠裂合酶，后者能降解褐藻膠，但得到的是非均聚甘露糖醛酸寡糖與非均聚古羅糖醛酸寡糖的混合物，并非單一古羅糖醛酸寡糖，這種方法的缺陷與所用酶的專一性不高有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶制備古羅糖醛酸寡糖的方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種用古羅糖醛酸裂合酶制備古羅糖醛酸寡糖的方法，其特征是將α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶加到含有多聚古羅糖醛酸或者褐藻膠的水溶液中，在25-40℃和pH6-8的磷酸鹽緩沖液中恒溫酶解12-24小時，再將溫度升高到60-80℃，旋轉(zhuǎn)濃縮，濃縮液用BioGel-P2或者Sephadex-G10柱脫鹽，冷凍干燥得到寡糖混合物，或再將該寡糖混合物進(jìn)行柱色譜分離得到古羅糖醛酸寡糖單體。
本發(fā)明中使用一種新型古羅糖醛酸裂合酶，該酶專一強(qiáng)，選擇性高，穩(wěn)定性好，可特異降解褐藻膠中多聚古羅糖醛酸，形成不飽和古羅糖醛酸寡糖片斷，得到的寡糖可作為功能食品添加劑和植物促生長劑等。


及
具體實(shí)施例方式
附圖1為用本發(fā)明方法得到的不飽和古羅糖醛酸寡糖的紫外掃描圖譜。
附圖2為用本發(fā)明的方法制備的不飽和古羅糖醛酸五糖的ESI/MS圖譜。
實(shí)施例1將多聚古羅糖醛酸用pH6-8的磷酸鹽緩沖液配成0.5-1.0％濃度(重量百分濃度，下同)的水溶液，加入古羅糖醛酸裂合酶0.1-0.3ml，在25-40℃和pH6-8下的磷酸鹽緩沖液中恒溫酶解12-24小時，然后將溫度升高到80℃使酶失活，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用BioGel-P2柱脫鹽，收集合并含糖組分并冷凍干燥即得古羅糖醛酸寡糖混合物。
實(shí)施例2將褐藻膠用水配成1-2％濃度的水溶液，加入古羅糖醛酸裂合酶0.1-0.3ml，在10mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6-8)，35℃下恒溫酶解12-24小時，將溫度升高到80℃，濃縮后加入無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到45-55％，離心去除沉淀，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液用Sephadex-G10柱脫鹽，含糖組分旋轉(zhuǎn)濃縮后冷凍干燥即得古羅糖醛酸寡糖混合物，其最大吸收波長為235nm。
將所得到的上述兩種古羅糖醛酸寡糖混合物分別用水溶解，加到BioGel-P6(XK26/95，45μm)層析柱或者Superdex30TM(XK35/90，30um)層析柱中，在AKTA-FPLC儀器上，用0.1-0.3mol/L NaCl或者碳酸氫銨水溶液沈脫，235nm紫外分析儀上在線檢測，根據(jù)峰型收集合并各寡糖組分，BioGel-P2或者Sephadex-G10柱脫鹽，在40℃下旋轉(zhuǎn)濃縮，凍干，得到聚合度為2-16的多種古羅糖醛酸寡糖純品單體，即分別為不飽和古羅糖醛酸二糖至十六糖。
用本發(fā)明的方法制得的古羅糖醛酸寡糖的聚合度為2-16，分子式為C12+6nH16+8nO12+6n，其中，n＝0-14。分子量分別為352，528，704，880，1056，1232，1408，1584，1760，1936，2112，2288，2464，2640，2816。
本發(fā)明以多聚古羅糖醛酸或者褐藻膠為原料，利用α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶制備古羅糖醛酸寡糖單體或其混合物。所述的古羅糖醛酸裂合酶是由弧菌發(fā)酵產(chǎn)生的，其保藏單位CCTCC，保藏號為M203075。所述的柱色譜分離采用BioGel-P6或者Superdex30TM填料，用0.1-0.3mol/L氯化鈉溶液或者碳酸氫銨溶液洗脫，用紫外或者示差檢測器檢測。酶解時間越長寡糖聚合度越低，因此，通過控制酶解時間得到不同聚合度寡糖。該系列寡糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為非還原端C4，5之間含有一個不飽和雙鍵，糖環(huán)之間均為α-1，4-糖苷鍵連接。通過色譜分離可以得到非還原端含有不飽和雙鍵的古羅糖醛酸單體化合物。從附圖可知，寡糖的最大吸收波長為235nm，經(jīng)過色譜分離后得到的不飽和古羅糖醛酸五糖的分子量為880。這些單體化合物或者它們的混合物(聚合度2-16)在食品，醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種用古羅糖醛酸裂合酶制備古羅糖醛酸寡糖的方法，其特征是將α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶加到含有多聚古羅糖醛酸或者褐藻膠的水溶液中，在25-40℃和pH6-8的磷酸鹽緩沖液中恒溫酶解12-24小時，再將溫度升高到60-80℃，旋轉(zhuǎn)濃縮，濃縮液用BioGel-P2或者Sephadex-G10柱脫鹽，冷凍干燥得到寡糖混合物，或再將該寡糖混合物進(jìn)行柱色譜分離得到古羅糖醛酸寡糖單體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的α-1，4-L-古羅糖醛酸裂合酶是由弧菌發(fā)酵產(chǎn)生的，所述的弧菌為Vibro sp.WYB，保藏單位CCTCC，保藏號M203075。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的柱色譜分離采用Superdex30TM或者BioGel-P6填料，并用0.1-0.3mol/L氯化鈉或者碳酸氫銨水溶液洗脫，用紫外或者示差檢測器檢測。
全文摘要
一種用古羅糖醛酸裂合酶制備古羅糖醛酸寡糖的方法，其特征是將弧菌Vibro sp.WYB發(fā)酵得到的α－1，4－L－古羅糖醛酸裂合酶加到含有多聚古羅糖醛酸或者褐藻膠的水溶液中，在25－40℃和pH6－8的磷酸鹽緩沖液中恒溫酶解12－24小時，再將溫度升高到60－80℃，旋轉(zhuǎn)濃縮，濃縮液用BioGel－P2或者Sephadex－G10柱脫鹽，合并含糖組分，冷凍干燥得到寡糖混合物，該寡糖混合物采用Superdex30
文檔編號C12P19/00GK1544644SQ20031010572
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者于廣利, 王遠(yuǎn)紅, 趙峽, 呂志華 申請人:中國海洋大學(xué)