專利名稱：提高水稻氮吸收效率和產(chǎn)量的基因OsPTR9及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。植物體擁有一系列的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)基因以實(shí)現(xiàn)從土壤中吸收氮素營(yíng)養(yǎng)和在植物體內(nèi)對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的重新分配，以滿足植株在生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖過程中對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的需要。本發(fā)明具體涉及一種提高對(duì)氮肥的利用效率和提高水稻產(chǎn)量的基因0sPTR9，該基因超量表達(dá)后，使正常的水稻吸收氮肥的效率提高，分蘗能力增強(qiáng)，穗長(zhǎng)增加，千粒重增加，產(chǎn)量提高。該基因在闡述氮素影響植物生長(zhǎng)及發(fā)育過程方面；在水稻高效利用氮肥與提高產(chǎn)量方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
水稻作為重要的糧食作物，世界上三分之一以上的人以其為主食。為解決人口增長(zhǎng)與耕地面積減少的矛盾，提高水稻單位面積產(chǎn)量仍是人們面臨的挑戰(zhàn)。如何進(jìn)一步提高水稻產(chǎn)量來(lái)滿足人類不斷增長(zhǎng)的需求已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一項(xiàng)主要任務(wù)。我國(guó)普遍存在著由于氮肥利用率低和大量的氮素?fù)p失導(dǎo)致的一系列環(huán)境問題。目前，中國(guó)氮肥用量占全球氮肥用量30 % [彭少兵，黃見良，鐘旭華，楊建昌，王光火，鄒應(yīng)斌，張福鎖，朱慶森，Roland Buresh, Christian Witt.提高中國(guó)稻田氮肥利用率的研究策略.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).2002,35(9) :1095-1103]，成為世界第一大消費(fèi)國(guó)。而且雖然氮肥用量增加，但糧食并沒有同步增產(chǎn)。從1984年到1993年，我國(guó)化肥用量增加了 81 %，而糧食總產(chǎn)只增加了 14.6%。其中水稻田中氮肥的施用量超過其它任何農(nóng)作物，氮肥的損失量也占施肥總量的 70%。氮肥的損失不僅嚴(yán)重浪費(fèi)了有限的養(yǎng)分資源，由于其向水體和大氣的排放，也帶來(lái)了令人擔(dān)憂的環(huán)境問題。因此，探討有限氮素供應(yīng)條件下作物高產(chǎn)高效的新途徑，不僅是實(shí)現(xiàn)我國(guó)兩高一優(yōu)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)目標(biāo)所必需的，而且也是保護(hù)環(huán)境、造福子孫后代的重要問題。氮是作物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組分，氮是限制植物生長(zhǎng)和形成產(chǎn)量的首要因素。在上壤中，氮素可以以氨(NH3和NH4-)、硝酸鹽、氨基酸、可溶性肽、非溶性含氮復(fù)合物等多種不同的形式被植物吸收利用。植物種類不同，它們所喜好的氮源也不一樣，水稻是一種喜氨的植物。硝酸鹽被植物吸收后，首先也被還原成氨，然后以氨的形式整合到谷氨酰胺和谷氨酸鹽。銨鹽的同化作用通常發(fā)生在植物體的根部，而硝酸鹽的同化作用既可在根部也可在葉片進(jìn)行，取決于植物的種類和環(huán)境條件。部分在根部吸收的硝酸鹽通過木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)饺~片進(jìn)行同化，而在葉片中同化的氮主要通過韌皮部以氨基酸的形式運(yùn)輸?shù)狡渌璧鞴龠M(jìn)行再分配。氮素的這種再分配對(duì)于那些不參與氮素同化的供應(yīng)組織是至關(guān)重要的。當(dāng)?shù)赝饔冒l(fā)生在根部時(shí)，氨基酸會(huì)隨著木質(zhì)部中的蒸騰流而被運(yùn)輸?shù)匠墒烊~片，而大部分運(yùn)輸?shù)匠墒烊~片的氨基酸又重新從木質(zhì)部進(jìn)入韌皮部參與氮素的再分配，這個(gè)過程可稱之為氨基酸的循環(huán)。當(dāng)?shù)氐耐饔冒l(fā)生在葉片時(shí)，氨基酸的循環(huán)過程對(duì)于滿足根部氮素營(yíng)養(yǎng)的需求是非常重要的(Marschner H et al. Importance of cycling and recycling of mineral nutrients within plants for growth and development. Acta botanica gallica，1997，110 :265-273)。在根部，過量的氨基酸可以從韌皮部重新回到木質(zhì)部，參與再循環(huán)的過程[Larsson CM et al. Translocation and cycling through rootsof recently absorbed nitrogen and sulphur in wheat (Triticum aestivum)during vegetative and generative growth. Physiologia Plantarum，1991，82 (3) :345-352]。在某些細(xì)胞中，氮素也可以通過其他的形式，如小分子肽[Steiner HY et al. AnArabidopsis peptide transporter is a member of a new class of membrane-transport proteins. The Plant Cell，1994，6 (9) : 1289-1299]、嘌呤、嘧啶及其衍生物[Gillissen B et al. A new family of high-affinity transporters for adenine， cytosine, and purine derivatives in Arabidopsis. The Plant Cell，2000，12 (2) :291-300]等，穿過細(xì)胞的質(zhì)膜完成氮素在細(xì)胞間的運(yùn)輸。氮的吸收和分配是由一整套完整而復(fù)雜的運(yùn)輸?shù)鞍讈?lái)完成的，這些運(yùn)輸?shù)鞍拙哂胁煌奶禺愋浴⒂H和力以及運(yùn)輸能力，在不同的環(huán)境條件下，受到差異性的調(diào)控，從而使植物能正常地生長(zhǎng)和發(fā)育。氮的運(yùn)輸?shù)鞍字饕譃橄跛岣\(yùn)輸?shù)鞍?、銨根運(yùn)輸?shù)鞍住?氨基酸運(yùn)輸?shù)鞍?、肽運(yùn)輸?shù)鞍滓约班堰始班堰恃苌镞\(yùn)輸?shù)鞍讕状蠹易?Williams L et al.Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，2001， 52 :659-688)。一般而言，植物肽的運(yùn)輸?shù)鞍卓梢詺w類到三個(gè)不同的基因家族ABC運(yùn)輸?shù)鞍准易?ATP-binding cassette transporter family，ABCfamily)、寡妝運(yùn)輸?shù)鞍准易?(oligopeptide transporter family, OPT family)及小分子肽運(yùn)輸?shù)鞍准易?peptide transporter family, PTR family)[Stacey G et al. Peptide transport in plants. Trends in Plant. Science，2002，7 (6) :257-263] 0 擬南芥基因組序列分析預(yù)測(cè)有 53 個(gè) PTRs家族成員(Arabidopsis Genome Initiative，2000)，聚類分析表明這些基因分成明顯的4個(gè)亞方矣(Stacey G et al. Peptide transport in plants. Trends in Plant Science， 2002,7(6) :257-263) o其中被確定為運(yùn)輸小分子肽只有幾個(gè)，其余大部分是運(yùn)輸硝酸根離子[Tsay YF et al. Nitrate transporters and peptide transporters. FEBS letters， 2007,581(12) :2290-2300]。第一個(gè)從擬南芥中鑒定的PTR家族成員CHLl (NRT1 1)是一個(gè)雙親和力的硝酸根運(yùn)輸?shù)鞍?Tsay YF et al. The herbicide sensitivity gene CHLl of Arabidopsis encodes a nitrate-inducible nitrate transporter. Cell，1993，72 :705-713)。隨后， 通過酵母肽運(yùn)輸缺陷型突變體功能互補(bǔ)的方法鑒定出了另外一個(gè)擬南芥PTR家族成員 AtPTR2[Rentsch D et al. Ntrl encodes a high-affinity oligopeptide transporter in Arabidopsis. FEBS letters，1995，370 (3) :264-268]。AtPTRl 也是通過酵母肽運(yùn)輸功能缺陷突變體的異源互補(bǔ)鑒定出來(lái)的，它不僅僅能夠運(yùn)輸多種自然發(fā)生的二肽和三肽，而且能夠運(yùn)輸一種經(jīng)修飾的三妝菜顯毒素[Dietrich D et al. AtPTRl. a plasma membrane peptide transporter expressed during seed germination and in vascular tissue of Arabidopsis. The Plant Journal，2004，40 (4) :488-499] DAtPTRl 的表達(dá)在種子儲(chǔ)藏物的調(diào)動(dòng)、種子發(fā)育和土壤養(yǎng)分的獲得等過程中起重要作用。大麥盾片肽的運(yùn)輸?shù)鞍譎vPTRl 是目前為止特征分析最為詳細(xì)的植物PTR，它負(fù)責(zé)運(yùn)輸胚乳儲(chǔ)藏蛋白水解產(chǎn)生的小分子月太到正在發(fā)育的胚[West CE et al. Cloning and functional characterisation of a peptide transporter expressed in the scutellum of barley grain during the early stages of germination. The Plant Journal，1998，15 (2) :221-229]。水稻中雖然存在數(shù)量龐大的PTR家族成員，但是到目前為止，僅僅有兩個(gè)PTR基因(OsNTRl和0sPTR6)被鑒定[Lin CM et al. Cloning and functional characterization of a constitutively expressed nitrate transporter gene, OsNRTl. from rice. Plant Physiology,2000, 122(2) :379-388 ；0uyang J et al. Identification and analysis of eight peptide transporter homologs in rice, Plant Science, 2010,179 :374-382],由于 PTR 家族不同基因的底物不同，這些基因一方面從根的周圍吸收小分子肽或其他底物作為植物生長(zhǎng)與發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)，這些基因在植物體內(nèi)也運(yùn)輸小分子肽或其他底物，參與氮的重新分配，以滿足植物不同器官不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)氮的需求。所以，PTR家族成員在植物氮素運(yùn)輸和代謝過程中起著非常重要的作用，對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生重要影響。但到目前為止，已報(bào)道氮運(yùn)輸基因多數(shù)集中在氮吸收、生物量提高和突變體的功能研究方面，對(duì)于產(chǎn)量提高方面還無(wú)報(bào)道。本發(fā)明以水稻的一個(gè)PTR家族新成員基因0sPTR9，通過超量表達(dá)后，使正常的水稻吸收氮肥的效率提高，分蘗能力增強(qiáng)， 穗長(zhǎng)增加、總粒數(shù)和千粒重增加，從而產(chǎn)量提高，另外還通過RNAi技術(shù)，并且在0sPTR9基因突變體中證實(shí)了該基因的功能。本基因不僅對(duì)水稻在低氮條件下氮吸收增加及稻谷增產(chǎn)有促進(jìn)作用，同時(shí)也可以減輕因氮素?fù)p失對(duì)環(huán)境問題的負(fù)面影響。

發(fā)明內(nèi)容
氮素是作物重要的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，直接影響水稻的產(chǎn)量?？刂扑井a(chǎn)量的性狀較多，例如有效穗、穗長(zhǎng)、谷粒大小等。我們從稻屬普通栽培稻(Oriza sativa L.)中克隆了 0sPTR9的全長(zhǎng)序列，本發(fā)明的目的在于提供了一種提高水稻氮利用效率、分蘗能力強(qiáng)、 穗長(zhǎng)及千粒重增加的轉(zhuǎn)基因水稻及其應(yīng)用。本發(fā)明的主要內(nèi)容如下I.本發(fā)明在于提供了一種控制水稻氮利用效率、分蘗能力及產(chǎn)量的基因 0sPTR9(如SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列)，在轉(zhuǎn)基因水稻超表達(dá)植株中提高了水稻的氮利用效率、分蘗能力、穗長(zhǎng)及千粒重等。2.本發(fā)明在于提供一種基因0sPTR9在其他轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。通過超量表達(dá)基因0sPTR9來(lái)提高植物的氮利用效率及產(chǎn)量。所述的植物是指單子葉植物或雙子葉植物； 如小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜蓿等。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下超量表達(dá)0sPTR9基因驗(yàn)證其功能構(gòu)建超表達(dá)載體0sPTR9-pl301，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11，最后獲得超表達(dá)的組培苗80株，作為對(duì)照的由正常粳稻品種中花11愈傷分化的組培苗30株，都種于大田，結(jié)果超表達(dá)組培苗出現(xiàn)穗長(zhǎng)、總粒數(shù)和千粒重增加的現(xiàn)象。說(shuō)明0sPTR9基因具有提高水稻產(chǎn)量的功能。單株收種并種植，直至 T2代鑒定出純合植株，超表達(dá)植株的穗長(zhǎng)、粒數(shù)和千粒重均比對(duì)照提高。通過RNAi技術(shù)構(gòu)建干涉表達(dá)載體PTCK303-R1R2，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干涉載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11，最后獲得基因表達(dá)量下降的株系5個(gè)，直至T2代繼續(xù)觀察表型，仍表現(xiàn)為結(jié)實(shí)率嚴(yán)重下降，千粒重下降的現(xiàn)象。將目的基因的突變體Tl代種子(由華中農(nóng)大突變體庫(kù)提供(http://rmd.ncpgr.cn/)。無(wú)菌播種后,移栽于框中,待小苗長(zhǎng)高后,種于大田，對(duì)突變體植株純、雜合篩選，純合體同樣出現(xiàn)結(jié)實(shí)率嚴(yán)重下降，千粒重下降的現(xiàn)象，從而證實(shí)了該基因的功能。0sPTR9基因的應(yīng)用通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法或基因槍法或其它遺傳轉(zhuǎn)化方法超量表達(dá)水稻廣量基因0sPTR9可以提聞水稻吸收氣肥的效率，提聞植株分葉能力，提聞水稻的糖長(zhǎng)、粒數(shù)和千粒重，并且在RNAi和突變體中得到了功能驗(yàn)證。控制水稻氮素吸收和稻谷產(chǎn)量基因 0sPTR9可以在轉(zhuǎn)基因水稻中應(yīng)用也可以在其他轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用，培育具有高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的品種。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果I.本發(fā)明克隆的0sPTR9基因超表達(dá)后使水稻分蘗能力增強(qiáng)，穗長(zhǎng)、粒數(shù)和千粒重增加，說(shuō)明0sPTR9基因?qū)μ岣咚井a(chǎn)量較明顯，通過基因工程技術(shù)提高0sPTR9基因的表達(dá)能夠提高植物產(chǎn)量。這不僅有助于通過低氮條件下培育高產(chǎn)水稻，還可以通過分子育種進(jìn)行植物的品質(zhì)改良。2.擬南芥PTR家族的很多基因雖被研究，但水稻目前還很少。0sPTR9基因的成功克隆，進(jìn)一步證實(shí)了 PTR家族在氮吸收過程的重要作用，對(duì)闡明PTR家族的生物學(xué)功能有重要的意義，另外對(duì)進(jìn)一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動(dòng)作用。3.雖然目前已克隆到了一些提高植物產(chǎn)量的基因，但對(duì)植物增產(chǎn)的分子機(jī)制仍不清楚。而本發(fā)明克隆的0sPTR9基因能夠提高水稻的產(chǎn)量，這對(duì)植物增產(chǎn)的關(guān)鍵因素有極大的推動(dòng)作用。


SEQ ID No. I為0sPTR9基因編碼區(qū)氨基酸殘基序列，共有421個(gè)氨基酸。SEQ ID No. 2為0sPTR9基因的cDNA序列全長(zhǎng)。(全長(zhǎng)2429bp，編碼區(qū)1266bp，在 926-219 Ibp 間。)圖I.超表達(dá)載體構(gòu)建的0sPTR9_pCAMBIA1301載體圖。圖2.干擾載體實(shí)驗(yàn)所用的PTCK303載體圖。圖3.突變體純雜合PCR檢測(cè)原理示意圖。A表示在插入位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)的引物，B表示在插入位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物。在T2代植株中，純合突變體只有B和C配對(duì)可以擴(kuò)增的出， 因?yàn)橛蠺-DNA插入A與B配對(duì)的產(chǎn)物太大無(wú)法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA 的插入，只有A和B配對(duì)可以得到產(chǎn)物，雜合植株則B和C配對(duì)以及A和B配對(duì)時(shí)都可以壙增得到產(chǎn)物。圖4.超表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因植株設(shè)計(jì)引物檢測(cè)分離的PCR結(jié)果。上游引物在35S啟動(dòng)子中，下游引物在0sPTR9的cDNA內(nèi)部。1_10泳道均有帶，可判定此株系為純合植株。圖5.干擾載體轉(zhuǎn)基因植株設(shè)計(jì)引物檢測(cè)分離的PCR結(jié)果。上下游引物均在載體上，中間包括干擾載體中間的內(nèi)含子及0sPTR9插入的一段cDNA序列，2-5泳道均有帶，可判定為轉(zhuǎn)基因株系。圖6.突變體純雜合檢測(cè)。野生型只有A和B配對(duì)可以得到產(chǎn)物，雜合植株則B和 C配對(duì)以及A和B配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。純合型只有B和C配對(duì)擴(kuò)增出產(chǎn)物。所以第10泳道為純合型突變體植株。圖7.不同轉(zhuǎn)基因植株穗子的表型。從左到右依次為中花11、T2代超表達(dá)植株、Tl 代干涉植株和Τ3代突變體植株。圖8.不同轉(zhuǎn)基因材料的結(jié)實(shí)率比較。從左到右依次為中花11、Τ2代超表達(dá)植株、 Tl代干涉植株和Τ3代突變體植株。圖9.不同轉(zhuǎn)基因材料的千粒重比較。從左到右依次為中花11、Τ2代超表達(dá)植株、 Tl代干涉植株和Τ3代突變體植株。圖10. 0sPTR9在不同氮素條件下生物量比較。水培20d，氮素分別添加3mM，其中 pep代表大豆蛋白胨，ZH代表中花11，OE代表超表達(dá)植株，RNAi代表干涉植株，ptr9代表
突變體植株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例0sPTR9基因的功能驗(yàn)證和應(yīng)用遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建超表達(dá)載體所用載體是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的0sPTR9_pCAMBIA1301。 0sPTR9-pCAMBIA1301是在國(guó)際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301 (Sun et al. Xa26, a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice,encoding a LRR receptor kinase-like protein. Plant Journal. 2004, 37 :517-527)基礎(chǔ)上改建的， 攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米35S啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體(圖2)。 pCAMBIA 載體由由澳大利亞 CAMBIA 實(shí)驗(yàn)室(center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠贈(zèng)。提取 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用加酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增后連接pGEMT-easy載體，連接反應(yīng)PCR產(chǎn)物5 μ 1，載體0. 5 μ 1，2U T41igase， IOx buffer I μ 1，總10 μ I體積，16°C連接3h。取10 μ I連接產(chǎn)物，用氯化鈣凍融法轉(zhuǎn)到大腸桿菌toplO,加800ml LB,復(fù)蘇lh, 6000rpm 5min離心富集菌后涂于氨節(jié)抗生素的LB平板，37°C過夜。挑單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。待測(cè)序正確無(wú)誤后，把構(gòu)建后的載體連接到PCAMBIA1301已酶切好的大片段上。酶切和PCR驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105， 抽提質(zhì)粒，酶切和PCR驗(yàn)證，取700 μ I含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿桿菌菌液加300 μ I 50%甘油混勻，-70°C保存。構(gòu)建好的載體命名為ptr9-pCAMBIA1301。干涉載體所用載體是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的PTCK303-R1R2。pTCK303_RlR2是在國(guó)際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pTCK303(ZHEN WANG et al. A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice Plant Molecular Biology Reporter. 2004,22 409-417)基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的Ubi啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體(圖3)。pTCK303載體由中科院植物所分子和發(fā)育生物學(xué)研究中心(Research Cemer for Molecular and Developmental Biology)惠贈(zèng)。選擇 0sPTR9 基因的 cDNA 干涉片段的區(qū)間，將加酶切位點(diǎn)的第一個(gè)cDNA片段和第二個(gè)cDNA片段分別連接pGEMT-easy 載體，連接反應(yīng)PCR 產(chǎn)物 5 μ 1，載體 0. 5 μ 1，2U T41igase，10x buffer 1μ1』、10μΗΨ 積，16°C連接3h。取10 μ I連接產(chǎn)物，用氯化鈣凍融法轉(zhuǎn)到大腸桿菌toplO，加800ml LB，復(fù)蘇lh,6000rpm 5min離心富集菌后涂于氨節(jié)抗生素的LB平板,37°C過夜。挑單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。待測(cè)序正確無(wú)誤后，將酶切好的第一個(gè)cDNA片段連在PTCK303載體大片段上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定無(wú)誤后，將已酶切好的第二個(gè)cDNA片段連接含有第一個(gè)cDNA片段的pTCK303載體大片段上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒酶切，因兩個(gè)片段插入位點(diǎn)兩側(cè)含有BamHI和Sac I酶切位點(diǎn)，故可用這兩種酶酶切進(jìn)行鑒定cDNA插入情況。將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，抽質(zhì)粒，酶切和PCR驗(yàn)證，取700 μ I含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌菌液加等300 μ I 50%甘油混勻，-70°C保存。構(gòu)建好的載體命名為 PTCK303-R1R2。遺傳轉(zhuǎn)化米用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, 1994,Plant Journal 6 :271-282)將超表達(dá)載體和干涉載體導(dǎo)入正常中花11水稻品種。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下愈傷誘導(dǎo)
成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理lmin，5%的次氯酸鈉溶液消毒 50min ；
滅菌水洗種子4-5次；
將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，
置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度25-27°C。
愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 25-27 0C ο
預(yù)培養(yǎng)
挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4d，溫度25-27°C。
農(nóng)桿菌培養(yǎng)
在帶有卡那霉素和鏈霉素的YEB培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌EHA1052d，溫度 28 0C ；
將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28 °C搖床上培養(yǎng)2-4h。
農(nóng)桿菌侵染
將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子里；
調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D_ = 0. 8-1. 0 ;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡20min ；
轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，溫度19-20°C。
愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)
滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；
浸泡在含含400mg/L頭孢霉素的滅菌水中30min ；
轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。
分化及生根
將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7d ；
轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照(20001χ)下培養(yǎng)，溫度26°C，5-7周。
移栽待愈傷分化成苗并生根后，洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。轉(zhuǎn)基因植株及突變體植株的分子檢測(cè)待轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)大后，剪取葉子提DNA，并設(shè)計(jì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，最后獲得超表達(dá)的組培苗80株，結(jié)果超表達(dá)植株出現(xiàn)穗長(zhǎng)、總粒數(shù)和千粒重增加的現(xiàn)象。單株收種并種植，直至T2代檢測(cè)出純合植株(圖5)。同樣，設(shè)計(jì)引物對(duì)干涉轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，最后獲得干涉植株9株，結(jié)果出現(xiàn)結(jié)實(shí)率和千粒重嚴(yán)重降低的現(xiàn)象。超表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)的引物為F TTGCGATAAAGGAAAGGC ；R :ATCAGCAGCGGCAGAAGC。干涉載體轉(zhuǎn)基因植植株檢測(cè)的引物為F TCTGGTCCAGTCTTTCCG ；R :AACCCATCTCATAAATAACG。單株收種并種植，直至Tl代繼續(xù)觀察表型(圖6)。突變體Tl代種子由華中農(nóng)大突變體庫(kù)提供。將突變體種子無(wú)菌播種后，移栽于框中，待小苗長(zhǎng)高月IOcm時(shí)，種于大田中，待苗長(zhǎng)大后，對(duì)突變體種子純、雜合篩選。擴(kuò)增基因片段的上下游引物通過網(wǎng)址http://signal. salk. edu/ ricetdnprimers. 4. html (圖4 :A, B)設(shè)計(jì)，擴(kuò)增T-DNA插入的邊界序列引物為NTLB和 pFRB (圖 4 :C，D)。NTLB 的引物序列為 AATCCAGATCCCCCGAATTA。在 PCR 體系中加入 A、B 及 C或D中的一種即可鑒定出純雜合。由Tl代檢測(cè)的42株突變體Tl代植株中27株為雜合型，比率為64. 29%，無(wú)純合型。由T2代檢測(cè)的434株突變體植株中36株為純合型，比率為8. 29%。(圖7純合的突變體植株一致表現(xiàn)出結(jié)實(shí)率嚴(yán)重下降，千粒重下降的現(xiàn)象。見圖8，圖9及圖10統(tǒng)計(jì)結(jié)果。0sPTR9基因超表達(dá)結(jié)果和應(yīng)用最后獲得T2超表達(dá)植株60株，作為對(duì)照的由正常中花11植株30株，都種于大田， 超表達(dá)植株分蘗增強(qiáng)，穗長(zhǎng)、總粒數(shù)和千粒重增加，產(chǎn)量提高，而干涉植株Tl代中本基因降低表達(dá)的株系結(jié)實(shí)率嚴(yán)重下降，千粒重下降。見圖8，圖9及圖10統(tǒng)計(jì)結(jié)果。說(shuō)明0SPTR9 基因能影響結(jié)實(shí)率和千粒重，進(jìn)而影響產(chǎn)量的功能。PTR家族成員在植物氮素運(yùn)輸和代謝過程中起著非常重要的作用，對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生重要影響。另外通過添加不同氮素 (3mM)進(jìn)行了水培試驗(yàn)，水培培養(yǎng)20d后，超表達(dá)植株在多種氮素中生物量出現(xiàn)明顯增加的現(xiàn)象(圖10)?？傊?，本發(fā)明以水稻的一個(gè)新PTR家族成員0sPTR9為研究對(duì)象，通過超量表達(dá) 0sPTR9基因，使正常的水稻氮素吸收提高，分蘗能力增強(qiáng)，穗長(zhǎng)和千粒重增加，產(chǎn)量提高，另外還通過RNAi技術(shù)及目的基因突變體證實(shí)了該基因的功能。本基因?qū)Φ偷獥l件水稻高效利用氮肥與提高產(chǎn)量方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑和配方試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-節(jié)基腺嘌呤)；KT(Kinetin,激動(dòng)素)； NAA(Napthaleneacetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_acetic acid, Π引哚乙酸)；2, 4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringone,乙酉先丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)； DMSO(Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6大量元素；N6微量元素；MS大量元素；MS微量元素組織培養(yǎng)的溶液配方
1)N6大量母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KN03)28. 3g磷酸二氫鉀(KH2P04)4. 0g硫酸銨((NH4)2S04)4. 63g硫酸鎂(MgS04 7H20) 1. 85g氯化鈣(CaCl2 2H20) 1. 66g逐一溶解，然后在20_25°C下定容至1000ml。2) N6微量元素母液[100倍濃縮液(100 X)]碘化鉀(KI)0. 08g硼酸(H3B03)0. 16g硫酸錳(MnS04 4H20) 0. 44g硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 15g在20_25°C下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA 儲(chǔ)存液(100X)在一個(gè)大三角燒瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeS04 7H20) 2. 78g在另一個(gè)大三角燒瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70°C，然后加入乙二胺四乙酸 二鈉(Na2EDTA 2H20) 3. 73g在它們都溶解后混合在一起，70°C水浴中保持2h，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素儲(chǔ)存液(100 X)煙酸(Nicotinicacid)0. lg維生素B1 (Thiamine HC1)0. lg維生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. lg甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)lOg加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS大量元素母液(10X)硝酸銨(NH4N03)16. 5g硝酸鉀9. Og磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml6) MS微量元素母液(100 X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳2.23g硫酸鋅0.86g鑰酸鈉(Na2Mo04 2H20) 0. 025g硫酸銅(CuS04 5H20) 0. 0025g
氯化鈷(CoCl2· 6H20) O. 0025g在20_25°C下溶解并定容至1000ml。7)2，4-0儲(chǔ)存液(111^/1111)2,4-D IOOmgImllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。8) 6-BA 儲(chǔ)存液(lmg/ml)6-BA IOOmgIml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，燃后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。9) NAA 儲(chǔ)存液(lmg/ml)NAA IOOmgIml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在4°C
下保存?zhèn)溆谩?0) IAA 儲(chǔ)存液(lmg/ml)IAA IOOmgImlIN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在4°C
下保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖儲(chǔ)存液(O. 5mg/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS 儲(chǔ)存液ASO. 392gDMSOIOml分裝至I. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀儲(chǔ)存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，在20-25 °C下保存?zhèn)溆谩?4) KT 儲(chǔ)存液(lmg/ml)KT IOOmgImllN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。培養(yǎng)基配方I)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6大量元素母液(IOX) IOOmlN6微量元素母液(100X) IOmlFe2EDTA 儲(chǔ)存液(100X) IOml維生素儲(chǔ)存液(100X)IOml2，4_D 儲(chǔ)存液2.5ml
脯氨酸(Proline)O. 3g
CHO. 6g
鹿糖(Sucrose)30g
Phytagel3g
加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8，煮沸(100°C )并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
2)預(yù)培養(yǎng)基
N6大量元素母液(IOX)12. 5ml
N6微量元素母液(100X)I. 25ml
Fe2EDTA 儲(chǔ)存液(100X)2. 5ml
維生素儲(chǔ)存液(100X)2. 5ml
2，4-D儲(chǔ)存液0. 75ml
CH0. 15g
鹿糖 5g
瓊脂粉(Agarose) I 75g
加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖儲(chǔ)存液和250 μ I AS儲(chǔ)存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/ M )
3)懸浮培養(yǎng)基
Ν6大量元素母液(IOX)5ml
Ν6微量元素母液(100Χ)0. 5ml
Fe2EDTA 儲(chǔ)存液(100Χ)0. 5ml
維生素儲(chǔ)存液(100Χ)Iml
2，4-D儲(chǔ)存液0. 2ml
CH0. 08g
蔗糖2g
加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個(gè)IOOml的三角瓶中，封口滅菌。
使用前加Iml葡萄糖儲(chǔ)存液和IOOul AS儲(chǔ)存液。
4)選擇培養(yǎng)基
N6大量元素母液(IOX)25ml
N6微量元素母液(100X)2. 5ml
Fe2EDTA 儲(chǔ)存液(100X)2. 5ml
維生素儲(chǔ)存液(100X)2. 5ml
2，4-D儲(chǔ)存液0. 625ml
CH0. 15g
蔗糖7. 5g
瓊脂粉1.75g
加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ I 50mg/ml的潮霉素和500mg/L頭孢霉素，分別倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。5)預(yù)分化培養(yǎng)基N6大量元素母液(IOX)25mlN6 微量元素母液(100X)2.5mlFe2EDTA 儲(chǔ)存液(100X)2.5ml維生素儲(chǔ)存液(100X)2.5ml6-BA 儲(chǔ)存液0.5mlKT 儲(chǔ)存液0.5mlNAA 儲(chǔ)存液50 μ IIAA 儲(chǔ)存液50 μ ICHO. 15g鹿糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加250 μ I 50mg/ml的潮霉素和500mg/L頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。6)分化培養(yǎng)基N6大量元素母液(IOX) IOOmlN6微量元素母液(100X) IOmlFe2EDTA 儲(chǔ)存液(100X) IOml維生素儲(chǔ)存液(100X) IOml
0201]6-BA 儲(chǔ)存液2ml
0202]KT 儲(chǔ)存液2ml
0203]NAA 儲(chǔ)存液O. 2ml
0204]IAA 儲(chǔ)存液O. 2ml
0205]CHIg
0206]蔗糖30g
0207]Phytagel3g
0208] 加蒸懼水至900ml, IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. O,封口滅菌。
權(quán)利要求
1.一種控制水稻氮利用效率、分蘗能力及產(chǎn)量的基因，其特征在于具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)(1)序列表中SEQID No. I所不的氣基酸殘基序列；(2)SEQ ID No. I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至五十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育的蛋白質(zhì)。
2.一種如權(quán)利要求I所述的控制水稻氮利用效率、分蘗能力及產(chǎn)量的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQID No. 2所示的核苷酸序列；(2)編碼的序列表中SEQID No. 2蛋白質(zhì)序列的DNA ；(3)與SEQID No. 2限定的核苷酸序列同源性具有90%以上且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；(4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQID No. 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述的水稻的0sPTR9基因的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求2所述的水稻0sPTR9基因的大腸桿菌或農(nóng)桿菌。
5.含有權(quán)利要求2所述的水稻0sPTR9基因的轉(zhuǎn)基因植株。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2所述的水稻0sPTR9基因中任一片段的引物對(duì)。
7.權(quán)利要求3所述的水稻0sPTR9基因的表達(dá)載體在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于將所述水稻0sPTR9基因的超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，得到植株氮利用效率提高、分蘗能力增強(qiáng)，穗長(zhǎng)、千粒重及產(chǎn)量提高的水稻。
10.按照權(quán)利要求7所述的植物，其特征在于所述的植物包括水稻、小麥、玉米、黃瓜、 番茄、楊樹、草坪草及苜蓿等。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種提高水稻氮利用效率和增產(chǎn)基因OsPTR9的分離克隆及應(yīng)用。OsPTR9是水稻PTR家族的一個(gè)基因，編碼的蛋白是含氮有機(jī)物的轉(zhuǎn)運(yùn)體。本發(fā)明通過超量表達(dá)OsPTR9基因，使正常的水稻吸收氮肥的效率提高，分蘗能力增強(qiáng)，穗長(zhǎng)及千粒重增加，并且通過RNAi技術(shù)以及在OsPTR9目的基因突變體中證實(shí)了該基因的功能。通過基因工程技術(shù)提高或減弱OsPTR9基因的表達(dá)量能夠充分說(shuō)明OsPTR9基因能夠控制水稻的氮吸收、植株分蘗、穗長(zhǎng)及千粒重等。該基因在闡述氮素影響植物生長(zhǎng)及發(fā)育過程方面；在水稻高效利用氮肥與提高產(chǎn)量方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102604962SQ20111002298
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者夏快飛, 張明永, 方中明, 曾紀(jì)睛, 楊鑫, 馬鎮(zhèn)榮, 黃瑋婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院華南植物園