一種水稻高氮利用效率基因的分子標(biāo)記鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻高氮利用效率基因（NRT1. 1B)的分子標(biāo)記鑒定方法，屬于生 物技術(shù)工程領(lǐng)域，專用于水稻高氮利用效率NRT1. 1B基因的水稻資源鑒定和標(biāo)記輔助育 種。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國最重要的糧食作物之一，全國水稻種植面積約占糧食作物面積的 30%，產(chǎn)量接近糧食總產(chǎn)量的一半(張佳宇，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008)，約為我國60%以上的人 口提供口糧。按照植物學(xué)分類劃分，我國種植的水稻品種屬于亞洲栽培稻。亞洲栽培稻有兩 個(gè)亞種，即秈亞種和粳亞種(楊有新等，科學(xué)通報(bào)，2009,（15) : 2212-2218)，它們在形態(tài)、發(fā) 育與生理等方面都表現(xiàn)出較大的不同特征。從目前來看，粳稻的產(chǎn)量往往不及秈稻，然而前 者食味品質(zhì)卻大都優(yōu)于后者。隨著人們生活水平的不斷提高，粳稻憑借較優(yōu)的食味品質(zhì)而 更受消費(fèi)者的青睞，在我國的種植面積逐年擴(kuò)大。但與秈稻相比，粳稻的低氮肥利用效率成 為制約其種植面積擴(kuò)大的重要因素。令人興奮的是，2015年6月8日世界著名雜志《Nature Genetic》在線報(bào)道了"一個(gè)偉大的發(fā)現(xiàn)"，Hu等從秈稻中克隆了一個(gè)高氮利用效率NRT1. 1B 基因；試驗(yàn)表明，將NRT1. 1B基因?qū)刖?，大大提高粳稻的氮肥吸收率，一半施肥條件下， 與對照相比增產(chǎn)30~33%，氮肥利用效率提高30% ;在正常施氮條件下，增產(chǎn)8~10%，氮肥利用 效率提高約 10%(HuB,etal.，NatGenet, 2015，47(7): 834-838)。NRT1.1B基因在 粳稻氮肥利用效率改良上具有巨大應(yīng)用價(jià)值，相應(yīng)基因的鑒定方法值得研究探討。
[0003] 序列分析顯示，秈稻野生型NRT1. 1B基因與粳稻突變型nrtl.lb基因在編碼序列 (Codingsequence，⑶S)區(qū)域第980位存在一個(gè)堿基T與C的差異。對于單堿基差異的檢 測，最直接的方法就是測序，但存在費(fèi)用昂貴、操作工序復(fù)雜及耗時(shí)長等缺點(diǎn)，不利于推廣 應(yīng)用。四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(tera_primeramplificationrefractorymutation system-PCR，tera-primerARMS-PCR)是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來專門用于單核苷酸多 態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)檢測的衍生技術(shù)，能對SNP進(jìn)行分型鑒定， 呈共顯性標(biāo)記特性，是一種簡便、快速、低廉檢測SNP的方法(管峰等，生命的化學(xué)，2004， 24(6) : 514-516)?；诙i稻野生型NRT1. 1B基因與粳稻突變型nrtl.lb基因存在的單核 苷酸差異，結(jié)合tera-primerARMS-PCR引物設(shè)計(jì)原理，本發(fā)明開發(fā)出了用于鑒定水稻高氮 素利用效率NRT1. 1B基因的分子標(biāo)記，為相應(yīng)目的基因的資源鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育 種中提供重要參考，有利于提尚工作成效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的技術(shù)問題：本發(fā)明針對利用測序鑒定NRT1. 1B基因存在的費(fèi)用昂貴、工 序復(fù)雜及耗時(shí)長等缺點(diǎn)，根據(jù)野生型NRT1. 1B基因與突變型nrtl.lb基因在編碼序列⑶S 第980位存在的堿基T與C的差異，結(jié)合tera-primerARMS-PCR引物設(shè)計(jì)原理，開發(fā)該基 因的四條特異性引物并于同管PCR反應(yīng)擴(kuò)增水稻基因組DNA來準(zhǔn)確、快速地鑒定NRT1. 1B 基因的類型，為相應(yīng)目的基因的資源篩選鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供重要參考。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一種水稻高氮利用效率基因的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在 于：使用高氮利用效率NRT1. 1B基因的特異性引物。引物包括四條，序列如下： 正向外引物NRT1. 1B-0-F:5' -GATGGAGGCGATGAGGAAGA-3' ； 反向外引物NRT1. 1B-0-R:5' -GCTGCCAAGAAACACCACAA-3' ； 正向內(nèi)引物NRT1. 1B-I-F:5' -TCGTGCACAGCCTCCACTTGCTCGACG-3' ； 反向內(nèi)引物NRT1. 1B-I-R:5' -AGGTCGGCGGCGGAGTCGCCGGCTAT-3'。
[0006] 使用以上所述的四條引物準(zhǔn)確、快速鑒定區(qū)分NRT1. 1B基因型的PCR分子標(biāo)記方 法如下： (1)水稻植株基因組DNA的提?。喝》痔Y期水稻葉片適量，按CTAB方法對DNA進(jìn)行提 取，具體步驟為：①取約〇. 〇5g新鮮葉片，置于研缽中，加入0. 5ml的CTAB溶液（CTAB-2% (W/V)，NaCl-1. 4Mol/L，EDTA-0. 02M〇1/L，TrisBasic-0.IMol/L，pH=8. 0)進(jìn)行研磨；_ 將研磨液移入1. 5ml的離心管，在65T下水浴lh，期間搖晃數(shù)次；議12000rpm/min離心 8min，回收上清液0. 3ml至滅菌1. 5ml離心管，棄去沉淀；_!:加入苯酸：氯仿：異戊醇溶液 (25:24:1) 0. 3ml，上下顛倒數(shù)次，靜置lOmin;⑤12000rpm/min離心lOmin，小心吸取上清 0? 2ml至滅菌 1. 5ml離心管；_加入 20y1 的 3Mol/LNaAC(PH=5. 2)，再加入 0? 4ml的-20°C 無水乙醇，-20°C靜置lh;議12000rpm/min離心lOmin，棄上清液，加入0? 3ml的70%乙醇 洗滌兩次;g將離心管放到超凈工作臺風(fēng)干，加入0. 2ml超純水溶解備用。
[0007] (2)水稻基因組DNA的PCR擴(kuò)增：將所述的四條引物NRT1. 1B-0-F、NRT1. 1B-0-R、 NRT1. 1B-I-F及NRT1. 1B-I-R加入到同管PCR反應(yīng)體系對水稻植株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增； 20yL的PCR反應(yīng)體系包括：DNA2yL(10~100ng/L)，引物NRT1. 1B-0-F、NRT1. 1B-0-R、 NRT1.1B-I-F及NRT1.1B-I-R各 0.5yL(2yM/L)，10XTaqBuffer2yL(含Mg2+)， dNTPMixture0.4yL(2. 5mM/L)，TaqDNA聚合酶 0.4 (2500/mL)，ddH20 13.2yL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋合仍?5°C下預(yù)變性5min;然后95°C下變性30s，62°C下退火復(fù)性30s，72°C下 延伸lmin，循環(huán)31次；然后72°C下再延伸10min，12°C下2min，可將產(chǎn)物取出備用。
[0008] (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度約為3%的瓊脂糖凝膠于150V電壓 下電泳40min，越華洋的gillgreen核酸染料染色，置于伯樂凝膠成像系統(tǒng)GELDOCXR下觀 察、拍照及記載。若同時(shí)擴(kuò)增出368bp和243bp兩條特征條帶，則為含野生型NRT1.1B基 因的純合體；若同時(shí)擴(kuò)增出368bp和177bp兩條特征條帶，則為含突變型nrtl.lb基因的 純合體；若同時(shí)擴(kuò)增出368bp、243bp和177bp三條特征條帶，則為含NRT1.lB/nrtl.lb 基因的雜合體。
[0009] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的"一種水稻高氮利用效率基因的分子標(biāo)記鑒定 方法"，具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記并非與NRT1. 1B連鎖的標(biāo)記，而是基于基因本身的DNA序列 而設(shè)計(jì)的功能性分子標(biāo)記，它能直接反映水稻植株的基因型，不會發(fā)生類似連鎖標(biāo)記與基 因的遺傳交換而導(dǎo)致基因型鑒定的錯(cuò)誤。
[0010] (2)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記能準(zhǔn)確、快速地對水稻高氮利用效率NRT1. 1B基因的 基因類型進(jìn)行鑒定。
[0011] (3)與測序鑒定相比，本發(fā)明采用四條引物同管一步PCR擴(kuò)增方法對NRT1. 1B基因 的基因型進(jìn)行鑒定，不僅能高效地區(qū)分目的基因的純合和雜合類型，而且還可以克服費(fèi)用 昂貴、工序復(fù)雜及耗時(shí)長等缺點(diǎn)，顯得更為高效、快捷且費(fèi)用低廉，非常適合對大批量水稻 資源及育種材料的鑒定，具有重大的意義和推廣價(jià)值。
【附圖說明】
[0012] 圖1鑒定高氮利用效率NRT1. 1B基因分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)策略 (nrtl.lb代表粳稻突變型基因序列；NRT1. 1B代表秈稻野生型基因序列；對比序列中 標(biāo)示有下劃線的字母表示存在差異的堿基；箭頭表示引物位置及擴(kuò)增方向，NRT1. 1B-0-F 表示正向外引物，NRT1. 1B-0-R表示反向外引物，NRT1. 1B-I-F表示正向內(nèi)引物， NRT1. 1B-I-R表示反向內(nèi)引物） 圖2分子標(biāo)記對水稻NRT1. 1B基因的檢測 (M: 100bpDNALadder;1 :9311 ;2 :南京 11 ;3 :培矮 64 ;4 :勝利秈；5 :特青；6 :黃華 占；7 :明恢63 ;8 :珍汕97B;9 :日本晴；10 :武運(yùn)粳7 ;11 :秀水134 ;12 :空育131 ;13 :龍粳 29 ;14 :秀水 114 ;15 :武運(yùn)粳 23 號；16 :牡丹江 28 ;17 :F1 (9311/ 日本晴);18 :F1 (培矮 64/ 日本晴）；19 :F1 (9311/空育131) ;20 :F1 (南京11/日本晴)。） 圖3分子標(biāo)記對培矮64/武運(yùn)粳7的F2群體中單株不同基因型的檢測 (M:100bpDNALadder;P1:武運(yùn)粳 7 ;P2 :培矮 64 ;1-18:F2 個(gè)體植株。）。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明"一種水稻高氮利用效率基因的分子標(biāo)記鑒定方法"作 進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0014] 下面給出本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例： 1、供試材料： (1) 明確含野生型NRT1. 1B基因的秈稻8份：9311、南京11、培矮64、勝利秈、特青、黃 華占、明恢 63、珍汕 97B(HuB,etal.，NatGenet, 2015，47(7): 834-838); (2) 明確含突變型nrtl.lb基因的粳稻8份：日本晴、武運(yùn)粳7、秀水134、空育131、 龍粳 29、秀水 114、武運(yùn)粳 23 號、牡丹江 28(HuB,etal.，NatGenet, 2015，47(7): 834-838)； (3) 明確含NRTl.IB與nrtl.lb基因的親本雜交的后代FI材料4份：FI(9311/日本 晴)，F(xiàn)1 (培矮64/日本晴)，F(xiàn)1 (9311/空育131)，F(xiàn)1 (南京11/日本晴）； (4) 培矮64/武運(yùn)粳7雜交的后代F2育種材料。
[0015] 上述材料于2015年4月10日種于貴州省畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水稻科研基地。
[0016] 2、引物設(shè)計(jì)及合成： 根據(jù)Hu(NatGenet. 2015，47(7): 834-838)等的研究結(jié)果，野生型NRT1. 1B基因 與突變型nrtl.lb基因⑶S區(qū)域的第980位分別存在的堿基T與C的差異，從NCBI網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載NRT1. 1B基因的DNA序列（GenBank:DP000086. 1)， 定位到DNA序列相應(yīng)的位置，結(jié)合專用于檢測SNP突變的tera-primerARMS-PCR引物設(shè)計(jì) 原理，設(shè)計(jì)用于檢測鑒定NRT1. 1B基因的分子標(biāo)記，標(biāo)記由4條引物組成，包括內(nèi)外引物各 2條。
[0017]正向外引物NRT1 ? 1B-0-F:5' -GATG