專利名稱：茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片。液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶(ATP)酶是液泡膜上的插入蛋白(Integral protein)，它水解ATP的部分在液泡膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，ATP水解產(chǎn)生的能量，把細(xì)胞質(zhì)中的氫離子“泵”到膜外，調(diào)節(jié)液泡內(nèi)的氫離子梯度，跨膜的氫離子梯度及膜電位的增加，產(chǎn)生了跨膜的離子能差，就是離子進(jìn)入細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)力——質(zhì)子動(dòng)力。氫離子對(duì)有生命細(xì)胞維持內(nèi)在環(huán)境的平衡有極其重要的作用，有它形成的跨膜質(zhì)子推動(dòng)力，可用于ATP的形成，驅(qū)使次級(jí)離子或溶質(zhì)的傳遞和控制某些與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的過(guò)程。
背景技術(shù)：
生物體基因組中可轉(zhuǎn)錄表達(dá)的序列(即基因)僅占總序列的2％左右，對(duì)這部分序列進(jìn)行測(cè)定，將直接導(dǎo)致新基因的發(fā)現(xiàn)，并獲取基因組中與產(chǎn)業(yè)化關(guān)系最為密切的信息。20世紀(jì)80年代，高通量的自動(dòng)測(cè)序的出現(xiàn)，使從質(zhì)?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡(jiǎn)稱cDNA，下同)文庫(kù)隨機(jī)選取許多cDNA克隆和測(cè)定來(lái)自非載體兩端的幾百個(gè)堿基(Base Pair，簡(jiǎn)稱bp，下同)的脫氧核糖核酸(簡(jiǎn)稱DNA，下同)序列成為可能。這些短的DNA序列叫作“表達(dá)序列標(biāo)簽”(Expressed Sequence Tags，簡(jiǎn)稱ESTs)。表達(dá)序列標(biāo)簽的概念最早是由Adams等在1991年提出來(lái)的(Science，252(5013)1651-1656)。隨后Venter等(1991)(Science，252(5013)1651-1656)創(chuàng)立了大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)，其基本特征就是從以質(zhì)粒為載體，構(gòu)建完成的目的組織cDNA文庫(kù)中，隨機(jī)選擇許多cDNA克隆，利用質(zhì)粒上攜帶的通用引物對(duì)cDNA兩端進(jìn)行一輪脫氧核糖核酸序列測(cè)定，所獲得的來(lái)自3′端或5′端的幾百個(gè)堿基的非載體短脫氧核糖核酸序列。1992年Sikela和Matsubara(Sikela，et al.Nucleic Acids Research 19，1837-1843；Matsubara，et al.Nature Genetics，2，173-179)針對(duì)獲得大量信使核糖核酸(mRNA)序列的迫切需要，提出大規(guī)模cDNA測(cè)序的研究戰(zhàn)略。簡(jiǎn)而言之，表達(dá)序列標(biāo)簽是來(lái)自表達(dá)基因片段3′端或5′端的短脫氧核糖核酸序列(通常為300-500bp)，代表一個(gè)特定組織或發(fā)育階段的表達(dá)基因部分轉(zhuǎn)錄片段。表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)對(duì)于基因組研究缺乏的物種，如茶樹，具有特別重要的意義和價(jià)值。
根據(jù)表達(dá)標(biāo)簽序列提供的序列信息設(shè)計(jì)合成基因特異引物(Gene specific primer，GSP)在使用Oligo(dT)對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的同時(shí)加上錨定引物(Anchored primer)，然后在總RNA中，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid amplification cDNA ends)技術(shù)，獲得目的基因的全長(zhǎng)序列。也可以用該標(biāo)簽序列提供的信息設(shè)計(jì)引物，合成探針對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，挑取最長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，以期獲得目的基因。邢桂春等(中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2001，17(2)203-208)用電子延伸結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆出了腫瘤相關(guān)MAGE基因家族的一個(gè)新基因MAGE-D1；羅瑛等(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2001，28(2)188-191)據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物，成功分離了RIG1基因的全序列；Qian J等(Acta Biochem Biophys Scnica，2001，33(2)147-152)用一個(gè)與泛蛋白途徑相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽序列，結(jié)合RACE-PCR技術(shù)分離了UBAP1基因全長(zhǎng)。
隨著生物技術(shù)和生命科學(xué)發(fā)展的需要以及表達(dá)序列標(biāo)簽固有的特點(diǎn)，近幾年，人們發(fā)明了生物芯片。生物芯片(Biochips)的實(shí)質(zhì)就是在面積不大的基片上有序地點(diǎn)陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識(shí)別分子(Lipshutz，RJ et al.Bio Techniques 19(1995)，442-447；Fodor，SP et al.Nature 364(1993)，555-556；Fodor，SP et al.Science 251(1991)，767-773；Pease，AC et al.Proceedings of National Academy of Science，USA 91(1994)，5022-5026)。由于最初的生物芯片主要是用于DNA序列測(cè)定、基因表達(dá)譜鑒定(Lockhart，DJ et al.Nature Biotechnology14(1996)，1675-1680)、基因突變體的檢測(cè)和分析(Feriotto，G et al.，Human Mutation 13(1999)，390-400；Hacia，JG et al.Nature Genetics 21(suppl 1)(1999)，42-47；Hacia，JG et al.NatureGenetics 22(1999)，164-167；Nilsson，P et al.Bio Techniques 26(1999)，308-316)，所以又稱為DNA芯片或生物芯片。目前，這一技術(shù)已擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，因此生物芯片已超出了原來(lái)的范圍。如今生物芯片主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、動(dòng)電微陣列、蛋白質(zhì)芯片和免疫芯片等，還出現(xiàn)了組織芯片、細(xì)胞芯片、多肽芯片、質(zhì)譜芯片和電芯片等新的品種和技術(shù)。
1995年10月P.Brown和他的同事(Bio Techniques，19(1995)，442-447)提出了cDNA微陣列技術(shù)，M.Schena(Science 270(1995)，467-470)和D.Shalon(Genome Research 6(1996)，639-645)等首次制造了cDNA陣列，隨后這項(xiàng)技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。運(yùn)用生物芯片技術(shù)，將獲得的芯片運(yùn)用雜交技術(shù)和掃描技術(shù)對(duì)生物芯片進(jìn)行芯片處理、有效數(shù)據(jù)提取、分析和報(bào)告，可獲得相應(yīng)的基因表達(dá)譜(Gene expression profiling)。目前DNA芯片因具有強(qiáng)有力性、靈活性、敏感性和相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而被應(yīng)用在許多領(lǐng)域，如DNA序列測(cè)定、基因多態(tài)性檢測(cè)(Wang，et al.Science 280(1998)，1077-1082；Nalushka，et al.Nature Genetics 22(1999)，239-247)、新基因的發(fā)現(xiàn)、疫苗和藥物研究、植物的抗逆性研究(Schenk，PM et al.Proceedingsof National Academy of Science，USA，97(2000)，11655-11660)、有機(jī)體的發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的基因的協(xié)調(diào)性研究、檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期不同組織中基因的波動(dòng)性活動(dòng)等。分析基因組規(guī)?；幕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)，將最終導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞分化的整體性觀察，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、能量代謝、胞間和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)的產(chǎn)生、細(xì)胞遷移的基因組分子圖譜等。表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片用于生物功能的研究和檢測(cè)平臺(tái)。生物包括動(dòng)物、植物以及它們的器官、植物的種子、動(dòng)植物細(xì)胞和它們的產(chǎn)物；所說(shuō)的生物功能的研究包括基因藥物、疫苗、植物的抗逆性、動(dòng)植物育種和植物新品種的產(chǎn)生、動(dòng)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的機(jī)理和藥物的毒理學(xué)；生物功能的檢測(cè)包括轉(zhuǎn)基因植物的安全性檢測(cè)、食物成分的功能性評(píng)估、病原體的檢測(cè)和診斷、生物物種的鑒定，包括動(dòng)植物和微生物。抗逆性包括抗干旱、抗病害、抗蟲害、抗低溫和抗鹽堿的特性。
通過(guò)對(duì)茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行基因表達(dá)分析，有助于發(fā)現(xiàn)并克隆基因家族新成員、基因定位克隆、作為序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence-Tagged Sites，簡(jiǎn)稱STSs)進(jìn)行染色體的基因定位和基因圖譜制作、遺傳突變位點(diǎn)的鑒定、分析基因在不同組織中的表達(dá)特異性和建立DNA物理圖譜和對(duì)細(xì)胞和有機(jī)體的整體研究等。正因?yàn)楸磉_(dá)序列標(biāo)簽具有如此的優(yōu)越性，因此表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序已經(jīng)成為許多基因組研究機(jī)構(gòu)的工作重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因全長(zhǎng)的克隆。
一種分離出的茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽的序列表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1所示的序列；所示序列的互補(bǔ)序列或同源序列；所示序列中8～100個(gè)連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。
它的制備方法為1)茶樹總RNA(核糖核酸)提取；2)mRNA(信使核糖核酸)分離與純化；3)采用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法合成cDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核酸)第一鏈和第二鏈；4)cDNA酶切、純化，并與載體連接；5)產(chǎn)生噬菌體文庫(kù)與質(zhì)粒cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化；
6)重組質(zhì)粒的培養(yǎng)和提??；7)表達(dá)序列標(biāo)簽序列的測(cè)定；8)剔除載體序列、冗余序列，互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索、分類，獲得SEQ ID No.1表達(dá)序列標(biāo)簽序列。
一種由權(quán)利要求1所述表達(dá)序列標(biāo)簽所組成的生物芯片在載體上結(jié)合有SEQ ID No.1所示的序列、同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子；所說(shuō)的核酸分子是脫氧核糖核酸；核糖核酸和多聚寡核苷酸。
芯片制備方法為1)對(duì)SEQ ID No.1表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增；2)PCR產(chǎn)物純化處理后用于芯片制作；3)芯片由芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制。
上述載體為固相載體或液相載體；固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜、凝膠。
一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1所示的序列、互補(bǔ)序列或同源序列、序列中的8～100個(gè)連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)序列作為基因表達(dá)分析檢測(cè)的探針。
茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)方法的步驟為1)靶基因組織總RNA或mRNA的提??；2)甲醛凝膠變性電泳分離RNA；3)將變性電泳后的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜；4)利用SEQ ID No.1所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列、8-100個(gè)核苷酸序列為探針，采用生物素法制備探針；5)探針與靶基因雜交、放射自顯影，通過(guò)定性、定量比較雜交圖譜，可以明確特定組織液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因是否表達(dá)、表達(dá)的活性是上調(diào)還是下調(diào)。
一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因全長(zhǎng)的克隆利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQID No.1所示的序列、互補(bǔ)序列或同源序列、序列中的30～100個(gè)連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列來(lái)合成聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的基因特異引物、擴(kuò)增待克隆基因全長(zhǎng)的5’或3’引物。
茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因的克隆方法，它的步驟為1)總RNA的提取和mRNA的分離；
2)PCR法合成5’或3’cDNA；3)利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列或30～100個(gè)連續(xù)核苷酸來(lái)合成液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因特異引物，PCR快速擴(kuò)增末端cDNA；4)Southern雜交或克隆測(cè)序鑒定PCR產(chǎn)物的特性；5)當(dāng)PCR產(chǎn)物被部分或全部測(cè)序所鑒定后，以5′cDNA為模板，用表達(dá)序列標(biāo)簽5’或3’設(shè)計(jì)的引物，采用長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增獲得基因全長(zhǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.用獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽制成表達(dá)序列標(biāo)簽芯片具有許多商用價(jià)值和科研價(jià)值(1)應(yīng)用該表達(dá)序列標(biāo)簽芯片可用于作物種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)。(2)應(yīng)用該生物芯片也可用于對(duì)農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行早期預(yù)測(cè)，篩選出最佳的優(yōu)勢(shì)雜交種。(3)應(yīng)用該生物芯片也能用于對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行商品檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)可食轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。(4)應(yīng)用該生物芯片還可用于查找藥物的毒性和副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究，利于對(duì)新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選。(5)該生物芯片可用于植物的育種和植物新品種的產(chǎn)生。(6)該生物芯片還可用于從整體上研究整個(gè)信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，這對(duì)生物體基因調(diào)節(jié)的整體性研究具有重要的科研和實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。(7)應(yīng)用該生物芯片還可以運(yùn)用突變體研究植物中胞間和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，為發(fā)現(xiàn)植物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據(jù)。(8)該生物芯片能夠作為一種商品，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)科學(xué)研究和實(shí)際生產(chǎn)中。
2.應(yīng)用這個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽可進(jìn)行茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因的表達(dá)分析檢測(cè)。通過(guò)對(duì)茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因的分析，經(jīng)過(guò)與表達(dá)序列標(biāo)簽的比較，可以判定特定茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因是否表達(dá)以及表達(dá)的強(qiáng)弱，是上調(diào)，還是下調(diào)。
3.應(yīng)用這個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽可進(jìn)行茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因的克隆。采用PCR技術(shù)，根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽所提供的序列信息來(lái)合成待克隆基因PCR反應(yīng)的基因特異引物以及PCR擴(kuò)增基因全長(zhǎng)的5’和3’引物，非常容易獲得茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶的全長(zhǎng)基因。
4.還可以利用這個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽繪制基因圖譜。如果一個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽在基因組中只出現(xiàn)一次，那么它可以做為序列標(biāo)簽位點(diǎn)。由表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)建的物理圖譜叫表達(dá)圖或轉(zhuǎn)錄圖(expression or transcript maps)。利用表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行基因圖制作，可以加快序列標(biāo)簽位點(diǎn)的制作和新基因的染色體定位。
5.表達(dá)序列標(biāo)簽序列可以作為基因特異性探針，對(duì)組織特異性基因表達(dá)的研究具有重要的作用。
6.表達(dá)序列標(biāo)簽豐富了表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)，并可以最大限度地利用公開的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)信息，大大縮短克隆新的全長(zhǎng)互補(bǔ)脫氧核糖核酸的周期并可減少克隆的成本，加快生物信息積累較薄弱的茶樹基因克隆進(jìn)度。
7.表達(dá)序列標(biāo)簽還可進(jìn)行新基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。表達(dá)序列標(biāo)簽可以對(duì)所有動(dòng)植物的基因作為一種標(biāo)簽庫(kù)，通過(guò)不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因的遺傳進(jìn)化圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建一、茶樹總RNA的提取春天取生長(zhǎng)健壯的茶樹嫩葉100mg，迅速加液氮冷凍研磨成細(xì)粉末狀，加入1000μLTrizol試劑(購(gòu)自Gibco BRL)繼續(xù)研磨后，又再加入1000μL Trizol試劑，混勻分裝到兩個(gè)經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的1.5mL離心管中，冰上放置5分鐘，各加入200μL的氯仿，顛倒混勻，4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取500μL上清液，加入等體積的異丙醇，上下輕輕顛倒10次，室溫放置10分鐘，4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清，沉淀中加入1mL 75％乙醇輕輕清洗，倒去乙醇，干燥后加入20μL經(jīng)焦炭酸二乙酯處理過(guò)的雙蒸水溶解沉淀。甲醛凝膠變性電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，RNA 3.5μL中加入上樣緩沖液(1mL由45％甲酰胺545μL、37％甲醛196μL、10×3-(N-瑪林代)丙磺酸121μL、80％甘油76μL和10％溴酚蘭62μL配制)16.5μL，混勻后在95℃變性2分鐘后，迅速放入冰浴中，防止退火。電泳時(shí)，電泳槽置于冰上，保證低溫，電壓不超過(guò)5v/cm。RNA可放于-70℃冰箱中長(zhǎng)期保存，備用。
二、mRNA的分離和純化1.生物素標(biāo)記的Oligo(dT)探針與mRNA的退火在經(jīng)焦炭酸二乙酯處理不含RNA酶的1.5mL離心管中加入0.5mg總RNA，溶解于500μL焦炭酸二乙酯處理水中，65℃水浴保溫10分鐘，加入3μL的Oligo(dT)探針，13μL的20×SSC(1L 20×SSC含175.3g氯化鈉和88.2g檸檬酸鈉，pH 7.0)輕輕混勻，室溫放置約10-20分鐘至冷卻。
2.親和素順磁磁珠的沖洗將一管親和素順磁磁珠(購(gòu)自Promega Corporation)輕輕懸浮后放入磁性分離架中，使親和素順磁磁珠集中到管的一側(cè)，小心除去上清，用300μL 0.5×SSC清洗親和素順磁磁珠三次，每次用磁性分離架集中磁珠，去除上清液，將清洗過(guò)的親和素順磁磁珠溶于100μL的0.5×SSC中備用。
3.雜交體的生成和漂洗將已退火的生物素標(biāo)記探針，加入到溶于100μL的0.5×SSC的親和素順磁磁珠中，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，每隔1-2分鐘輕混勻一次，用磁性分離架捕獲磁珠親和素順磁磁珠，小心去除上清，用300μL的0.1×SSC洗滌親和素順磁磁珠，磁性分離架集中后去除上清液，共重復(fù)4次。
4.洗脫mRNA將漂洗過(guò)的親和素順磁磁珠重新懸浮于100μL的焦炭酸二乙酯水中，用磁性分離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中，重復(fù)清洗親和素順磁磁珠，共得到250μL的mRNA。
5.mRNA的沉淀和溶解加入0.1×體積的醋酸鈉(pH 5.2)和1×體積的異丙醇沉淀mRNA，-20℃過(guò)夜。12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清。加入1mL的75％的乙醇懸浮后，離心片刻，去上清，干燥，復(fù)溶于30μL的焦炭酸二乙酯處理的水中。3.5μL mRNA加入16.5μL上樣緩沖液(按7∶33配)混勻后在95℃變性2分鐘，拿出后立即放入冰上，防止退火，甲醛凝膠變性電泳時(shí)，電泳槽置于冰上，保證低溫。電壓不超過(guò)5v/cm。
三、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(一)cDNA第一鏈合成在0.5mL的離心管中，分別加入3μL的茶樹mRNA，1μL 10μM 5’PCR第一鏈合成引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGG CCGGG-3’)，1μL 10μM 3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGC CGACATG-d(T)30N-1N-3’)(N＝A，G，C或者T；N-1＝A，G，C)?；靹颍噪x心，72℃溫育2分鐘，冰上冷卻2分鐘，離心把組分收集到底部，每管中加入2μL 5×第一鏈合成緩沖液(250mM Tris，pH8.3，30mM氯化鎂，375mM氯化鉀)，1μL二硫蘇糖醇(20mM)，1μL dNTP混合物(10mM)，1μL反轉(zhuǎn)錄酶，至總體積為10μL。經(jīng)渦旋、瞬間離心混勻，在PTC-220 PCR儀(MJ Research，Inc.)中42℃溫育1小時(shí)后，取出放于冰上，終止第一鏈的合成。放于-20℃冰箱中可保存3個(gè)月，備用。
(二)cDNA第二鏈的合成先把PCR儀加熱到95℃。在一個(gè)0.5mL的離心管中加入2μL第一鏈cDNA，80μL無(wú)離子水，10μL 10×PCR緩沖液，2μL 50×dNTP mix，2μL 10μM 5’PCR第二鏈合成引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGT-3’)，2μL 3’PCR引物(5’-ATTCT AGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30N-1N-3’)(N＝A，G，C或者T；N-1＝A，G，C)，2μL 50×聚合酶混合物至總體積為100μL，輕輕振動(dòng)混勻，稍離心，將物質(zhì)收集到底部，必要時(shí)加2滴礦物油以覆蓋液面。放進(jìn)經(jīng)預(yù)熱到95℃的PCR儀中，PCR反應(yīng)程序如下95℃變性20秒，接著95℃5秒，68℃6分鐘共24個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后，取5μL用1.1％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE(45mM Tris-硼酸，1mM乙二胺四乙酸，pH8.0)中電泳。其余放于-20℃冰箱可保存3個(gè)月。
(三)蛋白消化及cDNA純化1.取75μL cDNA加到一個(gè)0.5mL的管中，加2μL的蛋白酶K(20μg/μL)。
2.45℃溫育20分鐘3.取出后，離心一下，將組分收集到管底4.加入23μL的無(wú)離子水，保證總體積為100μL5.加入等體積充分混勻的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，v/v/v)，來(lái)回混勻1-2分鐘6.14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘7.離心后有三層，取上層到一個(gè)新的0.5mL的管中8.加入100μL的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)來(lái)回混勻1-2分鐘9.14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘10.取上清液11.加入10μL的醋酸鈉(3M，pH4.8)、1.3μL糖原(20μg/μL)，260μL 95％乙醇。迅速以14000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心20分鐘12.小心除去上清13.用100μL 80％的乙醇洗滌沉淀14.干燥約10分鐘去除殘留的乙醇15.加入79μL的無(wú)離子水，懸浮沉淀(四)Sfi I酶切獲得可連接的cDNA1.在一個(gè)0.5mL的離心管中加入，79μL cDNA(經(jīng)蛋白酶K消化)，10μL 10×Sfi I緩沖液，10μL Sfi I內(nèi)切酶(20單位/μL)，1μL 100×牛血清白蛋白充分混勻2.50℃水浴保溫2小時(shí)，取出后放于-20℃冰箱中3.分離時(shí)再加入2μL 1％二甲苯青，充分混勻(五)建庫(kù)用cDNA分離1.準(zhǔn)備16個(gè)1.5mL離心管
2.準(zhǔn)備CHROMA SPIN-400柱(購(gòu)自Clontech Laboratories，Inc.)1)將CHROMA SPIN-400從4℃中取出，在室溫下放置1小時(shí)，顛倒數(shù)次徹底懸浮膠體；2)從柱中除去氣泡，用1000μL的移液器輕輕懸浮膠體，避免產(chǎn)生氣泡。拿走底部的蓋，讓柱體自然流下。(如3分鐘之后不流了，蓋上上面的蓋，會(huì)使柱體繼續(xù)流下)；3)鐵夾夾住柱子；4)貯存緩沖液通過(guò)柱子自然流下，直至能看到柱體中膠的表面，膠的高度應(yīng)在1mL標(biāo)記處。如果少的話，可以用其它柱中的膠來(lái)調(diào)整；5)流速大約為1滴/40-60秒，1滴約為40μL。(如果流速太低，＜1滴/100秒，或者每滴的體積＜25μL必須重新懸浮，重復(fù)上述步驟)3.貯存緩沖液流完后，靠柱內(nèi)邊緣小心加入700μL的柱子緩沖液，直到流光。
4.當(dāng)柱子緩沖液流完后(約15-20分鐘)，小心將約100μL經(jīng)Sfi I酶切的cDNA和二甲苯青的混合物加到膠頂部中心部位的表面，不光滑的膠表面不會(huì)影響下面的分離。
5.進(jìn)行下一步之前，讓樣品充分進(jìn)入膠內(nèi)(在膠表面沒有殘留的液體)。
6.用100μL的柱子緩沖液清洗含有cDNA的管，再輕倒入膠表面。
7.讓緩沖液流光，當(dāng)停止時(shí)，繼續(xù)下一步，讓染料層進(jìn)入膠內(nèi)幾毫米。
8.將放有16個(gè)管子的架子放在柱子下面，第一個(gè)管子正在柱子下的出口。
9.加600μL的柱子緩沖液，立即開始收集，每管35μL(約1滴)，收集后的管子立即加蓋，當(dāng)都收集完后，蓋上柱子的蓋子。
10.在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，檢查每個(gè)管子的組分，在1.1％的瓊脂糖/EB膠上電泳，每管用3μL連續(xù)在點(diǎn)樣孔加樣，用1kb DNA Marker作分子量標(biāo)記，150V電泳10分鐘。收集最亮的3-4個(gè)組分到一個(gè)新1.5mL的管中。
11.將1/10體積醋酸鈉(3M；pH4.8)，1.3μL糖原(20mg/mL)，2.5體積95％乙醇(-20℃)混勻，-20℃過(guò)夜。
12.室溫14000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。
13.小心去上清。
14.輕離心，去剩余的上清，干燥約10分鐘。
15.溶于7μL的無(wú)離子水，輕輕混勻。這些Sfi I酶切的cDNA現(xiàn)在已經(jīng)可以與經(jīng)Sfi I酶切的λTripIEx2載體(購(gòu)自Clontech Laboratories，Inc.)連接。
(六)cDNA與載體連接1.按下列組分準(zhǔn)備一個(gè)連接反應(yīng) 對(duì)照(μL) 樣品(μL)cDNA 0 1.0λTripIEx2載體(500ng/μL) 1.0 1.0
10×連接酶緩沖液 0.5 0.5ATP(10mM) 0.5 0.5T4DNA連接酶(400單位/μL) 0.5 0.5無(wú)離子水 2.5 1.5總體積5.0 5.0其中10×連接酶緩沖液由500mM Tris-鹽酸，pH 7.8，100mM氯化鎂，100mM二硫蘇糖醇，0.5mg/mL牛血清白蛋白組成。
2.輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，瞬間離心使組分沉到底部，16℃連接過(guò)夜3.對(duì)于每一個(gè)連接，做一個(gè)包裝反應(yīng)。
(七)包裝反應(yīng)1.在每一個(gè)連接產(chǎn)物中加入25μL的包裝蛋白。
2.30℃溫育90分鐘。
3.取出放于4℃冰箱中可保存2周。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的文庫(kù)可以在4℃穩(wěn)定保存6-7個(gè)月，或在7％二甲基亞砜中-70℃至少保存1年以上。
(八)測(cè)定滴度1.原始和工作平板的制備為復(fù)蘇冰凍細(xì)胞，取5μL冰凍的大腸桿菌細(xì)胞XL1-Blue在含氨卞青霉素的LB平板(1LLB蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，瓊脂糖15g，pH7.0高壓滅菌20分鐘)上劃板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，作為原始平板，置于4℃可保存2周。從原始平板中挑取單克隆在另一個(gè)含氨卞青霉素的LB/硫酸鎂(1L LB/硫酸鎂含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，10mM硫酸鎂，瓊脂15g，pH 7.0，高壓滅菌20分鐘)平板上涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，作為工作平板。
2.未擴(kuò)增文庫(kù)的滴度測(cè)定從工作平板中挑取分離良好的單克隆接種到含15mL LB/硫酸鎂/麥芽糖培養(yǎng)基(1L含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，10mM硫酸鎂，瓊脂15g，0.2％麥芽糖，pH 7.0，高壓滅菌20分鐘)的50mL試管中，140轉(zhuǎn)/分鐘震蕩37℃培養(yǎng)過(guò)夜直至OD值達(dá)到2.0，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液，用7.5mL 10mM硫酸鎂重新懸浮沉淀。將包裝產(chǎn)物用噬菌體緩沖液稀釋5-20倍，在200μL過(guò)夜培養(yǎng)的XL-1Blue受體菌中加入1μL稀釋的噬菌體，讓噬菌體在37℃吸收10-15分鐘，再加入2mL溶解的LB/硫酸鎂頂層瓊脂?？焖兕嵉够靹虿⒌谷虢?jīng)37℃預(yù)熱的LB/硫酸鎂平板，快速搖動(dòng)平板使均勻分布，室溫冷卻10分鐘讓頂層瓊脂變硬，倒置平板在37℃培養(yǎng)6-17小時(shí)，統(tǒng)計(jì)菌斑并根據(jù)公式文庫(kù)滴度(pfu/mL)＝(噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù))/受體菌的體積，計(jì)算未擴(kuò)增文庫(kù)滴度6.8×105pfu/mL，總克隆數(shù)為3.5×105個(gè)。
(九)文庫(kù)重組率的測(cè)定本文庫(kù)可以利用X-Gal顯色原理測(cè)定重組率，在測(cè)定滴度時(shí)加入100mM的IPTG及100mM的X-Gal，過(guò)夜培養(yǎng)后，通過(guò)藍(lán)斑(未重組克隆)、白斑(重組克隆)的數(shù)量計(jì)算重組率為98.05％。
(十)cDNA插入片段的PCR鑒定從LB平板上隨機(jī)挑取15-20個(gè)獨(dú)立的噬菌斑，分別加到含有200μL噬菌體緩沖液的離心管中，37℃放置1小時(shí)后，保存于4℃，利用λTripEX2噬菌體5’PCR引物(5’-CTCCGAGATCTGGACGAGCT-3’)和3’PCR引物(5’-GGGATATCACTCAG CATAAT-3’)對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體積為20μL，其中的組成為含單克隆噬菌斑的稀釋液2μL，25mM Mg2+1.4μL，10μM dNTPs 0.4μL，10×PCR緩沖液2μL，10μM 5’及3’引物分別0.1μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，去離子水13.9μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4分鐘，95℃變性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)在PCR儀(PTC-225型，MJ Research，Inc.)上進(jìn)行。PCR結(jié)果表明插入片段大多分布在0.5-2.0kb之間，絕大部分在1.0-1.5kb左右。
(十一)cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增、滴度測(cè)定從工作平板中挑取分離良好的XL1-Blue單克隆接種到含15mL的LB/硫酸鎂/麥芽糖培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，37℃140轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)過(guò)夜至OD值達(dá)到2.0。5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清液，用7.5mL10mM硫酸鎂重新懸浮沉淀。在7mL試管中加入500μL細(xì)菌培養(yǎng)液和足夠稀釋過(guò)的溶菌物，在37℃水浴溫育15分鐘，加4.5mL熔化的LB/硫酸鎂軟頂層瓊脂(1L含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，10mM硫酸鎂，瓊脂7.2g，pH 7.0，高壓滅菌20分鐘)，快速混合并傾倒細(xì)菌/噬菌體混合物到LB/硫酸鎂平板上，使瓊脂均勻鋪于平板上。室溫冷卻10分鐘，使頂層瓊脂變硬，倒置平板于37℃培養(yǎng)6-18小時(shí)直至菌落長(zhǎng)至相互接觸。加入12mL 1×Lambda稀釋緩沖液(0.1M氯化鈉，10mM硫酸鎂·7H2O，35mMTris-鹽酸，0.01％明膠)于每個(gè)平板，4℃過(guò)夜，一個(gè)平板可以成為一個(gè)擴(kuò)增文庫(kù)的溶菌物。平板在室溫50轉(zhuǎn)/分鐘震蕩1小時(shí)后倒入一個(gè)已滅菌的廣口瓶。為去除細(xì)胞碎片和裂解剩余的完整細(xì)胞，充分混合噬菌體裂解物并倒入一個(gè)50mL聚丙烯帶蓋的滅菌離心管中，加入10mL氯仿蓋緊蓋子，渦旋2分鐘后，7000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)滅菌的50mL離心管中，4℃保存，并按前述方法測(cè)定擴(kuò)增后文庫(kù)的滴度為7.2×109pfu/mL。
把經(jīng)擴(kuò)增的文庫(kù)分裝成1mL，加入終濃度7％的二甲基亞砜于-70℃可長(zhǎng)期保存，盡量避免多次凍融過(guò)程。
(十二)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的產(chǎn)生在LB固體培養(yǎng)基上加入5μL DH12S菌液，涂板，37℃過(guò)夜。取其單克隆到含有10mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 140轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)至OD值為1.2。取出后加入氯化鎂至終濃度為10mM，混勻，取1μL噬菌體cDNA文庫(kù)與100μL的DH12S菌液混勻，37℃培養(yǎng)15分鐘，然后加入700μL SOC培養(yǎng)基(1L SOC含細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨20g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖，pH 7.0，高壓滅菌20分鐘)37℃搖床培養(yǎng)45分鐘，獲得質(zhì)粒文庫(kù)，取出放于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2，表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序和獲得(一)質(zhì)粒的培養(yǎng)和提取1.將獲得的cDNA質(zhì)粒文庫(kù)稀釋，進(jìn)行梯度試驗(yàn)，選出最佳稀釋濃度。
2.在LB固體培養(yǎng)基(1L LB含蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，瓊脂糖15g，pH7.0，高壓滅菌20分鐘)上涂板。
3.37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)左右，直至長(zhǎng)出菌落。
4.將菌落接種在96孔板上，每孔加入1mL LB(含氨卞青霉素)(1L蛋白胨10g，酵母5g，氯化鈉5g，氨卞青霉素終濃度為50μg/mL)接種單細(xì)菌克隆。37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)左右。
5.保存菌種，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞。
6.加入200μL溶液I(50mM Tris-鹽酸，pH8.0，10mM乙二胺四乙酸，0.1mg/mL RNA酶，4℃)，用膠帶封口，振蕩混勻。
7.加入200μL溶液II(0.2N氫氧化鈉，1％十二烷基硫酸鈉，室溫)，用新膠帶封口，翻轉(zhuǎn)混合10次。此時(shí)裂解液應(yīng)該透明、粘稠，不含細(xì)菌碎片。
8.加入200μL溶液III(3M醋酸鉀，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.5，4℃)，用新膠帶封口，翻轉(zhuǎn)混合10次。
9.沸水浴5分鐘。
10.冰浴10分鐘。
11.4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，上清液全部轉(zhuǎn)入下面的深孔板中。
12.取下深孔板，加入300μL異丙醇溶液，用膠帶封口，立即翻轉(zhuǎn)混合3次。離心15分鐘(4000轉(zhuǎn)/分鐘)，沉淀DNA。
13.去掉上清，加入300μL 70％乙醇，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。
14.用水重新溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)測(cè)序PCR反應(yīng)和序列測(cè)定1.用水稀釋5’測(cè)序引物(5’-CTCCGAGATCT GGACGAGC T-3’)。注意加到每個(gè)反應(yīng)的DNA和引物的體積要依賴于他們的濃度。調(diào)整加入的無(wú)菌水的量，反應(yīng)混合物的終體積是20μL。
2.在96孔板上，將要測(cè)序的每個(gè)模板加入下列試劑DYEnamic ET終止子試劑預(yù)先混合物8μL，引物(5μM)1μL，DNA模板0.2-2μg，使總體積為20μL。
3.將混合物輕輕震蕩充分混合。
4.將96孔板封口并放到預(yù)先設(shè)計(jì)好程序的PCR熱循環(huán)儀上。
5.按照下列條件進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，95℃，20秒，50℃，15秒，60℃，1分鐘，共32個(gè)循環(huán)。
6.循環(huán)完成后，簡(jiǎn)單離心收集管子底部的溶液。
7.每個(gè)反應(yīng)管中加1μL 7.5M乙酸銨，27.5μL無(wú)水乙醇，5μL去離子水。
8.4000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘。
9.除掉上清液。
10.每個(gè)反應(yīng)管中加50μL 70％的乙醇，并混合好。
11.4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘。
12.除去上清夜，真空干燥或空氣干燥沉淀。不要過(guò)分干燥。
13.將沉淀重新懸浮在5μL的點(diǎn)樣溶液中，用力震蕩10-20秒，確保完全懸浮，簡(jiǎn)單離心收集樣品。
14.將樣品放入DNA測(cè)序儀(型號(hào)為MegabaceTM1000，Amershan Pharmacia Biotech Inc.)中進(jìn)行測(cè)序。
(三)表達(dá)序列標(biāo)簽的獲得1.將序列測(cè)定結(jié)果輸出。
2.剔除載體序列和冗余序列獲得表達(dá)序列標(biāo)簽的序列。
3.用非冗余序列對(duì)公共表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，按功能將其分類。
4.表達(dá)序列標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的克隆進(jìn)行保存、備用。
實(shí)施例3，生物芯片的制備一、對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增茶樹cDNA質(zhì)粒插入片段PCR擴(kuò)增，反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行(PTC-225型，MJ Research，Inc.)，引物為M13通用引物(正向?yàn)?’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’，反向?yàn)?’-AGCGGATAATTT CACACAGG-3’)，每100μL的反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液10μL；25mM氯化鎂7μL；100ng/μL的正反向引物各1μL，20mM dNTPs 1μL，3單位的Taq DNA聚合酶(購(gòu)自Promega Corporation)和15ng的質(zhì)粒模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4分鐘，每個(gè)循環(huán)于94℃變性30秒，58℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；共36-40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
二、PCR產(chǎn)物處理加入100μL異丙醇和10μL 3M的醋酸鈉(pH 5.2)于-20℃沉淀8小時(shí)，4000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心40分鐘，棄上清，沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥后溶解于20μL DNA變性液(0.4M氫氧化鈉，10mM乙二胺四乙酸)。
三、芯片制備變性液溶解后的表達(dá)序列標(biāo)簽用于茶樹特異表達(dá)序列標(biāo)簽芯片的點(diǎn)制，芯片由芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制，芯片的載體為玻片，所有的點(diǎn)點(diǎn)制為36×24一級(jí)陣，每一個(gè)點(diǎn)在8個(gè)基因構(gòu)成的4×4的二級(jí)陣中平行兩次以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性。
實(shí)施例4，茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)一、茶樹總RNA的提取和mRNA純化取待分析的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段或不同器官的茶樹幼嫩材料100-500mg(材料多少視RNA含量而定)，采用實(shí)施例1，“cDNA文庫(kù)的構(gòu)建”中的“RNA的提取”、“mRNA的分離和純化”所描述的流程、方法提取總RNA，分離和純化mRNA用于以下的步驟。
二、甲醛凝膠變性電泳1.配制5×甲醛凝膠電泳緩沖液0.1M 3-(N-瑪林代)丙磺酸(pH 7.0)，40mM醋酸鈉，5mM乙二胺四乙酸(pH 8.0)。
2.凝膠制備將適量的瓊脂糖熔于水，冷卻至60℃，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液至終濃度為1×和2.2M。在通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，在室溫放置30分鐘以上，使凝膠凝固。
3.在一滅菌的離心管中混合下列液體，以制備樣品總RNA或mRNA 4.5μL，5×甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μL，甲醛3.5μL，甲酰胺10μL于65℃溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒使管內(nèi)液體集中于管底。
4.加2μL滅菌并經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的甲醛凝膠加樣緩沖液(50％甘油，1mM乙二胺四乙酸，pH 8.0，0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF)。
5.加樣前將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓為5V/cm，隨后將樣品加至凝膠樣孔。以已知大小的RNA混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。
6.將凝膠浸入1×甲醛凝膠加樣緩沖液中，3-4V/cm電壓降進(jìn)行電泳。
7.電泳結(jié)束后，溴化乙錠染色，在紫外燈下照相(分子量標(biāo)記旁放一把透明直尺以距離計(jì)算RNA分子的大小)后將RNA轉(zhuǎn)移至膜上。
三、轉(zhuǎn)膜1.將凝膠移至一個(gè)玻璃干烤皿內(nèi)，用鋒利刀片修去凝膠的無(wú)用部分，并在其右上角(加樣孔一端為上)切去凝膠一小角作為以下操作的記號(hào)。
2.用長(zhǎng)和寬均大于凝膠的一塊有機(jī)玻璃作為平臺(tái)，將其放入大干烤皿內(nèi)，上面放一張濾紙作為紙橋，倒入20×SSC使液面略低于平臺(tái)，當(dāng)平臺(tái)上的濾紙濕透后，用玻璃棒趕出所有的氣泡。
3.用一把鋒利的裁紙刀裁一張硝酸纖維素膜或者尼龍膜，其長(zhǎng)度和寬度應(yīng)各比凝膠大2mm，并切去一角使之與凝膠對(duì)應(yīng)。
4、將濾膜浸入去離子水表面，直至濕透為止，隨后用20×SSC浸泡濾膜至少5分鐘。
5.將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺(tái)上濕潤(rùn)的濾紙中央，兩者之間不留任何氣泡。
6.用雙層保鮮膜包裹凝膠四周。
7.在凝膠上方放置濕潤(rùn)的濾膜，并使兩者的切角重疊。
8.用2×SSC溶液浸濕2張與凝膠同樣大小的濾紙，并放置在濾膜上方，趕出所有氣泡。
9.切一疊與濾紙同樣大小的紙巾，放于濾紙上方，并在紙巾上方壓一塊玻璃板，然后用約500g重物壓實(shí)。目的是建立自液池經(jīng)凝膠流向?yàn)V膜的上行流路，使RNA在毛細(xì)管的作用下從凝膠流向并聚集在濾膜上。
10.使上述RNA轉(zhuǎn)膜12-18小時(shí)，當(dāng)中更換濕紙巾一次。
11.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和濾紙，從凝膠上剝離濾膜。以5×SSC溶液浸泡濾膜5分鐘，于室溫干燥30分鐘以上。
12.將晾干的濾膜放在兩張濾紙之間，在80℃烤箱中干烤2-3小時(shí)。
四、探針的制備采用實(shí)施例3，“生物芯片的制備”中“對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增”所描述的方法和流程，對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得15ng/μL的PCR產(chǎn)物作探針，用生物素標(biāo)記法制備探針。
1.加入純化的特異表達(dá)序列標(biāo)簽PCR產(chǎn)物1μg和滅菌的雙蒸水至16μL。
2.沸水浴變性10分鐘后迅速冰上冷卻。
3.充分混合地高辛引物，加入4μL變性的表達(dá)序列標(biāo)簽，瞬時(shí)離心，37℃溫育1小時(shí)或過(guò)夜，時(shí)間越長(zhǎng)，獲得地高辛標(biāo)記探針的產(chǎn)量越高。
4.加入2μL 0.2M乙二胺四乙酸(pH 8.0)或65℃加熱10分鐘停止反應(yīng)。
五、預(yù)雜交、雜交和放射自顯影1.在含50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt試劑，0.1％十二烷基硫酸鈉溶液中預(yù)雜交1-2個(gè)小時(shí)。
2.在預(yù)雜交液中加入變性的已標(biāo)記的探針，在適宜溫度下繼續(xù)溫育12-24小時(shí)。
3.用1×SSC，0.1％十二烷基硫酸鈉于室溫洗膜20分鐘，隨后用0.2×SSC、0.1％十二烷基硫酸鈉洗膜3次，每次20分鐘。
4、用醫(yī)用X光片進(jìn)行放射自顯影，可于室溫曝光4-10分鐘。
六、基因表達(dá)的分析檢測(cè)觀察X光片，進(jìn)行茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)分析檢測(cè)，通過(guò)定性、定量比較雜交圖譜，可以明確基因是否表達(dá)、表達(dá)的活性是上調(diào)還是下調(diào)。
實(shí)施例5，茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因的克隆一、總RNA的提取和mRNA的分離采用實(shí)施例1，“cDNA文庫(kù)的構(gòu)建”中的“RNA的提取”、“mRNA的分離和純化”所描述的流程、方法提取總RNA，分離和純化mRNA用于以下的步驟。
二、5’或3’cDNA的合成1.在0.5mL滅菌離心管中混合(1)進(jìn)行5′cDNA合成1-3μL RNA樣品，1μL 5′引物[5′-(T)25V N-3′(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)]，1μL Oligo(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCG GG-3′)，(2)進(jìn)行3′cDNA合成1-3μL RNA樣品，1μL 3′引物A(5′-AAGCAGTGGTA TCAACGCAGAG TAC(T)30VN-3′，(N＝A，C，G，or T；V＝A，G或C)2.加入滅菌水至每個(gè)反應(yīng)的總體積為5μL3.混合樣品并瞬間離心4.離心管在70℃溫育2分鐘5.冰上冷卻2分鐘6.瞬間離心收集樣品到管底7.加入下列成分到每個(gè)離心管(已含5μL)2μL 5×第1鏈合成緩沖液(250mM Tris-鹽酸(pH8.3)，375mM KCl，30mM MgCl2)，1μL二六硫蘇糖醇(20mM)，1μL dNTP混合物(10mM)，1μL逆轉(zhuǎn)錄酶，總體積為10μL8.用移液器輕輕混合反應(yīng)成分9.瞬間離心收集成分到管底10.在42℃有熱蓋的PCR儀保溫1.5小時(shí)11.用Tricine-乙二胺四乙酸緩沖液稀釋第一鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物從＜200ng總RNA開始加20μL，從＞200ng總RNA開始加100μL，從mRNA開始加250μL12.在72℃C加熱離心管7分鐘13.樣品能在-20℃保存3個(gè)月三、對(duì)照PCR反應(yīng)1.按每管50-μL PCR反應(yīng)體積混合下列試劑34.5μL PCR-級(jí)水，5μL 10×PCR緩沖液，1μLdNTP混合物(10mM)，1μL 50×聚合酶混合物，總體積41.5μL2.渦旋混勻并瞬間離心3.按下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)，順序加入各成分到PCR管中，輕輕混勻

*10×通用引物混合物長(zhǎng)引物(0.4μM)5′-CTAATACGACTCACTATA GGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，短引物(2μM)，5′-CTAA TACGACTCACTATAGGGC-3′4.在PCR管中加入2滴礦物油，蓋緊蓋子。如果用有熱蓋的PCR儀，可以不加礦物油。
5.采用如下的程序，進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR，94℃ 30秒，72℃ 3分鐘，5個(gè)循環(huán)，94℃ 30秒，70℃30秒，72℃ 3分鐘，5個(gè)循環(huán)，94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分鐘，27個(gè)循環(huán)6.取5μL在1.2％瓊脂糖/溴化乙錠電泳分析，直到對(duì)照試驗(yàn)?zāi)芄ぷ鳌?br> 四、cDNA末端快速PCR擴(kuò)增1.按每管50-μL PCR反應(yīng)體積混合下列試劑34.5μL PCR-級(jí)水，5μL 10×PCR緩沖液，1μLdNTP混合物(10mM)，1μL 50×聚合酶混合物，總體積41.5μL2.渦旋充分混勻(避免產(chǎn)生氣泡)，瞬間離心3.進(jìn)行5′-PCR擴(kuò)增時(shí)，按下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)，順序加入各成分到PCR管中，輕輕混勻5′cDNA2.5μL，10×通用引物混合物5μL，§基因特異引物1(10μM)1μL，PCR混合物41.5μL，總體積為50μL。
§末端快速擴(kuò)增PCR必須根據(jù)已知的表達(dá)序列標(biāo)簽合成2個(gè)基因特異引物，5’PCR需要一個(gè)反義引物，3’PCR需要一個(gè)正義引物，它們必須滿足下列條件23-28bp，50-70％GC含量，Tm≥65℃可獲得最佳結(jié)果，如果Tm＞70℃可采用熱啟動(dòng)PCR。
4.進(jìn)行3′-PCR時(shí)，按下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)，順序加入各成分到PCR管中，輕輕混勻3′cDNA 2.5μL，10×通用引物混合物5μL，基因特異引物2(10μM)1μL，PCR混合物41.5μL，總體積達(dá)到50μL。
5.在PCR管中加2滴礦物油，蓋緊蓋子。如果用有熱蓋的PCR儀，可以不加礦物油。
6.根據(jù)最初從總RNA或mRNA開始，正確選擇如下程序的一個(gè)，進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR。
程序1(如果基因特異引物Tm＞70℃)，94℃ 30秒，72℃ 3分鐘，5個(gè)循環(huán)，94℃ 30秒，70℃ 30秒，72℃ 3分鐘，5個(gè)循環(huán)，94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分鐘，20個(gè)循環(huán)(如果用mRNA)或25個(gè)循環(huán)(如果用總RNA)程序2(如果基因特異引物Tm＝60-70℃)94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分鐘，20個(gè)循環(huán)(如果用mRNA)或25個(gè)循環(huán)(如果用總RNA)七、PCR產(chǎn)物的特性鑒定(一)Southern雜交1.先進(jìn)行1.2％瓊脂糖/溴化乙錠電泳，紫外燈下拍照。
2.按照實(shí)施例4，“茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)”的“轉(zhuǎn)膜”程序把DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。
3.可采用末端標(biāo)記的巢式基因特異引物1或2為探針。另外，如果合成的基因特異引物具有5’和3’重疊區(qū)，基因特異引物2可作為鑒定5′-PCR的探針，基因特異引物1可作為鑒定3′-PCR的探針。
4.預(yù)雜交、雜交，并在中等嚴(yán)謹(jǐn)度下洗膜，放射自顯影。
(1)把含有靶DNA的濾膜漂浮于一盤6×SSC液面上，上下濕潤(rùn)后在液體內(nèi)浸泡2分鐘。(2)將濾膜裝入塑料袋中，按0.2mL/cm2濾膜加入預(yù)雜交液(6×SSC，0.05×Blotto，50％甲酰胺)，擠出袋內(nèi)的空氣，在42℃水浴中溫育1-2小時(shí)。(3)100℃加熱5分鐘使探針變性，迅速在冰水浴中使探針驟冷。(4)快速?gòu)乃≈腥〕鲭s交袋，剪去袋的一角，向預(yù)雜交液中加入已變性的探針，盡量去除袋中的空氣，重新封口。(5)將雜交袋放入42℃水浴中，雜交2-3小時(shí)。(6)取出雜交袋迅速剪去一角，將雜交液倒入安全容器內(nèi)，沿3邊剪開袋子，將濾膜取出放到一個(gè)盛有足夠的2×SSC和0.5％十二烷基硫酸鈉塑料盒中，室溫浸泡。(7)5分鐘后濾膜轉(zhuǎn)移至另一個(gè)2×SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉的塑料盒中，于室溫輕搖浸泡15分鐘。(8)濾膜轉(zhuǎn)移至另一個(gè)0.1×SSC和0.5％十二烷基硫酸鈉的塑料盒中，于37℃輕搖浸泡1小時(shí)。(9)將溶液換為新配的0.1×SSC和0.5％十二烷基硫酸鈉，并把塑料盒轉(zhuǎn)移至68℃溫育1小時(shí)。(10)用0.1×SSC于室溫暫短漂洗濾膜，用紙吸去大部分液體。(11)包裝膜包被濾膜，將濾膜對(duì)X光片爆光24-72小時(shí)以獲得放射自顯影影象。
5.比較雜交帶型與瓊脂糖凝膠照片。
6.當(dāng)獲得與預(yù)期大小一致的條帶后，從凝膠中回收DNA，繼續(xù)下面的試驗(yàn)。
(二)PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序1.糖凝膠中回收可能的目的條帶(1)加入3-4倍體積的10M碘化鈉。(2)50℃溶解凝膠。(3)加入40％的氧化硅。(4)混勻，37℃水浴保溫5分鐘。(5)離心，加入2倍體積的清洗緩沖液(50％酒精，0.1M氯化鈉，0.1M Tris-鹽酸，pH 7.5)。(6)離心，去上清。(7)室溫干燥3分鐘。(8)加入10μL滅菌的雙蒸水。(9)離心，把上清液轉(zhuǎn)移至新離心管，即可將回收片段克隆到載體上。
2.回收條帶克隆到T/A類型或T類型載體上(可從Promega Corporation和Invitrogen Corporation購(gòu)買)。
(1)瞬時(shí)離心T載體和對(duì)照插入DNA管子，使組分集中于管底。(2)按下表設(shè)置回收DNA與T載體的連接反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)連接陽(yáng)性對(duì)照 背景對(duì)照T載體(50ng) 1μL1μL 1μL回收的DNA 3-5μL - -對(duì)照插入DNA - 1μL -5×T4DNA連接酶緩沖液 2μL2μL 2μLT4DNA連接酶(3單位/μL) 1μL1μL 1μL去離子水至總體積 10μL 10μL 10μL(3)移液器混勻，瞬間離心。室溫連接1小時(shí)或4℃連接過(guò)夜。(4)轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物混合5μL連接產(chǎn)物與50μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；于冰上放置30分鐘；42℃熱激2分鐘后立即于冰上放置2分鐘；加入600μL 2×YT(1L含蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，pH 7.0，高壓面菌20分鐘)肉湯培養(yǎng)基；37℃搖動(dòng)培養(yǎng)1小時(shí)；加入100μL X-Gal(30mg/mL)，10μLIPTG(30mg/mL)；分別取10μL、50μL、100μL、200μL在含氨卞青霉素的LB平板上涂板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑取3-5個(gè)白色單克隆在含氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒；(5)以T載體的通用引物，采用“實(shí)施例2，表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序和獲得”類似的方法測(cè)定插入的目的DNA片段序列。
3.采用32P標(biāo)記的巢式基因特異引物為探針雜交或者用基因特異引物為測(cè)序引物測(cè)定8-10個(gè)克隆的序列，鑒別出含特定基因插入的陽(yáng)性克隆。
(八)全長(zhǎng)基因的獲得當(dāng)PCR產(chǎn)物被部分或全部測(cè)序所鑒定后，可以用下列方法的獲得全長(zhǎng)基因1.以5′cDNA為模板，用表達(dá)序列標(biāo)簽5’或3’設(shè)計(jì)的引物，采用長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增獲得基因全長(zhǎng)。
2.用基因重疊區(qū)的限制性酶切位點(diǎn)，克隆5’或3’的重疊區(qū)，再獲得基因全長(zhǎng)。
表達(dá)序列標(biāo)簽的序列表SEQ ID No.1的信息(a)序列特征長(zhǎng)度654個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來(lái)源茶樹(d)序列描述SEQ ID No.1GGGGAGAACTTCAGATAGAGAAGGAAGATCTGACTCCGAAAAAACTCTCTCTTCTTCTTTCTGTACACCACAAATTTTCTCGCGATCCAAACACGTTTCGCTCGCTGAGAAAATCCAATCGAATCCAAAAGATGTCTTCGACATTCAGCGGTGATGAAACTGCTCCTTTCTTCGGCTTCCTCGGGGCCGCTGCTGCCCTCGTCTTCTCCTGTATGGGAGCTGCGTATGGGACAGCGAAGAGTGGTGTTGGAGTGGCGTCGATGGGTGTGATGAGGCCAGAACTGGTGATGAA
GTCGATCGTTCCTGTGTTATGGCTGGAGTGTTAGGTATTTATGGATTGATCATTGCTGTTATCATCAGCACTGGTATTAACCCTAAGGCCAAGTCCTATTACCTGTTGATGGTTATGCTCATCTTTCCTCTGGTCTCGCTTGTGGCCTCGCTGGCCTCTCTGCTGGAATGGCGATGGGGTCGTCGGGGATGCCGGTGTTAGAGCTAATGCACAGCAGCCAAAACTTTTGTTGGAATGATCCTCATTCTCATCTTTGCTGAAGCCTGGCCCTGTATGGTCTGATTGTGGCATCATATGTCTTCTCGAGCTGGTCAATCCAGAGCAGACTGAGAAGATGGTTTCTTAACCCAAAAAAAAAAAAA
權(quán)利要求
1.一種分離出的茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1所示的序列；所示序列的互補(bǔ)序列或同源序列；所示序列中8～100個(gè)連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離出的茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于，它的制備方法為1)茶樹總RNA提?。?)mRNA分離與純化；3)采用PCR法合成cDNA第一鏈和第二鏈；4)cDNA酶切、純化，并與載體連接；5)產(chǎn)生噬菌體文庫(kù)與質(zhì)粒cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化；6)重組質(zhì)粒的培養(yǎng)和提??；7)表達(dá)序列標(biāo)簽序列的測(cè)定；8)剔除載體序列、冗余序列，互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索、分類，獲得SEQ ID No.1表達(dá)序列標(biāo)簽序列。
3.一種由權(quán)利要求1所述表達(dá)序列標(biāo)簽所組成的生物芯片，其特征在于在載體上結(jié)合有SEQ ID No.1所示的序列、同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子；所說(shuō)的核酸分子是脫氧核糖核酸；核糖核酸和多聚寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于，所說(shuō)的芯片制備方法為1)對(duì)SEQ ID No.1表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新PCR擴(kuò)增；2)PCR產(chǎn)物純化處理后用于芯片制作；3)芯片由芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說(shuō)的載體為固相載體或液相載體；
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說(shuō)的固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜、凝膠。
7.一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)，其特征在于利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1所示的序列、互補(bǔ)序列或同源序列、序列中的8～100個(gè)連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)序列作為基因表達(dá)分析檢測(cè)的探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)，其特征在于所說(shuō)的茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因表達(dá)的分析檢測(cè)方法，它的步驟為1)靶基因組織總RNA或mRNA的提?。?)甲醛凝膠變性電泳分離RNA；3)將變性電泳后的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜；4)利用SEQ ID No.1所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列、8-100個(gè)核苷酸序列為探針，采用生物素法制備探針；5)探針與靶基因雜交、放射自顯影，通過(guò)定性、定量比較雜交圖譜，可以明確特定組織液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因是否表達(dá)、表達(dá)的活性是上調(diào)還是下調(diào)。
9.一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因全長(zhǎng)的克隆.其特征在于利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1所示的序列、互補(bǔ)序列或同源序列、序列中的30～100個(gè)連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列來(lái)合成聚合酶鏈反應(yīng)的基因特異引物、擴(kuò)增待克隆基因全長(zhǎng)的5’或3’引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因的克隆，其特征在于所說(shuō)的茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因的克隆方法，它的步驟為1)總RNA的提取和mRNA的分離；2)PCR法合成5’或3’cDNA；3)利用表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQ ID No.1所示的序列、同源序列、互補(bǔ)序列或30～100個(gè)連續(xù)核苷酸來(lái)合成液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶基因特異引物，PCR快速擴(kuò)增末端cDNA；4)Southern雜交或克隆測(cè)序鑒定PCR產(chǎn)物的特性；5)當(dāng)PCR產(chǎn)物被部分或全部測(cè)序所鑒定后，以5′cDNA為模板，用表達(dá)序列標(biāo)簽5’或3’設(shè)計(jì)的引物，采用長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增獲得基因全長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶表達(dá)序列標(biāo)簽及其生物芯片。表達(dá)序列標(biāo)簽具有SEQID No.1所示的序列；所示序列的互補(bǔ)序列或同源序列；所示序列中8～100個(gè)連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。運(yùn)用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)對(duì)構(gòu)建的茶樹互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)文庫(kù)進(jìn)行脫氧核糖核酸序列測(cè)定，獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽通過(guò)剔除冗余序列、互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索、分類，獲得了一條茶樹液泡致電的質(zhì)子泵三磷酸腺苷酶的表達(dá)序列標(biāo)簽，本發(fā)明可應(yīng)用于作物種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、作物雜種優(yōu)勢(shì)的早期預(yù)測(cè)、作物育種和新品種的產(chǎn)生與鑒定、植物抗逆性的研究、植物單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢定、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的安全性檢測(cè)、新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選等。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1552898SQ20031010952
公開日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者陳亮, 趙麗萍, 高其康, 陳 亮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所