專利名稱：一種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定性同位素標(biāo)記化合物生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及微生物發(fā)酵和生物提取方法。
背景技術(shù)：
對(duì)L-谷氨酰胺的生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外有一些研究小組對(duì)其作了許多研究工作(微生物學(xué)通報(bào)，4(5)211～212(1984)；16(2)73～76(1989)；發(fā)酵科技通訊，19(2)16～18(1990)；食品與發(fā)酵工業(yè)，221～25(1992)；工業(yè)微生物，21(5)11～17(1988)；微生物學(xué)雜志，6(3)35～37(1986)；Agri.Biol.Chem.，51(8)2089～2094(1987)；中國(guó)專利公報(bào)CN1225946A；日本特許公報(bào)昭62-18679；昭63-21379等)。但是，關(guān)于生物合成法研究15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)領(lǐng)域中還不見(jiàn)專利和文獻(xiàn)報(bào)道。采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)，目標(biāo)氨基酸大量富集，15N穩(wěn)定性同位素容易標(biāo)記，但由于發(fā)酵配方中有機(jī)氮源很難標(biāo)記，常常使L-谷氨酰胺-15N的豐度下降很多達(dá)不到產(chǎn)品要求，所以需要對(duì)常規(guī)發(fā)酵配方進(jìn)行改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種旨在解決15N豐度下降的問(wèn)題，并盡量提高15N利用率的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟(1)發(fā)酵菌株的選擇用于L-谷氨酰胺生產(chǎn)的黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)之一；(2)保藏斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種于斜面，29～37℃恒溫培養(yǎng)8～20小時(shí)，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制備將步驟(2)得到的保藏斜面接種于活化斜面，培養(yǎng)方法同步驟(2)；(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機(jī)氮源。主要配方如下表所示說(shuō)明碳源 葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL無(wú)機(jī)氮源 氯化銨3～5g/dL或硫酸銨4～8g/dL有機(jī)氮源 玉米漿、菌體水解液等0～0.5mL/dLK2HPO4.3H2O 0.1～0.4g/dLMgSO4.7H2O0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O 2～20mg/LFeSO4.7H2O2～20mg/LZnSO40.5～10mg/LVH 0～10μg/LVB1 50～500μg/LVB6 50～500μg/L泛酸 50～500μg/L尼克酸 50～500μg/L對(duì)氨基安息香酸 50～300μg/LCaCO32～6g/dL，分消(5)發(fā)酵工藝將步驟(3)培養(yǎng)好的活化斜面菌苔用少量培養(yǎng)基洗下后接種于已滅菌的裝有步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶(500mL三角瓶裝量20～50mL)或發(fā)酵罐(裝液量為罐體積的40～60％)中開(kāi)始發(fā)酵，搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵初始溫度30～39℃，初始pH6.4～6.8，搖床轉(zhuǎn)速180～220r/min，發(fā)酵中后期(18～32小時(shí))提高轉(zhuǎn)速至240～280r/min，發(fā)酵時(shí)間60～96小時(shí)；發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～39℃，初始pH6.4～6.8，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％飽和度，通過(guò)聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；在發(fā)酵中后期(18～32小時(shí))，提高轉(zhuǎn)速和通氣量保證溶解氧在30～50％飽和度；發(fā)酵全過(guò)程控制pH在微酸性(添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)pH6.4左右)，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2～5g/dL，發(fā)酵時(shí)間48～72小時(shí)；(6)分離提取將步驟(5)培養(yǎng)好的發(fā)酵液，通過(guò)發(fā)酵液預(yù)處理(添加草酸除去金屬離子，添加聚丙烯酰胺等絮凝劑、加熱除去蛋白，離心除菌體)得到的上清液采用離子交換法等分部提取得到15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺溶液，通過(guò)真空濃縮趕氨并采用活性炭脫色、乙醇低溫結(jié)晶、真空干燥得到產(chǎn)品。
步驟(1)中所述的黃色短桿菌是指黃色短桿菌(Brevobacterium flavum)ATCC14067、AS1.495、AS1.582和它們的突變株之一，谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13286、ATCC14751、ATCC13032、AS1.805、ACCC11063、IFFI10056、IFFI10052和它們的突變株之一，北京棒桿菌是指北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)AS1.299和其突變株之一，鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)AS1.452和其突變株之一。
步驟(4)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，玉米漿、菌體水解液等有機(jī)氮源添加極少量(0～0.5mL/dL，使用的有機(jī)氮源中氨基氮濃度5～20g/dL)以使其對(duì)15N豐度的影響降低到最低限度；通過(guò)直接添加VH、VB1、VB6、泛酸、尼克酸、對(duì)氨基安息香酸等維生素復(fù)合物，來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)，減少有機(jī)氮源的缺乏對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，同時(shí)強(qiáng)化L-谷氨酰胺代謝流。
步驟(5)中所述的溶解氧的控制通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓實(shí)現(xiàn)。
步驟(5)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)中后期通過(guò)提高轉(zhuǎn)速或通風(fēng)，促進(jìn)L-谷氨酰胺的生成。
步驟(5)中所述的發(fā)酵搖瓶通過(guò)添加CaCO3控制pH在微酸性，發(fā)酵罐上通過(guò)流加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨來(lái)控制pH在微酸性。
步驟(5)中所述的發(fā)酵罐發(fā)酵，通過(guò)流加50g/dL葡萄糖溶液控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度2～5g/dL。
本發(fā)明采用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-谷氨酰胺-15N2，通過(guò)添加微量維生素復(fù)合物改善生長(zhǎng)和代謝，旨在解決15N豐度下降的問(wèn)題，并盡量提高15N利用率，以滿足產(chǎn)品生產(chǎn)要求。
本發(fā)明通過(guò)改變發(fā)酵配方和工藝，直接添加VH、VB1、VB6、泛酸、尼克酸、對(duì)氨基安息香酸等維生素復(fù)合物，本發(fā)明獲得的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺產(chǎn)量比采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酸量相應(yīng)提高10～50％以上，而15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺15N豐度下降可以減少到1％以下，有的甚至幾乎不下降，大大提高了15N原料利用率，減少了生產(chǎn)成本。同時(shí)，在保證產(chǎn)品15N豐度條件下，簡(jiǎn)化發(fā)酵和提取工藝，由于原料得到充分利用大大節(jié)省了原料回收成本。本發(fā)明可利用低豐度和高豐度15N無(wú)機(jī)原料滿足不同豐度產(chǎn)品要求。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1使用菌種為以黃色短桿菌ATCC14067為出發(fā)菌誘變選育獲得的突變株8A31，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的發(fā)酵初始配方如下表所示發(fā)酵配方葡萄糖 12g/dL硫酸銨(15N豐度98.9％) 6g/dL玉米漿 0.1mL/dLK2HPO4.3H2O 0.25g/dLMgSO4.7H2O 0.05g/dL
MnSO4.H2O 10mg/LFeSO4.7H2O 10mg/LZnSO4.7H2O 1mg/LVH 3.5μg/LVB1400μg/LVB6400μg/L泛酸 400μg/L尼克酸 400μg/L對(duì)氨基安息香酸 200μg/LCaCO34g/dL(分消)將黃色短桿菌8A31從保藏斜面接種于活化斜面，31℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用少許發(fā)酵培養(yǎng)液洗下2支斜面菌苔轉(zhuǎn)入上述發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL三角瓶裝量20mL，共接10瓶)，然后加入分消CaCO3，31℃、200rpm于巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)32小時(shí)左右時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速240rpm，直到發(fā)酵終了，發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)結(jié)束，發(fā)酵平均產(chǎn)L-谷氨酰胺-15N2可達(dá)28g/L。
發(fā)酵液采用711陰離子交換樹(shù)脂單株分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-谷氨酰胺-15N2產(chǎn)品，經(jīng)質(zhì)譜分析得到產(chǎn)品豐度98.28％，豐度下降0.627％。
如果將發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿改為0.6，發(fā)酵工藝不變，發(fā)酵平均產(chǎn)L-谷氨酰胺-15N2可達(dá)36g/L，但豐度只有95.34％，豐度下降3.6％。如果發(fā)酵培養(yǎng)基中不加玉米漿，發(fā)酵平均產(chǎn)L-谷氨酰胺-15N2只有18g/L，豐度98.71％，豐度下降0.192％。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中如果不添加泛酸、尼克酸、VB6、對(duì)氨基安息香酸等維生素復(fù)合物，發(fā)酵平均產(chǎn)L-谷氨酰胺-15N2只有22g/L。綜合考慮，此發(fā)明效果顯著。
實(shí)施例2使用菌種為以谷氨酸棒桿菌S9114為出發(fā)菌誘變選育獲得的突變株SB274，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的發(fā)酵初始配方如下表所示
發(fā)酵配方葡萄糖 14g/dL氯化銨，15N豐度98.7％ 4g/dL玉米漿 0.1mL/dLK2HPO4.3H2O 0.2g/dLMgSO4.7H2O0.05g/dLMnSO4.H2O 2mg/LFeSO4.7H2O2mg/LZnSO4.7H2O1mg/LVH 3.5μg/LVB1 400μg/LVB6 200μg/L泛酸 400μg/L尼克酸 400μg/L對(duì)氨基安息香酸 200μg/LCaCO35g/dL，分消將谷氨酸棒桿菌SB274從保藏斜面接種于活化斜面，31℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用少許發(fā)酵培養(yǎng)液洗下2支斜面菌苔轉(zhuǎn)入裝量20mL上述發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后加入分消CaCO3，31℃、220rpm于巡回式搖床上發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)左右時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速260rpm，直到發(fā)酵終了，發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)結(jié)束，發(fā)酵平均產(chǎn)L-谷氨酰胺-15N2可達(dá)26g/L。
發(fā)酵液采用711陰離子交換樹(shù)脂單株分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-谷氨酰胺-15N2產(chǎn)品，經(jīng)質(zhì)譜分析得到產(chǎn)品豐度98.19％，豐度下降0.517％。
實(shí)施例3使用菌種為以北京棒桿菌AS1.299為出發(fā)菌誘變選育獲得的突變株AGM409，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的發(fā)酵初始配方如下表所示發(fā)酵初始配方葡萄糖 6g/dL氯化銨，5N豐度99.2％4g/dL玉米漿 0.1mL/dLK2HPO4.3H2O 0.25g/dLMgSO4.7H2O0.06g/dLMnSO4.H2O 10mg/LFeSO4.7H2O10mg/LZnSO4.7H2O1mg/LVH 5μg/LVB1 200μg/LVB6 400μg/L泛酸 400μg/L尼克酸 400μg/L對(duì)氨基安息香酸 200μg/L將北京棒桿菌AGM409從保藏斜面接種于活化斜面，31℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用少許發(fā)酵培養(yǎng)液洗下10支斜面菌苔轉(zhuǎn)入裝量2L上述發(fā)酵培養(yǎng)基的3.7L發(fā)酵罐中，發(fā)酵初始溫度31℃，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，通氣量1VVM，罐壓0.04Mpa，通過(guò)聚醚類或硅酮類消泡劑消泡，通過(guò)流加15N標(biāo)記氨水控制pH6.8；在發(fā)酵24小時(shí)后，提高轉(zhuǎn)速和通氣量保證溶解氧在20～40％飽和度，通過(guò)流加15N標(biāo)記氨水控制pH6.5，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2～5g/dL，發(fā)酵時(shí)間68小時(shí)，發(fā)酵平均產(chǎn)L-谷氨酰胺-15N2可達(dá)30g/L。
發(fā)酵液采用711陰離子交換樹(shù)脂單柱分離，采用常規(guī)方法得到干燥固體L-谷氨酰胺-15N2產(chǎn)品，經(jīng)質(zhì)譜分析得到產(chǎn)品豐度98.88％，豐度下降0.323％。
權(quán)利要求
1.一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟(1)發(fā)酵菌株的選擇用于L-谷氨酰胺生產(chǎn)的黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)之一；(2)保藏斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種于斜面，29～37℃恒溫培養(yǎng)8～20小時(shí)，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制備將步驟(2)得到的保藏斜面接種于活化斜面，培養(yǎng)方法同步驟(2)；(4)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制以全合成培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加少量有機(jī)氮源。主要配方如下表所示說(shuō)明碳源葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL無(wú)機(jī)氮源氯化銨3～5g/dL或硫酸銨4～8g/dL有機(jī)氮源玉米漿、菌體水解液0～0.5mL/dLK2HPO4.3H2O 0.1～0.4g/dLMgSO4.7H2O 0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O2～20mg/LFeSO4.7H2O 2～20mg/LZnSO40.5～10mg/LVH 0～10μg/LVB1 50～500μg/LVB6 50～500μg/L泛酸50～500μg/L尼克酸 50～500μg/L對(duì)氨基安息香酸 50～300μg/LCaCO32～6g/dL，分消(5)發(fā)酵工藝將步驟(3)培養(yǎng)好的活化斜面菌苔用少量培養(yǎng)基洗下后接種于已滅菌的裝有步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中開(kāi)始發(fā)酵，搖床發(fā)酵控制條件為發(fā)酵初始溫度30～39℃，初始pH6.4～6.8，搖床轉(zhuǎn)速180～220r/min，發(fā)酵中后期提高轉(zhuǎn)速至240～280r/min，發(fā)酵時(shí)間60～96小時(shí)；發(fā)酵罐控制條件為發(fā)酵初始溫度30～39℃，初始pH6.4～6.8，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.02～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％飽和度，通過(guò)聚醚類或硅酮類消泡劑消泡；在發(fā)酵中后期，提高轉(zhuǎn)速和通氣量保證溶解氧在30～50％飽和度；發(fā)酵全過(guò)程通過(guò)添加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨調(diào)節(jié)控制pH在微酸性，pH6.4左右，流加50％葡萄糖控制發(fā)酵液葡萄糖濃度2～5g/dL，發(fā)酵時(shí)間48～72小時(shí)；(6)分離提取將步驟(5)培養(yǎng)好的發(fā)酵液，通過(guò)發(fā)酵液預(yù)處理得到的上清液采用離子交換法等分部提取得到15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺溶液，通過(guò)真空濃縮趕氨并采用活性炭脫色、乙醇低溫結(jié)晶、真空干燥得到產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(1)中所述的黃色短桿菌是指黃色短桿菌(Brevobacteriumflavum)ATCC14067、AS1.495、AS1.582和它們的突變株之一，谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13286、ATCC14751、ATCC13032、AS1.805、ACCC11063、IFFI10056、IFFI10052和它們的突變株之一，北京棒桿菌是指北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)AS1.299和其突變株之一，鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)AS1.452和其突變株之一。
3.如權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(4)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，玉米漿、菌體水解液有機(jī)氮源添加0～0.5mL/dL，使用的有機(jī)氮源中氨基氮濃度5～20g/dL，以使其對(duì)15N豐度的影響降低到最低限度；通過(guò)直接添加VH、VB1、VB6、泛酸、尼克酸、對(duì)氨基安息香酸維生素復(fù)合物，來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)，減少有機(jī)氮源的缺乏對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，同時(shí)強(qiáng)化L-谷氨酰胺代謝流。
4.如權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(5)中所述的溶解氧的控制通過(guò)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓實(shí)現(xiàn)。
5.如權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(5)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)中后期通過(guò)提高轉(zhuǎn)速或通風(fēng)，促進(jìn)L-谷氨酰胺的生成。
6.如權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(5)中所述的發(fā)酵搖瓶通過(guò)添加CaCO3控制pH在微酸性，發(fā)酵罐上通過(guò)流加15N標(biāo)記尿素、氨水或液氨來(lái)控制pH在微酸性。
7.如權(quán)利要求1所述的15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記L-谷氨酰胺的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(5)中所述的發(fā)酵罐發(fā)酵，通過(guò)流加50g/dL葡萄糖溶液控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度2～5g/dL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種
文檔編號(hào)C12P13/14GK1626666SQ20031010931
公開(kāi)日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者譚青喬, 呂志賢, 梅叢笑, 杜曉寧, 李良君 申請(qǐng)人:上海化工研究院