專利名稱：一種埃菌氏菌屬菌種以及采用該菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，尤其是一種埃菌氏菌屬菌種以及采用該菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素是生物體內(nèi)一種重要的化合物，它是一種類異戊二烯的多聚體，或?yàn)榫€型或?yàn)榄h(huán)狀，由8個(gè)異戊二烯單位(四類萜)以頭尾相連方式組成。類胡蘿卜素是不溶于水的色素，出現(xiàn)于植物和光合細(xì)菌，其功能常常只在光合作用中作為輔助色素。作為一種重要的生物化工材料，類胡蘿卜素被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域，涵蓋大量產(chǎn)品，傳統(tǒng)的生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法均采用植物提取法，其工藝過(guò)程是植物體-粉碎-有機(jī)溶劑-濃縮-干燥，其缺點(diǎn)是有機(jī)溶劑用量大，受季節(jié)因素影響，產(chǎn)量不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要提供一種埃菌氏菌屬菌種。
本發(fā)明的另一個(gè)目的就是要提供一種該埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種埃菌氏菌屬菌種，其形態(tài)特征該菌在牛肉膏蛋白胨平板上生長(zhǎng)，菌落光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊，無(wú)特殊氣味，且能聚集玫瑰紅色的色素，在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)呈均勻混濁，有菌膜形成，整管為紅色，查氏培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出光滑、濕潤(rùn)的乳白色菌落，無(wú)特殊氣味。
其生理生化特征草蘭氏染色為陰性短小桿菌，細(xì)胞單生，不運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢，沒有鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧。
該菌種已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NOM203057。
(一)、該菌種的分離步驟在N30°41.602’，E111°18.499’附近表層5-6cm深處的土壤，其具體非限制性的分離步驟為①制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，并倒平板；②取N30°41.602’，E111°18.499’附近表層5-6cm深處的土壤10g，制備成土壤稀釋液，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀釋度的土壤溶液；③將上述不同濃度的土壤懸液采用平板涂布法涂布在牛肉膏蛋白胨平板的培養(yǎng)基表面；④將涂布好的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24小時(shí)；
⑤將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的產(chǎn)紅色素的單個(gè)菌落，菌落特征該菌在牛肉膏蛋白胨平板上生長(zhǎng)，菌落光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊，無(wú)特殊氣味，且能聚集玫瑰紅色的色素，在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)呈均勻混濁，有菌膜形成，整管為紅色，查氏培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出光滑、濕潤(rùn)的乳白色菌落，無(wú)特殊氣味，挑出少許，進(jìn)行鏡檢；⑥確定單個(gè)菌落為純種后，利用平板劃線分離法進(jìn)行純種分離，得到積聚紅色素的菌種；⑦對(duì)所得菌種進(jìn)行篩選，得該菌株。
(二)、培養(yǎng)該埃菌氏菌屬菌種采用的培養(yǎng)基①分離固體斜面分離培養(yǎng)基將10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g氯化鈉、2g瓊脂加入100ml的蒸餾水中，將PH值調(diào)節(jié)為7.2-7.4，在121℃的溫度條件下滅菌20分鐘。
②純化固體純化培養(yǎng)基將10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g氯化鈉、2g瓊脂加入100ml的蒸餾水中，將PH值調(diào)節(jié)為7.2-7.4，在121℃的溫度條件下滅菌20分鐘。
③增殖液體增殖培養(yǎng)基將10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g氯化鈉、2g瓊脂加入100ml的蒸餾水中，將PH值調(diào)節(jié)為7.2-7.4，在121℃的溫度條件下滅菌20分鐘。
④擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)基將1％的碳源、5％的氮源，加入5000ml的發(fā)酵罐中，調(diào)PH值為7.2-7.4，在121℃溫度下滅菌20分鐘。
其中碳源是指玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、葡萄糖、蔗糖中的一種或多種。
氮源是指米糠、麩皮、硫酸銨、尿素、玉米漿中的一種或多種。
營(yíng)養(yǎng)成份是指玉米漿、麥芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白中的一種或多種。
(三)、該埃菌氏菌屬菌種的培養(yǎng)條件①培養(yǎng)溫度15℃-45℃，最適溫度為28℃-30℃；②培養(yǎng)方式好氧培養(yǎng)；③培養(yǎng)時(shí)間48-72小時(shí)；④PH值范圍PH4-8，最適PH為5.5-6.0。
(四)、該埃菌氏菌屬菌種的形態(tài)特征該菌在牛肉膏蛋白胨平板上生長(zhǎng)，菌落光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊，無(wú)特殊氣味，且能聚集玫瑰紅色的色素，在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)呈均勻混濁，有菌膜形成，整管為紅色，查氏培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出光滑、濕潤(rùn)的乳白色菌落，無(wú)特殊氣味。
(五)、該埃菌氏菌屬菌種的生理生化特征革蘭氏染色為陰性短小桿菌，細(xì)胞單生，不運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢，沒有鞭毛，兼性厭氧。
根據(jù)上述特征，并經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定，從《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Brrgey’s Manual ofSystematic Bacteriology)中查知為埃菌氏菌屬的菌種。
采用上述埃菌氏菌屬菌種可發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，其工藝過(guò)程為在8％(重量比)的淀粉質(zhì)或糖的培養(yǎng)基中，加入0.5％(重量比)的氮源及0.01％(重量比)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用121℃的溫度進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻至常溫，加入0.1％(重量比)的高溫α-淀粉酶，液化1小時(shí)，冷卻至常溫，再加0.1％(重量比)的糖化酶糖化，同時(shí)接入5％(重量比)埃菌氏菌屬菌種，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使發(fā)酵液的PH值為5.5-6.0，然后在15℃-45℃的溫度條件下通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)，最后取發(fā)酵液上漂浮的物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)過(guò)濾、萃取、結(jié)晶、即獲得固體狀的類胡蘿卜素。
淀粉質(zhì)物質(zhì)是指玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、土豆粉、木薯粉中的一種或多種。
糖是指葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖中的一種或多種。
氮源是指米糠、麩皮、麥芽、麥根、硫酸銨、尿素或玉米漿中的一種或多種。
營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是指玉米漿、麥芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白其中的一種或多種。
堿性物質(zhì)是指氫氧化鈉、液氮、碳酸鈣、氫氧化鉀、氧化鈣其中的一種或多種。
本發(fā)明由于采用上述方案，直接利用玉米、紅薯、大米等淀粉質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品粗原料發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，生產(chǎn)成本低廉，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)率為每升1.06克。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明所述的埃菌氏菌屬菌種的具體提純方法在N30°41.602’，E111°18.499’附近表層5-6cm深處的土壤，其具體非限制性的分離步驟為①制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，并倒平板；②取N30°41.602’，E111°18.499’附近表層5-6cm深處的土壤10g，制備成土壤稀釋液，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀釋度的土壤溶液；③將上述不同濃度的土壤懸液采用平板涂布法涂布在牛肉膏蛋白胨平板的培養(yǎng)基表面；④將涂布好的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24小時(shí)；⑤將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的產(chǎn)紅色素的單個(gè)菌落，菌落特征菌落光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊，無(wú)特殊氣味，且能聚集玫瑰紅色的色素。挑出少許，進(jìn)行鏡檢；⑥確定單個(gè)菌落為純種后，利用平板劃線分離法進(jìn)行純種分離，得到積聚紅色素的菌種；⑦對(duì)所得菌種進(jìn)行篩選，得該菌株，該菌株的保藏號(hào)為CCTCC NOM203057。
實(shí)施例2采用該埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法將8％(重量比)的玉米粉、0.5％(重量比)的米糠、0.02％(重量比)磷酸氫二鉀、0.01％(重量比)的氯化鈉加入100ml的蒸餾水中混合，在121℃溫度條件下進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻至常溫，加入0.1％(重量比)的高溫α-淀粉酶，液化1小時(shí)，冷卻至常溫，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌屬菌種，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使發(fā)酵液PH值為5.5，然后在28℃-30℃的溫度條件下通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，最后取發(fā)酵液上漂浮的物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)、過(guò)濾、萃取、結(jié)晶，獲得5.4％(重量比)固體狀的類胡蘿卜素，純度為97％。本產(chǎn)品呈紅色。
實(shí)施例3采用該埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法將8％(重量比)的玉米淀粉、0.5％(重量比)的麩皮、0.02％(重量比)磷酸氫二鉀、0.01％(重量比)的氯化鈉加入100ml的蒸餾水中混合，在121℃溫度條件下進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻至常溫，加入0.1％(重量比)的高溫α-淀粉酶，液化1小時(shí)，冷卻至常溫，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌屬菌種，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使發(fā)酵液PH值為5.5，然后在28℃-30℃的溫度條件下通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，最后取發(fā)酵液上漂浮的物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)、過(guò)濾、萃取、結(jié)晶，獲得5.4％(重量比)固體狀的類胡蘿卜素，純度為97％。本產(chǎn)品呈紅色。
實(shí)施例4采用該埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法將8％(重量比)的薯干粉、0.5％(重量比)的麥芽、0.02％(重量比)磷酸氫二鉀、0.01％(重量比)的氯化鈉加入100ml的蒸餾水中混合，在121℃溫度條件下進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻至常溫，加入0.1％(重量比)的高溫α-淀粉酶，液化1小時(shí)，冷卻至常溫，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌屬菌種，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使發(fā)酵液PH值為5.5，然后在28℃-30℃的溫度條件下通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，最后取發(fā)酵液上漂浮的物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)、過(guò)濾、萃取、結(jié)晶，獲得5.4％(重量比)固體狀的類胡蘿卜素，純度為97％。本產(chǎn)品呈紅色。
實(shí)施例5采用該埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法將8％(重量比)的土豆粉、0.5％(重量比)的麥根、0.02％(重量比)磷酸氫二鉀、0.01％(重量比)的氯化鈉加入100ml的蒸餾水中混合，在121℃溫度條件下進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻至常溫，加入0.1％(重量比)的高溫α-淀粉酶，液化1小時(shí)，冷卻至常溫，再加入0.1％(重量比)的糖化酶糖化，接入5％(重量比)的埃菌氏菌屬菌種，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使發(fā)酵液PH值為5.5，然后在28℃-30℃的溫度條件下通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，最后取發(fā)酵液上漂浮的物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)、過(guò)濾、萃取、結(jié)晶，獲得5.4％(重量比)固體狀的類胡蘿卜素，純度為97％。本產(chǎn)品呈紅色。
本發(fā)明生產(chǎn)出來(lái)的類胡蘿卜素采用的檢測(cè)方法為利用色質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)及含量其進(jìn)樣方式為直接進(jìn)樣。
①色譜條件為色譜柱為硅銅柱長(zhǎng)15m，內(nèi)徑0.25mm，載氣流量2ml/分；柱溫130℃→240℃→250℃；氣化溫度250℃；進(jìn)樣量2.0ul；分流比30∶1。
②質(zhì)譜條件離子源EI；離子源溫度250℃，離子電壓70ev；EI發(fā)射電流200uA；倍增器電壓210KV；分辯率12.5；掃描方式為全掃描，掃描時(shí)間23’19，反應(yīng)氣氮?dú)?，進(jìn)樣器加熱240℃，利用其結(jié)構(gòu)確定類胡蘿卜素含量。
權(quán)利要求
1.一種埃菌氏菌屬菌種，其特征在于(1)形態(tài)特征該菌在牛肉膏蛋白胨平板上生長(zhǎng)，菌落光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊，無(wú)特殊氣味，且能聚集玫瑰紅色的色素，在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)呈均勻混濁，有菌膜形成，整管為紅色，查氏培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出光滑、濕潤(rùn)的乳白色菌落，無(wú)特殊氣味，(2)生理生化特征草蘭氏染色為陰性短小桿菌，細(xì)胞單生，不運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢，沒有鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種埃菌氏菌屬菌種，其特征在于該菌種已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NOM203057。
3.一種用埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于在8％(重量比)的淀粉質(zhì)或糖的培養(yǎng)基中，加入0.5％(重量比)的氮源及0.01％(重量比)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，0.02％(重量比)磷酸氫二鉀、0.01％(重量比)的氯化鈉用121℃的溫度進(jìn)行20分鐘滅菌，冷卻至常溫，加入0.1％(重量比)的高溫α-淀粉酶，液化1小時(shí)，冷卻至常溫，再加0.1％(重量比)的糖化酶糖化，同時(shí)接入5％(重量比)埃菌氏菌屬菌種，用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使發(fā)酵液的PH值為5.5-6.0，然后在15℃-45℃的溫度條件下通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)，最后取發(fā)酵液上漂浮的物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)過(guò)濾、萃取、結(jié)晶、即獲得固體狀的類胡蘿卜素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于淀粉質(zhì)物質(zhì)是指玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、土豆粉、木薯粉中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于糖是指葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于氮源是指米糠、麩皮、麥芽、麥根、硫酸銨、尿素或玉米漿中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是指玉米漿、麥芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白其中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用埃菌氏菌屬菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于堿性物質(zhì)是指氫氧化鈉、液氮、碳酸鈣、氫氧化鉀、氧化鈣其中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種埃菌氏菌屬菌種以及采用該菌種生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，包括如下步驟將淀粉質(zhì)原料用蒸餾水調(diào)漿，滅菌，加入淀粉酶液化后，在發(fā)酵液中加入糖化酶糖化，同時(shí)接入埃菌氏菌屬菌種，采用邊糖化邊發(fā)酵技術(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素。該菌種的保藏號(hào)為CCTCC NOM203057。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可直接利用玉米、紅薯、大米等淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，生產(chǎn)成本低廉、工藝簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1546648SQ200310111580
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者劉世玲, 邵偉 申請(qǐng)人:宜昌市微生物研究所