專利名稱：植物偏好型重組人表皮生長(zhǎng)因子及利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種依據(jù)番茄偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)的編碼人表皮生長(zhǎng)因子的核酸分子。本發(fā)明還涉及含有所述核酸分子的表達(dá)載體，以及所述表達(dá)載體用于制備轉(zhuǎn)基因植物的用途。本發(fā)明又一方面涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，以及利用所述核酸分子制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
自1983年首次轉(zhuǎn)基因植物成功以來(lái)，植物基因工程的研究與開(kāi)發(fā)進(jìn)展迅速。國(guó)際上已有生物技術(shù)公司約500家，已獲得轉(zhuǎn)基因植物100種以上，植物基因工程中所用的植物和轉(zhuǎn)入的基因涉及面日益廣泛。以植物為生物反應(yīng)器，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程藥物和疫苗是目前植物基因工程研究中的一大熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)化病毒蛋白、細(xì)菌毒素、和抗體分子的轉(zhuǎn)基因植物已有成功的報(bào)道。
研究表明，大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)基因植物中這些基因表達(dá)的蛋白都具有完全的生物活性。如轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的口蹄疫病毒或霍亂毒素B亞基抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行喂服反應(yīng)后，能對(duì)相應(yīng)的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。
植物反應(yīng)器具有以下優(yōu)點(diǎn)易栽培管理；易大規(guī)模生產(chǎn)；成本低廉；無(wú)毒副作用；環(huán)保等。用番茄作為生物反應(yīng)器除了它具有以上植物的優(yōu)點(diǎn)外，還由于它本身是一種蔬菜，果實(shí)味道鮮美，大多數(shù)人喜歡生吃，不破壞其藥效；番茄的轉(zhuǎn)化過(guò)程較為簡(jiǎn)單；生長(zhǎng)周期相對(duì)較短；適應(yīng)性極強(qiáng)，在很多地域都能生長(zhǎng)等。利用番茄作為轉(zhuǎn)基因植物文獻(xiàn)中曾有報(bào)道，如2001年Mor TS將重組的人乙酰膽堿酯酶基因轉(zhuǎn)入番茄，并在果實(shí)及葉中檢測(cè)到酶活性；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用轉(zhuǎn)基因番茄生產(chǎn)乙肝口服疫苗成功；林忠平等將胰島素基因?qū)敕眩瑱z測(cè)到有活性的胰島素等等。
表皮生長(zhǎng)因子是一類廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的可促進(jìn)或抑制多類細(xì)胞生長(zhǎng)的多肽，由53個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為6000da左右。人表皮生長(zhǎng)因子是人自身分泌的一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在人類的生命活動(dòng)中起著十分重要的作用，分泌量不足會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的正常生理機(jī)能，所以給該類人群補(bǔ)充適量的表皮生長(zhǎng)因子能起到很好的預(yù)防和治療效果。
利用轉(zhuǎn)基因番茄生產(chǎn)的人表皮生長(zhǎng)因子能夠有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道的保護(hù)作用，主要適用于胃潰瘍；胃灼熱，胃酸過(guò)多癥；胃食道反流癥；糜爛性食道炎；十二指腸潰瘍；口腔潰瘍等疾病。此外，從生產(chǎn)人表皮生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)基因番茄中提取hEGF還可制成片劑、針劑或噴劑用于輔助治療燒傷，創(chuàng)傷等其他疾病。
轉(zhuǎn)基因番茄生產(chǎn)的人表皮生長(zhǎng)因子還可用于制備保健品，適于正常人及老年人群的消化道保健，對(duì)胃酸過(guò)多及潰瘍病人尤為適用。
本發(fā)明人利用番茄偏好的密碼子人工合成重組人表表皮生長(zhǎng)因子基因，并轉(zhuǎn)化番茄，成功地實(shí)現(xiàn)了利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)高質(zhì)量的、價(jià)格低廉的人表皮生長(zhǎng)因子的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種依據(jù)番茄偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)的編碼人表皮生長(zhǎng)因子的核酸分子。為了利用番茄實(shí)現(xiàn)人表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，本發(fā)明人選用番茄植物偏愛(ài)的密碼子，對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子基因加以修飾，并人工合成了經(jīng)所述修飾的人表皮生長(zhǎng)因子基因。具體地，本發(fā)明所涉及的番茄偏愛(ài)的人表皮生長(zhǎng)因子基因編碼天然人表皮生長(zhǎng)因子的氨基酸序列，但所述核酸分子的核苷酸序列與天然的人表皮生長(zhǎng)因子核苷酸序列并不相同(SEQ ID NO1)。
本發(fā)明的又一方面涉及含有本發(fā)明所述核酸分子的表達(dá)載體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，任何能夠用于異源蛋白質(zhì)在植物中表達(dá)的表達(dá)載體均適于本發(fā)明。任選的，在所述表達(dá)載體中還具有與所述核酸分子有效連接的啟動(dòng)子。適于在本發(fā)明所述表達(dá)載體與本發(fā)明所述核酸分子有效連接的啟動(dòng)子選自番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子，或塊莖、根或其他貯藏器官可大量表達(dá)的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中采用了采用番茄果實(shí)專一性高效表達(dá)的啟動(dòng)子2A11，使表達(dá)的人表皮生長(zhǎng)因子集中于果實(shí)部位。
本發(fā)明依據(jù)文獻(xiàn)(Mark JJ et al.1993 Plant Mol Biol 21625-640)報(bào)道的番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A11的核苷酸序列及特征，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，成功擴(kuò)增出含有所述啟動(dòng)子的934bp序列。實(shí)驗(yàn)證明，這一啟動(dòng)子區(qū)域具有十分特異的果實(shí)專一性，而且表達(dá)量明顯高于通用的組成型表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35S。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，采用人工全合成方法合成經(jīng)番茄偏好密碼子修飾的人表皮生長(zhǎng)因子基因，并于5’端添加起始密碼子ATG及酶切位點(diǎn)BamHI，于3’端添加終止密碼子TAA和TAG及酶切位點(diǎn)KpnI(如SEQ ID NO1所示)，然后連接到pMD-18-T載體上(購(gòu)自TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd)，再通過(guò)添加啟動(dòng)序列和終止序列構(gòu)成一完整的基因表達(dá)結(jié)構(gòu)，最后連接到表達(dá)載體pCAMBIA2300上(購(gòu)自澳大利亞CAMBIA公司)。所用各部件都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格檢測(cè)，確定無(wú)誤后，進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。每構(gòu)建一步都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格檢測(cè)，最后對(duì)構(gòu)建的表達(dá)載體再經(jīng)過(guò)酶切、PCR及測(cè)序檢測(cè)。然后，轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌C58和LBA4404中，最后再對(duì)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)一步確認(rèn)。表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)圖2和圖3。
在本發(fā)明又一具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為pCAM-35S-hEGF和pCAM-2A11-hEGF。
本發(fā)明再一方面還涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，包括利用本發(fā)明所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，在所得轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)和其他部分實(shí)現(xiàn)人表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可以用于轉(zhuǎn)化植物的方法包括但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、PEG介導(dǎo)法，花粉管通道法。適于本發(fā)明所述方法的植物選自單子葉植物或雙子葉植物。優(yōu)選的，所述植物選自番茄、蔬菜類和瓜果類作物、水果類植物和塊根、塊莖類植物。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明所述植物偏好的人表皮生長(zhǎng)因子的編碼核酸分子的表達(dá)載體用于制備轉(zhuǎn)基因植物的用途。
本發(fā)明還涉及一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中包括用含有本發(fā)明所述植物偏好的人表皮生長(zhǎng)因子的編碼核酸分子之表達(dá)載體轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物。適于本發(fā)明所述方法的植物選自單子葉植物和雙子葉植物。具體的，所述植物包括但不限于番茄、蔬菜類和瓜果類作物、水果類植物和塊根、塊莖類植物。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明人對(duì)經(jīng)本發(fā)明所述方法制備的轉(zhuǎn)基因番茄的基因轉(zhuǎn)化過(guò)程加以檢測(cè)，具體步驟如下無(wú)菌番茄苗的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化外植體種子消毒→接種于MS培養(yǎng)基上→光照培養(yǎng)→外植體。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化將子葉剪成碎片，置農(nóng)桿菌中浸泡，無(wú)菌水沖洗并吸干，在共培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)。
抗性篩選及其穩(wěn)定整合表達(dá)的再生培養(yǎng)誘導(dǎo)番茄愈傷組織，外植體上的愈傷組織在含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選、分化培養(yǎng)，獲得抗性轉(zhuǎn)基因植株，抗性小苗經(jīng)過(guò)生根及練苗培養(yǎng)，最后完成組培苗到大田移栽。
通過(guò)分子檢測(cè)技術(shù)確定轉(zhuǎn)化成功的植株。初步檢測(cè)用PCR擴(kuò)增目的基因，進(jìn)一步用Southern雜交驗(yàn)證。
番茄(果實(shí)及植株)中表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)量的確定。Western雜交確定目的基因已經(jīng)表達(dá)，精確含量由放射免疫法測(cè)定。
本發(fā)明是利用番茄做為一種植物生物反應(yīng)器來(lái)制造人表皮生長(zhǎng)因子，這種人表皮生長(zhǎng)因子可以通過(guò)生吃番茄的果實(shí)，做為一種口服制劑集中于消化道上皮粘膜細(xì)胞損傷部位發(fā)揮作用，同時(shí)，也可以從這種番茄果實(shí)或其他部位提取，而獲得其他用途的人表皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)品。
本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于(1)選用番茄植物偏愛(ài)的密碼子，設(shè)計(jì)并人工合成人表皮生長(zhǎng)因子基因；(2)采用番茄果實(shí)專一性高效表達(dá)的啟動(dòng)子2A11，使表達(dá)的人表皮生長(zhǎng)因子集中于果實(shí)部位。


圖1表達(dá)載體pCAM-35S-hEGF和pCAM-2A11-hEGF結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2表達(dá)載體pCAM-35S-hEGF構(gòu)建過(guò)程示意3表達(dá)載體pCAM-2A11-hEGF構(gòu)建過(guò)程示意4左圖為表達(dá)載體pCAM-35S-hEGF的酶切驗(yàn)證圖，其中M分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1、2號(hào)為用HindIII+EcoRI的雙酶切，切出了大小為1.5kb，包含35S啟動(dòng)子、hEGF目的基因及終止序列的片段。右圖為PCR電泳圖，M分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、2號(hào)為擴(kuò)增圖，擴(kuò)出了大小為180bp左右的目的片段。
圖5。表達(dá)載體pCAM-2A11-hEGF的PCR驗(yàn)證圖。其中泳道1號(hào)為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從下到上依次為500bp、1000bp、2000bp、3500bp、5500bp、7000bp；3，4，5號(hào)為以2A11的上下游引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；2號(hào)為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從下到上為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；6，7，8號(hào)為以hEGF的上下游引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。由圖可以看出擴(kuò)增結(jié)果完全正確，說(shuō)明所構(gòu)建的表達(dá)載體是正確的。
圖6為轉(zhuǎn)基因番茄的Southern雜交圖。+表示質(zhì)粒對(duì)照，-表示未轉(zhuǎn)化植株對(duì)照，1-8為轉(zhuǎn)化植株，由圖可以看出除2、4外都出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果。
以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以闡明。
實(shí)施例1 人工全合成番茄偏好的人表皮生長(zhǎng)因子編碼核酸分子依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Elizabeth E.Murray.et al，1989，Nucleic AcidsResearch，17(2)477-498)確定番茄偏愛(ài)的密碼子，將人表皮生長(zhǎng)因子基因的有效區(qū)域替換為番茄偏愛(ài)的密碼子序列，送到博亞公司全合成基因序列，所得序列如SEQ ID NO1所示。
實(shí)施例2 含有番茄偏好的人表皮生長(zhǎng)因子編碼核酸分子表達(dá)載體的構(gòu)建1.pCAM-35S-hEGF表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程1)將如實(shí)施例1所述人工全合成hEGF基因連接到pMD-18T載體(購(gòu)自TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd)上，組成質(zhì)粒pMD-18-hEGF。
2)按照廠家說(shuō)明書(shū)中推薦的條件，用BamHI和KpnI雙酶切所得質(zhì)粒pMD-18-hEGF，回收目的基因片段；同時(shí)用BamHI和KpnI雙酶切質(zhì)粒pBS-nos(見(jiàn)實(shí)施例3)，電泳回收；將回收的片段進(jìn)行連接得到質(zhì)粒pBS-hEGF。
3)再用HindIII和BamHI雙酶切質(zhì)粒pBS-hEGF和pBS35S(見(jiàn)實(shí)施例4)，回收前者片段和后者中的通用啟動(dòng)子CaMV35S片段，連接得到包含CaMV35S啟動(dòng)子、hEGF基因和nos終止子的完整基因表達(dá)盒。該質(zhì)粒命名為pBS35S-hEGF。
4)用HindIII和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pBS35S-hEGF得到完整的基因表達(dá)盒，同時(shí)用這兩種酶切質(zhì)粒pCAMBIA2300(購(gòu)自澳大利亞CAMBIA公司)，電泳回收目的片段后連接得到最終表達(dá)載體pCAM-35S-hEGF。
2.pCAM-2A11-hEGF表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中上游引物為5’TTAAGCTTAGCACTTGTTAGACTCATCTG3’(SEQ ID NO2)，下游引物為5’TTGGATCCAATGGTTTTGGATTAATTGC3’(SEQID NO3)；從番茄的幼嫩子葉中提取DNA，通過(guò)具體條件為在50ul的反應(yīng)體系中加入2xTaq PCR MasterMix 25ul，上下游引物各2ul，DNA 4ul，滅菌水17ul。按94℃變性5min，94℃ 30s-60℃ 30s-72℃60s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min的PCR反應(yīng)條件，擴(kuò)增得到能在番茄的果實(shí)中特異表達(dá)的特異啟動(dòng)子2A11。
2)將該啟動(dòng)子片段連接到T載體pBS-T(購(gòu)于清華大學(xué)北京天為時(shí)代科技有限公司)上，得到質(zhì)粒pBS-2A11。
3)將質(zhì)粒pBS-2A11和表達(dá)載體pCAM-35S-hEGF分別用HindIII和EcoRI雙酶切，前者得到番茄果實(shí)特異表達(dá)的啟動(dòng)子2A11，后者得到去除CaMV35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體部分，兩者在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接過(guò)夜，即得到可在番茄果實(shí)中高效表達(dá)的表達(dá)載體pCAM-2A11-hEGF。
實(shí)施例3 pBS-nos的構(gòu)建過(guò)程用HindIII和BamHI雙酶切pBS-T和pLGV23(購(gòu)于SIGMA公司)，回收前者整個(gè)片段和后者含nos終止序列的片段，兩者在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接。
實(shí)施例4 pBS35S的構(gòu)建過(guò)程用HindIII和BglII雙酶切pBS-T和pCAMBIA2300，回收前者整個(gè)片段和后者含35S啟動(dòng)序列的片段，兩者在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接。
實(shí)施例5 番茄的轉(zhuǎn)化及再生a.轉(zhuǎn)化材料的培養(yǎng)對(duì)番茄種子進(jìn)行表面消毒，先在70-75％的酒精中清洗1-2min，然后在0.1％的升汞或者30％的次氯酸鈉中浸泡5-10min，用無(wú)菌水洗滌3-5次，無(wú)菌濾紙吸干后播種在含MS的培養(yǎng)基中，在25℃和光照16h/d條件下萌發(fā)一周左右，取番茄的幼嫩子葉作為轉(zhuǎn)化材料。
b.外植體的轉(zhuǎn)化將無(wú)菌的番茄幼嫩葉片剪成大約5×5mm大小的方塊，與農(nóng)桿菌培養(yǎng)液共浸染10-30min，用無(wú)菌水洗滌2-3次，用無(wú)菌濾紙吸去多余的液體。將浸泡的葉片置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS+2mg/L 6-BA+2mg/LZT+1mg/L IAA+100mg/L卡那霉素)，28℃黑暗中共培養(yǎng)2天。
c.愈傷組織的誘導(dǎo)及分化將葉片轉(zhuǎn)到選擇分化培養(yǎng)基上(MS+2mg/L 6-BA+2mg/L ZT+1mg/L IAA+100mg/L卡那霉素+羧芐青霉素500mg/l)25℃，光照16h/d。大約三周左右換一次培養(yǎng)基。
d.生根培養(yǎng)分化的抗性小苗長(zhǎng)到1-2cm時(shí)用鋒利的解剖刀從愈傷組織上切取單株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(1/2MS+1mg/L IBA)上誘導(dǎo)生根。
e.溫室或大田移栽。
抗性小苗根系比較發(fā)達(dá)后，去除培養(yǎng)瓶上的封口膜，在室溫下與空氣接觸練苗幾天，基本適應(yīng)外界環(huán)境后首先移栽到花盆中，成活后移栽到溫室或大田。
實(shí)施例6 分子檢測(cè)對(duì)移栽成活的植株分類編號(hào)，分別取幼嫩的組織100mg按植物基因組DNA提取試劑盒[購(gòu)于清華大學(xué)北京天為時(shí)代科技有限公司]說(shuō)明書(shū)的要求提取各植株的DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)，所提DNA純度較高，無(wú)降解拖尾現(xiàn)象，可用于分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
首先對(duì)各植株的DNA進(jìn)行PCR分析，以初步判斷轉(zhuǎn)化情況在0.5ml小離心管中分別加入2xTaq PCR MasterMix10ul，5uM上下游引物各1ul，DNA樣品2ul，去離子水6ul，總體積為20ul。按94℃變性5min，94℃30s-60℃30s-72℃60s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳分析，大部分植株都擴(kuò)出了大小為180bp的特異片段；參考分子克隆，將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，利用地高辛標(biāo)記法(參考分子克隆及公司說(shuō)明書(shū))進(jìn)行Southern雜交，得到了明顯的雜交條帶。
取部分植株的PCR產(chǎn)物送到生物博亞生物公司測(cè)序，所得結(jié)果與目的基因的堿基序列完全相同。由此可以證明番茄植株的基因轉(zhuǎn)化是成功的。
實(shí)施例7 表達(dá)量的測(cè)定參照<植物基因工程>[(第二版)王關(guān)林，方宏筠主編，科學(xué)出版社，2002]有關(guān)蛋白質(zhì)提取的方法，取番茄的不同部位分別提取蛋白，然后按表皮生長(zhǎng)因子放射免疫測(cè)定試劑盒(購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所)說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作和測(cè)定，最后測(cè)得在2A11啟動(dòng)子啟動(dòng)下，每克鮮重番茄含1.6ng/g重組人表皮生長(zhǎng)因子，CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)下得到0.7ng/g重組人表皮生長(zhǎng)因子。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所<120>植物偏好型重組人表皮生長(zhǎng)因子及利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)其的方法<130>IDC030067<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>168<212>DNA<213>artificial<400>1atgaatagcg attctgaatg tccactttcc cacgacggat actgcttgca tgatggtgtt 60tgcatgtaca ttgaggcttt ggacaagtat gcatgcaact gtgttgtggg ttacatcgga120gagagatgtc aataccgtga ccttaaatgg tgggaacttc gttaatag 168<210>2<211>29<212>DNA<213>primer<400>2ttaagcttag cacttgttag actcatctg 29<210>3<211>28<212>DNA<213>primer<400>3ttggatccaa tggttttgga ttaattgc28
權(quán)利要求
1.一種依據(jù)番茄偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)的編碼重組人表皮生長(zhǎng)因子的核酸分子，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述核酸分子的表達(dá)載體，任選的，在所述表達(dá)載體中還具有與所述酸分子有效連接的啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求2的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子選自番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A11、或塊莖、根或其他貯藏器官可大量表達(dá)的啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其為pCAM-35S-hEGF或pCAM-2A11-hEGF。
5.一種利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，包括利用權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，在所得轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)和其他部分實(shí)現(xiàn)人表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中轉(zhuǎn)化植物的方法選自農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、PEG介導(dǎo)法，花粉管通道法。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述植物選自單子葉植物和雙子葉植物。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述植物選自番茄、蔬菜類和瓜果類作物、水果類植物和塊根、塊莖類植物。
9.權(quán)利要求2所述表達(dá)載體用于制備轉(zhuǎn)基因植物的用途。
10.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中包括用權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物選自單子葉植物或雙子葉植物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述植物選自番茄、蔬菜類和瓜果類作物、水果類植物和塊根、塊莖類植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種依據(jù)番茄偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)的新重組人表皮生長(zhǎng)因子以及編碼所述表皮生長(zhǎng)因子的核酸分子。本發(fā)明還涉及含有所述核酸分子的表達(dá)載體，以及所述表達(dá)載體用于制備轉(zhuǎn)基因植物的用途。本發(fā)明又一方面涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人表皮生長(zhǎng)因子的方法，以及利用所述核酸分子制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1618966SQ20031011630
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者智慶文, 柴敏, 李前, 孫曼霽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所