專利名稱：具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因及其抗腫瘤應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的基因治療，具體涉及基因工程方法構(gòu)建具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因(我們把它命名為immunocaspase-6)、由所述基因編碼的多肽、含有所述基因的載體及上述物質(zhì)在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，目前，臨床治療腫瘤仍局限于手術(shù)切除與放、化療結(jié)合的傳統(tǒng)治療手段，存在著特異性差、治療后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。目前的治療方法不能從根本上治愈病痛，而且毒副作用大，因此療效不盡如人意。尤其是很多研究表明HER2陽(yáng)性的乳腺癌預(yù)后往往很差，還沒有行之有效的治療藥物和手段。
基因治療的出現(xiàn)給人們帶來了新的希望?；蛑委煟褪遣捎没蛐揎椀耐緩?，改變活細(xì)胞遺傳物質(zhì)，以達(dá)到徹底消除疾病目的的一種全新的治療手段。它在治療腫瘤、病毒性疾病(如乙肝、HIV感染等)和一些遺傳、代謝類疾病等的嘗試中都取得了令人鼓舞的成效，顯示出良好的應(yīng)用前景。
目的基因和受體細(xì)胞的選擇是腫瘤基因治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前用于腫瘤基因治療的基因包括細(xì)胞因子基因，腫瘤抑制基因，“自殺”基因，以及外源毒素基因等。將上述基因轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞并回輸患者，或通過基因修飾淋巴細(xì)胞等免疫功能細(xì)胞，以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，或者直接殺傷腫瘤細(xì)胞。隨著人們對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)理認(rèn)識(shí)的深入，已有越來越多的研究者試圖通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑治療腫瘤。然而，目前尚缺乏可以應(yīng)用于基因治療的，能夠高效、特異地殺傷腫瘤細(xì)胞且盡可能小地對(duì)系統(tǒng)帶來毒副作用的基因和治療手段。
天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)，亦稱半胱天冬酶，是一類細(xì)胞凋亡過程中起核心作用的蛋白酶，能夠特異性識(shí)別并切割A(yù)sp-X序列。目前發(fā)現(xiàn)的14個(gè)caspase家族的成員除caspase-1、4、5等被證實(shí)與炎癥細(xì)胞因子合成有關(guān)外，其余都直接參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。參與凋亡的caspases又可以劃分為起始caspases和效應(yīng)caspases兩類。
Caspase-6是效應(yīng)caspase分子(Fernandes AT，et al.Cancer Res.1995；55(13)2737-42)，是除caspase-3和caspase-7外重要的凋亡執(zhí)行分子。Fernandes-Alnemri等人于1995年從人T淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat通過PCR的方法首先分離得到了caspase-6基因，當(dāng)時(shí)命名為MCH2。caspase-6基因也可以用CASP6表示，該基因編碼一種34kD的蛋白。
caspase-6在細(xì)胞中以酶原的形式合成和存在。在外界或自身凋亡信號(hào)的刺激時(shí)(Faleiro L，et al.EMBO-J.1997；16(9)2271-81)，上游caspases及粒酶B激活后于原結(jié)構(gòu)域與大亞基之間及大小亞基之間被剪切，大小亞基游離并相互聚集形成有活性的二聚體形式，兩個(gè)二聚體還可以再聚合成活性更強(qiáng)的四聚體，作用于下游與凋亡相關(guān)的底物，如PARP和lamin A等，使細(xì)胞死亡。而當(dāng)沒有凋亡信號(hào)刺激的時(shí)候，caspase-6不表現(xiàn)活性。
1998年Alnemri等(Srinivasula SM，et al.J Biol Chem.1998；27310107-10111.)將caspase-6基因的大小亞基進(jìn)行重排后，得到一個(gè)與天然活性caspase-6分子晶體結(jié)構(gòu)非常相似的分子。該分子無須凋亡信號(hào)刺激，便同樣具有天然caspase-6的活性，可以用作對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高效殺傷的執(zhí)行者。然而，鑒于該活性caspase-6分子不具備特異性識(shí)別靶細(xì)胞的能力，所以在腫瘤治療的應(yīng)用中存在很大的障礙。
近年來，caspase-6在細(xì)胞凋亡中的作用越來越被重視，人們公認(rèn)它是一種細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分子，也是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的執(zhí)行分子之一。caspase-6基因不同于其他凋亡誘導(dǎo)分子之處在于caspase-6蛋白處于凋亡調(diào)節(jié)通路的下游(1)活性型的caspase-6可以直接作用于底物而使細(xì)胞凋亡；(2)還可以逃逸細(xì)胞內(nèi)龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中多種凋亡調(diào)節(jié)因子的抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因、由所述基因編碼的多肽、含有所述基因的載體及上述物質(zhì)在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建一種特異性強(qiáng)、活性高、免疫原性低、能持續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞的新型分子——具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因，將其引入腫瘤，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡通路的開放，以獲得一種高效、低毒地殺傷腫瘤細(xì)胞的新方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因，其具有序列表<400>1-4之一的序列。
重組半胱天冬酶-6基因編碼的多肽，其具有序列表<400>5-8之一的序列。
一種表達(dá)載體，其含有重組半胱天冬酶-6基因。
重組半胱天冬酶-6基因編碼的多肽在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，將重組半胱天冬酶-6基因克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過包裝細(xì)胞包裝后，分離得到逆轉(zhuǎn)錄病毒。
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
一種重組腺病毒，將重組半胱天冬酶-6基因克隆入腺病毒載體，通過包裝細(xì)胞包裝后，分離得到腺病毒。
重組腺病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明應(yīng)用了能特異性識(shí)別并結(jié)合HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的單鏈抗體e23sFv基因(Chen SY，et al.Nature 1997；38578-80)，與綠膿桿菌外毒素(PE)轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域和活性caspase-6基因融合，構(gòu)建一種特異性強(qiáng)、活性高、免疫原性低、能持續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞的靶向活性半胱天冬酶-6基因。該基因可以通過下列途徑，達(dá)到治療HER2陽(yáng)性腫瘤的目的(1)脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒直接進(jìn)行肌肉或腫瘤組織局部注射；(2)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染患者外周血淋巴細(xì)胞，回輸患者；(3)腫瘤組織局部感染重組腺病毒；(4)純化靶向活性半胱天冬酶-6蛋白，進(jìn)行肌肉、腫瘤或靜脈注射。本發(fā)明兼具細(xì)胞免疫和體液免疫特點(diǎn)，與其它治療策略相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明構(gòu)建分泌型免疫靶向基因，表達(dá)分泌后產(chǎn)生能特異性地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)分子，無論通過以上四種中的任何一種途徑進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，均能在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)產(chǎn)生免疫監(jiān)視作用。本發(fā)明所構(gòu)建的靶向活性半胱天冬酶-6基因具有以下特點(diǎn)□安全性——由于在N端融合長(zhǎng)的抗體和PE序列，因而推測(cè)這種融合蛋白在分泌后的轉(zhuǎn)移過程中和進(jìn)入腫瘤細(xì)胞前，由于不能正確折疊而不具有caspase-6的活性。加之；靶向活性半胱天冬酶-6效應(yīng)分子通過抗體特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織細(xì)胞沒有識(shí)別和殺傷作用。另外，靶向半胱天冬酶-6主要由人源化抗體和人自身蛋白構(gòu)成，不會(huì)誘發(fā)體內(nèi)強(qiáng)烈的排異，而且細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)不引起炎癥反應(yīng)，所以治療的毒副作用較小。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)被修飾的淋巴細(xì)胞本身功能正常，回輸這種細(xì)胞將可以持續(xù)分泌效應(yīng)蛋白。動(dòng)物模型的抗腫瘤應(yīng)用中也發(fā)現(xiàn)對(duì)除了HER2陽(yáng)性腫瘤組織以外的其他組織沒有毒性；□高效性——半胱天冬酶-6是細(xì)胞凋亡的直接執(zhí)行者，向細(xì)胞中導(dǎo)入活性形式的caspase-6分子能夠逃逸細(xì)胞內(nèi)多種抑制因素，使其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更直接，且效率更高；□持續(xù)性——靶向活性半胱天冬酶-6基因由細(xì)胞中表達(dá)后，不僅可以直接作用于鄰近的HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，而且可以進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，隨著血液流動(dòng)對(duì)各種組織細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期的免疫監(jiān)視。本發(fā)明可望為HER2陽(yáng)性腫瘤的靶向治療提供一種新手段。


圖1為Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞immunocaspase-6的分泌表達(dá)。
圖2為pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
圖3為轉(zhuǎn)染pCMV(左)或pCMV/immunocaspase-6(右)的Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響的柱狀圖。
圖4為Immunocaspase-6的殺傷活性與作用時(shí)間關(guān)系的柱狀圖。
圖5為效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例與殺傷效果關(guān)系的柱狀圖。
圖6為不同效應(yīng)細(xì)胞對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞殺傷的柱狀圖。
圖7為Jurkat-immunocaspase-6細(xì)胞對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷活性與作用時(shí)間關(guān)系的柱狀圖。
圖8為熒光顯微鏡觀察Annexin-V-FITC和PI染色后的被殺傷細(xì)胞的圖像。
圖9為陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹pCMV/immunocaspase-6抑制腫瘤生長(zhǎng)的柱狀圖。
圖10為陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹pCMV/immunocaspase-6延長(zhǎng)動(dòng)物模型的生存期曲線。
圖11為回輸被Re-immunocaspase-6感染的外周血淋巴細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)抑制的柱狀圖。
圖12為TUNEL染色檢測(cè)腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞的圖像。
圖13為回輸被Re-immunocaspase-6感染的外周血淋巴細(xì)胞的治療組動(dòng)物存活期延長(zhǎng)曲線。
圖14為Ad-immunocaspase-6治療組腫瘤生長(zhǎng)的柱狀圖。
圖15為TUNEL染色檢測(cè)Ad-immunocaspase-6治療組的腫瘤組織中凋亡細(xì)胞的圖像。
圖16為Ad-immunocaspase-6治療組動(dòng)物生存期延長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式
1.具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因的克隆，及其表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明構(gòu)建的具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因包括三部分，分別為抗腫瘤表面抗原HER2的單鏈抗體(e23sFv)，具有轉(zhuǎn)膜功能的綠膿桿菌外毒素(PE)的轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域和具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能的活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)。
(1)活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因的克?、僖吧桶腚滋於?6(caspase-6)基因的獲得提取人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
設(shè)計(jì)擴(kuò)增caspase-6基因的引物，引物合成后稀釋至終濃度20pmol/μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得野生型半胱天冬酶-6(caspase-6)基因，并進(jìn)行序列測(cè)定證實(shí)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
p1 5’ttt gaa ttc atg agc tcg gcc tcg ggg-3’P2 5’ttt gga tcc tta att aga ttt tgg aaa ga-3’在PCR專用的薄壁管中依次加入，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL、10×PCR buffer 5μL、50mM MgCl21.5μL、上下游引物各1μL、10mM dNTP 1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和H2O 38μL，進(jìn)行PGR反應(yīng)。PGR反應(yīng)條件為
96℃變性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸60秒；共進(jìn)行20循環(huán)②活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因的克隆為了擴(kuò)增出大小亞基次序顛倒的活性半胱天冬酶-6基因，應(yīng)用overlap-PCR原理，設(shè)計(jì)引物，引物合成后稀釋至終濃度20pmol/μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
引物序列為P35′cca aaa tct aat agc tcg gcc tcg ggg ctc cgc 3′P45′ttt tct aga tta atc tac tac atc caa agg aat 3′P55’cga ggc cga gct att aga ttt tgg aaa gaa atg 3’P65′ggc gcg gcc aac gca gcc tcc gtt tac acg ctg 3′P75′ggc gcg gcc aac gtt gaa att gat gca gcc tcc gtt tac acg ctg3′P85′agc acc cgc ggc gca gcc tcc gtt tac acg ctg 3′P95′agc acc cgc ggc gtt gaa att gat gca gcc tcc gtt tac acg ctg3′以P3和P4引物擴(kuò)增caspase-6的大亞基基因片段(large subunit557bp)；分別以P5和P6、P7、P8、P9引物擴(kuò)增caspase-6的小亞基基因片段(s(364)324bp，s(364；VEID)336bp，s(412)324bp，s(412；VEID)336bp)。分別表示融合PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域253-412位氨基酸和253-364位氨基酸序列，小亞基與轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域之間帶和不帶有自身識(shí)別并可能切割的氨基酸序列。以P4和P6、P7、P8、P9引物將大、小亞基的基因片段重組，獲得大、小亞基次序顛倒的活性caspase-6基因(rc6src6(364)857bp，rc6(364；VEID)869bp，rc6(412)857bp，rc6(412；VEID)869bp)；□克隆PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域基因和活性半胱天冬酶-6基因的重組體以pCMV-e23sFv-PE40為模板，以P10和P11、P12、P13、P14引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域(p(364)363bp，p(364；VEID)375bp，p(412)507bp，p(412； VEID)519bp)基因片段。
再分別用5’端引物P10和3’端引物P4，通過PCR反應(yīng)將四種PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域基因序列與四種活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因序列相連，得到PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域基因和活性半胱天冬酶-6基因的重組體-pc6(364)1197bp，pc6(364；VEID)1209bp，pc6(412)1344bp和pc6(412；VEID)1356bp。
引物序列為P105′ttt gcg gcc gcg aaa ggc ggc agc ctg 3′P115′aac gga ggc tgc gtt ggc cgc gcc ggc ctc gtc 3′P125′aac gga ggc tgc atc aat ttc aac gtt ggc cgc gcc ggc ctc gtc3′P135′aac gga ggc tgc gcc gcg ggt gct gaa gct gac 3′P145′aac gga ggc tgc atc aat ttc aac gcc gcg ggt gct gaa gct gac3′PCR反應(yīng)條件為

□靶向活性caspase-6基因(immunocaspase-6)的獲得及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建以Not I/Xba I酶切PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域與活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)的重組體基因，克隆入真核表達(dá)載體pCMV/e23sFv相應(yīng)位點(diǎn)，使4種融合蛋白基因位于前導(dǎo)肽和抗HER2抗體e23sFv基因下游，獲得插入有靶向活性caspase-6基因(immunocaspase-6(364)1965bp，immunocaspase-6(364；VEID)1977bp，immunocaspase-6(412)2112bp和immunocaspase-6(412；VEID)2124bp)的pCMV表達(dá)載體，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。
2.靶向活性半胱天冬酶-6基因(immunocaspase-6)的表達(dá)及其對(duì)HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將靶向活性半胱天冬酶-6基因?qū)塍w外培養(yǎng)的人淋巴瘤Jurkat細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)加入800μg/ml G418進(jìn)行篩選，約2周后絕大部分細(xì)胞死亡，有陽(yáng)性克隆長(zhǎng)出，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，便得到了能夠穩(wěn)定表達(dá)并分泌目的蛋白的細(xì)胞株——Jurkat-immunocaspase-6。
□Western blot方法鑒定靶向活性半胱天冬酶-6蛋白的表達(dá)與分泌收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)過透析除鹽和凍干后，以小體積溶解備用。向樣品中加入SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10分鐘，離心取上清，電泳，再電轉(zhuǎn)化到PVDF膜上，封閉液封閉后，加入適當(dāng)稀釋的caspase-6抗體，4℃孵育過夜，加入熒光素標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育1h，再加入抗熒光素的抗體，室溫避光孵育1h，以NBT/BCIP顯色。
參見附圖1，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶向活性半胱天冬酶-6基因(immunocaspase-6)不僅能夠被表達(dá)，并且能夠按照預(yù)期分泌到細(xì)胞外。
□靶向活性半胱天冬酶-6(immunocaspase-6)分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用1)穩(wěn)定表達(dá)靶向活性半胱天冬酶-6的細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)細(xì)胞的殺傷□Jurkat-immunocaspase-6細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)自身生長(zhǎng)的影響pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞，在正常培養(yǎng)情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，繪制的生長(zhǎng)曲線與轉(zhuǎn)染空載體pCMV或沒有轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞相似，參見附圖2。結(jié)果表明，immunocaspase-6分子對(duì)Jurkat細(xì)胞本身沒有殺傷效應(yīng)。
②Jurkat-immunocaspase-6培養(yǎng)上清對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的特異性為了檢驗(yàn)immunocaspase-6分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性的靶向性，以pCMV和pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)上清分別培養(yǎng)HER2陽(yáng)性細(xì)胞—SKBr-3和SKOV-3細(xì)胞；HER2陰性細(xì)胞-HeLa和BT325細(xì)胞。結(jié)果，參見附圖3，Jurkat-immunocaspase-6細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的影響，而轉(zhuǎn)染pCMV的Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)所有細(xì)胞均沒有影響。表明，immunocaspase-6的殺傷活性是具有靶向性的，只對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞有殺傷，而不影響HER2陰性細(xì)胞的生長(zhǎng)。
③Jurkat-immunocaspase-6培養(yǎng)上清對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷與時(shí)間的關(guān)系收集pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)上清，用于培養(yǎng)SKBr-3細(xì)胞，分別于1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，參見附圖4，結(jié)果表明殺傷時(shí)間越長(zhǎng)，殺傷效果越好，說明immunocaspase-6的殺傷活性與時(shí)間呈正相關(guān)。
2)穩(wěn)定表達(dá)并分泌靶向活性半胱天冬酶-6的細(xì)胞對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷活性測(cè)定①細(xì)胞計(jì)數(shù)方法測(cè)定穩(wěn)定表達(dá)靶向活性半胱天冬酶-6的細(xì)胞對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷率Jurkat-immunocaspase-6細(xì)胞與HER2陽(yáng)性細(xì)胞(SKBr-3和SKOV-3細(xì)胞)分別以1∶1、2∶1、5∶1、10∶1于Transwell中共培養(yǎng)，5天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，參見附圖5，發(fā)現(xiàn)“5∶1”的比例比較合適；Jurkat-immunocaspase-6細(xì)胞與HER2陽(yáng)性細(xì)胞(SKBr-3和SKOV-3細(xì)胞)共培養(yǎng)(5∶1)于Transwell中，5天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，有明顯的細(xì)胞死亡。參見附圖6，四種基因作用效果相當(dāng)，其中immunocaspase-6(412；VEID)殺傷作用略強(qiáng)。
Jurkat-immunocaspase-6細(xì)胞與HER2陽(yáng)性細(xì)胞(SKBr-3和SKOV-3細(xì)胞)和HER2陰性細(xì)胞(HeLa和BT325細(xì)胞)共培養(yǎng)(5∶1)，分別于1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。參見附圖7，結(jié)果顯示，Immunocaspase-6蛋白對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞有殺傷活性，而不影響HER2陰性細(xì)胞的生長(zhǎng)，殺傷活性隨著殺傷時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。
②被殺傷細(xì)胞的凋亡特征檢測(cè)Annexin V實(shí)驗(yàn)——消化被殺傷腫瘤細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌，再以孵育緩沖液重懸，加入Annexin-V-FITC和PI熒光顯微鏡下觀察，并照相，參見附圖8。結(jié)果表明Immunocaspase-6對(duì)HER2陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷通過誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)。
3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靶向活性半胱天冬酶-6(Immunocaspase-6)在體內(nèi)的抗腫瘤應(yīng)用挑選6-8周BALB/c裸鼠，右后肢皮下注射HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞——乳腺癌SKBr-3細(xì)胞(2×106個(gè)/只)，10天左右，形成明顯腫瘤后隨機(jī)分組，建立HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞(乳腺癌SKBr-3細(xì)胞)的裸鼠實(shí)體瘤模型。
□陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹pCMV/immunocaspase-6，對(duì)動(dòng)物模型的抗腫瘤應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體(20μL/只)包裹質(zhì)粒pCMV/immunocaspase-6或pCMV(10μg/只)注射入荷瘤裸鼠的后肢肌肉中，每3天追加1次，同時(shí)記錄瘤體大小變化，2周后將裸鼠處死，取出瘤體及心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織。
另挑選6-8周的裸鼠，陽(yáng)離子脂質(zhì)體(20μL/只)包裹質(zhì)粒pCMV/immunocaspase-6或pCMV(10μg/只)注射入荷瘤裸鼠的后肢肌肉中，每3天追加1次，2周后每1周追加1次，直至裸鼠全部死亡。
瘤體變化——實(shí)驗(yàn)中跟蹤并記錄瘤體大小變化，同時(shí)將瘤體變化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，參見附圖9，結(jié)果表明Immunocaspase-6對(duì)HER2陽(yáng)性腫瘤生長(zhǎng)有一定的抑制效果。
安全性鑒定——將心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織固定后，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色，觀察Immunocaspase-6的表達(dá)和組織損傷情況，從而評(píng)價(jià)抑瘤效果。以抗caspase-6的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織顯示為caspase-6陽(yáng)性，而治療組的其他組織及對(duì)照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織均顯示為caspase-6陰性。HE染色的結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織中有細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，而治療組的其他組織及對(duì)照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織細(xì)胞形態(tài)正常；TUNEL染色顯示腫瘤組織中有細(xì)胞發(fā)生凋亡。
裸鼠存活期——記錄裸鼠存活時(shí)間，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，參見附圖10，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組裸鼠存活期明顯比對(duì)照組延長(zhǎng)，且差異顯著。Log Rank TestP＝0.0289-SPSS10.0。
□逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶靶向活性半胱天冬酶-6基因?qū)?dòng)物模型進(jìn)行抗腫瘤應(yīng)用①攜帶immunocaspase-6基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的獲得pCMV/immunocaspase-6經(jīng)Xba I酶切，Klenow酶補(bǔ)平后再以Hind III酶切，回收基因片段。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX載體Cla I酶切，Klenow補(bǔ)平后再以Hind III酶切，回收載體片段。兩者連接，構(gòu)建了包含immunocaspase-6基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，酶切鑒定正確。與空載體分別轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，G418篩選建系，收集病毒上清，病毒分別命名為Re-immunocaspase-6和Re，-70℃保存，避免反復(fù)凍融。病毒上清倍比稀釋，感染NIH3T3細(xì)胞，以G418篩選2周，計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)。發(fā)現(xiàn)在104倍稀釋的病毒感染后，Re-immunocaspase-6及Re組都形成了4個(gè)克隆，所以病毒滴度均為4×104cfu/mL。病毒感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞系(HeLa，SKBr-3，PA317)24h后收集細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行Dot-blot，檢測(cè)到Re-immunocaspase-6感染后細(xì)胞中有immunocaspase-6基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。說明Re-immunocaspase-6能成功感染靶細(xì)胞，目的基因在靶細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)。
②重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(Re-immunocaspase-6)感染對(duì)細(xì)胞的特異性殺傷以上得到的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SKBr-3、HeLa、PA317細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)immunocaspase-6基因的表達(dá)，及其對(duì)細(xì)胞骨架和細(xì)胞核的影響，發(fā)現(xiàn)所有被Re-immunocaspase-6感染的細(xì)胞均表達(dá)目的蛋白，而只有HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞SKBr-3中出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞骨架和細(xì)胞核的改變。
③重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(Re-immunocaspase-6)的抗腫瘤應(yīng)用體外分離正常人外周血淋巴細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后，以重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(分兩組空載體對(duì)照組Re和實(shí)驗(yàn)組Re-immunocaspase-6)感染細(xì)胞，再培養(yǎng)2天后收集細(xì)胞，RMPI 1640洗滌2次，以2×106/mL的濃度將細(xì)胞重懸。由尾靜脈注射(100μL/只)入荷瘤裸鼠的外周血中，1周后追加，2周處死裸鼠。同時(shí)記錄瘤體大小變化，取出瘤體及心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織。
另挑選6-8周的裸鼠，建立裸鼠模型后，由尾靜脈注射重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的正常人外周血淋巴細(xì)胞，每1周追加1次，直至裸鼠全部死亡。
瘤體積變化——實(shí)驗(yàn)中跟蹤并記錄瘤體大小變化，同時(shí)將瘤體變化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，參見附圖11，結(jié)果表明immunocaspase-6對(duì)HER2陽(yáng)性腫瘤生長(zhǎng)有一定的抑制作用。
安全性鑒定——收集心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織固定后，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色，觀察immunocaspase-6的表達(dá)和組織損傷情況，從而評(píng)價(jià)抑瘤效果。以抗caspase-6的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織顯示為caspase-6陽(yáng)性，而治療組的其他組織及對(duì)照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織均顯示為caspase-6陰性。參見附圖12，HE染色的結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織中有細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，而治療組的其他組織及對(duì)照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織細(xì)胞形態(tài)正常；TUNEL染色顯示只有實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織中有細(xì)胞發(fā)生凋亡。
存活期變化——記錄裸鼠存活時(shí)間，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，參見附圖13，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組裸鼠存活期明顯比對(duì)照組延長(zhǎng)，且差異顯著。Log Rank TestP＝0.0090-SPSS10.0。
□腺病毒載體攜帶靶向活性半胱天冬酶-6基因?qū)?dòng)物模型進(jìn)行抗腫瘤應(yīng)用①攜帶immunocaspase-6基因的腺病毒載體的構(gòu)建及重組腺病毒的獲得pCMV/immunocaspase-6經(jīng)Xba I酶切，Klenow酶補(bǔ)平后再以Hind III酶切，回收immunocaspase-6基因片段；同時(shí)，腺病毒載體pShuttleCMV以Hind III、EcoR V雙酶切后，回收載體片段，兩者連接。pShuttle/immunocaspase-6和pShuttleCMV再分別與pAdeasy-1進(jìn)行細(xì)菌BJ5183內(nèi)重組，構(gòu)建了腺病毒載體—pAdeasyCMV和pAdeasy/immunocaspase-6。pAdeasy/immunocaspase-6及pAdeasyCMV轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293，2周后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病理性變化，收集病毒。病毒溶液稀釋后感染HEK293細(xì)胞，以含DMEM的瓊脂糖培養(yǎng)，兩周左右出現(xiàn)明顯病毒克隆，挑取病毒克隆，擴(kuò)大感染后提取病毒基因組，以地高辛標(biāo)記的靶向活性caspase-6基因片段探針進(jìn)行Dot-blot，鑒定為陽(yáng)性后，再感染HEK293細(xì)胞，收集病毒，病毒分別命名為Ad-immunocaspase-6和Ad。擴(kuò)大感染后再測(cè)定病毒滴度。計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)，發(fā)現(xiàn)在1012倍稀釋的病毒感染后，Ad-immunocaspase-6形成了8個(gè)克隆，病毒滴度為8×1012cfu/mL。Ad組形成了2個(gè)克隆，病毒滴度為2×1012cfu/mL。為了檢測(cè)病毒是否在包裝細(xì)胞以外的其他細(xì)胞中復(fù)制，即檢測(cè)病毒的安全性，以P15和P16引物擴(kuò)增細(xì)胞基因組中包裝病毒必須的E1A基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的細(xì)胞中，只有HEK293細(xì)胞內(nèi)有E1A基因。
引物序列為P155’cat att atc tgc cac gga gg 3’P165’gcc aca ggt cct cat ata gc 3’PCR反應(yīng)條件為96℃變性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸60秒。共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。
②重組腺病毒(Ad-immunocaspase-6)體外感染對(duì)細(xì)胞的影響病毒感染體外培養(yǎng)的SKBr-3、HeLa、HEK293細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增immunocaspase-6的部分序列，檢測(cè)到Ad-immunocaspase-6感染后細(xì)胞中有immunocaspase-6基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)immunocaspase-6基因的表達(dá)，及其對(duì)細(xì)胞骨架和細(xì)胞核的影響，發(fā)現(xiàn)所有被Ad-immunocaspase-6感染的細(xì)胞均表達(dá)immunocaspase-6，而只有HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞SKBr-3中出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞死亡。
③重組腺病毒(Ad-immunocaspase-6)的抗腫瘤應(yīng)用將收集的病毒進(jìn)行稀釋(終滴度為1×109cfu/mL)，以重組腺病毒(分三組空白對(duì)照組PBS、空載體對(duì)照組Ad和實(shí)驗(yàn)組Ad-immunocaspase-6)對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行瘤體直接注射，連續(xù)進(jìn)行3次，記錄瘤體大小變化和裸鼠存活時(shí)間。2周后每組各處死1只裸鼠，取出心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織。固定后，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色，觀察immunocaspase-6的表達(dá)和組織損傷情況，從而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)效果。
瘤體積變化——實(shí)驗(yàn)中跟蹤并記錄瘤體大小變化，同時(shí)將瘤體變化數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，參見附圖14，結(jié)果表明Ad-immunocaspase-6注射能抑制HER2陽(yáng)性腫瘤的生長(zhǎng)。
安全性鑒定——以抗caspase-6的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織顯示為caspase-6陽(yáng)性，治療組的其他組織及對(duì)照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織均顯示為caspase-6陰性。參見附圖15，HE染色的結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織中有細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，而治療組的其他組織及對(duì)照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織細(xì)胞形態(tài)正常。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色，結(jié)果表明Ad-immunocaspase-6治療組的腫瘤組織中顯示有細(xì)胞發(fā)生凋亡。
存活期的變化——記錄裸鼠生存時(shí)間，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，參見附圖16，結(jié)果表明Ad-immunocaspase-6治療組的裸鼠存活期明顯比對(duì)照組延長(zhǎng)，且差異顯著。Log Rank TestP＝0.0198-SPSS10.0。
權(quán)利要求
1.一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因，其具有序列表<400>1-4之一的序列。
2.由權(quán)利要求1的基因編碼的多肽，其具有序列表<400>5-8之一的序列。
3.一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求1所述的重組半胱天冬酶-6基因。
4.如權(quán)利要求2所述的多肽在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
5.一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，其特征為將權(quán)利要求1所述的重組半胱天冬酶-6基因克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過包裝細(xì)胞包裝后，分離得到逆轉(zhuǎn)錄病毒。
6.如權(quán)利要求5所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
7.一種重組腺病毒，其特征為將權(quán)利要求1所述的重組半胱天冬酶-6基因克隆入腺病毒載體，通過包裝細(xì)胞包裝后，分離得到腺病毒。
8.如權(quán)利要求7的所述的重組腺病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶－6基因、由所述基因編碼的多肽、含有所述基因的載體及上述物質(zhì)在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中具有靶向活性的重組半胱天冬酶－6基因表達(dá)后，能特異性識(shí)別并結(jié)合于HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞表面，通過PE轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域?qū)⒒钚詂aspase－6分子導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡通路的開放，以獲得一種高效、低毒地殺傷腫瘤細(xì)胞的新方法。本發(fā)明在應(yīng)用中，具有安全性、高效性和持續(xù)性等特點(diǎn)，可望為HER2陽(yáng)性腫瘤的靶向治療提供一種新手段。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1546662SQ20031011895
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者楊安鋼, 許彥鳴, 賈林濤, 張立紅, 于翠娟, 王立峰, 王成濟(jì) 申請(qǐng)人:楊安鋼