專利名稱：一種基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法及專用芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)涵物分析的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的分析細(xì)胞內(nèi)涵物方法以大量細(xì)胞為前提，獲取某一內(nèi)涵物(比如蛋白質(zhì)，核酸等)含量的總值，該值與細(xì)胞數(shù)量的比值外推至單細(xì)胞內(nèi)該物質(zhì)的含量。對(duì)于性質(zhì)相對(duì)均一的細(xì)胞群來(lái)說(shuō)，此方法可以接受，但在另外一些場(chǎng)合下，比如某些重大疾病的早期階段，僅有個(gè)別細(xì)胞的組分發(fā)生變化，這時(shí)，傳統(tǒng)方法將會(huì)平均掉該特異變化。因此，單個(gè)細(xì)胞層面的分析有助于疾病的早期診斷。此外，與傳統(tǒng)方法相比，單細(xì)胞分析在信息的獲取上相對(duì)準(zhǔn)確；有可能檢測(cè)活性周期較短的不穩(wěn)定中間產(chǎn)物。
從技術(shù)角度來(lái)看，單個(gè)細(xì)胞的分析可以分為完整的單細(xì)胞分析和破碎的單細(xì)胞分析。本發(fā)明僅涉及到后一種技術(shù)。在該技術(shù)類別中目前已有的技術(shù)包括單細(xì)胞凝膠電泳和毛細(xì)管電泳。前者的對(duì)象更多的局限于DNA損傷的分析。毛細(xì)管電泳技術(shù)分析單細(xì)胞內(nèi)涵物的方法相對(duì)比較成熟，但它存在著操作困難，通量低，不易完全自動(dòng)化等缺點(diǎn)。
微流控芯片作為一種新型分析平臺(tái)(又名芯片實(shí)驗(yàn)室，微全分析系統(tǒng)等)具有易自動(dòng)化，集成化程度高等優(yōu)勢(shì)，目前在該平臺(tái)上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的有單細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞的分離、分選、及細(xì)胞的輸運(yùn)、操縱和裂解，但其在單細(xì)胞內(nèi)涵物分析檢測(cè)方面的工作，世界范圍內(nèi)尚未充分展開(kāi)。僅有Ramesey等報(bào)道[Anal.Chem.1997，69，1564-1568，McClain MA，CulbertsonCT，Jacobson SC，Allbritton NL，Sims CE，Ramsey JM]以預(yù)先標(biāo)記了熒光染料的細(xì)胞為對(duì)象，在玻璃芯片上用緩沖池兩端的交變電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的破碎和染料的釋放，進(jìn)而完成染料的檢測(cè)過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在微流控芯片上完成細(xì)胞內(nèi)涵物分析的方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的裂解與分析同步完成，并且操作簡(jiǎn)單可控。
本發(fā)明具體提供了一種基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法，其特征在于首先在微流控芯片的進(jìn)樣通道壁兩側(cè)施以交變電場(chǎng)，使細(xì)胞裂解；所釋放的產(chǎn)物再經(jīng)分離通道進(jìn)行電泳分離檢測(cè)。
本發(fā)明基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法中，所述交變場(chǎng)強(qiáng)可以從10V/cm到500V/cm.。
本發(fā)明基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法中，所述電泳電場(chǎng)可以從10V/cm到1000V/cm。
本發(fā)明基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法中，所述細(xì)胞可以是未經(jīng)任何處理的細(xì)胞，也可以是標(biāo)有各種抗體或其他分子的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了專門用于上述細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片，其特征在于該微流控芯片具有雙層結(jié)構(gòu)；一層的表面刻有十字型通道，垂直通道即進(jìn)樣通道兩端的液池分別為細(xì)胞池和空池，水平通道即分離通道兩端的液池分別為緩沖池和廢液池；另一層的表面鍍有成對(duì)的破碎電極；上述兩層相對(duì)封接后，所述破碎電極恰好位于所述進(jìn)樣通道內(nèi)。
本發(fā)明用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片中，所述芯片的通道寬度可以在100微米到2000微米之間。
本發(fā)明用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片中，所述芯片材料是玻璃、石英、硅、高聚物塑料、陶瓷或它們的復(fù)合體。破碎電極以鉑金材料為最佳。
本發(fā)明用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片中，所述進(jìn)樣通道內(nèi)破碎電極數(shù)目可以是一對(duì)也可以是多對(duì)，電極可以直接相對(duì)也可以錯(cuò)開(kāi)一定位置，探入通道內(nèi)電極寬度可以從1個(gè)微米到10厘米，長(zhǎng)度從幾毫米到幾厘米。
本發(fā)明用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片中，所述進(jìn)樣通道與分離通道的十字交叉區(qū)域是一個(gè)或者多個(gè)。
對(duì)于非細(xì)胞的人工合成直徑在幾十微米的顆粒如脂質(zhì)體，膠囊等本發(fā)明同樣適用。
本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的裂解與分析同步完成，并且操作簡(jiǎn)單可控。


圖1為芯片底板，鉑金電極分布示意圖，黑色部分為鉑金電極；圖2為上層十字型芯片通道示意圖；圖3為進(jìn)樣通道內(nèi)細(xì)胞裂解示意圖，淺色部分為鉑金電極，黑色線條為通道壁，圓形顆粒示意細(xì)胞；圖4為該方法分離細(xì)胞內(nèi)核酸電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式以十字型通道的微流控芯片為操作平臺(tái)，垂直通道兩端的液池分別為細(xì)胞池和空池。水平通道兩端的液池分別為緩沖池和廢液池，并分別接高電壓和接地。芯片由上下兩層組成。下層鍍上所需形狀和位置的鉑金電極(見(jiàn)圖1)，與上層(見(jiàn)圖2)封接后，鉑金電極位于微通道內(nèi)(見(jiàn)圖3)。鉑金電極接交變電場(chǎng)。
將緩沖液加入到緩沖池和廢液池中，使緩沖液充滿所有通道，然后將細(xì)胞液加入細(xì)胞池中，在壓力的作用下，細(xì)胞從細(xì)胞池流向空池；流經(jīng)鉑金電極的細(xì)胞在交變電場(chǎng)作用下裂解，釋放的細(xì)胞內(nèi)涵物進(jìn)入十字交叉區(qū)，在緩沖池和廢液池兩端的高電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入水平通道即分離通道進(jìn)行電泳。
實(shí)施例1緩沖液池和廢液池先后加入13微升10mMPBS緩沖液，顯微鏡下觀察各通道中均連續(xù)充滿緩沖液后，在緩沖液池和廢液池插入電極，分別接500V和地。進(jìn)樣通道內(nèi)的破碎用電極接入交流電壓5V，從而在通道徑向產(chǎn)生電場(chǎng)強(qiáng)度為50V/cm。加13微升鯉魚紅細(xì)胞液(細(xì)胞濃度約108個(gè)mL)于細(xì)胞池。細(xì)胞在靜壓力作用下向空池流動(dòng)。流經(jīng)破碎電極時(shí)細(xì)胞破碎，釋放的核酸與緩沖液重的嵌入染料結(jié)合。所用染料是YOYO-I(1uM)。激光波長(zhǎng)488nm。核酸流入十字區(qū)后在緩沖液池和廢液池之間的電壓驅(qū)動(dòng)下流過(guò)激光焦斑，激發(fā)的熒光由光電倍增管收集。
權(quán)利要求
1.一種基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法，其特征在于首先在微流控芯片的進(jìn)樣通道壁兩側(cè)施以交變電場(chǎng)，使細(xì)胞裂解；所釋放的產(chǎn)物再經(jīng)分離通道進(jìn)行電泳分離檢測(cè)。
2.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法，其特征在于所述交變場(chǎng)強(qiáng)從10V/cm到500V/cm.。
3.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法，其特征在于所述電泳電場(chǎng)從10V/cm到1000V/cm。
4.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法，其特征在于所述細(xì)胞是未經(jīng)任何處理的細(xì)胞，或者是標(biāo)有各種抗體或其他分子的細(xì)胞。
5.一種專門用于權(quán)利要求1、2、3或4所述細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片，其特征在于該微流控芯片具有雙層結(jié)構(gòu)；一層的表面刻有十字型通道，垂直通道即進(jìn)樣通道兩端的液池分別為細(xì)胞池和空池，水平通道即分離通道兩端的液池分別為緩沖池和廢液池；另一層的表面鍍有成對(duì)的破碎電極；上述兩層相對(duì)封接后，所述破碎電極恰好位于所述進(jìn)樣通道內(nèi)。
6.按照權(quán)利要求5所述用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片，其特征在于所述芯片的通道寬度在100微米到2000微米之間。
7.按照權(quán)利要求5所述用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片，其特征在于所述探入到進(jìn)樣通道內(nèi)破碎電極的寬度從1個(gè)微米到10厘米。
8.按照權(quán)利要求5、6或7所述用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片，其特征在于所述芯片材料是玻璃、石英、硅、高聚物塑料、陶瓷或它們的復(fù)合體。
9.按照權(quán)利要求5、6或7所述用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片，其特征在于所述進(jìn)樣通道內(nèi)破碎電極數(shù)目是一對(duì)或者多對(duì)。
10.按照權(quán)利要求5、6或7所述用于細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法的微流控芯片，其特征在于所述進(jìn)樣通道與分離通道的十字交叉區(qū)域是一個(gè)或者多個(gè)。
全文摘要
一種基于微流控芯片的細(xì)胞內(nèi)涵物分析方法，其特征在于首先在微流控芯片的進(jìn)樣通道壁兩側(cè)施以交變電場(chǎng)，使細(xì)胞裂解；所釋放的產(chǎn)物再經(jīng)分離通道進(jìn)行電泳分離檢測(cè)。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的裂解與分析同步完成，并且操作簡(jiǎn)單可控。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1626673SQ20031011903
公開(kāi)日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月11日
發(fā)明者蓋宏偉, 於林芬, 戴忠鵬, 馬銀法, 林炳承 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所