專利名稱：肝癌細(xì)胞表達(dá)下調(diào)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人肝癌相關(guān)基因及應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及利用肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的肝癌相關(guān)基因來(lái)檢測(cè)腫瘤易感性的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤的死亡率在我國(guó)僅次于心、腦血管疾病名列第二。在惡性腫瘤中肝癌的死亡率列在肺癌、胃癌之后居第三位。目前對(duì)肝癌缺乏有效的診治手段。人們普遍認(rèn)為癌的發(fā)生是一種多因子多步驟的復(fù)雜事件，是多種癌基因激活和抑癌基因失活的結(jié)果。
我國(guó)每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，其中男性8萬(wàn)，女性3萬(wàn)，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。我國(guó)肝癌高發(fā)的趨勢(shì)十分嚴(yán)峻，這是由于我國(guó)有1.2億HBV攜帶者。肝癌的分子生物學(xué)研究是近年迅速發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新領(lǐng)域，它對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展及其與乙型肝炎病毒的關(guān)系等提供了新的材料。目前對(duì)肝癌的致癌基因、抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，以及肝癌與HBV的感染等方面研究進(jìn)展較快。
正常人體原癌基因和抑癌基因互相制約，控制細(xì)胞正常的增殖、分化，組織的再生和個(gè)體發(fā)育。癌癥的發(fā)生很大一部分是由于病毒或化學(xué)致癌物的作用使原癌基因激活成為癌基因，以及抗癌基因失活，引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控而形成。癌的發(fā)生涉及多種因素，分多階段形成，因此可能有多個(gè)癌相關(guān)基因在不同時(shí)期的激活或抑制。癌相關(guān)基因的激活或抑制，表現(xiàn)在與正常組織或細(xì)胞相比，基因的表達(dá)異常，出現(xiàn)表達(dá)量升高或降低，甚至基因結(jié)構(gòu)發(fā)生突變。
由于癌癥是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預(yù)防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來(lái)越關(guān)注腫瘤的早期診斷和基因治療。然而目前為止發(fā)現(xiàn)的肝癌相關(guān)基因的數(shù)量還很有限。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)研究新的癌癥相關(guān)的和/或具有抑癌功能的人蛋白，以及相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的腫瘤相關(guān)蛋白-人肝癌相關(guān)蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供利用肝癌相關(guān)基因檢測(cè)腫瘤易感性的方法和試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞中肝癌相關(guān)基因表達(dá)水平是否下調(diào)的方法，它包括步驟(a)檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b；(b)將待測(cè)細(xì)胞中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平與對(duì)照相比較，從而確定肝癌相關(guān)基因表達(dá)水平是否下調(diào)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中判斷下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平低1.5-100倍。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中判斷下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平低3-50倍。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中判斷下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平低4-25倍。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的待測(cè)細(xì)胞是肝細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的檢測(cè)是通過(guò)核酸芯片檢測(cè)法、半定量PCR法、定量PCR法、蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)法、或抗原-抗體檢測(cè)法進(jìn)行。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增肝癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的引物和說(shuō)明書(shū)，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b。
在另一優(yōu)選例中，所述的引物具有SEQ ID NO9和10所示的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的1-4對(duì)引物(i)Beclin1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO1和2所示的序列；(ii)Lis1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO3和4所示的序列；(iii)Pir51特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO5和6所示的序列；(iv)RbAp48特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO7和8所示的序列。
在另一優(yōu)選例中，檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的抗體和說(shuō)明書(shū)，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b。
在另一優(yōu)選例中，檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒包括檢測(cè)肝癌相關(guān)基因的芯片和說(shuō)明書(shū)，所述芯片選自下組(a)DNA芯片，所述芯片具有基片和點(diǎn)樣于基片上點(diǎn)樣區(qū)的點(diǎn)樣DNA，所述的點(diǎn)樣DNA包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的探針，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b；(b)蛋白質(zhì)芯片，所述芯片具有基片和點(diǎn)樣于基片上點(diǎn)樣區(qū)的點(diǎn)樣蛋白，所述的點(diǎn)樣蛋白包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的抗體，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1顯示了微矩陣雜交技術(shù)分析人肝癌組織與癌旁正常組織的基因表達(dá)差異。
圖2顯示了Beclin1，RbAp48，Aldolase b和Pir51四種基因在肝癌和癌旁正常組織中的表達(dá)檢測(cè)。T為肝癌組織，N為癌旁正常組織。
圖3顯示了Beclin1，RbAp48，Aldolase b，和Pir51四種基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)。
圖4顯示了Lis1基因在正常肝(N)，肝癌(K)和癌旁正常肝組織中(L)中的表達(dá)檢測(cè)。膜上總RNA的量，分別為5μg/點(diǎn)，10μg/點(diǎn)，20μg/點(diǎn)。β-actin(β-肌動(dòng)蛋白)基因的雜交結(jié)果為對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，新發(fā)現(xiàn)并分離了在肝癌中特異性低表達(dá)(甚至不表達(dá))的肝癌相關(guān)基因-Aldolase b(醛縮酶b)，因此所述肝癌細(xì)胞表達(dá)下調(diào)基因可作為肝癌發(fā)生發(fā)展(尤其是早期診斷)的標(biāo)記和基因治療的靶標(biāo)。
此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)并分離了一組與肝癌相關(guān)基因及其編碼的蛋白質(zhì)，這一組基因(Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)是在肝癌中特異性高表達(dá)，因此這些肝癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)基因也可作為肝癌發(fā)生發(fā)展(尤其是早期診斷)的標(biāo)記和基因治療的靶標(biāo)。
具體而言，本發(fā)明涉及利用cDNA微矩陣技術(shù)篩選正常肝和肝癌中表達(dá)差異基因，獲得了8400個(gè)基因的表達(dá)圖譜。把正常肝組織和肝癌組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)有256個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，267個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，這些基因的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)都大于4倍。本發(fā)明中公開(kāi)了5個(gè)經(jīng)鑒定的基因在40％以上樣品中表達(dá)有差異。這5個(gè)五個(gè)基因的差異表達(dá)百分率Lis1為40％，Beclin1為50％，RbAp48為50％，Pir51為60％，Aldolase b為70％。
本發(fā)明還采用Northern blot方法和RT-PCR方法檢測(cè)上述基因在正常肝組織和肝癌組織中的表達(dá)。
在Northern blot方法中，先分離提取來(lái)源于同一病人的肝癌組織和癌旁的正常肝組織的總RNA，經(jīng)含甲醛的1％瓊脂糖電泳分離后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并固定，然后用基因的特異片段制備探針雜交，根據(jù)雜交信號(hào)確定基因的表達(dá)強(qiáng)弱。
結(jié)果顯示Beclin1和RbAp48在50％以上所選腫瘤樣品中表達(dá)水平顯著上升，而正常肝組織中檢測(cè)不到；Aldolase b在70％所選腫瘤樣品中，其表達(dá)水平顯著降低。
在RT-PCR檢測(cè)方法中，先將分離制備的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用我們表1提供的基因特異的引物，進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳條帶的強(qiáng)弱，確定基因表達(dá)產(chǎn)物的高低。
結(jié)果顯示，pir51基因在60％所選腫瘤樣品中表達(dá)上調(diào)。Lis1基因在70％所選腫瘤樣品中表達(dá)上調(diào)。
本發(fā)明人還在6種肝癌細(xì)胞系L02、Bel-7402、Bel-7404、SMMC-7721、HepG2、Huh7中用RT-PCR及Northern blotting雜交方法檢測(cè)5種基因的表達(dá)情況。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lis1在6種細(xì)胞中都有表達(dá)；Beclin1在L02，Bel-7402，HepG2，SMMC-7721中表達(dá)，在Bel-7404，Huh7中不表達(dá)；Pir51在L02，Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2中表達(dá)；RbAp48在L02，Bel-7404，Huh7，HepG2，Bel-7402細(xì)胞中表達(dá)；而Aldolase b只在HepG2細(xì)胞中有微弱表達(dá)，其它肝癌細(xì)胞中不表達(dá)。這些結(jié)果與組織樣品中的檢測(cè)結(jié)果是吻合的。
因此，Aldolase b(醛縮酶b)是在肝癌中特異性低表達(dá)(甚至不表達(dá))的肝癌相關(guān)基因，Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48是在肝癌中特異性高表達(dá)的肝癌相關(guān)基因。
定義如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的肝癌相關(guān)基因”指在肝癌中表達(dá)下調(diào)的醛縮酶b(Aldolase b)基因。有時(shí)，該術(shù)語(yǔ)還包括在肝癌中表達(dá)上調(diào)的Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48基因。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的肝癌相關(guān)蛋白”指在肝癌中表達(dá)下調(diào)的醛縮酶b(Aldolase b)蛋白。有時(shí)，該術(shù)語(yǔ)還包括在肝癌中表達(dá)上調(diào)的Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48蛋白。
如本文所用，“核酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。除非另外說(shuō)明，該術(shù)語(yǔ)已包括能夠與天然核苷酸類似方式發(fā)揮作用的天然核苷酸的類似物。
“亞序列”指含有更長(zhǎng)序列核酸中一部分核酸的核酸序列。
“探針”或“核酸探針”指一種或多種核酸片斷的集合，可檢測(cè)它們與靶目標(biāo)的雜交。探針被如下所述的標(biāo)記，使得可檢測(cè)它與靶目標(biāo)的結(jié)合。探針是用一種或多種特定部分的基因組制備的，例如一種或多種克隆分離的完整染色體或染色體片斷或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物。探針可以用某種方式進(jìn)行加工，例如通過(guò)封閉或去除重復(fù)的核酸或富含獨(dú)特的核酸。因此術(shù)語(yǔ)“探針”不僅指可檢測(cè)的核酸，還指應(yīng)用于靶目標(biāo)的可檢測(cè)核酸。
“雜交”指通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)而使兩個(gè)單鏈核酸結(jié)合在一起。
“基本結(jié)合于”或“特異結(jié)合”或“選擇性結(jié)合”或“特異性雜交于”，指在寡核苷酸和靶序列之間的互補(bǔ)雜交反應(yīng)，并可包括微小的錯(cuò)配，這些錯(cuò)配可通過(guò)降低雜交介質(zhì)的嚴(yán)緊度來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)所需靶多核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還指在嚴(yán)緊條件下，一分子結(jié)合、復(fù)合或雜交與特定核苷酸序列，當(dāng)該序列存在于復(fù)合的混合物中(如總細(xì)胞NDA或RNA)時(shí)。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊條件”指探針雜交于靶定亞序列而不雜交于其他序列的條件。嚴(yán)緊條件是依賴于序列的，并且在不同情況下是不同的。較長(zhǎng)的序列可在更高的溫度下特異性雜交。通常，選定的嚴(yán)緊條件是比在限定的離子強(qiáng)度和pH下推定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5℃。該Tm是在達(dá)到平衡時(shí)，有約50％與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交時(shí)的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。通常，對(duì)于短探針而言，嚴(yán)緊條件是這樣的條件，其中鹽濃度至少約0.02Na離子濃度(或其他鹽)，pH7.0-8.3，且溫度至少約60℃。嚴(yán)緊條件還可通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實(shí)現(xiàn)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，此處所述的具體探針的確切序列可以被一定程度地修改(修飾)，以產(chǎn)生與所公開(kāi)的探針“基本相同”但保留基本結(jié)合于靶序列能力的探針。這些修改被本文各探針?biāo)采w。術(shù)語(yǔ)多核苷酸的“基本相同”指，與參照序列相比，一個(gè)序列有至少90％，更佳地至少95％序列相同性。
兩個(gè)核苷酸序列被認(rèn)為“相同”，如果以最大對(duì)應(yīng)性排列時(shí)，兩個(gè)序列中的核苷酸序列是相同的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指互補(bǔ)序列與參照序列的全部或一部分是序列的。
兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較，通常是將兩個(gè)序列的序列在“比較窗”范圍內(nèi)進(jìn)行比較，以鑒別和比較局部區(qū)域的序列相同性。如本文所用，“比較窗”指至少約20個(gè)鄰接位置，通常約50-200，更通常約為100-150個(gè)鄰接位置，其中在兩個(gè)序列被最佳排列后，將一個(gè)序列與具有相同數(shù)目鄰接位點(diǎn)的參照序列進(jìn)行比較。
“序列相同性百分比”的確定，是通過(guò)將兩個(gè)最佳排列的序列在比較窗內(nèi)進(jìn)行比較而得出的。其中與參照序列(不含有插入或缺失)相比，為了獲得兩個(gè)序列的最佳排列，在比較窗中的多核苷酸序列可含有插入或缺失(即缺口)。百分比的計(jì)算如下通過(guò)確定在兩個(gè)序列中相同核酸堿基或氨基酸殘基的數(shù)目，得到匹配位置的數(shù)目。然后將匹配位置數(shù)目除以比較窗中位置數(shù)目的總數(shù)，并將結(jié)果乘以100％，從而得到序列相同性百分比。
另一種表明核苷酸序列是基本相同的方法，是判斷兩個(gè)分子是否在嚴(yán)緊條件下雜交于同一序列。嚴(yán)緊條件是依賴于序列的，并且在不同情況下是不同的。
標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的探針是適用于原位雜交的探針。在雜交反應(yīng)之前，核酸探針可以被可檢測(cè)地標(biāo)記?；蛘撸褂媒Y(jié)合于雜交產(chǎn)物的可檢測(cè)標(biāo)記物。這些可檢測(cè)標(biāo)記物是本領(lǐng)域熟知的，并且包括任何具有可檢測(cè)的物理或化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)。
如本文所用，“標(biāo)記物”是任何一種可通過(guò)光譜法、光電法、生物化學(xué)法、免疫化學(xué)法、或化學(xué)法檢測(cè)的物質(zhì)。可用于本發(fā)明的標(biāo)記物包括放射性標(biāo)記物(如32P，125I，14C，3H，35S)，熒光染料(如熒光素、羅丹明)，電子致密試劑(如)金，酶(如ELISA中常用的酶)，比色標(biāo)記(如膠體金)，磁標(biāo)記(如DynabeadsTM)等。不直接檢測(cè)但可通過(guò)使用直接檢測(cè)標(biāo)記物而被檢測(cè)的標(biāo)記物例子，包括生物素、地高辛、以及已有標(biāo)記抗血清或單抗的半抗原和蛋白質(zhì)。
使用具體的標(biāo)記物對(duì)于本發(fā)明而言并不重要，然而優(yōu)選是的熒光標(biāo)記物(如熒光素-12-dUTP等)。
如本文所用，直接標(biāo)記的探針是附著有可檢測(cè)標(biāo)記物的探針。因?yàn)橹苯訕?biāo)記物已附著在探針上，因此隨后不需要步驟將探針與可檢測(cè)標(biāo)記物關(guān)聯(lián)起來(lái)。與之相反，間接標(biāo)記的探針是攜帶隨后(通常在探針與靶核酸雜交后)能結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記物的分子的探針。
此外，探針應(yīng)能檢測(cè)盡可能低的拷貝數(shù)，從而使分析的靈敏度最高，同時(shí)又能高于背景信號(hào)。最后，必需選擇可提供高局部信號(hào)的探針，從而在將染色結(jié)果與染色體進(jìn)行物理定位時(shí)可提供高空間分辨率，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法，將標(biāo)記物偶聯(lián)于探針。在優(yōu)選例子中，核酸探針是用缺口翻譯或隨機(jī)引物延伸法標(biāo)記的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的探針沒(méi)有必要對(duì)肝癌相關(guān)基因絕對(duì)特異。相反，探針是用于產(chǎn)生“染色反差”的?！胺床睢笔怯稍诨蚪M靶區(qū)域中探針濃度與基因組其他區(qū)域中探針濃度之比確定的。
如上所述，檢測(cè)到肝癌相關(guān)基因的擴(kuò)增是多種癌癥存在與否以及預(yù)后的標(biāo)志，尤其是肝癌。
在優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)將本發(fā)明的探針與靶核酸(如染色體樣品)的雜交來(lái)檢測(cè)肝癌相關(guān)基因的擴(kuò)增。合適的雜交方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括(但并不限于)各種Northern印跡法、原位雜交和定量擴(kuò)增方法(如定量PCR和半定量PCR)。
在一優(yōu)選例中，肝癌相關(guān)基因擴(kuò)增是通過(guò)原位雜交鑒別的。通常，原位雜交包括下列主要步驟(1)固定待分析的組織或生物結(jié)構(gòu)；(2)對(duì)生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)雜交以增加靶DNA的可接近性(acessibility)，并減少非特異性結(jié)合；(3)將核酸混合物與生物結(jié)構(gòu)或組織中的核酸進(jìn)行雜交；(4)進(jìn)行雜交后的洗滌以去除在雜交反應(yīng)中未雜交的核酸；和(5)檢測(cè)雜交的核酸片段。根據(jù)具體應(yīng)用，用于每一步驟的試劑及使用條件可以變化。
用于檢測(cè)的樣品的例子包括來(lái)自腫瘤的少量活檢樣品，尤其是肝細(xì)胞和肝組織。
在Northern印跡法中，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA與對(duì)靶區(qū)域特異的探針雜交。將來(lái)自針對(duì)靶區(qū)域的探針的雜交信號(hào)強(qiáng)度，與對(duì)照信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，從而提供靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)的估測(cè)值。
檢測(cè)方法用于檢測(cè)某一基因在待測(cè)細(xì)胞中表達(dá)量的方法是本領(lǐng)域中已知的。代表性的例子包括Northern雜交、定量和半定量PCT(包括RT-PCR)、DNA芯片檢測(cè)法、蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)法、抗原-抗體檢測(cè)法(如ELISA法)。此外，也可使用原位雜交法。上述這些方法都可用于本發(fā)明。相關(guān)的儀器和試劑可以購(gòu)自Sigma等公司。
肝癌相關(guān)基因的核酸、蛋白和抗體基于本發(fā)明所揭示的肝癌相關(guān)基因與肝癌的相關(guān)性以及肝癌相關(guān)基因的序列信息，利用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來(lái)產(chǎn)生肝癌相關(guān)蛋白或片段，并用相應(yīng)的肝癌相關(guān)蛋白或片段來(lái)產(chǎn)生抗肝癌相關(guān)基因的抗體。
本發(fā)明的人肝癌相關(guān)基因(Aldolase b、Beclin1、Lis1、Pir51、和RbAp48)都是在本發(fā)明之前的已知蛋白，其基本信息如下所示

Aldolase b是葡萄糖和果糖代謝的關(guān)鍵酶，是肝臟特異表達(dá)的基因。
Beclin1是一個(gè)Bcl-2結(jié)合蛋白，在乳腺癌與卵巢癌中表達(dá)缺失，可能是乳腺癌的一個(gè)抑癌基因。另外，Beclin1在神經(jīng)細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，可以抑制Sindbis病毒的復(fù)制，降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)的凋亡。
Lis1基因據(jù)報(bào)道與人無(wú)腦回綜合癥I的發(fā)生有關(guān)。Lis1蛋白在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，含有7個(gè)WD重復(fù)序列，可以介導(dǎo)蛋白與蛋白的相互作用。Lis1是血小板活化因子乙?；饷傅囊粋€(gè)亞基。另外，Lis1也與微管蛋白(tubulin)結(jié)合直接影響微管的運(yùn)動(dòng)。過(guò)量表達(dá)Lis1可以通過(guò)影響紡錘體與染色體的結(jié)合進(jìn)而影響細(xì)胞分裂。
Pir51是人Rad51重組酶的結(jié)合蛋白。真核細(xì)胞的Rad51蛋白在同源重組中起到很重要的作用，對(duì)細(xì)胞的增殖也是必須的。Pir51與Rad51結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Rad51的功能。
RbAp48是一個(gè)Rb結(jié)合蛋白。RbAp48還是染色質(zhì)組裝因子的一個(gè)亞基，又是組蛋白去乙?；笍?fù)合物的一個(gè)成員。RbAp48還與CREB結(jié)合。RbAp48的功能非常復(fù)雜，目前為止，了解的還不是很清楚。
本發(fā)明的人肝癌相關(guān)基因的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人肝癌相關(guān)基因DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人肝癌相關(guān)基因基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人肝癌相關(guān)基因基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人肝癌相關(guān)蛋白的分子，也包括那些并不影響人肝癌相關(guān)蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人肝癌相關(guān)基因基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人肝癌相關(guān)基因基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人肝癌相關(guān)基因或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人肝癌相關(guān)基因功能的抗體以及不影響人肝癌相關(guān)基因功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人肝癌相關(guān)基因基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人肝癌相關(guān)基因基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
基于特異性的抗肝癌相關(guān)蛋白抗體，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)腫瘤或腫瘤易感性的方法，它包括步驟在適合形成抗體復(fù)合物的條件下，將含有特異性抗Aldolase b的抗體與待測(cè)個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行接觸；和檢測(cè)形成的抗體復(fù)合物數(shù)量是否低于正常對(duì)照，其中形成的抗體復(fù)合物數(shù)量低于正常對(duì)照就表示該個(gè)體患有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。
此外，該方法還可與在肝癌中表達(dá)上調(diào)的其他肝癌相關(guān)基因(如Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)的檢測(cè)相結(jié)合，例如在適合形成抗體復(fù)合物的條件下，將含有特異性抗肝癌相關(guān)蛋白(Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)的抗體與待測(cè)個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行接觸；和檢測(cè)形成的抗體復(fù)合物數(shù)量是否高于正常對(duì)照，其中形成的抗體復(fù)合物數(shù)量高于正常對(duì)照就表示該個(gè)體患有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。
試劑盒本發(fā)明還提供了診斷肝癌相關(guān)基因異常的診斷試劑盒。在優(yōu)選例中，一種試劑盒包括一種或多種針對(duì)肝癌相關(guān)基因的探針。該試劑盒還可含有封閉探針以及描述如何使用試劑盒來(lái)檢測(cè)肝癌相關(guān)基因的說(shuō)明材料。試劑盒還可含有下組中的一種或多種用于協(xié)助檢測(cè)探針的各種標(biāo)記物或標(biāo)記試劑；用于雜交的試劑(包括緩沖液等)；以及陽(yáng)性和陰性雜交對(duì)照等。
另一種優(yōu)選的檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒包括特異性擴(kuò)增肝癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的引物和說(shuō)明書(shū)，所述的肝癌相關(guān)基因是Aldolase b。
另一種優(yōu)選的檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的抗體和說(shuō)明書(shū)，所述的肝癌相關(guān)基因是Aldolase b。
另一種優(yōu)選的檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒包括檢測(cè)肝癌相關(guān)基因的芯片和說(shuō)明書(shū)，所述芯片選自下組(a)DNA芯片，所述芯片具有基片和點(diǎn)樣于基片上點(diǎn)樣區(qū)的點(diǎn)樣DNA，所述的點(diǎn)樣DNA包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的探針，所述的肝癌相關(guān)基因是Aldolase b；(b)蛋白質(zhì)芯片，所述芯片具有基片和點(diǎn)樣于基片上點(diǎn)樣區(qū)的點(diǎn)樣蛋白，所述的點(diǎn)樣蛋白包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的抗體，所述的肝癌相關(guān)基因是Aldolase b。
此外，在上述各試劑盒中，都可額外地含有其他腫瘤相關(guān)因子(尤其是Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48)的特異性探針、或特異性抗體。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了新的肝癌相關(guān)基因，不僅填補(bǔ)了檢測(cè)的盲區(qū)，而且這些這些肝癌相關(guān)基因可作為肝癌診斷，基因治療，藥物治療的靶點(diǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1建立肝癌和癌旁正常肝組織的基因差異表達(dá)譜。
取在液氮中保存的肝癌和癌旁正常肝組織，按常規(guī)方法分離和提取總RNA。RNA的抽提用Trizol試劑(Life Teclonlogies，Inc，N.Y.，USA)。每50-100mg組織樣品，加入1ml Trizol，勻漿，室溫放置5分鐘；然后，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩，充分混勻，室溫靜置2-3分鐘；12,000g，4℃離心15分鐘；吸取上清于另一Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘。12,000g，4℃離心收集總RNA，沉淀用75％乙醇洗滌一次，抽干，溶于無(wú)菌水中?？俁NA經(jīng)變性甲醛瓊脂糖電泳檢查無(wú)降價(jià)后，用于mRNA的制備。一次反應(yīng)用200ug總RNA分離制備mRNA，mRNA的分離采用Oligotex mRNA minkit(Qiagen，Hilden，Germany)試劑盒。
cDNA微陣列采用LifeGrid 1.0微陣列膜購(gòu)自Incyte Genomic公司，該膜含有約8千4百個(gè)cDNA的PCR產(chǎn)物和27個(gè)對(duì)照，按雙點(diǎn)模式，印在一個(gè)12×22cm的尼龍膜上。來(lái)自肝癌和癌旁正常肝組織的mRNA分別在a-33P dCTP存在的條件下，用逆轉(zhuǎn)錄生成33P-標(biāo)記的cDNA探針。標(biāo)記摻入百分比不小于40％。每個(gè)cDNA探針與微陣列雜交的條件見(jiàn)LifeGrid 1.0微陣列的說(shuō)明書(shū)。雜交過(guò)夜后的膜，室溫晾干，由磷屏儀(Phosphor image)曝光并掃描，掃描結(jié)果即雜交信號(hào)的計(jì)算機(jī)分析解讀由Incyte公司完成。
根據(jù)Incyte公司提供的計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，獲得了肝癌和癌旁正常肝組織8400個(gè)基因的表達(dá)圖譜(圖1)。把正常肝組織和肝癌組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比，去除在正常肝組織和肝癌組織中都表達(dá)缺失的基因，去除相同cDNA兩個(gè)點(diǎn)差異大于2.5倍和一個(gè)點(diǎn)不到背景2倍的基因。最后，在正常肝組織和肝癌組織中，檢測(cè)到有6542個(gè)基因表達(dá)。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)在肝癌中有256個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，267個(gè)表達(dá)下調(diào)，這些表達(dá)上調(diào)或下調(diào)基因都是指大于4倍的表達(dá)差異。從這些表達(dá)差異的基因中，選擇與細(xì)胞分裂、基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝等有關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。Beclin1，Lis1，Pir51，RbAp48，Aldolase b是在肝癌中高表達(dá)或低表達(dá)5個(gè)基因。
實(shí)施例2Beclin1，RbAp48，Aldolase b和Pir51四種基因在肝癌和癌旁正常組織中的表達(dá)檢測(cè)按實(shí)施例1的方法制備總RNA，用SuperscripII反轉(zhuǎn)錄酶(Life TechonlogiesInc，N.Y.，USA)制備cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件按試劑盒說(shuō)明，在20ul反應(yīng)混合物中加入3ug總RNA。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)表1提供的引物，按表1所列的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得相應(yīng)基因的片段。

(a)Northern印跡分析同位素α-32P-dCTP標(biāo)記基因的片段作為探針，進(jìn)行Northern印跡分析每個(gè)泳道約15ug來(lái)自肝癌組織或癌旁正常組織的總RNA經(jīng)含甲醛的1％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。80℃，烤膜1小時(shí)，使RNA固定在膜上。在ExpressHyb雜交液(ClonTechInc，California，USA)中，68℃雜交3小時(shí)。用含0.1％SDS的2×SSC，室溫下洗膜一次，然后用含0.1％SDS的0.1×SSC，68度洗膜兩次，每次20分鐘，最后壓片1到6天，-80℃，放射自顯影。Northern blot的具體操作見(jiàn)Sambrook等人所著’分子克隆’實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。
檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，Beclin1、RbAp48和Aldolase b的檢測(cè)是采用Northern blot的方法，pir51的表達(dá)水平太低，采用PT-PCR的方法。Beclin1和RbAp48在腫瘤樣品中表達(dá)水平顯著上升，而正常肝組織中檢測(cè)不到；Aldolase b在70％所選腫瘤樣品中，其表達(dá)水平顯著降低。
(b)RT-PCR檢測(cè)方法首先將分離制備的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用我們表1提供的基因特異的引物，進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳條帶的強(qiáng)弱，確定基因表達(dá)產(chǎn)物的高低。
結(jié)果顯示，pir51基因在60％所選腫瘤樣品中表達(dá)上調(diào)。
實(shí)施例3Beclin1，RbAp48，Aldolase b，和Pir51四種基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)用與實(shí)施例2相同的RT-PCR方法檢測(cè)了6種肝細(xì)胞系(L02，Bel-7404，SMMC-7721，Bel-7402，HuH7，HepG2)中Beclin1，RbAp48，pir51及Aldolase b的表達(dá)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)Beclin1在L02，Bel-7402，HepG2，SMMC-7721四種細(xì)胞中表達(dá)，在Bel-7404，Huh7二種細(xì)胞中不表達(dá)；RbAp48在L02，Bel-7404，Huh7，HepG2，Bel-7402五種細(xì)胞中表達(dá)，在SMMC-7721細(xì)胞中不表達(dá)；Pir51在L02，Bel-7402，Bel-7404，SMMC-7721，HepG2五種細(xì)胞中都表達(dá)，在HuH7細(xì)胞中不表達(dá)；而Aldolase b只在HepG2細(xì)胞中有微弱表達(dá)，其它肝癌細(xì)胞中不表達(dá)。這個(gè)結(jié)果與組織樣品中的檢測(cè)結(jié)果是吻合的，即Beclin1，RbAp48和Pir51在大部分肝癌細(xì)胞中表達(dá)，而Aldolase b在大部分肝癌細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)(圖3)。
實(shí)施例4Lis1基因在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)檢測(cè)我們采用Northern點(diǎn)印跡法檢測(cè)Lis1基因在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)。按實(shí)施例1的方法制備總RNA，將各種來(lái)源的總RNA分別以每點(diǎn)5μg，10μg，20μg的量點(diǎn)在Hybond-N+尼龍膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。80℃，烤膜1小時(shí)，使RNA固定在膜上。在ExpressHyb雜交液(ClonTech Inc，California，USA)中，68℃雜交3小時(shí)。用含0.1％SDS的2×SSC，室溫下洗膜一次，然后用含0.1％SDS的0.1×SSC，68度洗膜兩次，每次20分鐘，最后壓片1到3天，-80℃，放射自顯影。Northern Dot Blot的具體操作見(jiàn)Sambrook等人所著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Lis1基因在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，正常肝組織和癌旁組織中不表達(dá)或低表達(dá)(圖4)。
實(shí)施例5肝癌易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱 Beclin1引物 濃度正向引物 SEQ ID NO1 干粉20D反向引物 SEQ ID NO2 干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液實(shí)施例6肝癌易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱 Lis1引物 濃度正向引物 SEQ ID NO3 干粉20D反向引物 SEQ ID NO4 干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液實(shí)施例7肝癌易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱 Pir51引物 濃度正向引物 SEQ ID NO5 干粉20D反向引物 SEQ ID NO6 干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液實(shí)施例8肝癌易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱 RbAp48引物濃度正向引物 SEQ ID NO7 干粉20D
反向引物 SEQ ID NO8 干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液實(shí)施例9多檢測(cè)因子的肝癌易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱 Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48的引物 濃度正向引物 SEQ ID NO1，3，5，7 各干粉20D反向引物 SEQ ID NO2，4，6，8 各干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液實(shí)施例10肝癌易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱 Aldolase b的引物 濃度正向引物 SEQ ID NO9 干粉20D反向引物 SEQ ID NO10 干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液取待檢測(cè)男性病人的少量肝細(xì)胞，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從肝細(xì)胞中提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將實(shí)施例5-9肝癌檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所獲得的cDNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳條帶的強(qiáng)弱，確定基因表達(dá)產(chǎn)物的高低。
檢測(cè)結(jié)果，Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48表達(dá)量上調(diào)以及Aldolase b表達(dá)量下調(diào)表示肝癌易感性高于正常人群。
實(shí)施例11多檢測(cè)因子的肝癌易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱 Beclin1、Lis1、Pir51、RbAp48濃度和Aldolase b的引物正向引物 SEQ ID NO1，3，5，7，9各干粉20D反向引物 SEQ ID NO2，4，6，8，10 各干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>肝癌細(xì)胞表達(dá)下調(diào)基因及其應(yīng)用<130>035913<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cttaccacag cccaggcgaa ac22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2gccagagcat ggagcagcaa 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3acattacagc caagatggtg 20<210>4<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4aatcaacggc actcccacac 20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8atggctcaga cacctacctc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>10tctccttccc aacctaccac 20<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11tgacggggtc acccacactg tgcc 24<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12cttagaagca ttgcggtgga cgatg 2權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞中肝癌相關(guān)基因表達(dá)水平是否下調(diào)的方法，其特征在于，它包括步驟(a)檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b；(b)將待測(cè)細(xì)胞中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平與對(duì)照相比較，從而確定肝癌相關(guān)基因表達(dá)水平是否下調(diào)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中判斷下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平低1.5-100倍。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中判斷下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平低3-50倍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的待測(cè)細(xì)胞是肝細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的檢測(cè)是通過(guò)核酸芯片檢測(cè)法、半定量PCR法、定量PCR法、蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)法、或抗原-抗體檢測(cè)法進(jìn)行。
6.一種檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增肝癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的引物和說(shuō)明書(shū)，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b。
7.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO9和10所示的序列。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有選自下組的1-4對(duì)引物(i)Beclin 1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO1和2所示的序列；(ii)Lis 1特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO3和4所示的序列；(iii)Pir51特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO5和6所示的序列；(iv)RbAp48特異性引物，所述引物具有SEQ ID NO7和8所示的序列。
9.一種檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒，其特征在于，它包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的抗體和說(shuō)明書(shū)，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b。
10.一種檢測(cè)腫瘤易感性的試劑盒，其特征在于，它包括檢測(cè)肝癌相關(guān)基因的芯片和說(shuō)明書(shū)，所述芯片選自下組(a)DNA芯片，所述芯片具有基片和點(diǎn)樣于基片上點(diǎn)樣區(qū)的點(diǎn)樣DNA，所述的點(diǎn)樣DNA包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的探針，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b；(b)蛋白質(zhì)芯片，所述芯片具有基片和點(diǎn)樣于基片上點(diǎn)樣區(qū)的點(diǎn)樣蛋白，所述的點(diǎn)樣蛋白包括特異性結(jié)合于肝癌相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物的抗體，所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對(duì)個(gè)體的腫瘤(如肝癌)易感性進(jìn)行診斷的方法它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平，并與正常人群中肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平相比較，存在差異就表明該個(gè)體患腫瘤的可能性高于正常人群，其中所述的肝癌相關(guān)基因是醛縮酶b，所述的差異是表達(dá)下調(diào)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1635143SQ200310124559
公開(kāi)日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者趙慕鈞, 宋海, 夏雙絡(luò), 王冀飛, 李載平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院