專利名稱：：使用可選剪接在真核細(xì)胞中表達(dá)多肽多聚體的方法和構(gòu)建物的制作方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本文公開的發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及使用可選剪接在體外和在體內(nèi)在真核細(xì)胞中表達(dá)多肽多聚體的載體和方法。還包括用于生成包含這些載體的細(xì)胞的方法，以及這些載體及由其表達(dá)的多肽用于治療疾病和用于在體內(nèi)或在體外高效生產(chǎn)此類多聚體蛋白質(zhì)的用途。背景和相關(guān)技術(shù)的描述多肽多聚體是一起形成復(fù)合物的兩條或多條多肽的裝配物。構(gòu)成復(fù)合物的多肽通常是不同的?？贵w是典型的多肽多聚體，因?yàn)樗鼈冇梢黄鹦纬伤木垠w復(fù)合物的兩條抗體輕鏈多肽和兩條抗體重鏈多肽構(gòu)成。在宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽多聚體是富有挑戰(zhàn)性的過程，因?yàn)楸仨毿⌒膮f(xié)調(diào)構(gòu)成多肽多聚體的每種不同多肽的表達(dá)。例如，為了在真核細(xì)胞中表達(dá)抗體，必須將編碼抗體輕鏈的第一基因和編碼抗體重鏈的第二基因?qū)爰?xì)胞，并在可接受的比例范圍內(nèi)表達(dá)。同一細(xì)胞或培養(yǎng)系統(tǒng)中不能接受的抗體輕鏈與重鏈表達(dá)比例可導(dǎo)致期望的多聚體復(fù)合物的生產(chǎn)高度無效，或是導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞或生物體毒性。過去用于在真核細(xì)胞中表達(dá)多肽多聚體的方法包括導(dǎo)入兩種或多種載體，每種載體分開編碼構(gòu)成多肽多聚體的每種不同多肽。每種載體通常攜帶驅(qū)動(dòng)復(fù)合物一種多肽表達(dá)的啟動(dòng)子，而且至少一種載體通常編碼選擇標(biāo)記。然后，將載體連續(xù)或一起導(dǎo)入細(xì)胞(通常通過轉(zhuǎn)染)，并就兩種選擇標(biāo)記的表達(dá)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共選擇。在另一種方法中，將構(gòu)成多肽復(fù)合物的每種多肽的編碼序列與啟動(dòng)子一起插入單一載體。此方法消除了操作多種載體的需要，但是仍然沒有消除每種編碼序列間啟動(dòng)子競(jìng)爭的可能性。同樣，此方法通常不能解決以可接受的比例表達(dá)構(gòu)成蛋白質(zhì)多聚體的各種多肽從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)多聚體的高效表達(dá)的問題。如此，在上述兩種方法中，不能始終在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)兩種產(chǎn)物的一貫比例。這可能是由于諸如下列因素，不同啟動(dòng)子活性、啟動(dòng)子競(jìng)爭最佳表達(dá)所需要的細(xì)胞因素、蛋白質(zhì)多聚體成分多肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯效率、和/或?qū)爰?xì)胞的每種載體的拷貝數(shù)的差異。還已經(jīng)開發(fā)了利用單一剪接供體和剪接受體的剪接載體。美國專利號(hào)5,043,270公開了一種小基因，它表達(dá)選擇標(biāo)記，如DHFR，且具有包含編碼目的蛋白質(zhì)的基因的內(nèi)含子。美國專利號(hào)5,561,053公開了倒轉(zhuǎn)占位(inversesituation)，其中編碼目的蛋白質(zhì)的基因在編碼序列的5’端含有內(nèi)含子。此內(nèi)含子含有以剪接供體和受體為界的編碼選擇標(biāo)記的基因。這種類型的內(nèi)含子表達(dá)載體還描述于Lukas，B.K.等，NucleicAcidsRes.241774-1779，1996。美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2005/0019925A1公開了具有融合選擇標(biāo)記的類似內(nèi)含子載體。它還公開了兩對(duì)剪接供體和剪接受體用于表達(dá)超過一種目的蛋白質(zhì)的用途。然而，所有這些發(fā)表的構(gòu)建物依賴成對(duì)的剪接供體和剪接受體，即單一剪接受體有一個(gè)剪接供體來匹配。每一種這些構(gòu)建物的效力依賴所有位點(diǎn)的高效剪接。沒有涉及使用單一剪接供體來激活超過一個(gè)剪接受體的可選剪接以表達(dá)多種多肽。另外，沒有提出需要以不同比例表達(dá)多肽或者替換不同剪接受體以控制多肽的相對(duì)表達(dá)。因此，需要以一貫比例連接兩種或多種基因的表達(dá)使得所得基因產(chǎn)物高效生成和裝配的構(gòu)建物。發(fā)明概述通過經(jīng)由可選剪接的使用連接兩種或多種基因的表達(dá)，本發(fā)明解決了使用一種表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽多聚體的上述問題。因此，可使用具有一個(gè)啟動(dòng)子的單一載體來驅(qū)動(dòng)可剪接成兩種或多種不同mRNA轉(zhuǎn)錄物的前mRNA的表達(dá)，使得所述兩種或多種mRNA轉(zhuǎn)錄物編碼不同多肽。如此，兩種或多種產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)不受獨(dú)立啟動(dòng)子的不同活性、啟動(dòng)子競(jìng)爭或載體拷貝數(shù)的影響。具體而言，本發(fā)明提供了用于將使用單一啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)單一前mRNA轉(zhuǎn)錄的單一表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法，所述前mRNA隨后可選剪接成兩種或多種不同基因產(chǎn)物，它們隨后可翻譯成兩種或多種不同多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因產(chǎn)物編碼多聚體蛋白質(zhì)的多肽亞基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因產(chǎn)物是構(gòu)成抗體的抗體輕鏈和重鏈。因此，本發(fā)明具有幾項(xiàng)優(yōu)勢(shì)，包括但不限于下列各項(xiàng)-提供了用于表達(dá)多種多肽，特別是異聚體多肽諸如抗體或抗體片段的載體；-在真核細(xì)胞諸如動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞中生產(chǎn)多種多肽，例如抗體重鏈和輕鏈多肽的有效方法；-生產(chǎn)用于診斷性或治療性應(yīng)用的重組抗體的有效方法；和-通過所述方法生產(chǎn)的重組抗體，用于治療需要重組抗體治療的受試者。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以5’至3’或順流方向包含啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子；5’非翻譯區(qū)(UTR)，提供如加帽信號(hào)；剪接供體；內(nèi)含子；第一剪接受體；編碼第一多肽的第一外顯子；第二剪接受體；和編碼第二多肽的第二外顯子的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子可操作連接所述第一和第二外顯子。剪接位點(diǎn)(即供體和受體)可以是天然存在的剪接位點(diǎn)、經(jīng)過改造的剪接位點(diǎn)，例如合成的剪接位點(diǎn)、規(guī)范的或共有的剪接位點(diǎn)、或非規(guī)范的剪接位點(diǎn)，如隱蔽剪接位點(diǎn)。每個(gè)外顯子還可包含聚腺苷酸化信號(hào)。在此，術(shù)語“第一”或“第二”在用于遺傳元件諸如外顯子、內(nèi)含子、任何剪接位點(diǎn)等時(shí)僅僅用于彼此鑒別和區(qū)分各種元件，并非涉及所述元件在基因內(nèi)的實(shí)際線性位置或編號(hào)或是編碼蛋白質(zhì)多聚體各個(gè)多肽成分的前mRNA分子的表達(dá)順序。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含一個(gè)剪接供體和超過一個(gè)剪接受體，例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多剪接受體。每個(gè)剪接受體與緊挨著位于該剪接受體下游的外顯子相連。因此，所述載體包含超過一個(gè)外顯子，例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多外顯子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一多肽是抗體重鏈，而所述第二多肽是抗體輕鏈，或者，所述第一多肽是抗體輕鏈，而所述第二多肽是抗體重鏈。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述重鏈和/或輕鏈?zhǔn)鞘笤吹摹⑶逗系摹⑷嗽椿幕蛉说?。所述輕鏈和重鏈可包含氨基酸改變，諸如在如Fc區(qū)中引入或消除糖基化位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1至約1∶20、約15∶1至約1∶15、約12∶1至約1∶12、約10∶1至約1∶10、約9∶1至約1∶9、約8∶1至約1∶8、約7∶1至約1∶7、約6∶1至約1∶6、約5∶1至約1∶5、約4∶1至約1∶4、約3∶1至約1∶3、約2∶1至約1∶2、或約1∶1的比例表達(dá)。在具體的實(shí)施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1、約19∶1、約18∶1、約17∶1、約16∶1、約15∶1、約14∶1、約13∶1、約12∶1、約11∶1、約10∶1、約9∶1、約8∶1、約7∶1、約6∶1、約5∶1、約4∶1、約3∶1、約2∶1、約1∶1、約1∶2、約1∶3、約1∶4、約1∶5、約1∶6、約1∶7、約1∶8、約1∶9、約1∶10、約1∶11、約1∶12、約1∶13、約1∶14、約1∶15、約1∶16、約1∶17、約1∶18、約1∶19、或約1∶20的比例表達(dá)。該比例的測(cè)定通常使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)來測(cè)定，諸如逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或Northern印跡(用于測(cè)量轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量)或免疫印跡或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)技術(shù)(用于測(cè)量多肽的相對(duì)量)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含SEQIDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述載體包含SEQIDNO29。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含能夠表達(dá)兩種或多種可選剪接基因產(chǎn)物的上述載體的真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的可選剪接載體整合到細(xì)胞的染色體DNA中，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是附加體。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的可選剪接盒或構(gòu)建物整合到細(xì)胞的染色體DNA中。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的可選剪接盒或構(gòu)建物是附加體。在另一些其它相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的可選剪接載體包含病毒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明載體的真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如例如幼倉鼠腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、NSO細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞或CHO細(xì)胞，或是昆蟲細(xì)胞，諸如例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf9)細(xì)胞、甘藍(lán)銀紋夜蛾(Tricoplusiani)(Tn.TnHigh-Five)細(xì)胞或家蠶蛾(Bombyxmori)(BMN)細(xì)胞?；蛘?，含有本發(fā)明載體的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞，例如糖酵母(Saccharomyces)細(xì)胞、裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces)細(xì)胞或畢赤酵母(Pichia)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)含有本發(fā)明可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物的上述細(xì)胞，隨后由所述細(xì)胞培養(yǎng)物分離所述第一和所述第二多肽。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二多肽形成多肽多聚體，諸如抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過該方法生產(chǎn)的上述肽多聚體，用于制造用于治療或預(yù)防疾病或紊亂的藥物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在體內(nèi)將所述可選剪接載體或可選剪接盒或構(gòu)建物投遞至患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以回體(exvivo)將所述可選剪接載體或可選剪接盒或構(gòu)建物投遞至患者的細(xì)胞或組織。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了將包含所述可選剪接載體或可選剪接盒或構(gòu)建物的患者細(xì)胞或組織返還患者體內(nèi)。根據(jù)下文詳述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。附圖簡述圖1顯示了本發(fā)明可選剪接載體的結(jié)構(gòu)和功能方面的示意圖，所述載體設(shè)計(jì)成容許單一啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)單一前mRNA的轉(zhuǎn)錄，它隨后可以可選剪接成兩種或多種轉(zhuǎn)錄物。所述兩種或多種轉(zhuǎn)錄物隨后翻譯成兩種或多種相應(yīng)多肽。圖2顯示了本發(fā)明的表達(dá)載體在用于表達(dá)抗體輕鏈和重鏈且它們隨后裝配形成成熟四聚體抗體時(shí)的示意圖。圖3是為了在真核細(xì)胞中生產(chǎn)抗體而設(shè)計(jì)成由單一啟動(dòng)子表達(dá)抗體輕鏈和重鏈的本發(fā)明可選剪接載體的質(zhì)粒圖譜。該質(zhì)粒圖譜還指出了剪接位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、聚腺苷酸化序列、及用于在真核細(xì)胞中進(jìn)行選擇(DHFR)和在原核細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增(β-內(nèi)酰胺酶)的標(biāo)記的位置和取向。還可參見SEQIDNO29，它提供了載體主鏈的序列。圖4顯示了所測(cè)試第一剪接受體的剪接位點(diǎn)、內(nèi)含子和外顯子區(qū)(分別是小寫和大寫)的序列，及相應(yīng)的質(zhì)粒名稱和序列標(biāo)識(shí)符。發(fā)明詳述為了提供對(duì)說明書和權(quán)利要求的清楚理解，下文方便的提供了下列定義。定義術(shù)語“第一多肽”和“第二多肽”指希望其共表達(dá)的多肽。這些包括例如由多個(gè)多肽亞基構(gòu)成的多聚體蛋白質(zhì)的多肽“鏈”。這些多聚體蛋白質(zhì)可以是在自然界中發(fā)現(xiàn)的，例如本領(lǐng)域所描述的。當(dāng)然，術(shù)語“第一多肽”和“第二多肽”還可在將來用于描述本領(lǐng)域目前尚未描述過的多聚體蛋白質(zhì)。這些多聚體蛋白質(zhì)還可以是人造的，如由在自然界中通常發(fā)現(xiàn)不締合的多肽構(gòu)成。另外，所述多肽可以是不締合在一起的，但是為了一些功能目的而共表達(dá)，例如選擇標(biāo)記和目的多肽的共表達(dá)。另外，所述多肽可以是天然序列或突變的，諸如通過氨基酸添加、刪除或替代。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易的認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的載體適用于廣泛的多肽，而且能夠使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)修改所述載體以適應(yīng)這些多肽的使用。術(shù)語“抗體”或“抗體片段”指多肽或多肽片段的裝配物，它們具有針對(duì)靶多肽或受體的結(jié)合活性，或者具有期望的效應(yīng)物功能。通常，此類裝配物至少包括抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)，例如Fab片段，或是兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈，四條鏈一起形成四聚體抗體(L:H:H:L)，其可變區(qū)能夠結(jié)合抗原。本發(fā)明的抗體可以是本領(lǐng)域知道的任何形式，例如鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。還可以修飾本發(fā)明的抗體以具有其它特征，諸如改變的糖基化位點(diǎn)或Fc區(qū)。術(shù)語“UTR”意為非翻譯區(qū)，指轉(zhuǎn)錄成前mRNA和成熟mRNA非翻譯區(qū)的核酸序列區(qū)段。5’UTR通常擔(dān)當(dāng)轉(zhuǎn)錄物的5’末端，以起動(dòng)mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯成多肽的7-鳥、7-甲基鳥苷帽進(jìn)行修飾或“加帽”。術(shù)語“以...比例表達(dá)”指表達(dá)成轉(zhuǎn)錄物或多肽的基因產(chǎn)物的產(chǎn)量比例。該比例的測(cè)定通常使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)來測(cè)定，諸如逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或Northern印跡(用于測(cè)量轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量)或免疫印跡或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)技術(shù)(用于測(cè)量多肽的相對(duì)量)。在某些實(shí)施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1至約1∶20、約15∶1至約1∶15、約12∶1至約1∶12、約10∶1至約1∶10、約9∶1至約1∶9、約8∶1至約1∶8、約7∶1至約1∶7、約6∶1至約1∶6、約5∶1至約1∶5、約4∶1至約1∶4、約3∶1至約1∶3、約2∶1至約1∶2、或約1∶1的比例表達(dá)。在具體的實(shí)施方案中，所述第一和第二多肽以約20∶1、約19∶1、約18∶1、約17∶1、約16∶1、約15∶1、約14∶1、約13∶1、約12∶1、約11∶1、約10∶1、約9∶1、約8∶1、約7∶1、約6∶1、約5∶1、約4∶1、約3∶1、約2∶1、約1∶1、約1∶2、約1∶3、約1∶4、約1∶5、約1∶6、約1∶7、約1∶8、約1∶9、約1∶10、約1∶11、約1∶12、約1∶13、約1∶14、約1∶15、約1∶16、約1∶17、約1∶18、約1∶19、和/或約1∶20的比例表達(dá)。術(shù)語“第一外顯子”指編碼多肽或多肽區(qū)的編碼序列或核酸序列，而術(shù)語“第二外顯子”指編碼第二多肽區(qū)的不同的第二編碼序列或核酸序列。本發(fā)明的第一和第二外顯子還包含5’剪接受體序列。術(shù)語“宿主細(xì)胞”或“真核宿主細(xì)胞”指使用本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)生成或表達(dá)所述第一和第二外顯子的基因產(chǎn)物的任何真核細(xì)胞。這包括例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如幼倉鼠腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞(如NS0細(xì)胞)、人PER.C6細(xì)胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。可用于表達(dá)的昆蟲細(xì)胞包括例如草地夜蛾(Sf9)細(xì)胞、甘藍(lán)銀紋夜蛾(Tn.TnHigh-Five)細(xì)胞或家蠶蛾(BMN)細(xì)胞。可用于表達(dá)的酵母細(xì)胞包括例如糖酵母細(xì)胞、裂殖糖酵母細(xì)胞或畢赤酵母細(xì)胞。此類細(xì)胞易于從公開的和商業(yè)性的來源獲得，諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。術(shù)語“內(nèi)含子”指進(jìn)行轉(zhuǎn)錄且存在于前mRNA中但由剪接機(jī)制根據(jù)剪接供體和剪接受體的序列切除因而在成熟mRNA轉(zhuǎn)錄物中不存在的核酸序列區(qū)段。術(shù)語“可操作連接”指各成分處于容許它們以其設(shè)定方式發(fā)揮功能的相互關(guān)系的并置方式(如功能性連接)。術(shù)語“聚腺苷酸化信號(hào)”指RNA轉(zhuǎn)錄物中存在的、在存在酶聚腺苷酰轉(zhuǎn)移酶時(shí)容許轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化的核酸序列。本領(lǐng)域知道許多聚腺苷酸化信號(hào)，它們可用于本發(fā)明。實(shí)例包括人變體生長激素聚腺苷酸化信號(hào)、SV40晚期聚腺苷酸化信號(hào)和牛生長激素聚腺苷酸化信號(hào)。術(shù)語“啟動(dòng)子”指足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列，優(yōu)選在真核細(xì)胞中?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括例如提供高水平表達(dá)的病毒、哺乳動(dòng)物、昆蟲和酵母啟動(dòng)子，如哺乳動(dòng)物巨細(xì)胞病毒或CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、或本領(lǐng)域知道的適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)的任何啟動(dòng)子。術(shù)語“剪接位點(diǎn)”指能夠被真核細(xì)胞的剪接機(jī)制識(shí)別而適于切割和/或與相應(yīng)剪接位點(diǎn)連接的特定核酸序列。剪接位點(diǎn)容許切除前mRNA轉(zhuǎn)錄物中存在的內(nèi)含子。通常，將剪接位點(diǎn)的5’部分稱為剪接供體，而將3’相應(yīng)剪接位點(diǎn)稱為受體剪接位點(diǎn)。術(shù)語剪接位點(diǎn)包括例如天然存在的剪接位點(diǎn)、經(jīng)過改造的剪接位點(diǎn)，例如合成的剪接位點(diǎn)、規(guī)范的或共有的剪接位點(diǎn)、和/或非規(guī)范的剪接位點(diǎn)，例如隱蔽剪接位點(diǎn)。術(shù)語“與...剪接”指剪接供體與剪接受體相互作用從而容許剪接機(jī)制(如剪接體)剪接轉(zhuǎn)錄物。如上所述，剪接即切除轉(zhuǎn)錄物中以剪接供體和剪接受體為界的部分(內(nèi)含子)。對(duì)于每條轉(zhuǎn)錄物，剪接供體只與一個(gè)剪接受體剪接。對(duì)于可選剪接，在轉(zhuǎn)錄物集合中，剪接供體與超過一個(gè)剪接受體剪接。例如，剪接供體可與一條轉(zhuǎn)錄物的第一剪接受體剪接，但是在另一條轉(zhuǎn)錄物上，剪接供體與第二剪接受體剪接，生成轉(zhuǎn)錄物的異質(zhì)集合(heterogeneouspool)。術(shù)語“剪接轉(zhuǎn)錄物”指在剪接供體和第一或第二任一剪接受體之間已進(jìn)行過剪接的、包含第一或第二外顯子的、由本發(fā)明可選剪接載體轉(zhuǎn)錄的RNA。術(shù)語“載體”指在導(dǎo)入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞提取物后能夠賦予基因產(chǎn)物以表達(dá)的核酸分子(DNA或RNA任一)。此術(shù)語可與“可選剪接載體”、“表達(dá)載體”、“表達(dá)盒”或“構(gòu)建物”互換。此類載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物可包含本發(fā)明的可選剪接元件以及用于在細(xì)胞中擴(kuò)增載體、載體侵入細(xì)胞和后續(xù)表達(dá)的額外序列、選擇標(biāo)記、或任何其它功能性元件。此類元件是本領(lǐng)域眾所周知的，而且可根據(jù)需要使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)互換。術(shù)語“病毒載體”或其變化(諸如“腺病毒載體”)指包含本發(fā)明的可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物的減毒型或復(fù)制缺陷型病毒顆粒。如下文更為詳細(xì)描述的，此類病毒載體可用于將本發(fā)明的可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物插入宿主細(xì)胞。詳述1.概觀通過提供包含驅(qū)動(dòng)兩個(gè)或多個(gè)外顯子表達(dá)的單一啟動(dòng)子的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物，其中所述外顯子經(jīng)過改造可選剪接成兩種或多種可表達(dá)轉(zhuǎn)錄物，本發(fā)明部分提供了用于在真核細(xì)胞中表達(dá)兩種或多種基因產(chǎn)物的方法。如此，所述載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物適用于表達(dá)兩種或多種多肽，特別是多肽多聚體，例如通常作為兩條輕鏈和兩條重鏈抗體多肽的裝配物的抗體(或抗體片段)。此外，因?yàn)楸景l(fā)明的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物使用單一啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)前mRNA的表達(dá)，它隨后可選剪接成兩種或多種基因產(chǎn)物，本發(fā)明避免了多個(gè)啟動(dòng)子的使用、因使用多個(gè)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子競(jìng)爭、或獨(dú)立啟動(dòng)子的不同活性。另外，經(jīng)由多個(gè)剪接受體的使用，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)，即在真核細(xì)胞中以期望比例提供多種基因產(chǎn)物的表達(dá)，使得例如所得多肽裝配物，例如四聚體抗體高效生成。另外，本發(fā)明提供了通過改變剪接元件，特別是第一剪接受體的序列來改變所編碼多肽的表達(dá)比例。改變所表達(dá)多肽比例的能力通過以最佳數(shù)量提供多肽而容許更加有效的多聚化或多肽的其它功能性方面。如此，本發(fā)明的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物容許以足以生成一種或多種期望蛋白質(zhì)的數(shù)量表達(dá)所述多肽。如此，本發(fā)明還提供了適用于使用可選剪接表達(dá)多肽多聚體，如抗體的載體，以及包含所述載體的細(xì)胞和由此類細(xì)胞生成的抗體及其在例如在受試者例如人類患者中預(yù)測(cè)、診斷、預(yù)防、改善或治療紊亂或疾病中的用途。另外，本發(fā)明提供了適用于通過將載體直接或經(jīng)由回體(exvivo)技術(shù)投遞至受試者而在體內(nèi)表達(dá)多肽的載體。2.用于表達(dá)多肽多聚體的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物的設(shè)計(jì)本發(fā)明的方法采用使用(以5’至3’或順流方向)包含啟動(dòng)子；5’非翻譯區(qū)(UTR)(它可以包含或不包含編碼序列)；單一5’剪接供體；以3’剪接受體結(jié)束的內(nèi)含子，所述3’剪接受體以優(yōu)選約5-95％的效率使用(取決于期望的產(chǎn)物比例)(例示性的3’剪接受體效率包括但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％)；含有第一基因和，任選地，聚腺苷酸化信號(hào)的外顯子；以效率高于50％(在優(yōu)選的實(shí)施方案中，3’剪接受體的效率高于75％(如80％、85％、90％、95％或100％)，效率高于85％(如90％、95％或100％)，效率高于90％(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)，或者，在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，效率高于95％(如96％、97％、98％、99％或100％)的3’剪接受體結(jié)束的內(nèi)含子序列；和含有第二基因和，任選地，聚腺苷酸化信號(hào)的外顯子的載體(見圖1)?？蓪⒈景l(fā)明的載體、表達(dá)盒或構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞，它在其中生成可選剪接mRNA轉(zhuǎn)錄物。這些兩種或多種mRNA轉(zhuǎn)錄物編碼不同的多肽，它們隨后以足以生成一種或多種期望多聚體蛋白質(zhì)的數(shù)量表達(dá)。如果需要，可經(jīng)由合適剪接位點(diǎn)的選擇，如較弱或較強(qiáng)的剪接受體來改變兩種或多種產(chǎn)物的比例。在具體的實(shí)施方案中，可經(jīng)由只選擇第一剪接受體來改變兩種或多種產(chǎn)物的比例。通常，前mRNA剪接涉及精確切除內(nèi)含子序列，且部分基于剪接機(jī)制如剪接體對(duì)內(nèi)含子-外顯子邊界處特定序列即供體和受體剪接位點(diǎn)的識(shí)別。這些邊界序列通常符合共有序列，內(nèi)含子5’端的MAG/GURAGU(SEQIDNO30)和內(nèi)含子3’端的Y10NCAG/G(SEQIDNO31)(其中M＝A或C，標(biāo)有下劃線的是不變的核苷酸，Y10＝10個(gè)連續(xù)的C或T核苷酸，而N＝任何核苷酸)。內(nèi)含子和外顯子中的序列以及內(nèi)含子長度也已證明在剪接效率中發(fā)揮作用(參見如Chabot，B.，TrendsinGenetics12472-478，1996)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可選剪接能夠調(diào)控由本發(fā)明載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物的外顯子編碼的每種多肽的表達(dá)。對(duì)于每條獨(dú)立的剪接轉(zhuǎn)錄物，剪接供體只與一個(gè)剪接受體剪接，或者根本不剪接。然而，可選剪接形成轉(zhuǎn)錄物的異質(zhì)集合，因?yàn)榧艚庸w可與一條轉(zhuǎn)錄物上的第一剪接受體剪接，而與另一條轉(zhuǎn)錄物上的第二剪接受體剪接。如此，單一剪接供體與多個(gè)剪接受體的剪接將調(diào)控細(xì)胞中由本發(fā)明載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物生成的第一和第二(或更多)外顯子的剪接轉(zhuǎn)錄物水平。不同剪接轉(zhuǎn)錄物水平的相對(duì)數(shù)量將取決于剪接供體多么頻繁的連接特定剪接受體，這稱為剪接事件效率。特定剪接事件在轉(zhuǎn)錄物中發(fā)生的頻率越高，則表示與該剪接事件相關(guān)的剪接供體和剪接受體效率越高或越強(qiáng)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，優(yōu)選的是，剪接供體和3’末端剪接受體(例如第二剪接受體)高度有效，因此整體剪接高度有效且第一剪接受體的強(qiáng)度控制剪接外顯子轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)水平。未剪接轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率通常很低，因此最大限度剪接促進(jìn)多肽表達(dá)。例如，如果剪接供體和第二剪接受體高度有效，那么大多數(shù)新生mRNA將被剪接。如果第一剪接受體強(qiáng)(即高效)，那么細(xì)胞內(nèi)將存在相對(duì)較高水平的包含第一外顯子的剪接轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致第一多肽較之第二多肽高比例表達(dá)。。如果第一剪接受體較弱，那么細(xì)胞內(nèi)將存在相對(duì)較低水平的包含第一外顯子的剪接轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致第一多肽較之第二多肽低比例表達(dá)。因?yàn)榉g高度依賴包含指定外顯子的剪接轉(zhuǎn)錄物的水平，所以由第一或第二外顯子編碼的多肽的表達(dá)依賴?yán)镁o挨著外顯子上游的剪接受體的剪接水平。因此，在某些實(shí)施方案中，因?yàn)榧艚佑绊懓杀景l(fā)明載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物編碼的每種外顯子的成熟轉(zhuǎn)錄物的水平，所以使用可選剪接來調(diào)控由外顯子編碼的多肽的表達(dá)。剪接供體和剪接受體在本領(lǐng)域是眾所周知的，且任何剪接供體和剪接受體都可用于本發(fā)明。這些元件尤其可在本領(lǐng)域中找到或衍生自共有序列，或是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)插入、刪除或替代核苷酸，或是使用能夠預(yù)測(cè)剪接序列的軟件，諸如2.4版Netgene2。可在本發(fā)明中對(duì)此類剪接元件測(cè)試合適性，諸如使用實(shí)施例中描述的方法。本發(fā)明部分引入和改進(jìn)此類序列以經(jīng)由遺傳工程在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)兩種或多種期望重組基因產(chǎn)物的可選剪接。本發(fā)明的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物可用于表達(dá)多種異多聚體蛋白質(zhì)。實(shí)例包括但不限于異二聚體諸如糖蛋白激素(如絨毛膜促性腺激素(CG)、促甲狀腺素(TSH)、促黃體素(LH)、和促卵泡素(FSH))或整聯(lián)蛋白家族的成員。還可使用由兩對(duì)相同亞基組成的異四聚體。適宜異四聚體的實(shí)例包括抗體、胰島素受體(α2β2)和轉(zhuǎn)錄起始因子TFIIE(α2β2)。另外，使用生成2∶1表達(dá)比例的剪接受體對(duì)，載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物可用于表達(dá)異三聚體，諸如淋巴毒素α1β2。通過組合不同剪接受體改變表達(dá)比例可生成能夠以不同比例表達(dá)多聚體的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物，容許許多不同異多聚體蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)剪接供體和/或剪接受體信號(hào)的序列來預(yù)測(cè)表達(dá)比例。在其它實(shí)施方案中，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定表達(dá)比例。此外，可使用本發(fā)明的可選剪接系統(tǒng)用于生成多肽多聚體例如抗體的基因序列可從許多不同來源獲得。例如，多種人蛋白質(zhì)基因可從公眾可獲得的基因序列保藏物和/或質(zhì)粒、克隆、細(xì)胞等的保藏物獲得。許多蛋白質(zhì)序列和蛋白質(zhì)編碼序列已經(jīng)發(fā)表，且可由這些序列諸如本文所述合成合適的基因。或者，可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)選擇并培養(yǎng)蛋白質(zhì)生成細(xì)胞系。在其它實(shí)施方案中，基因序列是經(jīng)由登錄訂閱的數(shù)據(jù)庫獲得的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道許多方法適于獲得基因序列信息。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從最初生成抗體的雜交瘤細(xì)胞或從其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離編碼抗體的RNA，諸如異硫氰酸胍提取和沉淀，后續(xù)離心或?qū)游觥Ｔ谛枰獣r(shí)，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從總RNA分離mRNA，諸如在寡dT纖維素上進(jìn)行的層析。適于這些目的的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是熟悉的。編碼抗體輕鏈和重鏈的cDNA可依照眾所周知的方法使用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶同時(shí)或分開制備?？捎霉灿泻愣▍^(qū)引物或以例如發(fā)表的抗體輕鏈和重鏈DNA和氨基酸序列為基礎(chǔ)的更特異引物起始。如上所述，PCR也可用于分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在這種情況中，可用共有引物或較大同源探針諸如小鼠恒定區(qū)探針篩選文庫?；蛘?，抗體和抗體片段可使用衍生自眾所周知的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)的序列合成。此類建模技術(shù)可用于預(yù)測(cè)在由保守氨基酸序列定義的指定抗體框架的背景下將結(jié)合預(yù)測(cè)配體結(jié)構(gòu)的抗體序列。通過使用這種已知關(guān)系，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)期望抗體或抗體片段的氨基酸序列，然后合成編碼期望多肽的核酸序列。此類設(shè)計(jì)的抗體或抗體片段稱為“合成的”。本發(fā)明的組合物和方法適于任何抗體，或?qū)嶋H上任何多鏈或多聚體蛋白質(zhì)。與本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案相容的寡核苷酸合成技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，且能夠使用幾種商品化自動(dòng)化合成儀任何一種來進(jìn)行。另外，編碼本文列出的幾種重鏈和輕鏈類型的DNA序列可經(jīng)由商業(yè)DNA賣主獲得。然后可改變或修飾使用任何上述方法獲得遺傳材料以提供與本發(fā)明及此類抗體的期望用途相容的抗體。多種不同抗體類型可依照本發(fā)明表達(dá)。例如，對(duì)某一抗原如腫瘤相關(guān)抗原、病原體、或涉及自身免疫病的自身抗原具有特異免疫反應(yīng)性的抗體或抗體片段?？尚揎椏贵w(或其片段)使得一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)刪除或以其它方式改變，從而提供期望的功能活性諸如血清半衰期、或效應(yīng)物功能。Kuby，J.，《Immunology》，第3版，W.H.FreemanandCo.，1997中描述了許多此類抗體。適于使用本發(fā)明的方法在真核細(xì)胞中表達(dá)的抗體包括五個(gè)截然不同的抗體類別IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。雖然所有五類都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，但是下面的討論主要針對(duì)IgG類分子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易的使下面的討論適應(yīng)其它類別的免疫球蛋白。IgG分子通常包含兩條相同的抗體輕鏈，每條分子量約23kD，和兩條相同的抗體重鏈，每條分子量約53-70kD。在圖2所示構(gòu)造中，鏈間二硫鍵連接這四條鏈。另外，抗體輕鏈和重鏈二者都分成結(jié)構(gòu)和功能同源性的區(qū)域。術(shù)語“恒定”和“可變”在功能上使用。在這點(diǎn)上，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，抗體輕鏈(VL)和重鏈(VH)的可變區(qū)決定抗原識(shí)別和特異性。相反，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定區(qū)賦予重要的生物學(xué)特性，諸如分泌、經(jīng)胎盤遷移、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合、和其它效應(yīng)物功能。輕鏈分為入κ或λ鏈?？砂l(fā)現(xiàn)每類重鏈或與κ或與λ輕鏈結(jié)合。一般而言，輕鏈和重鏈彼此共價(jià)鍵合，且在由雜交瘤、B細(xì)胞或經(jīng)過遺傳工程改造的宿主細(xì)胞生成免疫球蛋白時(shí)兩條重鏈的“尾”部通過共價(jià)二硫鍵彼此鍵合(見圖2)。N端是可變區(qū)，而C端是恒定區(qū)。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，其中還有亞類。這條鏈的本質(zhì)決定抗體的“分類”是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。免疫球蛋白亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，已經(jīng)充分鑒定且已知賦予功能特化。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的第一外顯子或第二外顯子可用于二選一地編碼抗體輕鏈或重鏈，只要所得載體編碼一條輕鏈和一條重鏈?？乖Y(jié)合位點(diǎn)由每條VH和VL鏈上的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)決定。每個(gè)單體抗體上存在的六個(gè)CDR是較短的非連續(xù)氨基酸序列，它們的具體占位使得抗體在水性環(huán)境中采取三維構(gòu)象時(shí)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。重鏈和輕鏈可變區(qū)的剩余部分在氨基酸序列上顯示較低的分子間可變性，稱為框架區(qū)?？蚣軈^(qū)大部分采取β-折疊構(gòu)象，而CDR形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)，且在有些情況中構(gòu)成β-折疊的一部分。如此，框架區(qū)的作用是形成支架，通過鏈間非共價(jià)相互作用為正確取向的六個(gè)CDR提供定位。由定位的CDR形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)決定與免疫反應(yīng)性抗原上表位的表面互補(bǔ)性。此互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體與免疫反應(yīng)性抗原表位的非共價(jià)結(jié)合。抗體片段適于使用本發(fā)明的可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物表達(dá)。此類片段是期望抗體的任何一個(gè)或多個(gè)部分，且可包括如Fab片段、F(ab’)2片段、和Fc片段。另外，抗體片段可包括單鏈抗體或包含少于全長四聚體抗體蛋白質(zhì)的其它抗體衍生多肽。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，使用本發(fā)明的可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物表達(dá)的抗體可包含提供抗體與選定抗原結(jié)合的任何類型的可變區(qū)。在這點(diǎn)上，可變區(qū)可包含任何類型的哺乳動(dòng)物的或衍生自能夠誘導(dǎo)引起體液應(yīng)答并生成針對(duì)期望抗原的免疫球蛋白的任何類型的哺乳動(dòng)物。因此，經(jīng)修飾抗體的可變區(qū)可以是例如鼠源的、非人靈長類的、或人源的。在衍生自不同物種時(shí)，通常是鼠源可變區(qū)與人源恒定區(qū)融合，將該抗體稱為嵌合抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)二者都是人源的。在其它選定實(shí)施方案中，相容抗體的可變區(qū)(通常衍生自非人來源)可進(jìn)行改造或特定剪裁以改進(jìn)分子的結(jié)合特性(如親和力成熟)或降低免疫原性。在這點(diǎn)上，可用于本發(fā)明的可變區(qū)可進(jìn)行人源化或以其它方式改變，即經(jīng)由包含引入的DNA或氨基酸序列。此類具有自另一種物種移植的CDR的人抗體稱為人源化抗體。另外，可變區(qū)可以是經(jīng)過改造的，或合成的，正如先前所述。任何上述抗體可進(jìn)一步修飾以具有改變的糖基化位點(diǎn)、適于PEG化的位點(diǎn)、和/或賦予抗體以改變的效應(yīng)物功能的位點(diǎn)，如改變的補(bǔ)體結(jié)合、改變的Fc受體結(jié)合、和/或改變的免疫細(xì)胞相互作用活性。為了本發(fā)明的目的，可采用許多可選剪接表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，本發(fā)明的可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物可含有衍生自動(dòng)物病毒的DNA元件，諸如人或牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV)、巨細(xì)胞病毒、或SV40病毒。另外，可通過導(dǎo)入一種或多種容許選擇受到轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的標(biāo)記來選擇能夠?qū)⒖蛇x剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物整合到其染色體中或作為附加體維持載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物的細(xì)胞。選擇標(biāo)記基因可以直接連接待表達(dá)的DNA序列，或者通過共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入同一細(xì)胞。下文討論了適于導(dǎo)入本發(fā)明載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。3.在培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞中表達(dá)多肽多聚體可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將本發(fā)明的可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。這些包括例如轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、使用包膜DNA的細(xì)胞融合、顯微注射、和病毒感染(參見如Ridgway，A.A.G.，“MammalianExpressionVectors”，第24.2章，第470-472頁，《Vectors》，Rodriguez和Denhardt編，Butterworths，Boston，Mass.，1988)。如上所述，本發(fā)明的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物可整合到宿主細(xì)胞的染色體中，以附加體形式維持，或者瞬時(shí)表達(dá)。經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在適于生成其中所編碼多肽，如抗體輕鏈和重鏈的條件下培養(yǎng)，并測(cè)定多肽合成。用于鑒定和測(cè)量多肽合成的例示性測(cè)定技術(shù)包括如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、放射免疫測(cè)定法(RIA)、熒光激活細(xì)胞分揀分析(FACS)、和免疫組織化學(xué)。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主細(xì)胞系優(yōu)選真核起源，例如哺乳動(dòng)物起源，或者酵母或昆蟲。例示性宿主細(xì)胞系包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)系、HeLa(人宮頸癌)、CVI(猴腎細(xì)胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中國倉鼠成纖維細(xì)胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)、HAK(倉鼠腎細(xì)胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、NS0(骨髓瘤)、BEC(牛肉皮細(xì)胞)、RAJI(人淋巴細(xì)胞)、293(人腎)、PER.C6(人)、草地夜蛾(Sf9)(昆蟲)、甘藍(lán)銀紋夜蛾(Tn.TnHigh-Five)(昆蟲)、家蠶蛾(BMN)(昆蟲)、糖酵母(酵母)、裂殖糖酵母(酵母)和畢赤酵母(酵母)。宿主細(xì)胞系通?？蓮纳虡I(yè)服務(wù)機(jī)構(gòu)諸如AmericanTissueCultureCollection(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)或出版的文獻(xiàn)獲得。體外生產(chǎn)容許擴(kuò)大規(guī)模以生成大量的使用本發(fā)明可選剪接系統(tǒng)生產(chǎn)的期望多肽，優(yōu)選抗體。用于組織培養(yǎng)條件下的真核如哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，包括同質(zhì)懸浮培養(yǎng)，如在氣升式反應(yīng)器中或在連續(xù)攪拌式反應(yīng)器中，或者固定化或圈閉式(entrapped)細(xì)胞培養(yǎng)，如在中空纖維中、微囊、在瓊脂糖微珠上、陶瓷筒、或在發(fā)酵罐中。為了分離和回收依照本發(fā)明生產(chǎn)的多聚體蛋白質(zhì)，特別是就抗體而言，可首先濃縮培養(yǎng)物上清液中的蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白)，如通過硫酸銨沉淀，針對(duì)吸濕材料諸如PEG透析，和經(jīng)選擇性膜過濾。如果必需和/或期望的話，通過慣例的層析方法純化多聚體蛋白質(zhì)(如多價(jià)抗體)的濃縮液，例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素的層析、或免疫親和層析(如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G)。本發(fā)明還涵蓋在使用本發(fā)明的可選剪接系統(tǒng)表達(dá)時(shí)締合生成功能性抗體的任何抗體輕鏈和重鏈序列的表達(dá)，所述功能性抗體如特異結(jié)合靶抗原諸如腫瘤相關(guān)抗原、病原體或自身抗原或者具有期望效應(yīng)物功能的抗體。重要的是，可選擇可選剪接構(gòu)建物中抗體輕鏈和重鏈基因的拷貝數(shù)，從而獲得優(yōu)選的輕鏈/重鏈比例。在某些實(shí)施方案中，輕鏈以范圍通常為相對(duì)于重鏈的約10/1、約5/1、約3/1或約1/1的水平表達(dá)。在相關(guān)實(shí)施方案中，輕鏈和重鏈多肽以約20∶1至約1∶20、約15∶1至約1∶15、約12∶1至約1∶12、約10∶1至約1∶10、約9∶1至約1∶9、約8∶1至約1∶8、約7∶1至約1∶7、約6∶1至約1∶6、約5∶1至約1∶5、約4∶1至約1∶4、約3∶1至約1∶3、約2∶1至約1∶2、或約1∶1的比例表達(dá)。在具體的實(shí)施方案中，輕鏈和重鏈多肽以約20∶1、約19∶1、約18∶1、約17∶1、約16∶1、約15∶1、約14∶1、約13∶1、約12∶1、約11∶1、約10∶1、約9∶1、約8∶1、約7∶1、約6∶1、約5∶1、約4∶1、約3∶1、約2∶1、約1∶1、約1∶2、約1∶3、約1∶4、約1∶5、約1∶6、約1∶7、約1∶8、約1∶9、約1∶10、約1∶11、約1∶12、約1∶13、約1∶14、約1∶15、約1∶16、約1∶17、約1∶18、約1∶19、和/或約1∶20的比例表達(dá)。本發(fā)明還提供了選擇任何期望比例的方法，通過篩選具有不同剪接位點(diǎn)的載體使得如在指定細(xì)胞系中獲得所述期望的比例(參見如實(shí)施例2)。這在高效表達(dá)抗體時(shí)尤其至關(guān)重要，因?yàn)橐呀?jīng)觀察到某些輕鏈表達(dá)水平可能有助于指導(dǎo)抗體重鏈和輕鏈的適當(dāng)裝配，而過量未成對(duì)的重鏈可能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。此外，輕鏈還在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中指導(dǎo)裝配好的抗體重鏈和輕鏈折疊以生成功能性抗原結(jié)合抗體中至關(guān)重要。因此，在某些實(shí)施方案中，抗體輕鏈通常以相對(duì)于抗體重鏈的約10/1至1/1表達(dá)(例示性的輕鏈/重鏈比例包括但不限于約10/1、9/1、8/1、7/1、6/1、5/1、4/1、3/1、2/1和1/1)。在某些實(shí)施方案中，依照本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗體可以是對(duì)任何期望抗原特異的。優(yōu)選的是，抗體將是引發(fā)治療性效果的功能性抗體，諸如可用于治療自身免疫性、炎性、傳染性、變應(yīng)性或贅生性疾病的抗體?？贵w可為了協(xié)同作用而聯(lián)合其它治療劑。例如，抗體可聯(lián)合如其它抗體、小分子、或用作癌癥化療劑的放射源。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物聯(lián)合并非有意依賴可選剪接來表達(dá)多種多肽的其它載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物使用。4.藥用組合物本發(fā)明還特別提供了包含使用本發(fā)明的方法和/或載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物表達(dá)的多聚體蛋白質(zhì)的治療性組合物，用于治療有所需要的受試者或患者。本發(fā)明的組合物可經(jīng)由施用通過本發(fā)明方法生成的治療性多肽或通過包含本發(fā)明可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物的基因療法而用于治療有所需要的受試者(即患者)。有所需要的受試者指患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上可通過施用本發(fā)明組合物來治療或預(yù)防的疾病、紊亂或狀況的受試者。所述受試者可以是哺乳動(dòng)物受試者。優(yōu)選的受試者是人類受試者。在某些實(shí)施方案中，此類治療性組合物在藥學(xué)上可接受載體中包含此類多聚體蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類治療性組合物在藥學(xué)上可接受載體中包含至少一種本發(fā)明生產(chǎn)的重組抗體或抗體片段。“藥學(xué)上可接受載體”指至少一種通常用于施用活性成分的藥用制劑成分。因此，載體可含有本領(lǐng)域使用的任何藥用賦形劑和用于施用的任何形式媒介物。組合物可以是例如注射液、水性懸浮液或溶液、非水性懸浮液或溶液、固體或液體口服劑型、藥膏、凝膠劑、油膏、皮內(nèi)貼劑、乳膏、洗劑、片劑、膠囊劑、持續(xù)釋放劑型、諸如此類。額外賦形劑可包括例如著色劑、掩味劑、助溶劑、懸浮劑、壓模劑、腸衣、持續(xù)釋放助劑、諸如此類。本發(fā)明的試劑常常作為包含活性治療劑和多種其它藥學(xué)上可接受成分的藥用組合物而施用。參見《Remintong’sPharmaceuticalScience》，第15版，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，1980。優(yōu)選形式取決于預(yù)定施用模式和治療應(yīng)用。根據(jù)期望劑型，組合物還可包含藥學(xué)上可接受的、無毒的載體或稀釋劑，它們的定義是常用于配制動(dòng)物或人類施用的藥用組合物的媒介物。選擇的稀釋劑應(yīng)不影響組合物的生物學(xué)活性。此類稀釋劑的實(shí)例包括但不限于蒸餾水、生理學(xué)磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液和Hank氏溶液。另外，藥用組合物或制劑還可包含其它載體、佐劑、或無毒的、無治療作用的、無免疫原性的穩(wěn)定劑。通常，此類組合物以治療有效量施用，即足以對(duì)患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上可受本發(fā)明組合物治療影響的疾病、紊亂或狀況的受試者或患者引起可檢測(cè)的，優(yōu)選在醫(yī)學(xué)上有益的效果的數(shù)量。依照本發(fā)明生產(chǎn)的多聚體蛋白質(zhì)可以注射或植入制劑的形式施用，它們可以這樣一種方式配制以容許持續(xù)釋放活性成分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類多聚體蛋白質(zhì)是抗體。一種例示性組合物包含5mg/ml單克隆抗體，在由50mML-組氨酸、150mMNaCl組成且用HCl調(diào)至pH6.0的水性緩沖液中配制。通常，組合物制備成注射劑，即液態(tài)溶液或懸浮液；也可制備成適于在注射前溶解或懸浮在液態(tài)媒介物中的固體形式。如上所述，所述制劑還可在脂質(zhì)體或微粒諸如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物中乳化或裝囊以增強(qiáng)輔助效果(參見Langer，Science2491527，1990；及Hanes，AdvancedDrugDeliveryReviews2897，1997)。5.預(yù)防和治療方法在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于適于預(yù)防、緩解或治療任何疾病、紊亂或狀況的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。此類紊亂或疾病包括癌癥、癌前狀態(tài)、和遺傳性疾病或狀況諸如肌肉營養(yǎng)不良?？墒芡ㄟ^本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)治療影響的疾病、紊亂或狀況包括諸如下列狀況，遺傳病(即可歸于一種或多種基因缺陷的疾病狀況)、獲得性病理學(xué)(即不可歸于先天缺陷的病理學(xué)狀況)和預(yù)防方法(即預(yù)防疾病或不期望的醫(yī)學(xué)狀況)。獲得性病理學(xué)可以是表現(xiàn)為異常生理學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞、結(jié)構(gòu)或分子生物學(xué)狀態(tài)的疾病或綜合征?？墒芡ㄟ^本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是感染，包括病毒和細(xì)菌感染、過度增殖性疾病或紊亂，包括癌癥和癌前狀況、免疫紊亂，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、遺傳性免疫缺陷狀況，諸如高IgM綜合征、原發(fā)性或混合型免疫缺陷狀況，包括特征為嗜中性粒細(xì)胞減少的狀況、以及神經(jīng)學(xué)紊亂、心血管紊亂，諸如缺血、和內(nèi)分泌紊亂，諸如糖尿病、甲狀腺紊亂和不孕不育?？墒芡ㄟ^本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是過度增殖性疾病或紊亂，包括癌癥。此類疾病或紊亂可涉及任何細(xì)胞、組織或器官，包括腦、肺、鱗狀細(xì)胞、膀胱、胃、胰、乳房、頭、頸、肝、腎、卵巢、前列腺、結(jié)腸、直腸、食道、鼻咽、甲狀腺和皮膚。癌癥可以是黑素瘤、淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤或癌癥。癌癥可以是實(shí)體瘤，或者可涉及體液，諸如血液?？墒芡ㄟ^本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是遺傳上繼承的疾病，諸如亨庭頓氏病(Huntington’sdisease)、雙相型障礙(bipolardisorder)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease)、腕管綜合征(CarpalTunnelSyndrome)、囊性纖維化、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-MerzbacherDisease)、多發(fā)性硬化或迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良(DuchenneMuscularDystrophy)?？墒芡ㄟ^本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)治療影響的疾病、紊亂或狀況可以是傳染病，諸如結(jié)核病、瘧疾、黃熱病、或由乙肝病毒、皰疹病毒、人免疫缺陷病毒等感染引起的疾病。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明還特別致力于適于預(yù)防或治療紊亂或疾病如免疫系統(tǒng)的紊亂或疾病的抗體或抗體片段的生產(chǎn)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段可用于預(yù)防或治療免疫紊亂，包括例如腎小球腎炎、硬皮病、硬化、多發(fā)性硬化、狼瘡腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化、炎性腸病、變態(tài)反應(yīng)或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段可用于治療或預(yù)防炎性紊亂，包括但不限于阿耳茨海默氏病、重度哮喘、特應(yīng)性皮炎、惡病質(zhì)、CHF缺血、冠狀動(dòng)脈再狹窄、克羅恩氏病、糖尿病腎病、淋巴瘤、銀屑病、纖維化/輻射誘發(fā)的、幼年型關(guān)節(jié)炎、中風(fēng)、由外傷引起的腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、和潰瘍性結(jié)腸炎?？捎靡勒毡景l(fā)明生產(chǎn)的抗體或抗體片段來預(yù)防或治療的其它炎性紊亂包括由于角膜移植、慢性阻塞性肺病、丙型肝炎、多發(fā)性骨髓瘤和骨關(guān)節(jié)炎的炎癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段可用于預(yù)防或治療瘤形成，包括但不限于膀胱癌、乳房癌、頭和頸癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、黑素瘤、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、胃癌、白血病/淋巴瘤、和多發(fā)性骨髓瘤。其它瘤形成疾病包括宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、非鱗狀細(xì)胞肺癌和前列腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段可用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性性紊亂，包括但不限于阿耳茨海默氏病、中風(fēng)、和外傷性腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。其它神經(jīng)變性性紊亂包括ALS/運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、糖尿病性周圍神經(jīng)病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、亨庭頓氏病、黃斑變性和帕金森氏病。在臨床應(yīng)用中，根據(jù)展現(xiàn)疾病或紊亂的至少一種體征或癥狀來鑒定具有上述疾病之一或有患上述疾病之一風(fēng)險(xiǎn)的受試者。以足以治療例如上文所述的疾病或紊亂的至少一種癥狀的數(shù)量施用本發(fā)明的至少一種抗體或其抗體片段或者包含至少一種本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)適于作為治療劑在受試者中產(chǎn)生有益治療響應(yīng)的條件下施用于受試者，例如用于預(yù)防或治療疾病或紊亂，例如本文所述。本發(fā)明的治療劑通常是基本上純的，不含不想要的雜質(zhì)。這意味著試劑通常是至少約50％w/w(重量/重量)純，以及基本上不含干擾性蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。試劑有時(shí)是至少約80％w/w純，且更優(yōu)選至少90％或約95％w/w純。然而，使用常規(guī)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如本文所述，可獲得至少99％w/w的同質(zhì)肽。所述方法可用于無癥狀患者和目前顯示疾病癥狀的患者二者。此類方法使用的抗體可以是人源的、人源化的、嵌合的或非人源的抗體或其片段(如抗原結(jié)合片段)，且可以是單克隆的或多克隆的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特色是與藥學(xué)上載體一起作為藥用組合物施用依照本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗體?；蛘撸赏ㄟ^施用編碼至少一條抗體鏈的多核苷酸將抗體施用于受試者。所述多核苷酸在受試者中表達(dá)，生成抗體鏈。因此，所述多核苷酸編碼抗體重鏈和輕鏈。所述多核苷酸在受試者中表達(dá)，生成重鏈和輕鏈。在例示性實(shí)施方案中，對(duì)受試者監(jiān)測(cè)受試者血液中所施用抗體的水平。6.基因投遞本發(fā)明還涵蓋基因療法，由此為有所需要的患者提供包含可選剪接載體的核酸。可治療、改善或預(yù)防與上文關(guān)于使用通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的多肽進(jìn)行治療所述相同的疾病、紊亂和狀況。將DNA轉(zhuǎn)移或投遞至細(xì)胞以表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的各種方法，其它地方稱為基因療法，公開于“GeneTransferintoMammalianSomaticCellsinvivo”，N.Yang，Crit.Rev.Biotechn.12(4)335-356，1992，將其引入本文作為參考?；虔煼êw將DNA序列導(dǎo)入體細(xì)胞或種系細(xì)胞以用于回體(exvivo)或體內(nèi)療法?；虔煼ǖ墓δ苁翘鎿Q基因，提高正常或異?；蚬δ埽翱箵舾腥拘约膊『推渌±韺W(xué)狀況。通過基因療法來治療這些醫(yī)學(xué)問題的策略包括治療性策略，諸如鑒定缺陷基因，然后添加功能性基因以替換缺陷基因的功能或加強(qiáng)略有功能的基因；或是預(yù)防性策略，諸如添加其產(chǎn)物蛋白質(zhì)將治療該狀況或?qū)⑹沟媒M織或器官更易受到治療方案影響的基因?；蛘?，可轉(zhuǎn)移賦予免疫力的基因，諸如通過在本發(fā)明的可選剪接載體中提供針對(duì)特定抗原的抗體。用于基因療法的基因轉(zhuǎn)移方法分成三大類物理的(如電穿孔、直接基因轉(zhuǎn)移和微粒轟擊)、化學(xué)的(基于脂質(zhì)的載體或其它非病毒載體)和生物學(xué)的(病毒衍生載體和受體攝取)。例如，可使用非病毒載體，包括復(fù)合有DNA的脂質(zhì)體。此類脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物可直接靜脈內(nèi)注射到患者體內(nèi)。認(rèn)為脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物在肝中集中，在此它們將DNA投遞給巨噬細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞。這些細(xì)胞長期存活，并因此提供所投遞DNA的長期表達(dá)。另外，基因的載體或“裸露的”DNA可直接注射到期望器官、組織或腫瘤中以靶向投遞治療性DNA?；虔煼ǚ椒▽W(xué)還可通過投遞部位來描述。用于投遞基因的基礎(chǔ)方法包括回體(exvivo)基因轉(zhuǎn)移、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和體外基因轉(zhuǎn)移。在回體基因轉(zhuǎn)移中，從患者采集細(xì)胞并在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)。將DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，在數(shù)量上擴(kuò)增轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后植回患者體內(nèi)。在體外基因轉(zhuǎn)移中，方法是相同的，只是轉(zhuǎn)染細(xì)胞是在培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞，諸如組織培養(yǎng)細(xì)胞，而非來自各個(gè)患者的細(xì)胞。體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移涉及在細(xì)胞位于患者體內(nèi)時(shí)將DNA導(dǎo)入患者細(xì)胞。方法包括使用病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，其中使用非感染性病毒將基因投遞到患者體內(nèi)，或者將裸露的DNA注射到患者體內(nèi)某部位并由一定百分比的細(xì)胞攝取，在該細(xì)胞中表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)。另外，本文描述的其它方法，諸如使用機(jī)械或化學(xué)方法，也可用于本發(fā)明核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。DNA投遞的機(jī)械方法包括直接注射DNA，諸如將DNA顯微注射到生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中，由壓縮空氣推動(dòng)投遞DNA包被的微粒，諸如“基因槍”中使用的金微粒，及無機(jī)化學(xué)方法，諸如磷酸鈣轉(zhuǎn)染。另一種方法，配體介導(dǎo)的基因療法，涉及將DNA與特定配體復(fù)合，形成配體-DNA偶聯(lián)物，以將DNA投遞至特定細(xì)胞或組織?；虔煼ǖ幕瘜W(xué)方法可涉及化學(xué)制品以結(jié)合細(xì)胞和/或運(yùn)送DNA穿過細(xì)胞膜，諸如促融合脂質(zhì)囊泡諸如脂質(zhì)體或用于膜融合的其它囊泡、DNA摻入陽離子脂質(zhì)中的脂質(zhì)微粒諸如脂轉(zhuǎn)染試劑、或多賴氨酸介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。脂轉(zhuǎn)染試劑或細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，結(jié)合帶負(fù)電荷的DNA的基于脂質(zhì)的陽離子，構(gòu)成能夠穿越細(xì)胞膜的復(fù)合物并在細(xì)胞內(nèi)部提供DNA。另一種化學(xué)方法使用基于受體的胞吞作用，它涉及使特定配體結(jié)合細(xì)胞表面受體并將它包裹和轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)胞膜。配體結(jié)合DNA，而整個(gè)復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。將配體-基因復(fù)合物注射到血流中，然后具有受體的靶細(xì)胞將特異結(jié)合配體，并將配體-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。許多基因療法方法學(xué)采用病毒載體以將基因?qū)爰?xì)胞，而且能夠進(jìn)行改造以包含本發(fā)明的可選剪接載體。例如，經(jīng)過改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)用于回體(exvivo)方法以將基因?qū)胪庵艿暮徒櫮[瘤的淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、表皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、或其它體細(xì)胞。然后將這些經(jīng)過改變的細(xì)胞導(dǎo)入患者以由插入的DNA提供基因產(chǎn)物。病毒載體還已經(jīng)用于使用體內(nèi)方案將基因?qū)爰?xì)胞(參見如Eck，S.L和J.M.Wilson，“GeneBasedTherapy”，《Goodman&Gilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics》，第9版，pp.77-101，McGraw-Hill，NewYork，1996)。為了指導(dǎo)外來基因的組織特異性表達(dá)，可使用已知具有組織特異性的順式作用調(diào)控元件或啟動(dòng)子?；蛘?，這可以通過在體內(nèi)將DNA或病毒載體原位投遞至特定解剖學(xué)部位來實(shí)現(xiàn)。例如，在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移至血管是通過在動(dòng)脈壁的選定部位植入體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。病毒感染同樣表達(dá)基因產(chǎn)物的周圍細(xì)胞?？蓪⒉《据d體直接投遞至體內(nèi)部位，例如通過導(dǎo)管，由此只容許某些區(qū)域受到病毒的感染，并提供長期的、部位特異的基因表達(dá)。通過將經(jīng)過改變的病毒注射到通向器官的血管中，還在乳房組織和肝組織中驗(yàn)證了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。已經(jīng)用于基因療法方案的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、其它RNA病毒諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒或辛德比斯病毒(Sindbisvirus)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、SV40、牛痘和其它DNA病毒。復(fù)制缺陷型鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體是最廣泛使用的基因轉(zhuǎn)移載體。鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒由與核核心蛋白質(zhì)和聚合酶(pol)復(fù)合，裝入蛋白質(zhì)核心(gap)并由決定宿主范圍的糖蛋白包膜(env)圍繞的單鏈RNA構(gòu)成。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)包括由5’和3’長末端重復(fù)序列(LTR)包圍的gag、pol和env基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)利用這樣的事實(shí)，即倘若在包裝細(xì)胞系中反式提供病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，那么含有5’和3’LTR和包裝信號(hào)的最小載體足以容許載體包裝、感染和整合到靶細(xì)胞中。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因轉(zhuǎn)移的根本優(yōu)勢(shì)包括在大多數(shù)細(xì)胞類型中的高效感染和基因表達(dá)，精確的單拷貝載體整合到靶細(xì)胞染色體DNA中，和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的易操作性。腺病毒由與核心蛋白質(zhì)復(fù)合并以衣殼蛋白質(zhì)包圍的線性雙鏈DNA構(gòu)成。分子病毒學(xué)的發(fā)展導(dǎo)致了利用這些生物體的生物學(xué)來創(chuàng)建能夠在體內(nèi)將新型基因序列轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞中的載體的能力?；谙俨《镜妮d體將以高水平表達(dá)基因產(chǎn)物肽。腺病毒載體具有高效感染性，甚至是低滴度的病毒。另外，病毒作為無細(xì)胞病毒體具有完全感染性，所以不必注射生產(chǎn)者細(xì)胞系。腺病毒載體的另一項(xiàng)潛在優(yōu)勢(shì)是在有些細(xì)胞類型中實(shí)現(xiàn)長期異源基因表達(dá)的能力。腺病毒載體衍生自不能進(jìn)行復(fù)制的腺病毒，它們通常在E1基因中含有刪除。將此類載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，諸如293人胚腎細(xì)胞系，它容許E1刪除的腺病毒復(fù)制。轉(zhuǎn)染后，任選腺病毒載體在這些特化輔助細(xì)胞中復(fù)制并形成感染性顆粒，收集并純化。這些顆粒能夠感染廣泛的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)轉(zhuǎn)基因，如本發(fā)明的可選剪接載體，但是不能在沒有添加額外病毒因子的情況中復(fù)制。為了降低能進(jìn)行復(fù)制的腺病毒混有腺病毒制品的可能性，可使用在病毒基因組中具有額外刪除或突變的腺病毒載體，諸如E1/E3刪除的載體或所有或大多數(shù)病毒基因遭到滅活的“無內(nèi)容(gutless)”載體?；蛘?，可使用含有倒置蛋白質(zhì)pIX基因的腺病毒載體，正如美國申請(qǐng)?zhí)?0/621,782和60/631,246中所述。發(fā)現(xiàn)將質(zhì)粒DNA注射到肌肉細(xì)胞中產(chǎn)生高百分比的受到轉(zhuǎn)染且持續(xù)表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞。質(zhì)粒DNA可整合到細(xì)胞的基因組中或不然。不整合的轉(zhuǎn)染DNA將容許轉(zhuǎn)染和基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)在末端分化的、非增殖組織中表達(dá)較長一段時(shí)間而無需害怕細(xì)胞或線粒體基因組中的突變性插入、刪除或改變。長期但不必永久的將治療性基因轉(zhuǎn)移到特定細(xì)胞中可為治療或預(yù)防遺傳病。可定期重復(fù)注射DNA以維持基因產(chǎn)物水平而受體細(xì)胞基因組中不會(huì)發(fā)生突變。不整合的外源DNA可容許一個(gè)細(xì)胞中存在多種不同外源DNA構(gòu)建物，所有構(gòu)建物表達(dá)各種或多種基因產(chǎn)物。微粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法最初用于轉(zhuǎn)化植物組織。憑借微粒轟擊裝置，或“基因槍”，產(chǎn)生原動(dòng)力，將DNA包被的高密度微粒(諸如金或鎢)加速至容許穿透靶器官、組織或細(xì)胞的高速率。微粒轟擊可用于體外系統(tǒng)，或者與回體(exvivo)或體內(nèi)技術(shù)一起用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞、組織或器官。用于基因轉(zhuǎn)移的電穿孔使用電流使細(xì)胞或組織易受電穿孔介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的影響。使用指定電場(chǎng)強(qiáng)度的簡短電脈沖來提高膜的通透性，使得DNA分子能夠穿透進(jìn)入細(xì)胞。這種技術(shù)可用于體外系統(tǒng)，或者與回體或體內(nèi)技術(shù)一起用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞、組織或器官。載體介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移可用于將外來DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。載體-DNA復(fù)合物可方便的導(dǎo)入體液或血流，然后部位特異的指向體內(nèi)的靶器官或組織?？墒褂弥|(zhì)體和聚陽離子二者，諸如多賴氨酸、脂轉(zhuǎn)染試劑或細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑?？芍苽浼?xì)胞特異的或器官特異的脂質(zhì)體，由此脂質(zhì)體攜帶的外來DNA將由靶細(xì)胞攝取。注射靶向某些細(xì)胞上的特定受體的免疫脂質(zhì)體可作為常規(guī)方法用于將DNA導(dǎo)入攜帶該受體的細(xì)胞。已經(jīng)使用的另一種載體系統(tǒng)是用于將DNA攜帶至肝細(xì)胞用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的脫唾液酸糖蛋白/多賴氨酸偶聯(lián)物系統(tǒng)。轉(zhuǎn)染DNA還可復(fù)合有其它種類的載體，使得DNA被攜帶至受體細(xì)胞，然后駐留在胞質(zhì)或核質(zhì)中。DNA可在特定改造的囊泡復(fù)合物中偶聯(lián)載體核蛋白質(zhì)并直接被攜帶至核。例如，可用表達(dá)抗腫瘤多肽的本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染從患者切除的腫瘤細(xì)胞，并重新導(dǎo)回入患者體內(nèi)。轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞在患者體內(nèi)生成抑制腫瘤生長的蛋白質(zhì)水平?；颊呖梢允侨嘶蚍侨瞬溉閯?dòng)物。還可以通過本領(lǐng)域知道的物理或化學(xué)方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，諸如電穿孔、離子穿孔(ionoporation)、或經(jīng)由“基因槍”。另外，包含本發(fā)明可選剪接載體的核酸可直接注射到患者體內(nèi)，無需借助載體。具體而言，可將載體DNA注射到皮膚、肌肉或血液中。用于將本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染到患者中的基因療法方案可以是經(jīng)由將載體DNA整合到細(xì)胞的基因組中或微型染色體中，或是作為細(xì)胞胞質(zhì)或核質(zhì)中分開的復(fù)制或不復(fù)制DNA構(gòu)建物。蛋白質(zhì)表達(dá)可持續(xù)較長一段時(shí)間，或者可定期重新注射以維持細(xì)胞、組織或器官中期望的蛋白質(zhì)水平或預(yù)定的血液水平。7.治療方案和劑量在預(yù)防性應(yīng)用中，以足以消除或降低風(fēng)險(xiǎn)、減輕嚴(yán)重程度、或延遲疾病發(fā)作，包括疾病的生物化學(xué)、組織學(xué)和/或行為癥狀、其并發(fā)癥和疾病發(fā)展過程中呈現(xiàn)的中間病理學(xué)表型的數(shù)量，對(duì)患有可用本發(fā)明重組蛋白質(zhì)治療的疾病例如免疫系統(tǒng)疾病的受試者施用藥用組合物或藥物。在治療性應(yīng)用中，以足以治愈或至少部分阻止疾病的癥狀(生物化學(xué)、組織學(xué)和/或行為方面的)，包括其并發(fā)癥和疾病發(fā)展過程中的中間病理學(xué)表型的數(shù)量，對(duì)懷疑或早就患有此類疾病的受試者施用組合物或藥物。本發(fā)明的多肽對(duì)于調(diào)控駐留在血液中的細(xì)胞表面抗原的生物學(xué)活性特別有用，其中所治療或預(yù)防的疾病至少部分是由抗原的異常高或低生物學(xué)活性引起的。在有些方法中，本發(fā)明組合物的施用降低或消除免疫紊亂，例如炎癥。將適于實(shí)現(xiàn)治療性或預(yù)防性處理的數(shù)量定義為治療或預(yù)防有效量。在預(yù)防性和治療性兩種方案中，制劑通常以幾個(gè)劑量施用直至獲得足夠的免疫應(yīng)答。本發(fā)明組合物用于治療上文所述狀況的有效劑量隨許多不同因素而變化，包括施用手段、靶位點(diǎn)、受試者的生理學(xué)狀態(tài)、受試者是人還是動(dòng)物、施用的其它藥物、及處理是預(yù)防性的還是治療性的。通常，受試者是人，但是也可以處理非人哺乳動(dòng)物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的配制方法在藥學(xué)上可接受制劑中作為分離的和基本上純的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段提供由上文所述本發(fā)明可選剪接載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物表達(dá)的多肽和蛋白質(zhì)。這些制劑可通過標(biāo)準(zhǔn)路徑來施用。一般而言，可通過局部、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、顱內(nèi)、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)、陰道內(nèi)、子宮內(nèi)、口服、直腸或腸胃外(如靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))路徑來施用組合物。另外，可將多肽摻入容許持續(xù)釋放化合物的生物可降解聚合物，將該聚合物植入需要投遞藥物的部位附近，例如腫瘤部位，或者植入是為了系統(tǒng)的緩慢釋放多肽。還可使用滲透微泵來提供高濃度多肽的受控投遞，經(jīng)套管到達(dá)目的部位，諸如直接進(jìn)入轉(zhuǎn)移性生長或進(jìn)入該腫瘤的血管供應(yīng)。生物可降解聚合物及其用途詳細(xì)描述于例如Brem等，J.Neurosurg.74441-446，1991。本發(fā)明多肽的劑量將取決于所治療的疾病狀態(tài)或狀況及其它臨床因素，諸如人或動(dòng)物的體重和狀況及化合物的施用路徑。對(duì)于治療人或動(dòng)物，可施用約0.5mg/kg至500mg/kg多肽。根據(jù)多肽在特定動(dòng)物或人中的半衰期，可在每天幾次至每周一次之間施用多肽。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可應(yīng)用于人和獸醫(yī)用途二者。本發(fā)明的方法涵蓋單次以及多次施用，或是同時(shí)的或是在較長一段時(shí)間里。對(duì)于使用抗體的被動(dòng)免疫，劑量范圍為約0.0001-100mg/kg，且更常用的0.01-20mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重，或者在1-10mg/kg的范圍內(nèi)，優(yōu)選至少1mg/kg?？蓪?duì)受試者每天、隔天、每周或依照經(jīng)驗(yàn)分析決定的任何其它時(shí)間表施用此類劑量。一種例示性治療需要在較長一段時(shí)間例如至少六個(gè)月里施用多個(gè)劑量。其它例示性治療方案需要每兩周一次或每月一次或每3-6個(gè)月一次施藥。例示性劑量時(shí)間表包括連續(xù)每天1-10mg/kg或15mg/kg、隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在有些實(shí)施方案中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在這種情況中每種抗體的施用劑量落在所示范圍內(nèi)。通常在多個(gè)時(shí)刻施用抗體。單一劑量之間的時(shí)間間隔可以是每周、每月或每年。在有些方法中，調(diào)整劑量以獲得血漿抗體濃度1-1000μg/ml，而在有些方法中是25-300μg/ml?；蛘撸勺鳛槌掷m(xù)釋放制劑來施用抗體，在這種情況中需要較低頻率的施用。劑量和頻率隨抗體在受試者中的半衰期而變化。一般而言，人源抗體顯示最長的半衰期，隨后是人源化抗體、嵌合抗體和非人源抗體。施用的劑量和頻率可隨處理是預(yù)防性的或治療性的而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，將含有本發(fā)明抗體或其混合物的組合物施用于尚未處于疾病狀態(tài)的受試者以增強(qiáng)受試者的抵抗力。將此量定義為“預(yù)防有效量”。在此用途中，精確數(shù)量再次取決于受試者的健康和總體免疫(generalimmunity)狀態(tài)，但是通常范圍為每劑0.1-25mg，尤其是每劑0.5-2.5mg。在較長一段時(shí)間以相對(duì)稀疏的間隔施用相對(duì)較低劑量。有些受試者在其余生持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要相對(duì)較短間隔的相對(duì)較高劑量(如每劑約1-200mg抗體，更常用5-25mg的劑量)，直至疾病的進(jìn)展減緩或停止，且優(yōu)選直至受試者顯示疾病癥狀部分或完全緩解。此后，可對(duì)患者施行預(yù)防性方案。編碼抗體的核酸的劑量范圍為每名受試者約10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg、或30-300μgDNA。感染性病毒載體的劑量將隨所用病毒載體類型而變化，但體內(nèi)使用將在每劑1×105至1×1020個(gè)病毒體之間。對(duì)于體外劑量，通常將使用每個(gè)細(xì)胞約0.5至100個(gè)病毒體。治療劑可通過腸胃外、局部、靜脈內(nèi)、口服、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或肌肉內(nèi)手段來施用以用于預(yù)防性和/或治療性處理。蛋白質(zhì)藥物最典型的施用路徑是血管內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)，盡管其它路徑也可能是有效的。在有些方法中，將制劑直接注射到特定組織，在此積累沉積物(deposit)，例如顱內(nèi)注射。在有些方法中，將抗體作為持續(xù)釋放組合物或裝置施用，諸如MedipadTM裝置。蛋白質(zhì)藥物還可經(jīng)呼吸道施用，如使用干粉吸入裝置。本發(fā)明的試劑可任選聯(lián)合在本發(fā)明所針對(duì)的紊亂的治療中至少部分有效的其它制劑施用。出于例示的目的提供下面的實(shí)施例，而不應(yīng)當(dāng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。將貫穿此說明書引用的任何專利、專利申請(qǐng)、專利出版物(國家的和國際的)(具體包括序列表)和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容完整引入本文作為參考。例示貫穿實(shí)施例，使用了下列材料和方法，除非另有說明。材料和方法一般而言，本發(fā)明的實(shí)踐采用分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、及腫瘤學(xué)、神經(jīng)學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，尤其是如抗體技術(shù)，除非另有說明。參見如Sambrook、Fritsch和Maniatis，《MolecularCloning》，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989；AntibodyEngineeringProtocols，《MethodsinMolecularBiology》，510，Paul，S.，HumanaPress，1996；AntibodyEngineeringAPracticalApproach，《PracticalApproachSeries》，169，McCafferty編，IrlPress，1996；《AntibodiesALaboratoryManual》，Harlow等，C.S.H.L.Press，1999；及《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，Ausubel等編，John&Sons，1992。將可選剪接載體導(dǎo)入真核細(xì)胞為了在真核細(xì)胞中表達(dá)多肽，通常使用0.4cm電擊杯(BioRad，Hercules，CA)在0.8mlHEBS(20mMHepespH7.05、137mMNaCl、5mMKCl、0.7mMNa2HPO4、6mM右旋糖)中以0.28kV和950μF通過電穿孔將本發(fā)明的載體導(dǎo)入CHO細(xì)胞。每次電擊使用約5×106個(gè)細(xì)胞。電擊后，容許細(xì)胞在電擊杯中于室溫保溫5-10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到裝有10ml無血清CHO培養(yǎng)基的離心管中，并以1,000rpm離心5分鐘。然后將細(xì)胞沉淀物重懸于10ml無血清CHO培養(yǎng)基，接種T75燒瓶，并在加濕溫箱中于36℃和5％CO2保溫。轉(zhuǎn)染后3-5天，收獲條件培養(yǎng)基并通過ELISA測(cè)定抗體滴度。轉(zhuǎn)染進(jìn)行雙份。多肽多聚體表達(dá)分析表達(dá)分析通常使用DHFR選擇來進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞在不含核苷的無血清CHO培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周。未用DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(陰性對(duì)照)死亡，而含有選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長。為了評(píng)估細(xì)胞的特定多肽多聚體生產(chǎn)力，更換培養(yǎng)基，以2×105至3×105個(gè)存活細(xì)胞/ml接種細(xì)胞，并容許細(xì)胞生長2-3天，然后測(cè)定抗體滴度和細(xì)胞密度。所有滴度使用FRET測(cè)定法或者對(duì)抗體可變區(qū)特異的ELISA和/或?qū)贵wFc區(qū)特異的ELISA來測(cè)定。簡而言之，以10μg/mlAffiniPure山羊抗人IgGFcγ片段(產(chǎn)品目錄編號(hào)109-005-098，JacksonImmunoresearch，WestGrove，PA)或特定抗原的PBS溶液，以50μl/孔包被平板并于4℃保溫過夜。使用前，除去包被液，并用PBS、0.05％Tween-20清洗3次，然后用200μl/孔PBS、0.05％Tween-20、1％BSA(PBST/BSA)封閉至少1小時(shí)。除去封閉液，并針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣品。通常在PBST/BSA中稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品，于室溫保溫2小時(shí)，然后如上所述清洗。使用等分50μl/孔偶聯(lián)有過氧化物酶的AffiniPure驢抗人IgG(H+L)(JacksonImmunosearch，產(chǎn)品目錄編號(hào)709-035-149)來檢測(cè)抗體的存在。將偶聯(lián)物在PBST/BSA中1∶10,000稀釋，并于室溫保溫1.5小時(shí)，然后除去，并如上所述清洗。然后加入等分100μl/孔底物(溶于0.1M乙酸鈉緩沖液pH4.9的420mM四甲基聯(lián)苯胺和0.05％過氧化氫)來解析結(jié)合的抗原，即與底物一起保溫2分鐘，隨后用100μl/孔停止緩沖液2N硫酸固定。使用Softmax軟件(MolecualrDevices，Sunnyvale，CA)在MolecularDevicesSpectraMaxPlus讀板儀上于450nm讀取所得吸光度。對(duì)于FRET測(cè)定法，將50μl條件培養(yǎng)基樣品與75μl在含1％BSA的PBS(Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水溶液，產(chǎn)品目錄編號(hào)9280，IrvineScientific，SantaAna，CA；BSA，Sigma，產(chǎn)品目錄編號(hào)CA-7906)中稀釋的1.67μg/mlLanceTMEu-IDEC-152(用銪標(biāo)記的IgG1單克隆抗體)(PerkinElmer，Boston，MA)混勻。加入經(jīng)標(biāo)記抗體后，加入75μl在含1％BSA的PBS中稀釋的含有6.67μg/mlPhycolink山羊抗人IgG(Fc特異的)-XLAllophycocyanin(APC)偶聯(lián)物(產(chǎn)品目錄編號(hào)PJ253，ProzymeSanLeandro，CA)的測(cè)定混合液。將樣品加混合液在帶蓋的全孔未處理96孔黑板(FullwellNon-Treat96WellBlackPlate)(產(chǎn)品目錄編號(hào)237105，NalgeNuncInternational，Rochester，NY)中保溫，并使用TiterPlateShaker(滴定板搖床，產(chǎn)品目錄編號(hào)4625，VWR#57019-600，Bamstead/Lab-Line，MelrosePark，IL)搖動(dòng)超過15分鐘。使用1420MultilabelCounter(多標(biāo)記物計(jì)數(shù)器，Wallac，Gaithersburg，MD)以時(shí)間解析熒光模式讀板，激發(fā)337nm和發(fā)射665nm。使用Softmax軟件(MolecularDevices)分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例實(shí)施例1用于改造使用可選剪接來表達(dá)多種多肽的載體的方法下面的實(shí)施例描述了用于構(gòu)建適用于通過可選剪接在真核細(xì)胞中表達(dá)兩種或多種基因產(chǎn)物的載體的方法。本文描述的表達(dá)載體是美國申請(qǐng)?zhí)?0/237,067中描述的表達(dá)載體pV80的衍生物，其含有帶天然CMV剪接供體和剪接受體的天然CMV內(nèi)含子。簡而言之，構(gòu)建了如下DNA構(gòu)建物，它(以5’至3’或順流方向)包含細(xì)胞巨化病毒立即早期1(CMVIE1)啟動(dòng)子，包括CMVIE1內(nèi)含子(人細(xì)胞巨化病毒株AD169)前面的5’非翻譯區(qū)及CMVIE1內(nèi)含子的5’部分，包括天然剪接供體序列(SD)。CMVIE1內(nèi)含子的經(jīng)修飾3’部分包含用于方便更換可選剪接受體(SA1)的克隆多接頭(SwaI-BstBI)。另外，緊挨著SA1的下游添加了第一編碼序列的克隆位點(diǎn)(AscI)，其中克隆了人源化輕鏈基因，以及變體人生長激素(hGH)聚腺苷酸化區(qū)。再往下，向載體中引入了CMVIE1內(nèi)含子的3’部分，包括天然剪接受體(SA2)序列。緊挨著SA2的下游添加了第二編碼序列的克隆位點(diǎn)(BamHI)，其中克隆了人源化IgG1重鏈基因，以及變體人生長激素(hGH)聚腺苷酸化區(qū)。在載體中分開的位置引入了二氫葉酸還原酶(DHFR)選擇標(biāo)記。該選擇標(biāo)記衍生自pSI(Genbank編號(hào)#U47121，Promega，Madison，WI)，且在轉(zhuǎn)錄方面受到SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、人工內(nèi)含子(與可選剪接載體分開的)和SV40晚期聚腺苷酸化序列的控制。為了在原核細(xì)胞中克隆和擴(kuò)增可選剪接載體，添加了衍生自pUC19、包含β-內(nèi)酰胺酶基因的序列。圖3顯示了由上述改造步驟得到的載體(即pHL005)(還可見SEQIDNO29，它提供了AscI和BamHI位點(diǎn)中沒有插入外顯子編碼序列的載體主鏈序列)。在此實(shí)施例中，人源化抗體輕鏈和重鏈序列已經(jīng)分別克隆到AscI和BamHI位點(diǎn)中。此載體還容許在緊挨著第一編碼序列上游的限制性位點(diǎn)(SwaI-BstBI)處插入各種剪接受體，從而任選改變輕鏈和重鏈表達(dá)的比例。還構(gòu)建了其它表達(dá)載體，其中刪除了緊挨著剪接受體5’端的內(nèi)含子部分以生成pHLP005的載體主鏈。pHLP005的內(nèi)含子序列包含PflMI位點(diǎn)和BspEI位點(diǎn)，分別在SwaI位點(diǎn)5’端的約310bp和110bp處。為了生成這些刪除，通過PflMI或BspEI任一的部分消化將pHLP005質(zhì)粒線性化，然后用BspEI完全消化，并凝膠純化。為了生成具有不同第一剪接受體(SA1)的表達(dá)載體，將具有PflMI和BspEI或BspEI和BspEI相容位點(diǎn)的寡核苷酸(SEQIDNOs1-28)連接到各自pHLP005經(jīng)消化載體中并給予新的載體名稱(圖4)。然后通過DNA序列分析驗(yàn)證所有構(gòu)建物。所得載體以5’至3’或順流方向包含天然CMV剪接供體(SD)、選自SEQIDNOs1-28的第一剪接受體(SA1)、用于插入第一多肽的第一限制性位點(diǎn)(AscI)、作為第二剪接受體(SA2)的天然CMV剪接受體、和用于引入第二多肽的第二限制性位點(diǎn)(BamHI)。使用基于引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備抗體輕鏈和重鏈序列，并使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)將所得產(chǎn)物引入載體。所用引物包含用于插入AscI和BamHI位點(diǎn)的與編碼區(qū)鄰接的限制性位點(diǎn)。例如，5’引物可以是用于輕鏈的TTTTGGCGCGCCATGN(20)(SEQIDNO32)和用于重鏈的TTTTGGATCCATGN(20)(SEQIDNO33)。3’引物可以是用于輕鏈的GCACGGCGCGCCCTAN(20)(SEQIDNO34)和用于重鏈的GCAGGGATCCTCAN(20)(SEQIDNO35)。對(duì)于這些引物，N(20)代表對(duì)編碼期望重鏈或輕鏈的DNA特異的核苷酸序列。實(shí)施例2用于測(cè)定可選剪接效率的方法在此實(shí)施例中，描述了用于測(cè)定使用可選剪接來表達(dá)由與不同剪接受體鄰接的外顯子編碼的兩種不同基因產(chǎn)物的效率的方法和構(gòu)建物。雖然剪接是由外顯子/內(nèi)含子接合處的共有序列介導(dǎo)的，但是不能僅憑這些序列來決定剪接效率的精確預(yù)報(bào)。為此，必需用經(jīng)驗(yàn)方法來鑒定將會(huì)生成適當(dāng)比例的產(chǎn)物的剪接受體序列，這在本文中可作為所生成多聚體蛋白質(zhì)的總量來測(cè)量。因此，本發(fā)明提供了用于在任何指定細(xì)胞系中高效篩選期望剪接位點(diǎn)組合的便利載體。為了生成具有可選剪接位點(diǎn)的各種表達(dá)載體，制備了具有平端和BstBI相容末端的寡核苷酸，用于插入pHLP005載體的SwaI和BstBI位點(diǎn)。通過DNA序列分析驗(yàn)證所有構(gòu)建物。圖4和序列表(即SEQIDNOs1-28)提供了所測(cè)試剪接位點(diǎn)的序列。使用通過電穿孔實(shí)現(xiàn)的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染比較所生成的具有各種剪接受體的載體。用于轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞是二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系DG44(Urlaub等，Cell33405-412，1983)。所有DNA使用Megaprep試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)制備。轉(zhuǎn)染前，DNA用乙醇(EtOH)沉淀，用70％EtOH清洗，干燥，重懸于HEBS，并在轉(zhuǎn)染前定量。陰性對(duì)照不含DNA轉(zhuǎn)染且用作轉(zhuǎn)染對(duì)照。mAb特異ELISA和IgG特異ELISA二者都測(cè)量分泌到細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的總抗體。表1提供了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總抗體表達(dá)水平。結(jié)果證明，某些剪接位點(diǎn)，如pHLP0015和pHLP0018，在測(cè)試中在CHO細(xì)胞中瞬時(shí)生成高水平總抗體方面比其它剪接位點(diǎn)更有效。表1來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的抗體滴度實(shí)施例3可選剪接基因產(chǎn)物在真核細(xì)胞中的表達(dá)在此實(shí)施例中描述了可選剪接基因產(chǎn)物，特別是裝配好的IgG抗體的表達(dá)。簡而言之，通過電穿孔用本發(fā)明的可選剪接載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，并如上所述容許在選擇性培養(yǎng)基中恢復(fù)約2周以生成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。3-5天后，收獲條件培養(yǎng)基并通過ELISA測(cè)定抗體滴度。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將50μg編碼抗體輕鏈和重鏈的分開載體的DNA、50μg編碼抗體輕鏈和重鏈二者的可選剪接載體、或根本沒有DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞(CHO)，并作為抗體結(jié)合活性的函數(shù)來測(cè)定由細(xì)胞生成的功能性多肽多聚體的數(shù)量(表2)。表2穩(wěn)定集合的單位生產(chǎn)率(SpecificProductivityofStablePools)第一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了有可能由可選剪接載體生成功能性多肽多聚體，如單克隆抗體產(chǎn)物的原理。在其它實(shí)驗(yàn)中，將25μg編碼抗體輕鏈和重鏈的分開載體的DNA、50μg編碼抗體輕鏈和重鏈二者的可選剪接載體、或根本沒有DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞(CHO)，并作為抗體結(jié)合活性的函數(shù)來測(cè)定由細(xì)胞生成的功能性多肽多聚體的數(shù)量(表3-6)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明有可能由可選剪接載體生成功能性多肽多聚體，如單克隆抗體產(chǎn)物。數(shù)據(jù)說明pHLP015是比其它所測(cè)試載體更好的可選剪接載體，因?yàn)樗哂猩筛咚焦δ苄钥贵w的能力。表3來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的抗體滴度表4穩(wěn)定集合的單位生產(chǎn)率表5來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的抗體滴度表6穩(wěn)定集合的單位生產(chǎn)率因此，得出結(jié)論，可在真核細(xì)胞中使用可選剪接載體以瞬時(shí)和穩(wěn)定兩種方式生成功能性多肽多聚體，如抗體。因此，證明了經(jīng)由可選剪接表達(dá)超過一種多肽的單一載體系統(tǒng)的容易和效用。實(shí)施例4載體可生成具有優(yōu)良表達(dá)潛力的細(xì)胞系的證明本發(fā)明的載體設(shè)計(jì)用于優(yōu)化抗體表達(dá)的輕鏈和重鏈比例。免疫球蛋白重鏈不會(huì)分泌，除非與輕鏈一起裝配，而多數(shù)輕鏈可作為游離分子分泌。如此，過量的游離輕鏈將指示需要進(jìn)一步優(yōu)化載體以提高重鏈對(duì)輕鏈的產(chǎn)量比例。為了評(píng)估游離輕鏈的產(chǎn)量，生成了含有一種本發(fā)明載體的細(xì)胞系，并評(píng)估了它們的條件培養(yǎng)基，其中含有分泌的重組游離輕鏈和/或裝配好的抗體多聚體產(chǎn)物(表7)。載體構(gòu)建如實(shí)施例1和2中所述制備基于pHLP015的載體。如上所述將此載體導(dǎo)入CHO細(xì)胞并選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。如上所述衍生擴(kuò)增的細(xì)胞系，將單位生產(chǎn)率的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)設(shè)定為根據(jù)FRET分析測(cè)量的每天每個(gè)細(xì)胞生成超過10皮克蛋白質(zhì)。下文提供的結(jié)果證明了此表達(dá)載體在構(gòu)建抗體生產(chǎn)可接受的細(xì)胞系中的有效性。RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的剪接位點(diǎn)為了驗(yàn)證輕鏈和重鏈mRNA的剪接接合處符合構(gòu)建表達(dá)載體設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)的接合處，對(duì)細(xì)胞RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并隨后對(duì)cDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。自使用質(zhì)粒pHLP015進(jìn)行的轉(zhuǎn)染之一分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系并制備總RNA(RNAwiz，Ambion，Austin，TX)。使用與重鏈mRNA近似中心互補(bǔ)的引物，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶，Invitrogen，Carlsbad，CA)生成cDNA。然后將cDNA作為模板用于PCR(VentDNA聚合酶，NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)，其中使用CMV5’非翻譯區(qū)(剪接供體的5’端)中的引物和編碼區(qū)(重鏈編碼序列中剪接受體的3’端)中的引物。將此PCR產(chǎn)物測(cè)序，并驗(yàn)證CMV內(nèi)含子中的剪接供體和緊挨著重鏈編碼序列5’端的剪接受體之間的預(yù)測(cè)剪接產(chǎn)物。使用寡(dT)15作為引物，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，Promega，Madison，WI)由細(xì)胞RNA生成cDNA。然后將此cDNA作為模板用于PCR(VentDNA聚合酶，NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)，其中使用CMV5’非翻譯區(qū)(剪接供體的5’端)中的引物和編碼區(qū)(輕鏈編碼序列中剪接受體的3’端)中的引物。將此PCR產(chǎn)物測(cè)序，并驗(yàn)證CMV內(nèi)含子中的剪接供體和緊挨著輕鏈編碼序列5’端的剪接受體之間的預(yù)測(cè)剪接產(chǎn)物，指示表達(dá)載體如預(yù)期一樣通過可選剪接發(fā)揮功能。條件培養(yǎng)基的SDS-PAGE分析由使用來自實(shí)施例1-3的質(zhì)粒pHLP015(表7中的mAb#1-1)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。另外，使用另一種基于pHLP015的載體(在此實(shí)施例中生成，表7中的mAb#2-1至5)生成許多穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。為了純化完整mAb和游離輕鏈二者，將約50ml條件培養(yǎng)基加樣到1.3ml蛋白質(zhì)L-瓊脂糖(產(chǎn)品目錄編號(hào)P3351，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)柱上，用15ml3xPBS清洗柱子，然后是5ml1xPBS清洗，再用100mMNaH2PO4pH2.8洗脫，其中等分收集量0.3ml，并立即用75μl1MHepespH8中和。通過280nm的UV吸收定位蛋白質(zhì)峰，并使用消光系數(shù)1.5A280/mg/ml測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將適當(dāng)體積的峰樣品在樣品緩沖液中稀釋至15μl中加載1.5μg蛋白質(zhì)。將基于Laemmli的樣品緩沖液(0.25MTris-HClpH6.8、8％SDS、40％甘油、和0.01％溴酚藍(lán))的4x儲(chǔ)液與新鮮的100mMNEM一起配制以用于非還原性凝膠。將樣品于100℃加熱5分鐘，并將15μl施加到PAGErGoldPrecast4-20％tris-甘氨酸凝膠(產(chǎn)品目錄編號(hào)59517，Cambrex，EastRutherford，NJ)上。將凝膠在Laemmli緩沖液中以45mA運(yùn)行40分鐘。運(yùn)行后，將凝膠用約100ml考馬斯藍(lán)Cleveland染料(50％甲醇、10％乙酸、0.1％考馬斯藍(lán))染色，即微波1分鐘和搖動(dòng)10分鐘。然后將凝膠在約100ml10％甲醇、10％乙酸中脫色，即微波2分鐘和搖動(dòng)過夜并吸收泡沫(withabsorbentfoam)。在BioradGS-800CalibratedDensitometer(校準(zhǔn)密度計(jì))上掃描凝膠，并用BioradQuantityOne軟件對(duì)完整抗體和游離輕鏈條帶定量。表7顯示了表述為總分泌蛋白質(zhì)(完整抗體+游離輕鏈)百分?jǐn)?shù)的游離輕鏈數(shù)量。表7來自基于pHLP015細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中完整抗體和游離輕鏈相對(duì)數(shù)量的評(píng)估如圖7所示，沒有檢測(cè)到高水平的游離輕鏈，說明該載體很好地平衡了輕鏈相對(duì)于重鏈的表達(dá)。實(shí)施例5生成多聚體蛋白質(zhì)的載體本發(fā)明的載體和表達(dá)盒或構(gòu)建物可用于表達(dá)任何多聚體蛋白質(zhì)，包括但不限于上文詳述中描述的多聚體蛋白質(zhì)。許多此類蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的，且適用于本發(fā)明的載體和表達(dá)盒或構(gòu)建物。待表達(dá)的多肽數(shù)目可以不同。例如，如上所述可表達(dá)兩種多肽。額外的多肽可通過在載體中插入更多編碼多肽的外顯子來表達(dá)，優(yōu)選插入第一外顯子和第二剪接受體之間。每個(gè)額外外顯子將在該外顯子的5’端具有剪接受體，從而通過單一剪接供體和各個(gè)剪接受體之間發(fā)生的剪接來調(diào)控轉(zhuǎn)錄。如此，超過一種多肽可使用同一剪接供體和不同剪接受體來表達(dá)，其中以一定比例表達(dá)各種多肽以優(yōu)化一種或多種期望蛋白質(zhì)的表達(dá)。如上述實(shí)施例所述制備包含剪接受體的載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物，所述剪接受體容許以優(yōu)化多聚體蛋白質(zhì)表達(dá)的比例進(jìn)行剪接及后續(xù)多肽鏈的翻譯。首先，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆或擴(kuò)增編碼多肽鏈的基因，諸如使用對(duì)鏈特異的引物的RT-PCR和含有表達(dá)期望多肽的基因的適當(dāng)文庫。然后將所述基因插入能夠以適當(dāng)比例表達(dá)多肽的本發(fā)明載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物，所述比例足以表達(dá)高水平的多聚體蛋白質(zhì)。此載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物可具有便利的限制性位點(diǎn)以便于插入剪接位點(diǎn)、外顯子和其它期望元件。例如，可使用pHLP0015。或者，如實(shí)施例2和3中所述，將編碼多肽的基因插入超過一種載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物，每個(gè)具有不同的第一剪接受體，以篩選容許適當(dāng)表達(dá)水平的剪接受體。最后，將編碼多肽的一種或多種載體或表達(dá)盒或構(gòu)建物導(dǎo)入適當(dāng)細(xì)胞系，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞，并表達(dá)。然后可由細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基(如果分泌的話)或者由裂解細(xì)胞(如果蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)蛋白或膜結(jié)合蛋白)收集多聚體蛋白質(zhì)。將本文引用的所有參考文獻(xiàn)完整引入本文作為參考。等同方案對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)時(shí)，可找到與本文描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案等同的許多方案。所附權(quán)利要求涵蓋此類等同方案。序列表<110>比奧根艾迪克MA公司<120>使用可選剪接在真核細(xì)胞中表達(dá)多肽多聚體的方法和構(gòu)建物<130>2159.0310001<150>US60/553,478<151>2004-03-15<160>35<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>1aaatctgcagtcttcgaacagg22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>2tttagacgtcagaagcttgtcc22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>3aattctgcagtcaccgtcctt21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>4ttaagacgtgagtggcaggaagc23<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>5aattctgcactcaccgtcctt21<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>6ttaagacgtgagtggcaggaagc23<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>7aattgtgcagtcaccgtcctt21<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>8ttaacacgtcagtggcaggaagc23<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>9aattctgcaatcaccgtcct21<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>10ttaagacgttagtggcaggaagc23<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>11aagctagcagtcaccgtcctt21<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>12ttcgatcgtcagtggcaggaagc23<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>13aattctgcggtcaccgtcctt21<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>14ttaagacgccagtggcaggaagc23<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>15aagaggcctctcaccgtcctt21<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>16ttctccggagagtggcaggaagc23<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>17aagggggcagtcaccgtcctt21<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>18ttcccccgtcagtggcaggaagc23<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>19aagctagcagtcgaccacctt21<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>20ttcgatcgtcagctggtggaagc23<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>21ccggagggggcagtcaccgtcctt24<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>22tcccccgtcagtggcaggaagc22<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>23atgggggggcagtcaccgtcctt23<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>24ttgtacccccccgtcagtggcaggaagc28<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>25ccggattctgcagtcaccgtcctt24<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>26taagacgtcagtggcaggaagc22<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>27atggttctgcagtcaccgtcctt23<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<400>28ttgtaccaagacgtcagtggcaggaagc28<210>29<211>6801<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工載體<400>29agcttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttca60tagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc120gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat180agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagt240acatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcc300cgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatcta360cgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtgg420atagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagttt480gttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgac540gcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaa600ccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccggga660ccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagag720tgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcatgcta780tactgtttttggcttggggtctatacacccccgcttcctcatgttataggtgatggtata840gcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgata900ctttccattactaatccataacatggctctttgccacaactctctttattggctatatgc960caatacactgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtctcat1020ttattatttacaaattcacatatacaacaccaccgtccccagtgcccgcagtttttatta1080aacataacgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggaacggtggagggcag1140tgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagac1200taacagactgttcctttccatgggtatttaaatctgcagtcttcgaacaggcgcgccgtg1260cgatccctgcccgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggtcgtggaa1320ggtgctactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgttt1380gactaggtgtccttgtataatattatggggtggaggcgggtggtatggagcaaggggcag1440gttgggaagacaacctgtagggccttcagggtctattgggaaccaggctggagtgcagtg1500gcacgatcttggctcgctgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcag1560tctcccgaatagttgggattccaggcatgcacgaccaggctcagctaatttttgtatttt1620tggtagagacggggtttcaccatattggccagtctggtctccatctcctgacctcaggta1680atccgcccgcctcggcctcccaaattgctgggattacaggtatgagccactgggcccttc1740cctgtcctgtgattttaaaataattataccagcagaaggacgtccagacacagcatgggc1800tacctggccatgcccagccagttggacatttgagttgtttgcttggcactgtcctctcat1860gaattcgatatccggaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgc1920gcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtctttt1980ctgcagtcaccgtccttgacacgggatccctgcccgggtggcatccctgtgacccctccc2040cagtgcctctcctg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tggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaaca6780gctatgaccatgattacgcca6801<210>30<211>9<212>RNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>m是′a′或′c′<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>r是′g′或′a′<400>30magguragu9<210>31<211>15<212>RNA<213>人工序列<220><223>剪接位點(diǎn)盒<220><221>misc_feature<222>(1)..(10)<223>y是′c′或′t′<220><221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>n是任何核苷酸<400>31yyyyyyyyyyncagg15<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>5′輕鏈引物<220><221>misc_feature<222>(16)..(20)<223>n是任何核苷酸<400>32ttttggcgcgccatgnnnnn20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>5′重鏈引物<220><221>misc_feature<222>(14)..(20)<223>n是任何核苷酸<400>33ttttggatccatgnnnnnnn20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>3′輕鏈引物<220><221>misc_feature<222>(16)..(20)<223>n是任何核苷酸<400>34gcacggcgcgccctannnnn20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>3′重鏈引物<220><221>misc_feature<222>(14)..(20)<223>n是任何核苷酸<400>35gcagggatcctcannnnnnn20權(quán)利要求1.一種表達(dá)載體，其包含啟動(dòng)子；5’UTR；單一剪接供體；內(nèi)含子；第一剪接受體；編碼第一多肽的第一外顯子；第二剪接受體；和編碼第二多肽的第二外顯子，其中，所述啟動(dòng)子可操作連接所述第一和第二外顯子，在進(jìn)入細(xì)胞后，所述單一剪接供體與所述第一剪接受體剪接，形成容許所述第一外顯子轉(zhuǎn)錄的剪接轉(zhuǎn)錄物，并與所述第二剪接受體剪接，形成容許所述第二外顯子轉(zhuǎn)錄的剪接轉(zhuǎn)錄物，且所述第一多肽和所述第二多肽由所述剪接轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。2.權(quán)利要求1的載體，其中所述啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。3.權(quán)利要求1的載體，還包含與所述第一外顯子或第二外顯子可操作連接的聚腺苷酸化信號(hào)。4.權(quán)利要求1的載體，其中所述載體還包含一個(gè)或多個(gè)額外剪接受體和編碼額外多肽的額外外顯子，其中在進(jìn)入細(xì)胞后，所述單一剪接供體與所述額外剪接受體剪接，形成容許所述額外外顯子轉(zhuǎn)錄的額外剪接轉(zhuǎn)錄物，且所述額外多肽由所述額外剪接轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。5.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一或第二外顯子或二者編碼選擇標(biāo)記。6.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一和第二多肽形成多聚體。7.權(quán)利要求6的載體，其中所述多聚體蛋白質(zhì)是異二聚體、異三聚體或異四聚體。8.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一多肽以相對(duì)于所述第二多肽約10∶1至約1∶10的頻率表達(dá)。9.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一多肽以相對(duì)于所述第二多肽約3∶1至約1∶3的頻率表達(dá)。10.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一多肽以相對(duì)于所述第二多肽約1∶1的頻率表達(dá)。11.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一或第二剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。12.權(quán)利要求11的載體，其中所述剪接供體和所述第二剪接受體衍生自CMV，而所述第一剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。13.權(quán)利要求1的載體，其中所述載體是病毒載體。14.權(quán)利要求1的載體，包含SEQIDNO29。15.包含權(quán)利要求1的載體的真核細(xì)胞。16.權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述載體整合到所述細(xì)胞的染色體DNA中。17.權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述載體是附加體。18.權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。19.權(quán)利要求18的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自下組幼倉鼠腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、NS0細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞或CHO細(xì)胞。20.權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。21.用于生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括在培養(yǎng)物中培養(yǎng)權(quán)利要求15的細(xì)胞并由所述培養(yǎng)物分離所述第一多肽和所述第二多肽。22.通過權(quán)利要求21的方法生產(chǎn)的第一多肽和第二多肽。23.包含權(quán)利要求22的第一多肽和第二多肽的組合物，還包含藥學(xué)上可接受載體。24.用權(quán)利要求23的組合物治療有所需要的患者的方法。25.一種表達(dá)載體，其包含啟動(dòng)子；5’UTR；單一剪接供體；內(nèi)含子；第一剪接受體；編碼第一抗體多肽或其片段的第一外顯子；第二剪接受體；和編碼第二抗體多肽或其片段的第二外顯子，其中，所述啟動(dòng)子可操作連接所述第一和第二外顯子，在進(jìn)入細(xì)胞后，所述單一剪接供體與所述第一剪接受體剪接，形成容許所述第一外顯子轉(zhuǎn)錄的剪接轉(zhuǎn)錄物，并與所述第二剪接受體剪接，形成容許所述第二外顯子轉(zhuǎn)錄的剪接轉(zhuǎn)錄物，且所述第一抗體多肽或其片段和所述第二抗體多肽或其片段由所述剪接轉(zhuǎn)錄物表達(dá)且締合形成抗體或抗體片段。26.權(quán)利要求25的載體，其中所述第一外顯子或所述第二外顯子或二者編碼抗體片段。27.權(quán)利要求25的載體，其中所述第一多肽是抗體重鏈或其片段，而所述第二多肽是抗體輕鏈或其片段。28.權(quán)利要求25的載體，其中所述第一多肽是抗體輕鏈或其片段，而所述第二多肽是抗體重鏈或其片段。29.權(quán)利要求27的載體，其中所述輕鏈或重鏈或二者是鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。30.權(quán)利要求28的載體，其中所述輕鏈或重鏈或二者是鼠源的、嵌合的、人源化的、人的或合成的。31.權(quán)利要求25的載體，其中所述第一抗體多肽或其片段以相對(duì)于所述第二抗體多肽或其片段約3∶1至約1∶3的頻率表達(dá)。32.權(quán)利要求25的載體，其中所述第一抗體多肽或其片段以相對(duì)于所述第二抗體多肽或其片段約1∶1的頻率表達(dá)。33.權(quán)利要求25的載體，其中所述第一剪接受體或所述第二剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。34.權(quán)利要求33的載體，其中所述剪接供體和所述第二剪接受體衍生自CMV，而所述第一剪接受體包含任何一種選自下組的序列SEQIDNO1-28。35.權(quán)利要求25的載體，其中所述載體是病毒載體。36.權(quán)利要求25的載體，包含SEQIDNO29。37.包含權(quán)利要求25的載體的真核細(xì)胞。38.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述載體整合到所述細(xì)胞的染色體DNA中。39.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述載體是附加體。40.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。41.權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自下組幼倉鼠腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、NS0細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞或CHO細(xì)胞。42.權(quán)利要求41的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。43.用于生產(chǎn)抗體或抗體片段的方法，所述方法包括在培養(yǎng)物中培養(yǎng)權(quán)利要求37的細(xì)胞并由所述培養(yǎng)物分離所述第一多肽和所述第二多肽。44.通過權(quán)利要求43的方法生產(chǎn)的抗體或抗體片段。45.包含權(quán)利要求44的抗體或抗體片段的組合物，還包含藥學(xué)上可接受載體。46.用權(quán)利要求45的組合物治療有所需要的患者的方法。全文摘要本發(fā)明提供了使用單一表達(dá)載體在真核細(xì)胞中生產(chǎn)多種多肽，諸如抗體或抗體片段的方法。所述表達(dá)載體經(jīng)過改造包含在單一啟動(dòng)子控制下的兩種或多種表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒具有容許其可選剪接并以期望比例表達(dá)成兩種或多種獨(dú)立基因產(chǎn)物的剪接位點(diǎn)。公開了所述載體用于在真核宿主細(xì)胞中高效表達(dá)重組抗體的用途，以及此類抗體在診斷性和治療性應(yīng)用中的用途。文檔編號(hào)C07H21/00GK1961071SQ200580015621公開日2007年5月9日申請(qǐng)日期2005年3月15日優(yōu)先權(quán)日2004年3月15日發(fā)明者霍利·普倫蒂斯申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司