專利名稱：一種在真核細胞中高效表達重組人白細胞介素12的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域。具體地說，本發(fā)明涉及一種提高重組人IL-12在真核細胞中表達強度的方法。
背景技術：
白細胞介素-12(IL-12)是一種70kDa的異二聚體，由兩條共價連接的多肽鏈組成，一條為35kDa(P35亞基)，另一條為40kDa(P40亞基)。P35亞基由多種細胞產(chǎn)生，包括T、B淋巴細胞、NK細胞和大單核細胞等，而P40鏈主要由激活的單核細胞和B細胞產(chǎn)生。P35和P40單獨存在時均無任何IL-12的生物活性。
IL-12在細胞介導的免疫應答中是一種重要的調節(jié)因素，它作用于NK細胞和T淋巴細胞。
(1)IL-12是NK細胞強有力的刺激因子，它可通過NK細胞誘導γ-干擾素的復制，并與白細胞介素-2有較強的協(xié)同作用。另外，除了刺激產(chǎn)生γ-干擾素外，IL-12還可增強NK細胞的溶細胞活性，而且還是NK細胞的生長因子。
(2)IL-12刺激原初CD4+T細胞分化成TH1亞群，相應的IL-12和γ-干擾素的生產(chǎn)可控制TH1及TH2優(yōu)勢的T細胞的發(fā)展，這樣有助于TH1分化優(yōu)勢，及對IL-4和IL-10的控制并提高TH2的分化。
(3)IL-12刺激CD8+T細胞分化為成熟細胞，功能性激活的CTL，由于這些效應，IL-12在治療一些播散性腫瘤方面有潛在的作用。
IL-12能誘導NK細胞、T細胞等產(chǎn)生γ-干擾素，同時激活NK細胞和巨嗜細胞，增強其細胞殺傷活性，而且在γ-干擾素存在時顯示阻礙腫瘤新生血管的作用。它在機體早期的非特異性免疫和隨后的抗原特異性的適應性免疫過程中均扮演了極為重要的角色，它能顯著殺死癌細胞。初步研究結果顯示，重組人IL-12可以誘導全身性抗腫瘤免疫反應，從而抑制腫瘤生長或得到完全緩解。上述研究表明，IL-12是一種多功能的免疫調節(jié)因子，有可能成為治療癌癥的有效藥物。
另外，IL-12是目前發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)增強DNA疫苗誘導細胞免疫的良好佐劑中最好的，預計將來在DNA疫苗的研究上將發(fā)揮獨特的作用。
綜上所述，IL-12具有巨大的應用前景。
然而，在目前報道的利用真核細胞表達產(chǎn)生重組IL-12的方法中，重組IL-12的表達強度仍不令人滿意。因此，本領域中迫切需要有一種提高重組IL-12在真核細胞中的表達強度的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種在真核細胞中高效表達IL-12的方法，從而克服現(xiàn)有技術中表達強度不高的缺點，從而大大降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組人白細胞介素-12的方法，該方法包括a)提供對應于P35亞基的核苷酸序列和對應于P40亞基的核苷酸序列，其中所述P35亞基具有完整的第一信號肽；b)將步驟a)所述核苷酸序列插入表達載體中；c)用步驟b)獲得的表達載體轉化真核細胞；d)在適合重組人IL-12表達的條件下，培養(yǎng)步驟c)所得的轉染的真核細胞；e)從培養(yǎng)物中分離純化得到白細胞介素-12。
在上述方法中，真核表達載體可以是pMT2，真核細胞可選自CHO細胞、Vero細胞和COS細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述對應于具有第一信號肽的P35亞基的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。在另一實施方案中，所述對應于具有第一信號肽的P35亞基的核苷酸序列是真核細胞所偏好的。在還有一個實施方案中，所述對應于具有第一信號肽的P35亞基的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
本發(fā)明提供了一種能在真核細胞中高效表達重組人白介素-12的方法。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的方法可使P35亞基的表達提高大約8-17倍。由于P35亞基表達強度的提高，P35和P40兩個亞基的表達量得到了平衡，從而使具有生物活性的IL-12的表達量得到顯著提高。
下面將進一步詳細描述本發(fā)明。
發(fā)明實施方式本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組人白細胞介素-12的方法，該方法包括a)提供對應于P35亞基的核苷酸序列和對應于P40亞基的核苷酸序列，其中所述P35亞基具有完整的第一信號肽；b)將步驟a)所述核苷酸序列插入表達載體中；
c)用步驟b)獲得的表達載體轉化真核細胞；d)在適合重組人IL-12表達的條件下，培養(yǎng)步驟c)所得的轉染的真核細胞；e)從培養(yǎng)物中分離純化得到白細胞介素-12。
本文所用的術語“表達載體”通常指能在所選宿主細胞中復制的質?；蚱渌怂岱肿?。該表達載體可以自主復制，或可通過本領域熟知的方法插入宿主細胞的基因組中而進行復制。自主復制的載體具有在所選宿主細胞內起作用的復制起點或自主復制序列。通常，希望一個載體可用于多種宿主細胞內，例如在大腸桿菌中用于克隆和構建，在哺乳動物細胞用于表達。在本發(fā)明的一個實例中，所用的真核表達載體為pMT2(其圖譜見Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》第2版，1989年)。然而，本發(fā)明也可采用本領域技術人員熟知的其它的合適載體。
在本發(fā)明中，通常用哺乳動物細胞系來作為表達真核細胞衍生多肽的宿主細胞。哺乳動物細胞在培養(yǎng)物中的繁殖是本領域熟知的。見《組織培養(yǎng)》，Academic Press，Kruse and Patterson編輯(1973)，該文納入本文作為參考。較佳的哺乳動物細胞是許多可購得的無限增殖細胞系。這些無限增殖細胞系包括但不局限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Vero細胞、海拉細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(如Hep G2)和其它許多細胞系。它們?yōu)榈鞍踪|分子提供了翻譯后修飾，包括正確的折疊、正確的二硫鍵形成以及正確位點的糖基化。另外，宿主細胞系還可包括以下生物體，如細菌(如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)、酵母、絲狀真菌、植物細胞或昆蟲細胞。
本文所用的術語“轉化”是指用熟知的方法將含有感興趣的核酸的載體直接導入宿主細胞內。轉化方法因宿主細胞類型而異，通常包括電穿孔；采用氯化鈣、氯化銣磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質的轉染；微粒轟擊；脂轉染；感染和其它方法(見Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》第2版，1989年)。在本發(fā)明的一個實例中，轉化方法是脂轉染。
如上所述，重組人白介素-12是一種70kDa的異二聚體，它由P35亞基和P40亞基組成。P35和P40基因的核苷酸序列分別顯示在序列表SEQ ID NO1和SEQ IDNO2中。P35亞基的氨基酸序列顯示在序列表SEQ ID NO8中。
研究表明，P35亞基只有與P40亞基形成二聚體后才能有效地分泌到細胞外。因此，本發(fā)明者將這兩個基因分別插入到桿狀病毒感染最晚期的多角體蛋白(polyhedrin)啟動子和p10啟動子后面，使這兩個基因在量的方面盡可能有一均衡的比例。ELISA和Western印跡結果表明，桿狀病毒可以使兩個不同的基因在同一載體上得到有效的表達，并且能夠正確地折疊、形成有生物活性的二聚體。
Western印跡結果還表明，P40亞基單體的分泌量遠遠高于P35亞基。這一結果一方面支持P35亞基只有與P40亞基結合后才能分泌出細胞的觀點，另一方面表明重組人IL-12在真核細胞中最終表達量的高低主要取決于P35亞基的表達量。由此可見，具有生物活性的IL-12的表達量主要取決于P35亞基的表達量。因此，欲提高IL-12的表達量，其一種可行的途徑是提高P35亞基的表達量。
在P35基因中，有兩個起始密碼子，其中第二個起始密碼子位于第一個起始密碼子后面的第35位。由于這兩個起始密碼子的存在，該基因可以轉錄出兩種不同的mRNA產(chǎn)物。碰巧的是，這兩個起始密碼子是“嵌套”的，即具有相同的閱讀框架，第二個閱讀框架是第一個閱讀框架的一部分，因此這兩種起始方式的編碼產(chǎn)物的成熟蛋白結構是相同的。P35結構基因編碼產(chǎn)物的第一個信號肽由第1～34個氨基酸組成，第二個信號肽由第35～37位氨基酸組成。與P35亞基第一個信號肽的氨基酸序列對應的核苷酸序列為SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的核苷酸1-102。
目前報道的利用真核系統(tǒng)表達IL-12的研究均是從第二個信號肽開始的。然而，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在分子克隆中保留第一個信號肽序列可以使P35的表達量明顯提高。保留編碼第一個信號肽序列還可以增加P35mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高其編碼產(chǎn)物的產(chǎn)量。另外，本發(fā)明者還參照哺乳動物對密碼子的偏愛性對編碼第一信號肽的核苷酸序列作了基因工程改造，從而使該基因更能適合在真核細胞中表達，P35的表達量進一步得到提高。經(jīng)基因工程改造后的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO3中，其中核苷酸1-102對應于P35亞基的第一信號肽序列。
下面將結合實施例進一步詳細描述本發(fā)明。
實施例1基因的擴增A.引物設計1)P35的擴增引物正向引物5’ctcctgcagatgtggccccctggtcag-3’(SEQ ID NO4)，其中ctc為保護堿基，下劃線部分為向表達載體pMSG(購自Pharmacia)克隆時的切點(Pst I)。
反向引物5’-gcagaattcttaggaagcattcagatagctc-3’(SEQ ID NO5)，其中gca為保護堿基，下劃線部分為向上述表達載體克隆時的切點(Eco RI)。
2)P40的引物設計正向引物5’-ctgctgcagatgtggccccctggtcag-3’(SEQ ID NO6)，其中ctc為保護堿基，下劃線部分為向表達載體pMSG(Pharmacia)克隆時的切點(Pst I)。
反向引物5’-gcagaattcttaggaagcattcagatagctc-3’(SEQ ID NO7)，其中gca為保護堿基，下劃線部分為向上述表達載體克隆時的切點(Eco RI)。
合成所述引物并進行PAGE純化。
B.NC-37淋巴母細胞總RNA的提取、純化與反轉錄取5毫升1×106細胞/毫升的NC-37淋巴母細胞培養(yǎng)液，加入佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate)和鈣離子載體(calcium ionophor A23187)至最終濃度為5mM和7.5mM，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，誘導人表達IL-12的表達。
取約2×106個上述誘導后的淋巴母細胞培養(yǎng)液，6000rpm離心10分鐘收集細胞，加入約1毫升Trizol試劑(購自Invitrogene公司)，按照廠家說明提取純化總RNA。
純化的RNA經(jīng)1％瓊脂糖電泳鑒定，完整性良好，可用于反轉錄。
將上述純化的總RNA用反轉錄試劑盒(購自MBI)進行反轉錄，其反轉錄引物為oligo-(dT)18，操作按照廠家的說明書進行。電泳檢查證明，獲得的cDNA完整性良好。
C.P35和P40基因的擴增P35和P40的PCR反應體系均為50μL，反應體系組成1×PCR反應緩沖液，forward和backward引物濃度均為100pmol/L，鎂離子1.5mmol/L，模板DNA濃度為0.1mmol/L，含3U Pfu DNA聚合酶。上述每管50μL的反應體系共進行5只管子，以獲得足量的擴增產(chǎn)物。
P35和P40的PCR反應熱循環(huán)均采用以下條件預變性94℃2分鐘；主循環(huán)94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃2.5分鐘，共30個循環(huán)；后延伸72℃5分鐘。
以上循環(huán)完成后，在1％瓊脂糖電泳上進行鑒定。在P35的擴增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)有一個分子大小約750bp的單一條帶，與預期的分子量751bp相符。在P40的擴增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)有一個分子大小約為950-1000bp的單一條帶，與P40的預期的985bp相符。用膠回收試劑盒(Bio101)對該片段回收，操作過程按照廠家說明進行。得純化的DNA約各3微克。
實施例2基因的克隆、鑒定與測序將上述獲得的純化的擴增產(chǎn)物插入到pGEM-T載體(Promega產(chǎn)品)上。操作步驟按照廠家的說明進行，獲得重組DNA。
用常規(guī)方法將上述重組DNA轉化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)藍/白斑篩選獲得P35的陽性克隆19個，P40的陽性克隆23個。P35和P40各酶切鑒定5個克隆后分別確認2個和3個克隆帶有目的插入片段。
在ABI377全自動測序儀上對上述鑒定出的P35和P40的陽性克隆各2個進行雙向測序。測序結果如序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。
實施例3 P35亞基信號肽I和II的表達與P35表達量之間的關系Western印跡研究已經(jīng)證明，P40單體的分泌量遠遠高于P35，具有生物活性的IL-12的表達量主要取決于P35的表達量。因此，欲提高IL-12的表達量，一種可行的途徑是提高P35的表達量。
由于人們認為P35cDNA和一些細胞因子基因序列一樣，其序列本身可能就是調節(jié)其表達的調控元件，如何調整P35cDNA序列以增加P35的表達是提高最終IL-12產(chǎn)量的關鍵所在。
用分析軟件DNAstar3.10版對P35結構基因及其翻譯產(chǎn)物的結構特點進行分析，結果發(fā)現(xiàn)其編碼的產(chǎn)物包含有兩個信號肽(I和II)。第一個信號肽由第1～34個氨基酸組成，第二個信號肽由第35～37位氨基酸組成。
本發(fā)明的研究證明，保留兩個信號肽序列可以使P35的表達量明顯提高，最高可以提高8倍(結果見下表1)。而且還發(fā)現(xiàn)，保留編碼第一個信號肽序列可以增加P35mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高其編碼產(chǎn)物的產(chǎn)量。
表1.信號肽組成與P35表達強度的關系。

從表1可以看出，第一信號肽的存在可以明顯提高P35的表達量，這對協(xié)調P35和P40兩個亞基在數(shù)量上的平衡有著重要意義。
實施例4 P35的基因工程改造為了進一步提高P35基因的表達強度，在實施例3的基礎上，在保持第一信號肽氨基酸序列不變的前提下，本發(fā)明者又對P35基因第一信號肽的核苷酸序列參照哺乳動物對密碼子使用的偏愛性進行了基因工程改造，以使該基因更能適合在CHO等真核細胞中表達。設計的該段DNA編碼序列如下5’-atg tgg cca cct gga tca gca tcg cag cct cca ccg tca cct gca gct gcc act gga ctc cac cctgcg gca cga cct gtg tcc ctg cag tgc cgt cta agc-3’ (SEQ ID NO9)利用本領域已知的技術，合成上述DNA片段，并用該片段取代P35基因中的相應片段(即核苷酸1-102)。然后，將經(jīng)改造的P35基因(其核苷酸序列見SEQ ID NO3)插入到克隆載體上并進行測序。從6個克隆中挑選出了一個完全正確的克隆，將該克隆記作P35(I+II)M。
實施例5真核表達載體的構建與CHO細胞的轉染P35(I+II)、P35(I+II)M和P35(II)表達載體的構建將帶有兩個完整信號肽序列的P35cDNA(I+II)、P35(I+II)M和只帶有第二個信號肽編碼區(qū)的P35 cDNA(II)插入到真核表達載體pMT2(其圖譜見Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》，1989)上，將載體和上述cDNA經(jīng)Pst I(對P35(I+II)和P35(I+II)M進行不完全降解)和Eco RI雙酶切后進行連接，具體操作程序參照《分子克隆實驗指南》中描述的方法進行。
將上述重組DNA分子按照常規(guī)方法轉化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)藍白斑篩選得到6個P35(I+II)候選陽性克隆和5個P35(II)候選克隆。經(jīng)酶切驗證后各取一個克隆進行測序，獲得序列完全正確的克隆pMT2/P35(I+II)、pMT2/P35(I+II)M和pMT2/P35(II)。
P40表達載體的構建將實施例2中的P40cDNA克隆插入到真核表達載體pMT2上。具體克隆方法同上。經(jīng)藍白斑篩選和測序后得到了序列完全正確的克隆pMT2/P40。
高純質粒DNA的純化取分別帶有pMT2/P35(I+II)、pMT2/P35(I+II)M和pMT2/P35(II)以及pMT2/40質粒的大腸桿菌菌株，分別接種于500ml加入了氨芐青霉素的2xYT液體培養(yǎng)基，37℃260rpm震蕩培養(yǎng)16小時后，用Qiagen公司的超純質粒純化試劑盒(Ultrapure PlasmidPurification Kit)抽提質粒DNA，抽提過程按照廠家提供的說明書進行。
CHO細胞的轉染與篩選采用脂質體法對CHO細胞進行轉染，轉染試劑盒購自Invitrogene公司。轉染時取上述的純化的pMT2/P35(I+II)(0.95ug/ul)、pMT2/P35(I+II)M(0.95ug/ul)和pMT2/P35(II)(0.95ug/ul)各100微克，分別與100微克pMT2/40(1.0ug/ul)質粒DNA，充分混合后作為轉染的DNA樣品共轉染CHO細胞。轉染操作程序按照廠家的說明書進行。
轉染后的CHO細胞經(jīng)連續(xù)3個月的氨甲喋呤(MTX)篩選，其濃度從0.05uM到10uM，每兩周增加一次濃度，每次MTX的用量約為前一次的2倍。細胞培養(yǎng)按照常規(guī)進行，培養(yǎng)基為15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37度5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后按照常規(guī)極度稀釋法進行單克隆化。應用ELISA方法分別檢測其IL-12的生物活性，總共得到189個有IL-12表達的單克隆。經(jīng)ELISA法，上述部分克隆的IL-12表達強度進行了研究，結果顯示在下表2中表2 P35亞基信號肽對IL-12表達水平的影響

從表2的結果可以看出，增加第一信號肽編碼序列使得IL-12的表達水平提高幅度高達6倍。而對該增加的信號肽編碼序列進行適當改造后，IL-12的表達水平進一步得到提高，為僅帶第二信號肽時的18.9倍。
盡管本發(fā)明出于描述目的作了詳細描述，但是應當理解，這些詳細描述只是為了這個目的，本領域技術人員能在不脫離下列權利要求確定的本發(fā)明的精神和范圍內對其作各種變化。
序列表<110>上海張江生物技術有限公司<120>一種在真核細胞中高效表達重組人白細胞介素12的方法<130>014883<160>9<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>761<212>DNA<213>人<400>1atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgvgcagc 120ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttac 360cattggaatt aaccaagaat gagagttgcc taaattccag agagacctct ttcataacta 420atgggagttg cctggcctcc agaaagacct cttttatgat ggccctgtgc cttagtagta 480tttatgaaga cttgaagatg taccaggtgg agttcaagac catgaatgca aagcttctga 540tggatcctaa gaggcagatc tttctagatc aaaacatgct ggcagttatt gatgagctga 600tgcaggccct gaatttcaac agtgagactg tgccacaaaa atcctccctt gaagaaccgg 660atttttataa aactaaaatc aagctctgca tacttcttca tgctttcaga attcgggcag 720tgactattga tagagtgatg agctatctga atgcttccta a 761<210>2<211>985<212>DNA<213>人<400>2atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccttcacaag ctaagtatga 660aaactacacc agcagcttct tcatcaggga catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt 720gcagctgaag ccattaaaga attctcggca ggtggaggtc agctgggagt accctgacac 780ctggagtact ccacattcct acttctccct gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag 840caagagagaa aagaaagata gagtcttcac ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg 900caaaaatgcc agcattagcg tgcgggccca ggaccgctac tatagctcat cttggagcga 985<210>3<211>761<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<220><221>misc feature<223>p35基編碼序列(具有改造過的第一信號肽編碼序列)<400>3atgtggccac ctggatcagc atcgcagcct ccaccgtcac ctgcagctgc cactggactc 60caccctgcgg cacgacctgt gtccctgcag tgccgtctaa gcatgtgtcc agcgvgcagc 120ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttac 360cattggaatt aaccaagaat gagagttgcc taaattccag agagacctct ttcataacta 420atgggagttg cctggcctcc agaaagacct cttttatgat ggccctgtgc cttagtagta 480tttatgaaga cttgaagatg taccaggtgg agttcaagac catgaatgca aagcttctga 540tggatcctaa gaggcagatc tttctagatc aaaacatgct ggcagttatt gatgagctga 600tgcaggccct gaatttcaac agtgagactg tgccacaaaa atcctccctt gaagaaccgg 660atttttataa aactaaaatc aagctctgca tacttcttca tgctttcaga attcgggcag 720tgactattga tagagtgatg agctatctga atgcttccta a 761<210>4<211>27<212>DNA<213>引物<400>4ctcctgcaga tgtggccccc tggtcag27<210>5<211>31<212>DNA<213>引物<400>5gcagaattct taggaagcat tcagatagct c 31<210>6<211>27<212>DNA<213>引物<400>6ctgctgcaga tgtggccccc tggtcag27<210>7<211>31<212>DNA<213>引物<400>7gcagaattct taggaagcat tcagatagct c 31<210>8<211>253<212>PRT<213>人<400>8Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala1 5 10 15Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg20 25 30Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val35 40 45Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro50 55 60Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg65 70 75 80Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr85 90 95Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys100 105 110Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu115 120 125Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys130 135 140Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser145 150 155 160Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn165 170 175Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn180 185 190Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser195 200 205Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys210 215220Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala225 230 235 240Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser245 250<210>9<211>102<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<223>改造過的第一信號肽編碼序列<400>9atgtggccac ctggatcagc atcgcagcct ccaccgtcac ctgcagctgc cactggactc 60caccctgcgg cacgacctgt gtccctgcag tgccgtctaa gc 10權利要求
1.一種生產(chǎn)重組人白細胞介素-12的方法，該方法包括a)提供對應于P35亞基的核苷酸序列和對應于P40亞基的核苷酸序列，其中所述P35亞基具有完整的第一信號肽；b)將步驟a)所述核苷酸序列插入表達載體中；c)用步驟b)獲得的表達載體轉化真核細胞；d)在適合重組人IL-12表達的條件下，培養(yǎng)步驟c)所得的轉染的真核細胞；e)從培養(yǎng)物中分離純化得到白細胞介素-12。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述真核表達載體是pMT2。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述真核細胞選自CHO細胞、Vero細胞和COS細胞。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述對應于具有第一信號肽的P35亞基的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述對應于具有第一信號肽的P35亞基的核苷酸序列是真核細胞所偏好的。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述對應于具有第一信號肽的P35亞基的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述真核細胞選自CHO細胞、Vero細胞和COS細胞。
全文摘要
一種生產(chǎn)重組人IL－12的方法，該方法包括a)提供對應于具有第一信號肽的P35亞基的核苷酸序列和對應于P40亞基的核苷酸序列；b)將步驟a)所述核苷酸序列插入表達載體中；c)用步驟b)獲得的表達載體轉化真核細胞；d)在適合重組人IL－12表達的條件下，培養(yǎng)步驟c)所得的轉染的真核細胞。該方法通過提高P35亞基的表達強度使P35和P40兩個亞基的表達量得到了平衡，從而提高了具有生物活性的IL－12的表達量。
文檔編號C07K14/435GK1408727SQ0112692
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月29日 優(yōu)先權日2001年9月29日
發(fā)明者萬國光, 李春澍 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司