專利名稱：利用大環(huán)輔助配體檢測(cè)prp的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)造成亞急性、傳染性、海綿狀腦病的朊病毒病原體形式的方法。
天然或正常的朊病毒蛋白被命名為PrP或PrPc，對(duì)于細(xì)胞朊病毒蛋白，其是在哺乳動(dòng)物的淋巴和神經(jīng)元細(xì)胞中廣泛表達(dá)的糖蛋白。
PrPc構(gòu)象改變導(dǎo)致對(duì)蛋白酶K有抗性的蛋白病原體PrPc的出現(xiàn)和傳播。該蛋白病原體可被稱為PrPsc或PrPres。PrPsc在動(dòng)物器官中的積累是許多疾病的源頭，并特別是小型反芻動(dòng)物的震顫病、麋鹿和羚羊的慢性惡病質(zhì)病(或慢性消耗性病“CWD”)的源頭、以及牛海綿狀腦病(ESB)和人的克雅二氏癥(MCJ)的源頭。
感染了ESB的牛在2至6年的潛伏期后才有延遲表現(xiàn)并且病癥發(fā)展緩慢，大大地減慢了流行病學(xué)模式的進(jìn)展。ESB通過(guò)攝食傳染人類，導(dǎo)致了一種新型克-雅二氏病(vMJC)的出現(xiàn)。
在發(fā)病以前看起來(lái)很健康的被感染動(dòng)物體內(nèi)，尤其是患病動(dòng)物的血液或尿液中很難檢測(cè)到蛋白病原體PrPsc。目前，已確認(rèn)人在攝取被感染組織時(shí)，用于人類消耗目的的動(dòng)物中的PrPsc將傳染人類。因此，公共衛(wèi)生的一個(gè)主要目標(biāo)是通過(guò)檢測(cè)PrPsc的存在以避免這種傳染-在人類要消費(fèi)的動(dòng)物中，為了將它們從食物鏈中去除，-在要輸入人體的血液捐獻(xiàn)和血液衍生制品中。事實(shí)上，由于在腦失調(diào)前且在能夠在臨床上檢測(cè)到揭示朊病毒疾病的征象之前，蛋白質(zhì)病原體PrPsc已經(jīng)出現(xiàn)在血液和淋巴液中，因此對(duì)該疾病在人的生理病理學(xué)認(rèn)識(shí)得很少，并由于不能進(jìn)行在諸如綿羊中的實(shí)驗(yàn)性感染，缺少在血或其他生物學(xué)液體中的檢測(cè)測(cè)試，使之不能被研究并由此來(lái)防止經(jīng)由血液捐獻(xiàn)的人至人的傳染或在腦損傷開(kāi)始前治療感染的人；及
-在神經(jīng)病學(xué)進(jìn)程前的動(dòng)物群中，由此使得在它們到屠宰廠前早早地消除感染的動(dòng)物。
因此，檢測(cè)生物學(xué)樣品或動(dòng)物體內(nèi)PrPsc的存在已經(jīng)變得極為重要，幾個(gè)研究組正在研制免疫檢測(cè)方法(WO02/086511)。此外，為了治療vMJC，聯(lián)合使用肽、小分子或PrPsc抑制劑的方法組成了熱點(diǎn)研究的主題。然而，當(dāng)生物樣品中尤其在生物學(xué)液體中PrPsc的含量很低時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)的方法總是難以通過(guò)可靠的方式鑒定PrPsc。
本發(fā)明因而涉及一種允許在稀釋液中檢測(cè)PrP蛋白的方法，尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，其中所述蛋白不能用當(dāng)前使用的方法檢測(cè)，在發(fā)明人測(cè)試的119個(gè)樣品中，檢測(cè)達(dá)到了100％的可靠性。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選地使得對(duì)PrPsc的檢測(cè)被擴(kuò)大4倍。
更精確地，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)PrP蛋白的方法，尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于將游離的或與支持物相連的大環(huán)輔助配體(AML)加入到可能含有PrP的生物學(xué)樣品中，然后用抗PrP抗體與所得的懸液反應(yīng)，然后檢測(cè)PrP的存在。
可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)大環(huán)配體與支持物的連接，如通過(guò)吸附或共價(jià)鍵，優(yōu)選共價(jià)鍵或者所謂的接枝(greffage)。
當(dāng)試圖進(jìn)行檢測(cè)PrPsc時(shí)，本發(fā)明也可在接觸AML之前或之后，包括用蛋白酶K處理樣品的附加步驟。
通過(guò)檢測(cè)抗PrP/PrP的抗體反應(yīng)能識(shí)別PrP的存在，該方法能通過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何手段來(lái)進(jìn)行，尤其可通過(guò)三明治方法來(lái)進(jìn)行，例如ELISA、免疫印跡、免疫微懸臂(micro-cantilever)檢測(cè)、質(zhì)譜或通過(guò)光學(xué)和光譜學(xué)分析。通過(guò)表面光度掃描技術(shù)來(lái)進(jìn)行鑒定AML-PrP復(fù)合物，如掃描反射顯微鏡、近場(chǎng)掃描顯微鏡或共聚焦掃描顯微鏡。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，生物學(xué)樣品來(lái)自動(dòng)物，包括人。該樣品優(yōu)選來(lái)自腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或器官的組織，尤其是脾或腸。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，該樣品是生物學(xué)液體，尤其是腦脊液或血清。
術(shù)語(yǔ)“大環(huán)配體”指能與PrP結(jié)合的化合物，尤其能與PrPsc結(jié)合的化合物，而且其能通過(guò)連續(xù)環(huán)化來(lái)構(gòu)建形成大環(huán)。大環(huán)配體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的?？赡芤苑窍拗菩岳拥姆绞揭玫挠协h(huán)芳、間環(huán)芳(métacyclophanes)、環(huán)糊精、環(huán)(變色四酸)、球狀配體(sphérands)和環(huán)[n]乙酸香根酯烯(cyclo[n]vératrylènes)。
大環(huán)輔助配體能有益地與空間毗鄰或接近的位點(diǎn)結(jié)合，該位點(diǎn)用于與抗體結(jié)合并具有增強(qiáng)抗體-PrPsc結(jié)合的作用。
大環(huán)輔劑有益地選自間環(huán)芳。在間環(huán)芳中，尤其好的是在酚側(cè)官能化的對(duì)-磺酸基-杯芳烴(para-sulfonato-calix-arènes)。這些化合物可根據(jù)Da Silva等，J.Supramol.Chem.1，(2001)，135-138所述的方法獲得。
大環(huán)輔助配體能有益地相應(yīng)于下式(I)， 其中R1表示氫原子、羥基、OR基團(tuán)或OCOR基團(tuán)，其中R如下所定義，R2表示氫原子、R基、COR、Pol、CH2Pol，其中Pol表示磷酸、硫酸、胺、銨、羧酸基團(tuán)，而R如下所定義，R3表示氫原子、羥基、OR基團(tuán)或OCOR基團(tuán)，其中R如下所定義，R4表示氫原子、羥基、OR基團(tuán)、OCH2R基團(tuán)或OCOR基團(tuán)，其中R如下所定義，
Y是碳原子、氮或硫原子，R5和R6各自獨(dú)立地不存在或表示氫原子、CH2基團(tuán)或如下所定義的R，或R5和R6一起表示氧或硫原子，X表示CH2基團(tuán)或氧或硫原子，m表示等于0或1的正整數(shù)，R表示氫原子或烴鏈，該烴鏈為飽和或不飽和的、分枝或不分枝的、環(huán)或非環(huán)的、由鹵素取代或未取代的，并帶有極性或非極性官能團(tuán)，n是3至15之間的的正整數(shù)，及取代基R1至R5、R、X、Y和正整數(shù)m可根據(jù)結(jié)構(gòu)單元(les motifs)而具有不同性質(zhì)。
所以，式I的化合物以連續(xù)結(jié)構(gòu)單元形式出現(xiàn)，其特征在于具有苯環(huán)，并其中在以上定義的限制之內(nèi)該環(huán)的取代基在一個(gè)結(jié)構(gòu)單元與另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元中可能不同。
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)制備大環(huán)配體，例如Comprehensive Supramolecular Chemistry，Pergamon，Oxford，1996所述。
飽和或不飽和的、分枝或不分枝的、環(huán)或非環(huán)的、由鹵素取代或未取代的，并帶有極性或非極性官能團(tuán)的烴鏈對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。例如，烷基、烯基、芳基和飽和的環(huán)，如環(huán)己烷。非極性基團(tuán)的例子有CF3，而極性基團(tuán)的例子有如上所定義的取代基Pol。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，大環(huán)輔助配體相應(yīng)于以上通式I，并更精確地相應(yīng)于以下通式Ia
其中每個(gè)R2基各自獨(dú)立地為硫酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)，R7是(CH2)r-Z基團(tuán)，其中Z是COOEt、COOH、CN或NH2基團(tuán)，r是1至20之間的正整數(shù)，p是1至10之間的正整數(shù)，n是2至10之間的正整數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，大環(huán)輔助配體是p-磺酸基-杯-[4]-芳烴、p-磺酸基-杯-[6]-芳烴、p-磺酸基-杯-[8]-芳烴或它們的衍生物之一。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案，大環(huán)輔助配體相應(yīng)于以上通式I，并更精確地相應(yīng)于以下通式Ib 其中n是4至8之間的正整數(shù)，每個(gè)R2基各自獨(dú)立地為硫酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)，R8表示(CH2)t-(CO)s-(NH2)基團(tuán)或(CH2)t-COOH基團(tuán)，其中t是0至6之間的正整數(shù)，s是0至6之間的正整數(shù)。
式Ib的杯芳烴最好是兩個(gè)R2基團(tuán)的每一個(gè)都是硫酸基團(tuán)，n是4、6或8，而R8是氫原子、CH2COOH、CH2CONH2基團(tuán)或CH2CH2NH2基團(tuán)。
式Ib的杯芳烴優(yōu)選是兩個(gè)R2基團(tuán)的每一個(gè)都是硫酸基團(tuán)，n是等于6的正整數(shù)，而R7是(CH2)2-NH2基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，本發(fā)明的配體接枝于固體支持物上。該支持物由能與配體帶有的官能團(tuán)形成鍵的官能團(tuán)功能化。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，固體支持物由NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)鍵或NH2官能團(tuán)功能化。該官能團(tuán)能與配體上帶有的官能團(tuán)反應(yīng)。在該實(shí)施方案中，尤其優(yōu)選帶有的官能團(tuán)能反應(yīng)從而與固體支持物的功能鍵形成鍵的杯芳烴，特別是帶有NH2或COOH鍵的杯芳烴。
本發(fā)明也涉及接枝于功能化支持物上的大環(huán)輔助配體，其中配體相應(yīng)于以上定義的式Ib，其中n是4至8之間的正整數(shù)而且支持物是固體支持物類型，優(yōu)選由NHS基團(tuán)或NH2基團(tuán)功能化并優(yōu)選是磁珠或微量培養(yǎng)板。這種接枝物保留了將來(lái)在蛋白質(zhì)和配體間的相互作用以及立體化學(xué)呈遞表位(épitote)從而能通過(guò)抗PrP抗體來(lái)檢測(cè)。支持物上接枝物靶向的位點(diǎn)不同于用作與PrP相互作用的那些。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該大環(huán)輔助配體選自環(huán)糊精家族，尤其是相應(yīng)于通式II的環(huán)糊精 其中R9表示氫原子或CH2、OH、OR、OCOR、COR、CH2Pol、OCH2R、SR、NR、Pol基團(tuán)，R如下所定義，R10和R11各自獨(dú)立表示氫原子或CH2、OH、OR、OCOR、COR、CH2Pol、OCH2R、Pol基團(tuán)，R如下所定義，Pol表示磷酸、硫酸、胺、銨、羧酸基團(tuán)，R表示烴鏈，該烴鏈為飽和或不飽和的、分枝或不分枝的、環(huán)或非環(huán)的、由鹵素取代或未取代的，并帶有極性或非極性官能團(tuán)，n是6至8之間的正整數(shù)，
取代基R9至R11可根據(jù)結(jié)構(gòu)單元的性質(zhì)而不同。所以，式II的化合物以連續(xù)的n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的形式出現(xiàn)，其具有環(huán)，并在以上定義的范圍之內(nèi)，該環(huán)的取代基在一個(gè)結(jié)構(gòu)單元與另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元中可能不同。
根據(jù)本發(fā)明的變體，所述大環(huán)輔助配體選自變色環(huán)四酸家族，尤其是相應(yīng)于通式III的變色環(huán)四酸 其中R12和R13各自獨(dú)立表示氫原子或如下所定義的R或Pol基團(tuán)，R14和R15各自獨(dú)立表示氫原子、CH2基團(tuán)或如下所定義的R基團(tuán)，或R14和R15一起表示氧或硫原子，R16和R17各自獨(dú)立表示氫原子或羥基或OR、OCH2R、OCOR、SR、SCH2R、SCOR基團(tuán)，其中R如下所定義，M表示氫原子或選自Na、K、Li、Cs、Rb、Mg和Ca的原子，Pol表示磷酸、硫酸、胺、銨或羧酸基團(tuán)，R表示烴鏈，該烴鏈為飽和或不飽和的、分枝或不分枝的、環(huán)或非環(huán)的、由鹵素取代或未取代的，并帶有極性或非極性官能團(tuán)，n是3至15之間的正整數(shù)，取代基R12至R17、M、Pol和R可根據(jù)結(jié)構(gòu)單元的性質(zhì)而不同。所以，式III的化合物以連續(xù)的n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的形式出現(xiàn)，特征是具有環(huán)，并在以上定義的限制之內(nèi)，該環(huán)的取代基在一個(gè)結(jié)構(gòu)單元與另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元中可能不同。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該大環(huán)輔助配體選自環(huán)[n]乙酸香根酯烯家族，相應(yīng)于通式IV 其中R18表示氫原子或CH2、OH、OR、OCOR、COR、CH2Pol、OCH2R、SR、NR、Pol基團(tuán)，R如下所定義，R19、R20、R21和R22各自獨(dú)立表示氫原子或CH2、OH、OR、OCOR、COR、CH2Pol、OCH2R、Pol基團(tuán)，R如下所定義，Pol表示磷酸、硫酸、胺、銨或羧酸基團(tuán)，R表示烴鏈，該烴鏈為飽和或不飽和的、分枝或不分枝的、環(huán)或非環(huán)的、由鹵素取代或未取代的，并帶有極性或非極性官能團(tuán)，n是1至10之間的正整數(shù)，取代基R18至R22、R、Pol和R可根據(jù)結(jié)構(gòu)單元的性質(zhì)而不同。所以，式IV的化合物以連續(xù)的n個(gè)結(jié)構(gòu)單元的形式出現(xiàn)，特征是具有環(huán)，并在以上定義的限制之內(nèi)，該環(huán)的取代基在一個(gè)結(jié)構(gòu)單元與另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元中可能不同。
本發(fā)明的其它主題內(nèi)容包括大環(huán)輔助配體(AML)在檢測(cè)生物學(xué)樣品中PrPsc朊病毒的應(yīng)用，尤其是上式I、Ia或Ib的、游離的或與支持物結(jié)合的配體的應(yīng)用。
本發(fā)明的主題內(nèi)容還包括一種診斷由PrPsc造成的疾病的試劑盒，疾病包括ESB、小反芻動(dòng)物震顫病、克雅二氏癥，其特征在于其包括使用大環(huán)輔助配體，尤其使用上式I、Ia或Ib的、游離的或與支持物結(jié)合的配體。
本發(fā)明的主題內(nèi)容還有一種免疫定量PrPsc的試劑盒，其特征在于其包括使用大環(huán)輔助配體，尤其使用上式I、Ia或Ib的、游離的或與支持物結(jié)合的配體。
本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征可通過(guò)閱讀以下實(shí)施例來(lái)體現(xiàn)，所述實(shí)施例涉及生物學(xué)樣品在存在游離或接枝的大環(huán)輔助配體時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)PrPsc。
參考這些實(shí)施例及其中的附圖參考實(shí)施例1

圖1是用PrPsc免疫印跡檢測(cè)的比較實(shí)施例，一方面下述制備的特定大環(huán)輔助配體(AML1)加入到樣品中，而另一方面AML1不加入到樣品中。
圖2所示的是檢測(cè)PrPsc的光密度曲線，一方面AML1加入到樣品中，而另一方面AML1不加入到樣品中。
圖3所示的是在非接觸模式中掃描探測(cè)顯微鏡(SPM)中的圖像，干膠片上僅有重組蛋白朊病毒(recPrP)的為(A)，存在recPrP和ALM1的為(B)，以及僅有AML1的為(C)。
圖4所示的是在非接觸模式中掃描探測(cè)顯微鏡(SPM)中的圖像，干膠片上的recPrP和AML成不同的比例1/1000AML1/recPrP，1/100AML1/recPrP，1/10AML1/recPrP。
圖5示出了一個(gè)示意圖，其示出光密度(DO)值，通過(guò)溫育牛重組PrP溶液并用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗PrP AC23抗體顯色以后，通過(guò)接枝在活化胺平板(NHS)上的杯芳烴C6S的濃度函數(shù)獲得該值。
圖6示出了一個(gè)示意圖，其示出光密度(DO)值，通過(guò)溫育0.25μg/ml劑量的人重組PrP溶液并用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗PrP 8D11G12抗體直接顯色以后，通過(guò)接枝在活化胺珠(NHS)上的杯芳烴C6S的濃度函數(shù)獲得該值。
圖7示出了一個(gè)示意圖，其示出光密度(DO)值，通過(guò)用0.05％PBST稀釋的人血清與接枝在活化胺珠(NHS)上的杯芳烴C6S接觸溫育并通過(guò)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗PrP 8D11G12抗體直接顯色而獲得該值。
圖8示出了一個(gè)示意圖，其示出作為加熱函數(shù)的光密度(DO)值，通過(guò)將接枝在活化胺平板(NHS)上的杯芳烴C6S與人腦脊髓液的MJC陽(yáng)性(LCR+)和陰性(LCR-)樣品接觸，通過(guò)用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗PrP AC23抗體顯色而獲得該值。
圖9示出了一個(gè)示意圖，其示出光密度(DO)值，通過(guò)將接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烴C6S與從感染或未感染克雅二氏癥的患者(MJC+/MJC-)腦中提取的PrPsc接觸，之后通過(guò)用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗PrP AC23抗體顯色而獲得該值。
圖10示出了一個(gè)示意圖，其示出光密度(DO)值，通過(guò)與未感染MJC的患者的LCR樣品接觸以后，其中樣品稀釋到1/2或1/6并沒(méi)有用蛋白酶K消化，通過(guò)接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烴C6S的濃度函數(shù)獲得該值。
圖11示出了一個(gè)示意圖，其示出光密度(DO)值，通過(guò)與未感染MJC(LCR-)或感染該病(LCR+)的患者的LCR樣品接觸以后，其中樣品可能稀釋到1/2(LCR+1/2或LCR-1/2)并沒(méi)有用蛋白酶K消化，通過(guò)接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烴C6S的濃度函數(shù)獲得該值。
圖12示出了一個(gè)示意圖，其示出光密度(DO)值，通過(guò)將接枝在活化胺板(NHS)上的杯芳烴C6S與未感染MJC(LCR-)或感染該病(LCR+)的患者的LCR樣品接觸以后，通過(guò)蛋白酶K的濃度函數(shù)獲得該值。
實(shí)施例1 大環(huán)輔助配體的制備1.1制備對(duì)-磺酸基-3，7-(2-羧基-甲氧基)-杯-[6]-芳烴(被稱為AML1)
該大環(huán)輔助配體AML1具有通式V 該配體如下合成杯[6]芳烴的乙腈懸液在1當(dāng)量堿(K2CO3)中攪拌回流。30分鐘后，0.5當(dāng)量烷基化劑(溴乙酸乙酯)加入到反應(yīng)混合物中，保持回流并攪拌24小時(shí)。冷卻懸液后，減壓蒸去溶劑，所得固體溶于200ml CH2Cl2中并用鹽酸溶液(1M)洗2次并用軟化水洗1次。在硫酸鎂(MgSO4)上干燥后，減壓蒸去有機(jī)溶劑，獲得白色粉末。在硅石層析柱(洗脫液CH2Cl2∶己烷；4∶1)上純化該粉末。在1H、13CRMN和電噴霧質(zhì)譜中分析純化的產(chǎn)物。在攪拌條件下與環(huán)境溫度中用氫氧化鉀在水∶乙醇(30∶70)混合溶液中皂化羧酸酯24小時(shí)。過(guò)濾形成的沉淀，然后用50ml鹽酸(1M)和50ml水洗滌，然后在硅石層析柱(洗脫液氯仿∶甲醇∶乙酸；95∶5∶0.1％)上純化，蒸去溶劑后得到白色結(jié)晶固體。在1H、13C RMN和電噴霧質(zhì)譜中分析該產(chǎn)物。用硫酸于50℃進(jìn)行磺化24小時(shí)。用醚沉淀產(chǎn)物并獲得白色結(jié)晶粉末形式的AML1。
1.2制備對(duì)-磺酸基-3，7-(2-氨基乙氧基)-杯-[6]-芳烴(被稱為C6S)該大環(huán)輔助配體C6S具有通式VI
該配體按照Eric Da Silva和Anthony W.Coleman，Synthesis andComplexation Propertiex towards Amino Acids of Mono-Substitutedp-sulfonato-calix-[n]-aren，Tetrahedron 59(2003)7357-7364所述的方法制備。
1.3將配體C6S接枝到板或珠上該配體與帶有活性表面的固體支持物(珠或板)偶聯(lián)。
接枝到板上“NHS活化板”的96孔板可得自Covalab公司(Lyon，F(xiàn)rance)。100μl配體溶液以不同濃度溶于50mM pH8.2的磷酸緩沖液中。在37℃溫育2小時(shí)后用MilliQ水洗3遍孔(3×200μl)。使用前在環(huán)境溫度下干燥板。
接枝方案
以配體C6S的不同濃度制備幾種板。這些板在全文中被定義為“C6S板”。
接枝到珠上4ml活化珠NHS溶液(2×109個(gè)珠/ml；Dynabeads M270Amine，Dynals公司，Norway)等份分裝于1ml管中。離心并通過(guò)磁性沉淀珠。棄上清液并用1ml水洗珠3次。用不同體積的杯芳烴的50mM pH8.2磷酸緩沖液溶液再加工(repris)珠底部。加入600μl、120μl、60μl和12μl的50mg/ml(50mM pH8.2的磷酸緩沖液)配體溶液。在環(huán)境溫度下攪拌珠24小時(shí)。用18ΩMilliQ水洗3遍珠以去除未反應(yīng)的配體。珠保存在1ml水中以再達(dá)到2×109個(gè)珠/ml的初始濃度。珠溶液可以使用了。這些珠在全文中被定義為“C6S珠”。
在珠上接枝C6S的方案
1.4將AML1接枝到修飾的無(wú)機(jī)表面上1ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(ABCR公司)加入到50ml溶液(95％乙醇和5％H2O)中5分鐘。在攪拌條件下將硅板浸沒(méi)在該溶液中4分鐘。用乙醇沖洗硅板，然后將板置于130℃干燥15分鐘。10μl 0.1M AML1的DMSO溶液在修飾的硅板上用偶聯(lián)劑(DCC/HOBT)偶聯(lián)。樣品于23℃干燥12小時(shí)。
偶聯(lián)方案
實(shí)施例2用未與固體支持物偶聯(lián)的AML1檢測(cè)PrP2.1制備樣品用于說(shuō)明圖1和2例子的樣品如下制備不含AML的樣品0.5g腦組織在4.5ml 5％的葡萄糖溶液中粉碎以獲得10％重量/體積的懸液。向每100μl于5％葡萄糖中的10％腦勻漿(相當(dāng)于10mg腦)中加入10μl的1μg蛋白酶K(Boehringer)。旋轉(zhuǎn)振蕩溶液，然后于37℃溫育1小時(shí)。加入100μl變性Laemmli緩沖液后，于100℃加熱混合物5分鐘，于12000G離心5分鐘，回收上清液以使之在SDS PAGE上遷移。
含AML的樣品0.5g腦組織在4.5ml 5％的葡萄糖溶液中粉碎以獲得10％重量/體積的懸液。向每100μl于5％葡萄糖中的10％腦勻漿(相當(dāng)于10mg腦)中加入1μl的0.1M AML。37℃1小時(shí)后，加入10μl的1.5μg蛋白酶K(Boehringer)。旋轉(zhuǎn)振蕩溶液，然后于37℃溫育1小時(shí)。加入100μl變性Laemmli緩沖液后，于100℃加熱混合物5分鐘，于12000G離心5分鐘，回收上清液以使之在SDS PAGE上遷。
2.2用免疫印跡檢測(cè)的方法如Laemmli，Nature 227(1970)，680-685所述，在十二烷基硫酸鈉的15％聚丙烯酰胺一維電泳凝膠(SDS PAGE)上遷移后，通過(guò)電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并在環(huán)境溫度下用識(shí)別氨基酸126-160位所形成的特異表位的單克隆抗體免疫印跡60分鐘。二抗(1/5000)為抗小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈(IgG H+L)的山羊抗體，其綴和了辣根過(guò)氧化物酶。
然后洗滌印跡并用化學(xué)發(fā)光法在膠片(Biomex light，Kodak)上用ECL試劑盒(Amersham)或用super Signal Ultra(Pierce)并用Fluor S.Multimager(BioRad)觀察來(lái)檢測(cè)信號(hào)。
圖1是比較例，其顯示用本發(fā)明的方法比缺少AML1時(shí)檢測(cè)相同的蛋白質(zhì)時(shí)，朊病毒的檢測(cè)至少增加了4倍。缺少AML1時(shí)，超過(guò)1/8稀釋度的沒(méi)有檢出PrPsc。存在AML1時(shí)，在相同樣品中檢出PrPsc可能性多至1/32稀釋度。圖2的結(jié)果顯示了該檢測(cè)。
2.3顯微結(jié)果用于在圖3、4所報(bào)道的掃描探針顯微鏡實(shí)驗(yàn)中的樣品如下制備僅包含大環(huán)輔助配體的樣品通過(guò)在新制分裂的云母上沉積10μlAML溶液和10μl水，由此制備包含大環(huán)輔助配體的樣品(50mM)，并于37℃干燥24小時(shí)。
僅包含重組PrP蛋白(recPrP)的樣品通過(guò)在新制切割的云母上沉積10μl的1/10(v/v)AML1/recPrP、1/100(v/v)AML1/recPrP和1/1000(v/v)AML1/recPrP溶液和10μl水，由此制備包含recPrP的樣品，并于37℃干燥24小時(shí)。
同時(shí)包含大環(huán)輔助配體和recPrP的樣品1)通過(guò)在新制分裂的云母上沉積1μl AML溶液和1000μl recPrP，由此制備同時(shí)包含大環(huán)輔助配體和recPrP的樣品，并于37℃干燥24小時(shí)；2)通過(guò)在新切開(kāi)的云母上沉積1μl AML溶液和100μl recPrP，由此制備同時(shí)包含大環(huán)輔助配體和recPrP的樣品，并于37℃干燥24小時(shí)；3)通過(guò)在新切開(kāi)的云母上沉積1μl AML溶液和10μl recPrP，由此制備同時(shí)包含大環(huán)輔助配體和recPrP的樣品，并于37℃干燥24小時(shí)。
用裝有100μm三腳掃描儀的Thermomicroscope Explorer AFM以非接觸模式進(jìn)行圖像分析，分析利用錐形懸臂升高的共振頻率(F0＝320kHz)以掃描頻率1Hz的硅探針進(jìn)行。用SPMlab 5.1軟件進(jìn)行成像處理并不進(jìn)行濾波。
圖3、4指出僅有recPrP的膠片在環(huán)聚集中顯示出特征結(jié)構(gòu)。存在AML時(shí)，觀察到的recPrP結(jié)構(gòu)被持續(xù)修飾，并是AML數(shù)量的增加函數(shù)，并顯示出被環(huán)繞的而且可能是正交微晶的結(jié)構(gòu)單元。僅有大環(huán)輔助配體(AML1)的圖像顯示出相似但小于recPrP-AML膠片上結(jié)構(gòu)單元的結(jié)構(gòu)。
通過(guò)原子力顯微術(shù)來(lái)進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。
表1所示的是接下來(lái)的通過(guò)粗糙度表面分析的分析。這些粗糙度測(cè)定的能擴(kuò)展應(yīng)用至表面光度測(cè)定法分析技術(shù)。
表I
Ra=1NΣi=1N|zi-z‾|]]>式ARMS=1NΣi=1N<zi-z>2]]>式BAvgHeight=1NΣi=1Nzi]]>式C
通過(guò)Thermomicroscope SPML5.01軟件計(jì)算得到粗糙度值。平均粗糙度Ra定義為高度偏差的算術(shù)平均值(式A)，均方根粗糙度RMS定義為在平均圖像值上的點(diǎn)和樣品的平均高度(式C)的距離的平方的平均值的平方根(式B)。
實(shí)施例3用接枝在固體支持物上的C6S檢測(cè)重組PrP3.1在板上檢測(cè)牛重組PrPa)方案在該實(shí)驗(yàn)中所用的方案是與經(jīng)典ELISA中所認(rèn)識(shí)的方案相同。
根據(jù)實(shí)施例1，將于50mM PBS(磷酸緩沖液)中稀釋的磺化杯-6-芳烴(C6S)接枝到活性胺板(NHS)上6小時(shí)。然后，在用PBST(PBSTween)(0.05％)(奶粉5％)溶液于環(huán)境溫度下飽和1小時(shí)之前用蒸餾水沖洗板。沖洗后，濃度稀釋到0.25μg/ml的重組牛蛋白朊病毒(PrP)溶液在0.05％PBST中沉積。在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。再?zèng)_洗板3次。然后與用0.05％PBST稀釋到0.5μg/ml的標(biāo)記有過(guò)氧化物酶的抗PrP抗體在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。所用的抗體識(shí)別由人PrP的氨基酸145-154位所確定的區(qū)域和動(dòng)物PrP(AC23)的同源區(qū)域。最后，在又一次清洗后，加入顯影劑OPD(鄰-苯二胺)溶液，在環(huán)境溫度下避光溫育10分鐘。加入H2SO4溶液終止反應(yīng)。用分光光度計(jì)讀取在495nm處的信號(hào)。
b)結(jié)果圖5顯示了結(jié)果，其顯示在縱座標(biāo)上測(cè)到的光密度(DO)反映了由C6S捕獲的PrP的量，而且在洗后仍舊被捕獲。不同接枝得到的信號(hào)顯示重組牛PrP很好地被C6S捕獲。牛重組PrP與接枝到NHS板上的C6S固定在一起。
3.2在珠上檢測(cè)重組人PrPa)實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)實(shí)施例1，NHS珠首先與用蒸餾水稀釋的C6S溶液接觸從而使C6S接枝到珠上。此后，用蒸餾水洗珠，然后用0.05％PBST洗。同時(shí)，制備劑量為0.25μg/ml的重組人PrP的0.05％PBST溶液。然后在每100μlPrP溶液中加入0、0.1、1、5和10μl珠溶液以產(chǎn)生一系列C6S珠。在37℃溫育1小時(shí)，然后通過(guò)磁性從上清液中分離珠。根據(jù)與ELISA法近似的三明治方法，固定在珠上的PrP直接用標(biāo)記的抗體定量。
在用0.05％PBST溶液沖洗珠后，標(biāo)記過(guò)氧化物酶的顯色抗體在37℃溫育1小時(shí)。在又一次洗之前，通過(guò)磁性從上清液中分離珠，然后用溫育了10分鐘的OPD溶液顯色。加入H2SO4溶液終止反應(yīng)。所用的顯色抗體是8D11G12(bioMérieux，F(xiàn)rance)。
用495nm分光光度計(jì)讀取信號(hào)。
b)結(jié)果圖6顯示了珠上的顯色結(jié)果，其顯示C6S正確接枝，在NHS支持物上沒(méi)有喪失功能，但仍特別保留了它們捕獲不同物種的重組PrP的性質(zhì)，其甚至以可重復(fù)的方式放大用該蛋白質(zhì)特定抗體獲得的信號(hào)。
實(shí)施例4用接枝在固體支持物上的C6S檢測(cè)生理PrP4.1珠上的人血清a)方案根據(jù)實(shí)施例1，NHS珠首先與用蒸餾水稀釋的C6S溶液接觸以進(jìn)行接枝。此后，用蒸餾水洗珠，然后用0.05％PBST洗。
用PBS稀釋從而制備血清。同時(shí)，制備用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照的劑量為0.25μg/ml的人重組PrP的PBS溶液和0.05％的PBST溶液(奶粉5％)。
每250μl樣品加入5μl含2×109個(gè)珠/ml的珠液。在攪拌條件下，于37℃溫育1小時(shí)。然后通過(guò)磁性從上清液中分離珠。固定在珠上的PrP直接用標(biāo)記的抗體定量。
在珠上的顯影使用與ELISA近似的方案。標(biāo)記過(guò)氧化物酶的顯色抗體在37℃溫育1小時(shí)并在用0.05％PBST溶液洗珠之后輕輕攪拌。在重新洗之前，通過(guò)磁性從上清液中分離珠，然后用溫育了10分鐘的OPD溶液顯色。加入H2SO4溶液終止反應(yīng)。所用的顯色抗體是8D11G12。
用495nm分光光度計(jì)讀取信號(hào)。
b)結(jié)果圖7顯示了結(jié)果，其顯示-奶粉中的陰性對(duì)照能評(píng)估背景噪聲，而0.25μg/ml PrP溶液中的陽(yáng)性對(duì)照能驗(yàn)證試驗(yàn)功能并進(jìn)行解釋。
-接枝在NHS珠上的C6S捕獲人血清中存在的生理PrP。另外，飽和板上的血清稀釋程度增加到稀釋程度從1/5到1/10時(shí)能更好地捕獲。
c)結(jié)論令人驚訝地，接枝在NHS珠上的C6S捕獲人血清中存在的生理PrP。稀釋血清使珠上獲得的信號(hào)增強(qiáng)。
4.2在板上的液體人腦脊液(LCR)a)實(shí)驗(yàn)條件LCR樣品首先等體積分裝在管中。2個(gè)稀釋點(diǎn)每個(gè)樣品設(shè)立純的和1/2。然后，它們進(jìn)行3類熱處理56℃ 30分鐘，75℃ 15分鐘或95℃5分鐘。同時(shí)對(duì)純樣品不加熱設(shè)為對(duì)照。
根據(jù)實(shí)施例1，同時(shí)NHS板與在50mM PBS溶液中稀釋的C6S溶液接觸6小時(shí)進(jìn)行接枝。
然后，用蒸餾水洗板，然后用0.05％PBST洗。
然后沉淀樣品并在2-8℃并溫育一夜。然后洗板6次。然后用在0.05％PBST中稀釋到0.5μg/ml的生物素標(biāo)記的抗PrP抗體的溶液在環(huán)境溫度下溫育1小時(shí)。所用的抗體是AC23。
在又沖洗一次之后，加入鏈霉抗生素-PAL(堿性磷酸酯酶)溶液，在環(huán)境溫度下溫育20分鐘。最后一次洗板后，沉淀PNPP顯影劑溶液并于37℃溫育30分鐘。用0.4N NaOH溶液終止反應(yīng)。
用490nm濾光片，用405nm分光光度計(jì)讀取信號(hào)。
b)結(jié)果圖8顯示了結(jié)果，其顯示在LCR中可定量生理PrP。
實(shí)施例5用接枝在固體支持物上的C6S檢測(cè)腦中的PrPsc5.1在板上檢測(cè)a)實(shí)驗(yàn)條件第一階段包括獲得PrPsc，其從感染或未感染克雅二氏癥(MJC)的患者腦中提取純化而得。取260mg腦部樣品，然后粉碎以獲得在5％葡萄糖中的10％勻漿。然后用針頭過(guò)濾粉碎物質(zhì)。接著用蛋白酶K進(jìn)行消化階段，蛋白酶K的使用濃度是每100mg組織用20μg，在37℃進(jìn)行1小時(shí)處理。然后加入650μl 30％Sarkosyl溶液。同時(shí)，于試管底部沉積一層400μl的蔗糖以用于超速離心。則樣品沉積于該層中。裝填完試管后蓋上蓋，然后在20℃以100,000rpm超速離心2小時(shí)。棄上清液并用吸水紙吸干試管壁。然后向底部加入Tris馬來(lái)酸。然后將樣品于95℃加熱5分鐘，然后以12,000rpm在20℃離心15分鐘。樣品保存于-80℃直至下次使用。用Western印跡確證該第一階段的成功。
b)在杯-6-磺酸鹽上測(cè)試根據(jù)實(shí)施例1，用于50mM PBST溶液中稀釋的C6S溶液處理6小時(shí)進(jìn)行NHS板的接枝。在環(huán)境溫度下，它們首先用含5％奶粉的0.05％PBST溶液飽和6小時(shí)。然后用0.05％PBST溶液洗3次。先前用Tris馬來(lái)酸稀釋的樣品沉積于板上并在2-8℃溫育一夜。然后用0.05％PBST洗板6次。在環(huán)境溫度下，顯色抗體溶液溫育1小時(shí)。在一系列洗滌之后，鏈霉抗生物素-PAL溫育20分鐘。沉淀PNPP(對(duì)硝基苯磷酸)之前最后一次洗板，在37℃溫育30分鐘。然后加入蘇打終止顯色反應(yīng)。
用490nm濾光片，用405nm分光光度計(jì)讀取DO。
c)結(jié)果結(jié)果如圖9所示，其顯示通過(guò)本發(fā)明的方法，利用由接枝在NHS板上的C6S捕獲并用特異抗PrP蛋白的抗體檢測(cè)，能令人驚訝地檢測(cè)到患有克雅二氏癥的患者樣品的PrPsc，其可由重組人PrP陽(yáng)性對(duì)照和0.05％PBST陰性對(duì)照來(lái)驗(yàn)證。
實(shí)施例6使用接枝在固體支持物上的C6S檢測(cè)LCR中的PrPsc6.1制備樣品用腦脊液(LCR)樣品來(lái)制備標(biāo)本，LCR優(yōu)選未溶血且沒(méi)有細(xì)胞碎片。樣品是匿名的并于-80℃冷凍保存在試管中，其中試管壁能輕微吸附蛋白質(zhì)(“預(yù)潤(rùn)滑微離心管(Pre-lubricated micro centrifuge tube)1.7ml”，Marsh Biomedical Products，編號(hào)T6050G)。
它們分成2類一方面，樣品呈MJC陽(yáng)性。
這些是在尸體解剖時(shí)回收的死后LCR，尸體解剖是通過(guò)對(duì)腦室穿刺進(jìn)行的，其中在腦組織中用Western印跡研究PrPsc能夠確診MJC(某些病例)。在尸體解剖中，立即將所得的LCR裝入前述試管而不進(jìn)行前述的離心(除非樣品出現(xiàn)很大量的細(xì)胞碎片)并將等份LCR冷凍于-80℃。
另一方面，樣品呈MCJ陰性。它們有2種類型尸體解剖時(shí)回收的死后LCR，其中在腦組織中用Western印跡研究PrPsc而排除MJC的診斷(MJC陰性對(duì)照)。
不受MJC影響的患者及來(lái)自側(cè)腦室引流(DVE)的LCR。樣品的存儲(chǔ)條件與前述的那些一樣。
6.2 ELISA法a)分析原理樣品只在升高的溫度下溫育給定的時(shí)間，然后，冷卻后，用與免疫分析(ELISA)相容的緩沖液(pH8的Tris馬來(lái)酸緩沖液)將其稀釋至1/2或1/5。在沉積于板C6S上前進(jìn)行蛋白酶K消化，這時(shí)用蛋白酶K消化樣品15分鐘，然后以該方式沉積在板C6S上而無(wú)需前述的抑制。
因?yàn)榭紤]到用免疫學(xué)法展現(xiàn)配體/精制試劑的反應(yīng)類型，所以即便捕獲不是免疫學(xué)的，也可使用術(shù)語(yǔ)ELISA。
ELISA技術(shù)是免疫酶學(xué)定量技術(shù)，通過(guò)將底物轉(zhuǎn)化為與樣品中存在的抗原量成比例的可溶、可測(cè)產(chǎn)物，其允許定量要研究的抗原。在這所用的技術(shù)包括除了敏化容器之外與非競(jìng)爭(zhēng)性經(jīng)典ELISA三明治法相同的步驟。事實(shí)上，通過(guò)它們的胺官能團(tuán)，用接枝在微板NHS基團(tuán)上的磺化杯-6-芳烴替代了抗朊病毒捕獲抗體。
將C6S固定在微板的容器底部并飽和抗原固定的非特異位點(diǎn)之后，沉積樣品并溫育板以使抗原與C6S結(jié)合。然后，洗幾次后，加入朊病毒蛋白特異性的并標(biāo)記的顯色抗體。加入酶底物后，用比色法使觀測(cè)形成的復(fù)合物，即酶底物轉(zhuǎn)化成有色產(chǎn)物，用微板讀數(shù)儀(自動(dòng)分光光度計(jì))來(lái)測(cè)定其光吸收。
b)操作模式1體積的LCR于75℃在干燥的不銹鋼水池中溫育15分鐘。冷卻后，樣品用0.2M pH8的Tris馬來(lái)酸緩沖液稀釋5倍(加入4體積的緩沖液)，并將樣品直接沉積于預(yù)先用C6S處理的敏化的微板上，或用蛋白酶K于37℃消化15分鐘，然后再沉積在微板上。
按以下時(shí)間順序列舉接下來(lái)的免疫分析階段1.根據(jù)上述方法將于50mM PBST溶液中稀釋的磺化杯-6-芳烴C6S以一個(gè)濃度范圍或以固定的濃度在環(huán)境溫度下在活化胺板(NHS)上進(jìn)行接枝6小時(shí)。
2.然后用0.05％PBST洗板三次，然后于37℃用含5％奶粉的0.05％PBST飽和1小時(shí)。
3.洗滌后，按照上述分析原理制備的100μl LCR在小槽中進(jìn)行沉積；于37℃溫育板1個(gè)半小時(shí)。
4.洗滌后，100μl顯色抗體(0.5μg/ml AC23-HRP，HRP辣根過(guò)氧化物酶或0.5μg/ml AC23-生物素)在小槽中進(jìn)行沉積。于環(huán)境溫度下溫育板1小時(shí)。
5.洗滌后，將形成的復(fù)合物顯色5.1如果顯色抗體與生物素偶連，則100μl用0.05％PBST緩沖液稀釋到1/20000的SA-PAL溶液在小槽中進(jìn)行沉積。于環(huán)境溫度下溫育板20分鐘。洗滌后，100μl PNPP在小池中沉積。于37℃溫育板10至30分鐘。溫育后，每個(gè)小槽加入0.4N的50μl NaOH來(lái)終止顯色反應(yīng)。然后用450nm濾光片，用405nm分光光度計(jì)測(cè)量光密度。
5.2如果顯色抗體與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，則100μl OPD在小槽中進(jìn)行沉積。在黑暗中于環(huán)境溫度下溫育板10分鐘。
溫育后，每個(gè)小槽加入1.8N的50μl H2SO4來(lái)終止顯色反應(yīng)。然后用分光光度計(jì)測(cè)量在495nm處的光密度。
b)結(jié)果1.確證接枝在微板上的磺化單胺杯-6-芳烴(C6S)與腦脊液(LCR)朊病毒蛋白的締合未患有克雅二氏癥的患者的腦脊液于75℃加熱15分鐘，然后用與ELISA免疫顯色相容的緩沖液稀釋到1/2或1/6。樣品不用蛋白酶K消化，并在1.8至18μg/ml的濃度范圍在接枝C6S的板上沉積。溫育后，用0.5μg/ml偶連了過(guò)氧化物酶的AC23抗體來(lái)確保對(duì)捕獲在C6S上的抗原進(jìn)行免疫顯色。結(jié)果如圖10所示。
結(jié)果顯示C6S迅速與LCR中的朊病毒蛋白形成組合物，因?yàn)榭梢詮墓潭ㄔ谌萜鞯撞康腃6S第一個(gè)濃度上觀察到信號(hào)。
2.確證C6S不使用蛋白酶K與異源病理朊病毒蛋白的締合未患有MJJ的患者的LCR(LCR-)和患有MCJ的患者(MJC+)的LCR不進(jìn)行稀釋或稀釋到1/2，進(jìn)行不同類型的熱處理。然后將它們沉積在接枝了7.2μg/ml C6S的板上。洗滌后，用偶聯(lián)了生物素的抗朊病毒抗體AC23來(lái)確保進(jìn)行免疫顯色。
結(jié)果如圖11所示。
這些結(jié)果顯示了未用蛋白酶K處理的朊病毒蛋白吸附在接枝在板上的C6S上，陽(yáng)性樣品比陰性樣品更有效。不同的加熱處理輕微影響了朊病毒蛋白吸附在未稀釋的C6S上的效果，當(dāng)樣品稀釋后，影響更大。所以，測(cè)試條件希望是將朊病毒蛋白吸附在異源MN C6S上，因而該條件似乎是稀釋樣品并于95℃處理5分鐘。
3.確證C6S與使用了蛋白酶K的異源病理朊病毒蛋白的締合在分析前處理中，于37℃進(jìn)行蛋白酶K消化15分鐘，然后于37℃將消化混合物于C6C板上捕獲1小時(shí)。接下來(lái)用0.05％PBS Tween緩沖液連續(xù)洗以確保去除剩余的蛋白酶K。
結(jié)果如圖12所示。
結(jié)果顯示用蛋白酶K消化后光密度差異偏向于MJC的陽(yáng)性樣品。從測(cè)試的蛋白酶K的第一個(gè)濃度(0.5μg/ml)可看到該差異。
d)結(jié)論根據(jù)本發(fā)明，使得在LCR中檢測(cè)朊病毒蛋白變得可能。事實(shí)上，以一種不可預(yù)期的方式，在不用蛋白酶K消化的情況下，存在磺化的杯-6-芳烴可增加總(細(xì)胞和病理)PrP的可檢測(cè)度，優(yōu)選檢測(cè)PrPsc。用蛋白酶K消化樣品后在捕獲中用這些C6S就能夠檢測(cè)LCR的PrPsc，產(chǎn)生了信號(hào)，該信號(hào)在未患有MJC的患者中分離的LCR和患有MJC的患者中分離的LCR之間有顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc方法，特征在于將游離的或與支持物相連的大環(huán)輔助配體(AML)加入到可能含有PrP的生物學(xué)樣品中，然后用抗PrPsc抗體與所得的懸液反應(yīng)，鑒定PrP的存在。
2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于其包括在與AML接觸之前或之后用蛋白酶K處理樣品的額外步驟。
3.權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于所述生物學(xué)樣品來(lái)自包括人的動(dòng)物。
4.權(quán)利要求3所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于所述樣品是組織或生物學(xué)液體，尤其是腦脊液或血清。
5.權(quán)利要求1至4之任一所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于該固體支持物優(yōu)選以NHS基團(tuán)或NH2基團(tuán)官能化并優(yōu)選是磁珠或微量培養(yǎng)板。
6.權(quán)利要求1至5之任一所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于所述大環(huán)輔助配體結(jié)合與PrPsc和抗體的結(jié)合位點(diǎn)在空間上毗鄰或鄰近的位點(diǎn)。
7.權(quán)利要求1至6之任一所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于所述大環(huán)輔助配體選自間環(huán)芳，尤其是杯芳烴。
8.權(quán)利要求7所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于優(yōu)選的杯芳烴是在酚側(cè)官能化的對(duì)-磺酸基-杯-芳烴，優(yōu)選是對(duì)-磺酸基-杯-[4]-芳烴、對(duì)-磺酸基-杯-[6]-芳烴、對(duì)-磺酸基-杯-[8]-芳烴或它們的一種衍生物。
9.權(quán)利要求7或8所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于所述大環(huán)輔助配體相應(yīng)于如下通式(I)， 其中R1表示氫原子、羥基、OR基團(tuán)或OCOR基團(tuán)，其中R如下所定義，R2表示氫原子、R基、COR、Pol、CH2Pol，其中Pol表示磷酸、硫酸、胺、銨、羧酸基團(tuán)，而R如下所定義，R3表示氫原子、羥基、OR基團(tuán)或OCOR基團(tuán)，其中R如下所定義，R4表示氫原子、羥基、OR基團(tuán)、OCH2R基團(tuán)或OCOR基團(tuán)，其中R如下所定義，Y是碳原子、氮原子或硫原子，R5和R6各自獨(dú)立地不存在或表示氫原子、CH2基團(tuán)或如下所定義的R，或R5和R6一起表示氧或硫原子，X表示CH2基團(tuán)或氧或硫原子，m表示等于0或1的正整數(shù)，R表示氫原子或烴鏈，該烴鏈為飽和或不飽和的、分枝或不分枝的、環(huán)或非環(huán)的、由鹵素基團(tuán)取代或未取代的，并帶有極性或非極性官能團(tuán)，n是3至15之間的正整數(shù)，并且取代基R1至R5、R、X、Y和正整數(shù)m可根據(jù)結(jié)構(gòu)單元而具有不同性質(zhì)。
10.權(quán)利要求9所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于該大環(huán)輔助配體相應(yīng)于以下通式(Ia) 其中每個(gè)R2基團(tuán)各自獨(dú)立地為硫酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)，R7是(CH2)r-Z基團(tuán)，其中Z是COOEt、COOH、CN或NH2基團(tuán)，r是1至20之間的正整數(shù)，p是1至10之間的正整數(shù)，n是2至10之間的正整數(shù)。
11.權(quán)利要求9所述的方法，特征在于該配體相應(yīng)于以下式(Ib) 其中n是4至8之間的正整數(shù)，每個(gè)R2基團(tuán)各自獨(dú)立地為硫酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)，R8表示(CH2)t-(CO)S-(NH2)基團(tuán)或(CH2)t-COOH基團(tuán)，其中t是0至6之間的正整數(shù)，而s是0至6之間的正整數(shù)。
12.權(quán)利要求11所述的方法，特征在于該配體是式(Ib)的杯芳烴，其中兩個(gè)R2基團(tuán)的每一個(gè)都是硫酸基團(tuán)，n是4、6或8，而R8是氫原子、CH2COOH基團(tuán)、CH2CONH2基團(tuán)或CH2CH2NH2基團(tuán)。
13.權(quán)利要求11所述的方法，特征在于兩個(gè)R2基團(tuán)的每一個(gè)都是硫酸基團(tuán)，n是等于6的正整數(shù)，而R7是(CH2)2-NH2基團(tuán)。
14.權(quán)利要求7至12之任一所述的檢測(cè)PrP尤其是檢測(cè)PrPsc的方法，特征在于該杯芳烴結(jié)合于官能化的支持物，尤其是被NHS或NH2官能化的支持物。
15.一種接枝在官能化的支持物上的大環(huán)輔助配體，其中配體相應(yīng)于式(Ib) 其中n是4至8之間的正整數(shù)，每個(gè)R2基各自獨(dú)立地為硫酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)，R8表示(CH2)t-(CO)s-(NH2)基團(tuán)或(CH2)t-COOH基團(tuán)，其中t是0至6之間的正整數(shù)，而s是0至6之間的正整數(shù)，并且支持物是固體支持物類型，優(yōu)選被NHS基團(tuán)或NH2基團(tuán)官能化并優(yōu)選是磁珠或微量培養(yǎng)板。
16.大環(huán)輔助配體、尤其是游離或與支持物結(jié)合的、如權(quán)利要求9、10和15定義的式(I)、(Ia)或(Ib)的配體在制備一種組合物中的應(yīng)用，該組合物用于檢測(cè)生物學(xué)樣品尤其是生物學(xué)液體中的生理或病理的、牛或人或其它物種的PrP、重組PrP或PrPsc。
17.一種診斷試劑盒，用于由PrPsc造成的ESB類型疾病、小反芻動(dòng)物顫抖病、克雅二氏癥，特征在于其包含游離或與支持物結(jié)合的大環(huán)輔助配體、尤其是如權(quán)利要求9、10和15定義的式(I)、(Ia)或(Ib)的配體。
18.一種免疫學(xué)定量PrPsc的試劑盒，特征在于其包含游離或與支持物結(jié)合的大環(huán)輔助配體、尤其是如權(quán)利要求9、10和15定義的式(I)、(Ia)或(Ib)的配體。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)造成亞急性、傳染性海綿狀腦病的朊病毒病原體形式的方法，特征在于將游離的或與支持物結(jié)合的大環(huán)輔助配體(AML)加入到可能含有PrP
文檔編號(hào)C12Q1/37GK1729397SQ200380106774
公開(kāi)日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者阿利·穆薩, 安東尼·威廉·科爾曼, 帕特里克·沙哈加爾迪安, 埃里克·達(dá)席爾瓦, 安布魯瓦茲·馬丁, 阿迪納·尼科萊塔·拉扎爾, 埃德維熱·勒克萊爾, 瑪麗萊恩·迪潘, 埃爾韋·佩龍 申請(qǐng)人:法國(guó)食品衛(wèi)生安全署, 國(guó)立科學(xué)研究中心, 克洛德·貝納爾·里昂大學(xué), 生物梅里埃公司