專利名稱：胰島素受體基因snp與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及胰島素受體基因(Insulinreceptor，INSR)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
高血壓是指收縮壓或舒張壓升高的一組臨床癥侯群。血壓的升高與冠心病、腎功能障礙、高血壓心臟病及高血壓并發(fā)腦卒中的發(fā)生存在明顯的因果關(guān)系。高血壓最新的診斷標(biāo)準(zhǔn)是收縮壓≥19kpa(140mmHg)或舒張壓≥12kpa(90mmHg)，符合其中一項(xiàng)者可確診為高血壓。
大多數(shù)的高血壓患者在血壓升高早期僅有輕微的自覺癥狀，如頭痛、頭暈、失眠、耳鳴、煩燥、工作和學(xué)習(xí)精力不易集中并容易出現(xiàn)疲勞等。隨著病情的發(fā)展，特別是出現(xiàn)并發(fā)癥時(shí)，癥狀逐漸增多并明顯，如手指麻木和僵硬、多走路時(shí)出現(xiàn)下肢疼痛，或出現(xiàn)頸背部肌肉酸痛緊張感。當(dāng)出現(xiàn)心慌、氣促、胸悶、心前區(qū)疼痛時(shí)表明心臟已受累，出現(xiàn)夜間尿頻、多尿、尿液清淡時(shí)表明腎臟受累、腎小動(dòng)脈發(fā)生硬化。如果高血壓患者突然出現(xiàn)神志不清、呼吸深沉不規(guī)則、大小便失禁等提示可能發(fā)生腦出血，如果是逐漸出現(xiàn)一側(cè)肢體活動(dòng)不便、麻木甚至麻痹，應(yīng)當(dāng)懷疑是否有腦血栓的形成。
高血壓早期無明顯異常體征出現(xiàn)。當(dāng)腦、心、腎等重要器官出現(xiàn)輕度損害時(shí)可有異常的體征出現(xiàn)。常見的心臟異常表現(xiàn)有心尖搏動(dòng)左移、心前區(qū)有抬舉樣搏動(dòng)感，聽診心尖區(qū)第一心音增強(qiáng)、主動(dòng)脈瓣區(qū)第二心音增強(qiáng)且有收縮期雜音和舒張期雜音，表明已發(fā)生動(dòng)脈硬化和左心室肥厚，如果在心尖區(qū)聽及奔馬樣心律可能表明有心力衰竭的出現(xiàn)。另外還常見耳垂出現(xiàn)折痕、毛細(xì)血管搏動(dòng)、橈動(dòng)脈出現(xiàn)硬脈或無脈及下肢間歇性跛行等。
此外，由于某些誘發(fā)因素或高血壓本身的發(fā)展，可導(dǎo)致一些高血壓患者血壓顯著或急驟升高，同時(shí)伴有腦、心、腎、視網(wǎng)膜等重要器官功能損害，嚴(yán)重危及生命，出現(xiàn)一系列臨床特殊征象，稱為高血壓急癥。高血壓急癥的發(fā)病率占高血壓人群的5％，常見有高血壓腦病、腦出血、急性左心衰竭、可樂寧急性停藥綜合征、急性心肌梗塞、急進(jìn)型惡性高血壓等。
高血壓患者中約5％左右無自覺癥狀，也不知道血壓何時(shí)升高，更不知道什么時(shí)候已產(chǎn)生了血管和器官損害的并發(fā)癥，有些患者甚至在發(fā)生了心血管意外之后才知道自己患有高血壓。所以，找出高血壓發(fā)病的遺傳原因，及早的進(jìn)行預(yù)防以及檢測，可以有效控制高血壓的發(fā)病，將疾病對(duì)人體的傷害減到最小。
原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)也叫高血壓病，是一種獨(dú)立的疾病，有著自己的病因、發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸的規(guī)律和臨床表現(xiàn)。臨床上主要表現(xiàn)為動(dòng)脈血壓的升高。占人群高血壓患者的90％以上，目前發(fā)病機(jī)理尚未完全明了，主要依據(jù)排除了其他疾病導(dǎo)致的高血壓后才能診斷為原發(fā)性高血壓(高血壓病)。動(dòng)脈血壓的升高主要是因外周小動(dòng)脈阻力增高所致，同時(shí)有不同程度的血容量和心輸出量的增加。晚期常導(dǎo)致心、腦、腎等臟器受累發(fā)生高血壓心臟病、心力衰竭、腎功能障礙、腦出血等嚴(yán)重并發(fā)癥。原發(fā)性高血壓的治療主要是降低血壓同時(shí)防止并發(fā)癥的發(fā)生。原發(fā)性高血壓患者致死原因?yàn)槟X血管意外、心血管意外和腎功能不全，我國以腦血管意外為多見，心力衰竭和尿毒癥次之，而歐美國家以心力衰竭多見，腦血管意外和尿毒癥次之。
原發(fā)性高血壓作為最常見的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險(xiǎn)因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進(jìn)而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。
雖然已有許多關(guān)于各種基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的研究，但沒有證實(shí)INSR基因與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道，更沒有證實(shí)INSR基因的SNP與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道。
綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要尋找原發(fā)性高血壓易感基因，并開發(fā)檢測原發(fā)性高血壓的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種診斷(尤其是早期診斷)高血壓的方法及檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療高血壓的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測該個(gè)體的INSR基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的INSR基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測的是INSR的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常INSR核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性151位C→T；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在胰島素受體基因INSR的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用INSR基因特異性引物擴(kuò)增樣品的INSR基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性151位C→T；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，且含有SEQ IDNO1中第151位。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測高血壓的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增INSR基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴(kuò)增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第151位的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第151位的突變結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQ ID NO1中第151位的突變限制性內(nèi)切酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性151位C→T；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的INSR蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對(duì)大量候選基因的SNP進(jìn)行了測定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了INSR基因的部分SNP與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能INSR的改變將導(dǎo)致高血壓，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在INSR第151位的SNP(151位C→T)在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.05)，因此可作為檢測高血壓的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
INSR基因胰島素受體基因(Insulin receptor，INSR)的詳細(xì)序列可參見登錄號(hào)為M32822的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ IDNO4所示。其中，第8外顯子的序列如SEQ ID NO1所示。
INSR基因?qū)儆谝粋€(gè)結(jié)構(gòu)和功能上已經(jīng)比較清楚的激素受體。該受體基因位于人的第19對(duì)染色體的短臂末端，定位于19P13.2-13.3，1993年Trask等把INSR定位在19p13.3。目前有三個(gè)轉(zhuǎn)錄本已經(jīng)確定，分別分布在翻譯起始位點(diǎn)上游276，282，283堿基位點(diǎn)，在不同的組織胰島素受體具有遺傳異質(zhì)性。胰島素受體具有典型的變構(gòu)酶性質(zhì)，胰島素與之結(jié)合具有負(fù)協(xié)同性，因此每個(gè)胰島素受體只能以高親和性結(jié)合一個(gè)胰島素分子，即使這樣，就足以充分引發(fā)相應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)。
胰島素受體(IR)是一個(gè)跨膜糖蛋白，由兩個(gè)α亞基(分子質(zhì)量為135Kd)和兩個(gè)β亞基(分子質(zhì)量為95Kd)以二硫鍵連接而成。α亞基由719個(gè)氨基酸殘基組成，位于細(xì)胞外表面；β亞基由620個(gè)氨基酸殘基組成，分為三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)194個(gè)氨基酸殘基組成的N端區(qū)域暴露在細(xì)胞表面，通過二硫鍵與α亞基相連；由23～26個(gè)疏水性很強(qiáng)的氨基酸殘基組成的跨膜區(qū)域以及由403個(gè)氨基酸殘基組成的C端區(qū)域。α亞基肽鏈N端及富含半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域是胰島素的結(jié)合位點(diǎn)。酪氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域位于β亞基的996～1263位氨基酸殘基區(qū)域內(nèi)，在胰島素受體中有重要功能，這一區(qū)域的氨基酸殘基序列保守性極強(qiáng)，其中1003Gly-Gln-Gly-Ser-Phe-Gly1008是ATP結(jié)合位點(diǎn)，其后15～25個(gè)氨基酸殘基處是一保守的Lys，參與磷酸集團(tuán)的轉(zhuǎn)移及隨后的受體活化。激酶的催化結(jié)構(gòu)域位于ATP結(jié)合位點(diǎn)C端100～150個(gè)氨基酸殘基處，包含自身磷酸化的主要位點(diǎn)(1158Tyr-Glu-Thr-Asp-Tyr-Tyr1163)。位于其兩側(cè)的兩段高度保守序列1131AArg-Asp-Leu-Ala-ala-Arg-Asn1137及1172Pro-Val-Arg-Try-Met-Ala-Pro-Glu1179是胰島素受體表現(xiàn)激酶活性所必需的。此外，β亞基的C端尚有兩個(gè)自身磷酸化位點(diǎn)Tyr1316和Tyr1322。
胰島素受體基因編碼區(qū)由22個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成。外顯子1～11編碼a亞基，位于細(xì)胞膜外，功能與胰島素結(jié)合；12～22外顯子編碼β亞基，為跨膜結(jié)構(gòu)，含13個(gè)酪氨酸殘基，具有酪氨酸激酶活性又稱催化亞基。其中17～22外顯子編碼為β亞基酪氨酸激酶主要活性區(qū)。當(dāng)胰島素與α亞單位結(jié)合后，β亞單位發(fā)生自我磷酸化和激活酪氨酸激酶，此后激活細(xì)胞內(nèi)一系列中間分子，如SH-2、IRS-1和PI-3激酶(Phosphatidylinasital-3 Kinase)等，調(diào)節(jié)了糖、脂肪、蛋白質(zhì)、核糖核酸等重要物質(zhì)的合成與代謝。
胰島素受體的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的加工過程或者結(jié)構(gòu)基因異常將導(dǎo)致胰島素受體缺陷，導(dǎo)致胰島素耐受等一系列最終導(dǎo)致脂肪代謝和糖代謝等代謝紊亂，產(chǎn)生高胰島素血癥或者糖尿病最終導(dǎo)致血管以及其它組織等的器官損害，并造成動(dòng)脈粥樣硬化。已有的研究發(fā)現(xiàn)基因突變大部分均發(fā)生在外顯子，如有研究發(fā)現(xiàn)在胰島素抗性特征的病人發(fā)現(xiàn)受體252位精氨酸到L-半胱氨酸的突變，抑制了受體的內(nèi)吞(internalisation)但是不阻止信號(hào)的傳遞。
本發(fā)明人對(duì)INSR基因中的幾乎整個(gè)區(qū)域進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)了許多SNP，其中大部分SNP與高血壓易感性并不相關(guān)，然而關(guān)聯(lián)研究表明151位C→T卻是與高血壓易感性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。該SNP位于INSR的第8號(hào)外顯子，雖然不造成氨基酸變化，但tRNA對(duì)突變后密碼子的偏愛性有差異，因此造成對(duì)INSR的轉(zhuǎn)錄水平有影響，進(jìn)而導(dǎo)致影響胰島素受體的表達(dá)水平，并最終導(dǎo)致攜帶者的高血壓易感性明顯高于正常人群。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，INSR蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療INSR蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用于篩選促進(jìn)INSR蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人INSR蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人INSR蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人INSR DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人INSR基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人INSR基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人INSR蛋白的分子，也包括那些并不影響人INSR蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人INSR基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人INSR蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人INSR蛋白功能的抗體以及不影響人INSR蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人INSR基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人INSR基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗人INSR蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人INSR蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗INSR抗體是不識(shí)別正常INSR但識(shí)別突變INSR的抗體，或者識(shí)別正常INSR但不識(shí)別突變INSR的抗體。利用這些抗體，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的高血壓易感性檢測。
利用本發(fā)明INSR蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與INSR蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明INSR蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的INSR多肽可直接用于疾病治療，例如，用于高血壓治療。在使用本發(fā)明INSR蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療高血壓的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明INSR蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的INSR蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人INSR蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于INSR蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的INSR蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶INSR基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人INSR基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人INSR蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括ELISA等。
一種檢測檢測樣品中是否存在INSR蛋白的方法是利用INSR蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與INSR蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在INSR蛋白。
INSR蛋白的多聚核苷酸可用于INSR蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，INSR蛋白的多聚核苷酸可用于檢測INSR蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下INSR蛋白的異常表達(dá)。如INSR DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷INSR蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用INSR蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測INSR蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測INSR基因的突變也可用于診斷高血壓。檢測可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。INSR蛋白突變的形式包括與正常野生型INSR DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用INSR基因特異性引物擴(kuò)增樣品的INSR基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性151位C→T，其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了INSR基因的SNP與高血壓的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含該SNP位置的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在151位C→T。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之肉，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對(duì)應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對(duì)具有SEQ ID NO2和3的序列。
雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQ ID NO1中第151位。
由于本發(fā)明的SNP與高血壓具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期較準(zhǔn)確地診斷原發(fā)性高血壓，而且可以未雨綢繆地使攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措施(如在飲食上采取相應(yīng)控制)，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例11.1研究對(duì)象由于血壓是多基因參與的受多種環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀，必然在分析相關(guān)基因時(shí)要考慮遺傳異質(zhì)性的問題。選擇遺傳背景相對(duì)比較單一的隔離人群作為研究多基因疾病的材料將有助于降低遺傳異質(zhì)性的影響，同時(shí)由于這些群體具有比較固定的生活環(huán)境和較為一致的生活習(xí)慣使得環(huán)境因素的影響大大降低。選擇這樣的群體，不論是用于連鎖不平衡分析，還是從中選取家系進(jìn)行家系分析，都有助于提高高血壓易感基因位點(diǎn)的檢測靈敏度。因此在本實(shí)施例中選定隔離群體作為研究對(duì)象(隔離群體具有遺傳背景的相對(duì)一致性，奠基者數(shù)目比較少的優(yōu)點(diǎn))。
在知情同意的基礎(chǔ)上隨機(jī)收集了324個(gè)年齡在50歲以上的漢族個(gè)體，均來自于安徽省岳西縣大別山響腸鎮(zhèn)。80％的個(gè)體只有6個(gè)姓，奠基者數(shù)目應(yīng)該比較少，并且同一性別的個(gè)體來自于同一個(gè)奠基者。選用的高血壓樣本要求收縮壓不低于140mmHg，舒張壓不低于90mmHg，測量血壓兩次取平均值。
挑選其中的11％位于血壓分布的最頂端(37例個(gè)體；SBP＞178mmHg)和有7％位于血壓分布的最底端的(22個(gè)個(gè)體；SBP＜104mmHg)共59個(gè)個(gè)體，通過直接測序的方法進(jìn)行SNP的檢測。
1.2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果1.2.1 DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。
1.2.2 PCR及測序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中INSR的基因組序列，設(shè)計(jì)和合成以下引物。具體引物如下表1所示。
表1 引物序列表

1.2.3 INSR基因的PCR擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；以后94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
結(jié)果，獲得353bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。
1.2.4 SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學(xué)http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在以下SNP151位C→T。
1.2.5 SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測序法進(jìn)行SNP基因分型。即在高血壓病人和正常血壓對(duì)照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。
等位基因的頻率統(tǒng)計(jì)出來以后進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，通過對(duì)血壓最高的11％和最低的7％個(gè)體數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，初步確定是否等位基因的頻率和血壓水平連鎖。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1中151位的T型SNP在高血壓個(gè)體中的頻率為35％，而在低血壓人群中的頻率為30％。兩者之間的頻率差約為5％，證實(shí)了SEQ ID NO1中151位的T/C型SNP與高血壓的發(fā)生存在著相關(guān)性。
實(shí)施例2原發(fā)性高血壓易感性檢測試劑盒如實(shí)施例1所述，SEQ ID NO1中151位C→T的突變與高血壓疾病密切相關(guān)。因此，可基于這個(gè)突變?cè)O(shè)計(jì)INSR基因特異性引物在以病人的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行檢測。
制備一試劑盒(100人次)，它含有

抽取待檢測男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1ìmol/ìl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
或者，將擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，也可檢測出151位C→T。
檢測結(jié)果，含151位C→T的檢測對(duì)象的高血壓易感性高于正常人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>復(fù)旦大學(xué)上海人類基因組研究中心<120>胰島素受體基因SNP與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性<130>040138<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>401<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1cattagattg ttgggtgagt aacatgtgac cctatgggat gtaacttccc aggcctcatc 60tgcacggcac tcagtgtgac ggtcttgtaa gggtaactgc cttctgctgt tttgtcttga120aagcccttat cagaatgtga cggagttcga cgggcaggat gcgtgtggtt ccaacagttg180gacggtggta gacattgacc cacccctgag gtccaacgac cccaaatcac agaaccaccc240agggtggctg atgcggggtc tcaagccctg gacccagtat gccatctttg tgaagaccct300ggtcaccttt tcggatgaac gccggaccta tggggccaag agtgacatca tttatgtcca360gacagatgcc accagtgagt gtgtcttggg aatgtgaatt c401<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2atgtaacttc ccaggcctca20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>3tcccaagaca cactcactgg20<210>4<211>2085<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4agatctggcc attgcactcc agcctgggca acagagaaaa actccatcta aaaaaaaaaa 60aaaaaaaaaa aaaaaacaga gagagagaga gagagagaga gaaggaaacg gaactggggg 120gaggatttgc aaaaatatgg ttagggatgg cacttcagag atgaagccat cctggagtgt 180tacgggcaag ggaaatgctg gggcaaagcc ccagaggcag gaataggttt ggcctgttgc 240atgaacagtg ggtccagctc ctagcaaact gtttattgaa tgaaagaaga atgaatgcct 300tgggtctagg gttgtgctgg gcgctttctt aagttttctt tcccgggtac ctccccagaa 360ctggcatgca ggtattatta aacccattac acaagtgaaa ctggcccaga gacagaaaag 420tccctggtcc aagaccacac aggagtgagg ggtggaggaa ccctcctccc attgagttct 480ggctttccta tactgaaagc cccttcctct cctgcagtaa ggtaggtgga accgctgtcc 540cgccttgttg gtgaatgtcg ttgctagact tcagacacat acaggctggt ctgctgaaaa 600tcagagatgt ccacctgcgc cctattcgag gtctccggcg tcttctttgg cgtcgtcttt 660gccctttcag aagcgtctgc acatttttcc aggtgtcatt tctccaactt gaacacaggg 720agcgcactgg gcacgcgggc acgtggctgt ccccaggggc ctggcttggg tctcgcccct 780gggccggggc gcacgcgcgg gcgggacatc tgggggcgcc cacgcgctct gggacgagtg 840tcgctggcca ggcccggact gaggaaaggc gagtgagaca ctactcgcct ggggtgcaaa 900atttaaggga gtgaaaaaaa aaaaaaaaga aagaaaccaa aaccacctcg agtcaccaaa 960ataaacattt taatgcagta ttttttaaaa aatcaacagg aatcctccaa agcccactat1020gaacaaaata gcaaaatggt agagaaagga tctgtgccgc tgcgtcgggc ctgtggggcg1080cctccggggg tctgaaactg gaggagactc ggggctgtag ggcgcgcgga tctggggcgc1140gccctcggtc ccggcgcgcc cagggcctcc cgcgcggggc ccggcacagg gaggcgggga1200ggcgggcggg gcggggcggg gccgggcggc acctccctcc cctgcaagct ttccctccct1260ctcctgggcc tctcccgggc gcagagtccc ttcctaggcc agatccgcgc cgccttttcc1320cgcggcccgc acggggccca gctgacgggc cgcgttgttt acgggccgga gcagccctct1380ctcccgccgc ccgcccgcca cccgccagcc caggtgcccg cccgccagtc agctagtccg1440tcggtccgcg cgtccctctg tcccggagcc cgcagatcgc gacccagagc gcgcggggcc1500gagagccgag agacagtccc gggcgcagcg cggagctccg ggccccgaga tcctgggacg1560gggcccgggc cgcagcggcc ggggggtcgg ggccaccacc gcaagggcct ccgctcagta1620tttgtagctg gcgaagccgc gcgcgccctt cccggggctg cctctgggcc ctccccggca1680ggggggctgc ggcccgcggg tcgcgggcgt ggaagagaag gacgcgcggc ccccagcgcc1740tcttgggtgg ccgcctcgga gcatgacccc cgcgggccag cgccgcgcgc tctgatccga1800ggagaccccg cgctcccgca gccatgggca ccgggggccg gcggggagcg gcggccgcgc1860cgctgctggt ggcggtggcc gcgctgctac tgggcgccgc gggccacctg taccccggag1920agggtgagtc tgggggcgcg ggcgtgggcg gggagcgccg cgatggggag aggaccccac1980ccaagccaaa atcgatcccc cgcttgtgga ctgagaaccc tccccagggg cggggggcgg2040tggccaggac ggtagctcct gcatcgcgta gggggagcgg gaagc208權(quán)利要求
1.一種體外檢測樣品是否存在胰島素受體基因INSR的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用INSR基因特異性引物擴(kuò)增樣品的INSR基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性151位C→T；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQID NO2和3的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第151位。
4.一種檢測高血壓的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增INSR基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴(kuò)增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第151位的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第151位的突變結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQ ID NO1中第151位的突變限制性內(nèi)切酶。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性151位C→T；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
8.一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個(gè)體的INSR基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的INSR基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，檢測的是INSR的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常INSR核苷酸序列比較差異。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性151位C→T；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測個(gè)體的胰島素受體基因INSR、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個(gè)體患原發(fā)性高血壓的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1661065SQ20041001654
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者金力, 黃薇, 姜正文, 王穎, 張晨輝, 李艷平, 王志敏, 肖君華, 盧大儒 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué), 上海人類基因組研究中心