專利名稱：噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于噬菌體多肽鑒定的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法，尤其是一種噬菌體多肽融合熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，屬于分子藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
噬菌體展示技術(shù)中對噬菌體多肽的鑒定通常都是采用免疫學(xué)相關(guān)方法對噬菌體顆粒進(jìn)行追蹤。但這種方法有其明顯的局限性首先在鑒定過程中依然是采用噬菌體與多肽融合表達(dá)的方式，無法排除噬菌體顆粒上蛋白對于多肽的干擾因素，因此很難對多肽的導(dǎo)向性能做出肯定的解釋，其次一般的免疫學(xué)鑒定方式都是首先將細(xì)胞或者組織固定化以后鑒定，這樣就不能對多肽在體內(nèi)的作用過程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。另外，目前業(yè)內(nèi)通常采用人工合成多肽，并進(jìn)行FITC(異硫氰酸熒光素)熒光標(biāo)記的方法進(jìn)行鑒定，但是這種方式具有費(fèi)時(shí)較長、合成成本高、難以大量重復(fù)等缺點(diǎn)，同時(shí)由于FITC的毒性作用，這種方式也難以運(yùn)用于活體的實(shí)時(shí)檢測。
近年來發(fā)展起來的GFP生物標(biāo)記技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景，它可以在生物體內(nèi)直接發(fā)光，且發(fā)光穩(wěn)定，對細(xì)胞沒有任何毒害作用因此非常適合于對細(xì)胞以及組織的活體觀察。目前已經(jīng)廣泛的運(yùn)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種費(fèi)時(shí)較短、成本較低、適合于對細(xì)胞以及組織的活體觀察的噬菌體多肽熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法。
本發(fā)明采用分子生物學(xué)以及基因工程的方法對我們篩選得到的噬菌體多肽與熒光蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，以建立噬菌體肽在體內(nèi)外，與腫瘤結(jié)合的特性以及與其他無關(guān)器官組織的非特異性結(jié)合情況的定性、定量檢測方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的本發(fā)明首先構(gòu)建了一個(gè)熒光蛋白突變體的新型溫度誘導(dǎo)型重組質(zhì)粒載體，并對其物理、生物化學(xué)特性以及熒光蛋白的表達(dá)特性進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了噬菌體多肽熒光蛋白表達(dá)載體，具體而言構(gòu)建步驟如下第一步對熒光蛋白基因進(jìn)行改造，使其在氨基端獲得新的酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶對克隆載體上的熒光蛋白基因進(jìn)行雙酶切，回收目標(biāo)熒光蛋白基因后，與同樣經(jīng)雙酶切處理的表達(dá)載體進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，挑選陽性克隆，提取重組原核熒光蛋白表達(dá)載體。
本發(fā)明所用的熒光蛋白主要是起標(biāo)記物的作用，所以只要能正確標(biāo)記噬菌體多肽的熒光蛋白均可采用，本發(fā)明優(yōu)選綠色熒光蛋白GFP。
在第一步中所述的克隆載體優(yōu)選pBluSKP-GFPS65T載體，與此對應(yīng)的克隆載體上的熒光蛋白基因?yàn)镚FPS65T；在選擇克隆載體時(shí)只要滿足能表達(dá)熒光蛋白基因GFPS65T的載體均可以在本發(fā)明中使用。根據(jù)該克隆載體可以選擇一系列的限制性內(nèi)切酶，本發(fā)明優(yōu)選NcoI和SalI限制性內(nèi)切酶；在第一步中所述的表達(dá)載體優(yōu)選pBV221；在第一步中所述的大腸桿菌主要作為宿主細(xì)胞，因此所有可以作為宿主細(xì)胞的大腸桿菌均可以采用，在本發(fā)明中優(yōu)選DH5α。
因?yàn)閷晒獾鞍椎母脑爝^程僅改變了熒光蛋白首位的一個(gè)氨基酸，因此不會對熒光蛋白的熒光產(chǎn)生造成任何影響，同時(shí)也為我們對于噬菌體肽熒光蛋白融合表達(dá)體系的建立提供了極大的便利。
第二步根據(jù)噬菌體基因設(shè)計(jì)適用于多種絲狀噬菌體的PCR引物，將噬菌體多肽和與其連接的衣殼蛋白部分編碼基因共同擴(kuò)增，再將其連接在經(jīng)雙酶切的重組原核熒光蛋白基因的氨基端，構(gòu)建成噬菌體多肽融合熒光蛋白表達(dá)載體。
在本步驟中進(jìn)行雙酶切的限制性內(nèi)切酶優(yōu)選EcoRI和NheI。
由于噬菌體肽所固有的分子量小，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，我們考慮在融合表達(dá)時(shí)最大限度的保持噬菌體肽外環(huán)境的穩(wěn)定。因此在PCR提取噬菌體肽的同時(shí)我們將噬菌體衣殼蛋白上與多肽連接的DomainI同時(shí)拉出來。在保證以后工作更加便利的基礎(chǔ)之上，很好地保持了噬菌體多肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，也最好地保持篩選后多肽導(dǎo)向性。與此同時(shí)拉出的噬菌體基因總共僅約300bp(100個(gè)Aa)，因此這樣的設(shè)計(jì)也不會給以后的導(dǎo)向治療帶來不便。同時(shí)我們研究了常用于構(gòu)建噬菌體肽庫的絲狀噬菌體M13、f1等，設(shè)計(jì)了通用于這兩種噬菌體的PCR引物，大大增加了此項(xiàng)技術(shù)的適用范圍。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比較而言具有顯著的有益效果。本發(fā)明提供的噬菌體肽融合熒光蛋白表達(dá)載體采用的GFP熒光標(biāo)記技術(shù)大大降低了實(shí)驗(yàn)的成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，整個(gè)構(gòu)建過程僅需要2-3天就可完成，而且我們可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)克隆的構(gòu)建。另外大量的實(shí)驗(yàn)證明GFP對于活體組織沒有任何毒性，因此我們可以對噬菌體粘附肽進(jìn)行活體的實(shí)時(shí)觀測。最后，在已構(gòu)建的GFP熒光標(biāo)記體系的平臺上我們可以非常容易的對噬菌體特異性粘附肽進(jìn)行毒素分子的偶聯(lián)，為以后的導(dǎo)向治療研究打下了良好的研究基礎(chǔ)。而且不僅適合體外檢測，也適合于活體體內(nèi)檢測。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料與試劑1.實(shí)驗(yàn)材料綠色熒光蛋白基因GFPS65T(構(gòu)建于載體pGlow-TOPO，商品號K4830-01)，大腸桿菌DH5α(商品號11319-019)均購自Invitrogen公司。
2.試劑(1)酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Proteous Peptone購自英國OXOID公司(2)DNA快速純化/回收試劑盒、Tris飽和酚購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司(3)瓊脂糖購自西班牙BIOWEST生物公司(4)RNA酶、氨芐青霉素、蛋白Marker購自華美生物工程公司(5)SalI、NcoI、NheI、EcoRI等連接酶、T4DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司(6)λDNA/HindIII+EcoRI Marker、100bpDNA ladder購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司3.試劑的配制培養(yǎng)基(1)LB培養(yǎng)基酵母浸出粉5g；胰蛋白胨10g；NaCl 5g，加水定容至1000ml，調(diào)pH到7.0~7.2(固體培養(yǎng)基加2％瓊脂)(2)SOB培養(yǎng)基酵母浸出粉5g；胰蛋白胨20g；NaCl 0.5g；0.25MKCl 10ml；2M MgCl2 5ml，加水定容至1000ml，調(diào)pH到7.0~7.2。
(3)SOC培養(yǎng)基每1000ml SOB培養(yǎng)基，降溫至60℃，加入20ml除過菌的1M葡萄糖，調(diào)pH到7.0~7.2。
(4)Tris-乙酸(TAE)每升中含有0.04mol/L Tris-乙酸；0.001mol/LEDTA(5)胰RNA酶將胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。
(6)30％丙烯酰胺溶液將29g丙烯酰胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌，檢測該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。
(7)1mol/L CaCl2溶液在200ml蒸餾水中溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成每管10ml貯存于-20℃。
(8)溴化乙錠(10mg/ml溶液)在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。
(9)β-巰基乙醇(BME)溶液一般得到的是14.4mol/L溶液，棕色瓶中保存于4℃。
(10)酚/氯仿溶液把酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/LTris·HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液層，保存于4℃。
(11)磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶液在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至1000ml，在15lbf/in2(1034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。保存于室溫。
(12)10％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1000ml，分裝備用。
(13)1mol/L Tris溶液在800ml水中溶解121.91g Tris堿，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH值至所需值。
pHHCl7.470ml7.660ml8.042ml應(yīng)使溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定pH值，加水定容至1000ml，分裝后高壓滅菌。
(14)Tris-硼酸(TBE，0.5×)0.045mol/L Tris-硼酸；0.001mol/LEDTA(15)2×SDS凝膠加樣緩沖液100mmol/L Tris·HCl(6.8)；200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)；4％SDS(電泳級)；0.2％溴酚藍(lán)；20％甘油(16)0.5M EDTA pH8800ml H2O中加186.1g EDTA·Na2 2H2O，用NaOH調(diào)pH至8.0，定溶至1000ml。
(17)100×TE800ml H2O中加121.1g Tris，37.2 EDTA Na2 2H2O，用HCl調(diào)pH至8.0，定溶至1000ml，高溫滅菌。
(18)3M NaAc pH5.2600ml H2O中加入408.24gNaAc·3H2O，溶解后，用冰醋酸調(diào)pH至5.2，然后定溶1000ml，滅菌。
(19)20％SDS在2000ml熱水中緩慢加400g SDS，邊加邊攪拌，溶解后放置熱地方保存。
(20)溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液I可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱。
(21)溶液II0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋)，1％SDS。
(22)溶液III5mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為K+3mol/L，Ac-5mol/L。
(23)STE0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。
(24)TBE緩沖液(5×)稱取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。
(25)SDS蛋白電泳凝膠配方

具體實(shí)驗(yàn)過程首先構(gòu)建重組原核熒光蛋白表達(dá)載體。
1、PCR定點(diǎn)突變，采用50ul反應(yīng)體系。模板的制備采用大量制備質(zhì)粒的方法抽提大腸桿菌DH5α(pBV221-GFPS65T)，獲得質(zhì)粒pBV221-GFPS65T的濃度為0.02ug/ul。
P1TAACCATGGCTAGCAAGGGCGAGGAG(其中斜體為NcoI、下劃線為NheI)P2CCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAG10×Buffer 5uldNTP(10mM) 1ulP1(50pmol/ul)5ulP2(50pmol/ul)5ulddH2O 26ul模板 5ulRedTaq(1unit/ul) 3ul反應(yīng)條件首輪循環(huán)94℃ 3分鐘；50℃1分鐘；72℃ 1分鐘后續(xù)循環(huán)94℃ 1分鐘；50℃1分鐘；72℃ 1分鐘(35輪)末輪循環(huán)94℃ 1分鐘；50℃1分鐘；72℃ 10分鐘2、進(jìn)行酶切，按下表依次加樣，37℃水浴酶切反應(yīng)1小時(shí)，電泳檢查酶切結(jié)果。

3、酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離，再用DNA純化試劑盒分別提純pBV221中的約3.6kbp片段和pBluSKP-GFPS65T中的約0.7k片段；4、純化后的DNA按2∶1比例(pBV221∶pBluSKP-GFPS65T)依照下表依次加樣，16℃反應(yīng)過夜；

5、用CaCl2轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，37℃倒置培養(yǎng)24小時(shí)，抗性選用氨芐青霉素；紫外投射儀照射，挑選有綠色熒光的克隆，接種培養(yǎng)；提取陽性克隆質(zhì)粒，用SalI和NcoI雙酶切鑒定。
其次構(gòu)建噬菌體多肽融合熒光蛋白表達(dá)載體。
1、PCR擴(kuò)增噬菌體基因，采用50ul反應(yīng)體系。
模板制備無菌牙簽點(diǎn)取藍(lán)色噬菌斑，加入無菌水1ml后煮沸裂解。
P3GGAATTCATGGTACCTTTCTATTCTCACTC(斜體部分為EcoRI)P4CTAGCTAGCGTACTCAGGAGGTTTAG(斜體部分為NheI)
10×Buffer 5uldNTP(10mM) 1ulP3(50pmol/ul) 5ulP4(50pmol/ul) 5ulddH2O 26ul噬菌體模板(106/ml) 5ulRedTaq(1unit/ul) 3ul反應(yīng)條件首輪循環(huán)94℃ 3分鐘；50℃1分鐘；72℃ 1分鐘后續(xù)循環(huán)94℃ 1分鐘；50℃1分鐘；72℃ 0.5分鐘(35輪)末輪循環(huán)94℃ 1分鐘；50℃1分鐘；72℃ 10分鐘2、按下表依次加樣，37℃水浴酶切反應(yīng)1小時(shí)，電泳檢查酶切結(jié)果。

3、酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離，再用DNA純化試劑盒分別提純噬菌體肽片段和重組原核熒光蛋白片段。
4、純化后的DNA片段按2∶1比例(噬菌體肽片段和重組原核熒光蛋白片段)依照下表依次加樣，16℃反應(yīng)過夜；

連接得到噬菌體多肽融合熒光蛋白表達(dá)載體。
本發(fā)明還對多肽導(dǎo)向性進(jìn)行了鑒定。將與GFP融合表達(dá)后的B3多肽，與培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞BEL-7402共同孵育，PBS緩沖液洗脫未結(jié)合的B3多肽-GFP后，載玻片滴片在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)與對照組(未加GFP融合多肽)相比，細(xì)胞膜周圍明顯可見GFP特有的綠色熒光，證明了噬菌體多肽在脫離噬菌體結(jié)構(gòu)后依然保持了其結(jié)合作用。
通過我們的工作，我們首先建立了可以在原核系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)的GFP表達(dá)體系。在此基礎(chǔ)之上我們對GFP基因進(jìn)行了人工的改造，使其更加適合于與噬菌體插入肽基因的融合表達(dá)。最終我們獲得穩(wěn)定表達(dá)在大腸桿菌DH5α中的新型GFP基因GFPS65T/NheI(構(gòu)建于原核表達(dá)載體pBV221)，改造過的GFP不但保持了其原有穩(wěn)定、高效、熒光強(qiáng)度高等特性，還為我們在其氨基端融合噬菌體肽基因提供了便利。最后我們通過PCR擴(kuò)增，酶切連接等分子生物學(xué)常用手段獲得了與肝癌組織特異性結(jié)合肽B3相融合表達(dá)的熒光蛋白，并進(jìn)行了一系列的多肽結(jié)合性鑒定，取得了優(yōu)良的效果。
權(quán)利要求
1.一種噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法，其特征在于包括以下步驟第一步對熒光蛋白進(jìn)行改造，使其在氨基端獲得新的酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶對克隆載體上的熒光蛋白基因進(jìn)行雙酶切，回收目標(biāo)熒光蛋白基因后，與同樣經(jīng)雙酶切處理的表達(dá)載體進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，挑選陽性克隆，提取重組原核熒光蛋白表達(dá)載體；第二步根據(jù)噬菌體基因設(shè)計(jì)適用于絲狀噬菌體的PCR引物，將噬菌體多肽和與其連接的衣殼蛋白共同擴(kuò)增，再將其連接在經(jīng)雙酶切的重組原核熒光蛋白基因的氨基端，建立成噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系。
2.如權(quán)利要求1所述的噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法，其特征在于熒光蛋白為綠色熒光蛋白GFP。
3.如權(quán)利要求1所述的噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法，其特征在于第一步中的克隆載體為pBluSKP-GFPS65T載體，限制性內(nèi)切酶為Nco I和Sal I。
4.如權(quán)利要求1所述的噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法，其特征在于第一步中的表達(dá)載體為pBV221。
5.如權(quán)利要求1所述的噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法，其特征在于第一步中的大腸桿菌優(yōu)選DH5α。
6.如權(quán)利要求1所述的噬菌體多肽的熒光蛋白標(biāo)記體系的建立方法，其特征在于第二步中的限制性內(nèi)切酶為EcoR I和Nhe I。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種噬菌體多肽融合熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法，屬于分子藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先對熒光蛋白基因進(jìn)行改造，用限制性內(nèi)切酶對克隆載體上的熒光蛋白基因進(jìn)行雙酶切，與同樣經(jīng)雙酶切處理的表達(dá)載體進(jìn)行連接，獲得重組原核熒光蛋白表達(dá)載體。然后將噬菌體多肽和與其連接的衣殼蛋白部分編碼基因共同擴(kuò)增，再將其連接在經(jīng)雙酶切的重組原核熒光蛋白基因的氨基端，構(gòu)建成噬菌體多肽融合熒光蛋白表達(dá)載體。本發(fā)明提供的噬菌體肽融合熒光蛋白表達(dá)載體大大降低了實(shí)驗(yàn)的成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，不僅適合體外檢測，也適合于活體體內(nèi)檢測。
文檔編號C12N15/66GK1570118SQ20041001798
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月27日
發(fā)明者杜冰, 錢旻, 張小平, 范春妹, 周忠良, 章平, 郁萌 申請人:華東師范大學(xué)